JPH07501705A - 外来細胞による精巣精細管の再集団化，対応する結果としての生殖細胞並びに対応する結果としての動物および子孫 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 外来細胞による精巣精細管の再集団化、対応する結果としての生殖細胞並びに対 応する結果としての動物および子孫 この文書に記載した技術の基本とした研究は、米国政府（ＮＩＨ）基金により本 発明は、非原生生殖細胞を宿す動物、対応する動物系統および生殖細胞並びにこ れを取得するための方法に関するものである。

背景の説明 胚の遺伝子繁を修飾した後に、子孫における表現Ｖ発生パターンに対するその効 果を観察することにより、発生する細胞の分化に影響を与えようとする多くの試 みかある。これらの技術は、核移入（マクグラスとツルター、５ｃｉｅｎｃｅ（ １９８３）２２０　：ｌ３００−１３０２）、および細胞−非融合（グラハム、 「ヘテロ特異的ゲノム相互作用Ｊ、１９６９、ウィスター・インスティテユート ・プレス、ｐｐ、１９−３５、デフエンディ編）を含むものであった。この２つ の内で、前者の成功は限定されたものだった。

他の手法は、初期胚に幹細胞を添加し、発生に対するその効果を決定するもので あろう。例えば、骨髄由来の幹細胞は、宿主胚において発達する骨髄細胞の集団 化に寄与し、よってその分化を修飾し得ることを想定することができよう。この ような実験を導くために、加齢した胚細胞か若い胚に導入され、この結果として コロニー形成（ｃｏｌｏｎｉｚａｔ　１ｏｎ）を伴うささやかな成功か得られた （マウスタファとプリンスター、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｚｏｏｌ、（＋９７２）＋８１： １９３）。

これらの初期の実験に続いて、骨髄幹細胞およびテラトカルチノーマ幹細胞（旺 的カルチノーマ細胞とも呼ばれる）を使用する研究が行われた。これらの細胞の 両者か、発生する胚でコロニー形成する証拠かあった（プリンスター、Ｊ、Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ、（＋９７４）＋４０：１０４９−１０５６）、狂的カルチノーマ（ ＥＣ）細胞の場合、マウスの外皮における毛の色の変化により、コロニー形成か 劇的に示された。これは興奮させる結果てあり、非胚細胞を用いて動物にコロニ ー形成させる可能性を示したものであるため、この分野の科学者の間で大いなる 興味を刺激した。これは、コロニー形成する細胞のＤＮＡを介して新しい遺伝情 報を導入する手段を提供したものであろう。

これらの結果は次の年に確認され、２つの他の研究室により展開され（これらの 研究室の１って行われた仕事については、ミンッとイルメンセ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）（１９７５）７２：３５８５−３５８９を参 照することができる）、導入されたＥＣ細胞は生殖細胞（精子および卵）を含む 多数の組織でコロニー形成し得ることか示された。よって、試験管内で変異され 、修飾され、または細胞に添加された遺伝子を最終的に動物の精子または卵に結 び付けることができ、マウスの新しい遺伝的系統を創製するものとなった。

残念ながら、ＥＣ細胞は生殖細胞系で貧弱にコロニー形成するものであり、より 良い細胞系統が探索された。１９８１年に二人の科学者、ガイル・マーチンとマ ーチン・エバンスにより、胚的幹（ＥＳ）細胞と呼ばれるより効率的な細胞が独 立に記載された（マーチン、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ） （１９８１）７８ニア６３４；エバンスとカウフマン、Ｎａｔｕｒｅ　（１９ｇ ＋）２９２　：ｌ５４）。これらの細胞は、ＥＣ細胞より良好に生殖細胞系でコ ロニー形成する。しかしなから、これらは胚における原始形態の細胞の同一のプ ールから生起し、生物学的特性か非常に類似する可能性が高いと考えられる。

遺伝子を添加するか内生遺伝子を変化させ、その後に修飾した細胞を胚盤胞（こ こでこれらは発生に関与して精子となることかできる）に導入することにより、 狂的幹細胞を試験管内て（培養フラスコ内で）修飾することができる。この技術 により、マウスゲノムおよび他の種の極めて特異的な修飾が可能となる。

卵へのＤＮＡの注入を介して、非ヒト遺伝子導入動物を取得する技術も公知であ る。例えば、ゴートンら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、 （１９８０）７７：７３８０−７３８４を参照することができる。しがしながら 、これらの技術並びに前記銘記したＥＳ細胞の使用は、非常に労力の集中を要す るものである。

よって、この発明の目的は、生物学的に機能性の非原生生殖細胞を宿す動物を取 得するための、および対応する結果としての生殖細胞を取得するための容易な方 法を提供することにある。

この発明の他の目的は、新しい動物系統を取得するための、および対応する結果 としての生殖細胞を所得するための容易な方法を提供することにある。

この発明の他の目的は、生物学的に機能性の非原生生殖生殖細胞を宿す動物、そ の子孫並びに対応する結果としての動物系統および生殖細胞を提供することにあ る。

発明者らは、前記目的および以下に示すこの発明の説明がら明らかとなる他の目 的は、次の方法によって満足されることを突き止めた。オス動物宿主の精巣（ｌ または複数）を、宿主にとって原生ではない少なくとも１つの原始形態の細胞（ 例えば全能性幹細胞）により再集団化（ｒｅｐｏｐｕｒａｔｅ）する。その後こ の動物を交配させて、子孫動物の全ゆる細胞が元の宿主動物にとって遺伝的に非 原生である新規な動物系統を取得することができる。

図面の簡単な説明 図１および２は、成体マウスの精巣からの精細管の断面の写真である。図２は、 管の中心を占める、精子形成の全ての成熟段階における強度の青色（暗色）染色 を示す。対照の図１はこうではない。これは、この発明により動物の精巣に移入 した外来細胞（青色／暗色）の精子形成の生存、分化および後期段階への発生を 示すものである。

図３は、青色（暗色）染色した管を示す精巣の断面の写真であり、図２のように 、移入した細胞の生存、分化および発生を示すものである。図４は、図３に示し た管のより高い倍率の図である。図５および６は、同様に青色（暗色）染色した 管を示す。

好適な態様の詳細な説明 本発明によれば、調製した動物精巣（ｌまたは複数）の精細管に原始形態の細胞 を導入する。導入した原始形態の細胞は、そこで成熟した精子へと発生する。

このコロニー形成は、精細管の管腔が免疫学的に免除された部位であるために可 能なものである。これについての証拠は、精液に特異的な内生抗体が存在しない こと、およびオスの循環面、α中には精子に寛容なＴ細胞か存在することである 。

更に、オスの組織に精液を注入すると、一般に免疫応答が惹起される。

２以上の種類のより分化した細胞へと発生し得る細胞を、原始形態の細胞として 使用する。よって、次の２つの種類の細胞の１つを使用することができる＝　（ １）全能性細胞（これは生殖細胞を含む全ゆる細胞種類へと分化する潜在性を有 する細胞である）、および（２）多能性細胞（これは２以上の種類の細胞、例え は骨髄幹細胞、肝１１９↑細胞、腎臓幹細胞等へと分化し得る細胞である）。

宿主の精巣（１または複数）を再集団化する例示的な手順を以下に示す。セルト リ細胞を含む支持細胞を無傷に（すなわち生物学的に機能性に）止める方法によ り、精細管内の原生の生殖細胞集団を破壊することによって、オス宿主動物を調 製する。適切な公知の方法には、物理的手段（例えば放射線１、熱２等）、化学 的手段（例えはカドミウム３、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌ　ｆａｎＸ商標名）４ 等）が含まれるが、原生の精子細胞を選択的に破壊する全ゆる他の公知の技術を 使用することがてきる。好ましくは放射線を使用するか、プスルファン（商標名 ）が最も好適である。

１ウイザースら、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ、（１９７４）５７：８８−１０ ３゜ ２ガンンカら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ　（１９９０）３７　（３）：　３５７−３ ６６゜ コパリセク、Ｊ、Ｒｅｐｒｏｄ、Ｆｅｒｔ、（＋９６０）ｌ　：２９４−３０９ ゜ ４１．４−ブタンジオールジメチルスルホネートエステル、例えばｌ、４−ヒス （メタンスルホノキシ）ブタン、１．４−ジ（メタンスルホニロキシ）ブタン、 １．４−ン（メチルスルボッキン）ブタン、メタンスルホン酸テトラメチレンエ ステル、テトラメチレンヒス（メタンスルホネート）。ブンら、Ｍｕｔａｔｉｏ ｎ　Ｒｅｓ、（１９８７）１７６：２５９−２６８を参照することかてきる。

典堅的なブスルファン（商標名）処理を以下に示す。４０ミリグラムのプスルフ ァン（商標名）を］ＯｍＪのジメチルスルホキシドに溶解し、その後これに１０ ｍ１の水を添加する。２５ｇのマウス重量当Ｑ１ｍｇのブスルフ７ン（商標名） の投与量（ブシら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ、（１９８７）１７６：２５９− ２６８）を投与するのに十分な量で、この溶液の両分をマウスにｌＩＩ膜内注射 する。数週間の経過に渡り精巣生検体を組織学的に検査し、精子およびこれに起 因する精液の不存在を確かめる。その後このオスを回復させて試験し、交配およ び／または精巣の生検により残余の精子形成がないことを確認する。

代替的に、遺伝的にその精巣て精子の数カ沙ないがまたはこれを有さないオスの 宿主、例えば精子細胞の枯渇した精細管を有する子孫を産生ずるマウスの同系交 配系統を用いることができる。例えば、いわゆるＷ変異マウスの精子細胞は、そ の生存および増殖に必要な酵素を欠如している。この遺伝子のある種の対立遺伝 子についてのホモ接合体および複合へテロ接合体はこの酵素が欠如するため、生 体になっても精子細胞か完全に欠けている。ＷｖおよびＷ４４対立遺伝子を分離 するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ｗ対立遺伝子を分離するＷＢ／ＲＥＪマウス、お よびＷ５４対立遺伝子を分離する＋２９／ＳＶマウスを維持し、この目的のため に交配させることかできる。例えば、ＷＢ／ＲＥＪＷ／十に交配させたＣ５７Ｂ Ｌ／　６　Ｊ　Ｗｖ動物はある割合の雑種Ｗ／Ｗｖオスを与え、これは成熟する と精子細胞を全部欠失するものとなる。これらの雑種の精巣は、組織和合性の問 題なしにＣ５７ＢＬ／６ＪマウスまたはＷＢ／ＲＥＪマウス由来の供与体細胞を 受容することかできる。

必要であれば、宿主の精巣（ｌまたは複数）に移入されたこれらの原始形態の細 胞に対応する細胞を、精巣（ｌまたは複数）への原始形態の細胞の移入の前に宿 主の胸腺に移入することにより、受容体における寛容性を誘導することができる 。よって、積厚細胞か宿主の精巣（１または複数）に移入される原始形態の細胞 である場合、積厚細胞を宿主の胸腺に最初に移入して寛容性を誘導することがで きる。ポセルトら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）２４９　：ｌ２９３−１２９ ５を参照することかできる。

代替的に、受容体宿主としての同一系統の動物に由来する細胞を使用することか てき、または免疫欠損宿主を使用することかできる。後者の例については、精子 細胞の受容体として挙動するよう交配させたマウスの同系交配系統（例えば５Ｃ ＩＤマウスまたはヌードマウス）を使用することができる。前者の例としては、 白皮症についてＣおよびｃｈ対立遺伝子を分離する１　２９／ＳＶマウスを維持 することかできる。これらの対立遺伝子についてのホモ接合体および複合へテロ 接合体は、外皮の色によって容易に識別される。１つの対立遺伝子についてブス ルファン（商標名）処理したホモ接合体は、他の対立遺伝子についてのホモ接合 体に由来する供与体細胞を受容することかできる。その後受容体動物が供与体型 の外皮の色マーカーを示す子孫を生じた場合、これは供与体細胞が機能性の精子 を生じたことの証拠となる。

この発明により使用する原始形態の細胞は、他の個体（同一および他の種の両者 を含む）または試験管内培養から由来するものとすることかできる。使用し得る 原始形態の細胞の例には、全能性幹細胞、狂的カルチノーマ細胞（ｅｍｂｒｙｏ ｎａｌｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　）　、狂的幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉ ｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）　、他のオス（例えば高レベルの原始形態の精子細 胞梨を有する幼若体オス）由来の精子細胞、原始生殖細胞、他の原始形態の細胞 等か含まれる。精細管由来の原始形態の精子細胞、培養で生育した狂的幹細胞、 または体器官由来の原始形態の細胞は主な候補者である。メス（ＸＸ）細胞の使 用も本発明の範囲内である。

これらの原始形態の細胞は公知の手順により取得することかできる。例えば、積 厚幹細胞は次のように取得することかできる。新生児動物の精巣を補集し、被覆 体を除去する。管を酵素的に消化し、約１５９６幹細胞を含有する単一細胞懸濁 物を生成する。新生児および成体の精巣に認められるこの種の積厚細胞性幹細胞 の他に、適切な細胞の幾つかの池の公知の供給源がある。組織培養由来の幹細胞 、例えは狂的幹細胞および狂的カルチノーマ（テラトカルチノーマ）細胞は容易 に利用される。他の望ましい細胞は、再生する潜在性を有する器官、例えば肝臓 、またはリンパ器官、例えば骨髄からの原始形態の細胞である。

好適な態様では、細胞および／または管を修飾し、コロニー形成並びに有効な細 胞の多様性を促進するものとする。例えば、原始形態の細胞にその対応するセル トリ細胞を添加して集団化を促進することができ、または原始形態の細胞の表面 をフィトフエマグルチニン（ＰＨＡ）により処理して原始形態の細胞をより付着 性とすることかできる（ミンツら、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、３１　：１９５−９９） 。代替的に、管を限定した酵素的消化に供し、移入した原始形態の細胞に対して 、これらをより利用し易いものとすることかてきる。　この発明の至適の態様で は、原始形態の細胞を種々の公知の技術５により遺伝的に修飾し、これにより結 果的に得られる精子の遺伝的特性を所定のものとすることがてきる。しかしなが ら、この発明により使用する原始形態の細胞は、原生細胞（自然に誘導された変 異または変動を有する原生細胞を含む）または人工的に誘導された変異または変 動を有する原生細胞とすることもできる。

５例えば、ロヘルーバジｒテラトカルチノーマおよび狂的幹細胞：実際的なアプ ローチ」、ＩＲＬプレス（１９８７）ロバートソンまたはカベチ編、５ｃｉｅｎ ｃｅ　（＋９８９）２４：ｌ２８８−１２９２を参照することができる。

選択した原始形態の細胞を、その後側々の管に導入する。例えば、調製したオス を麻酔し、精巣（１または複数）を外科的に露呈させることができる。顕微操作 方法により細いガラス針を露呈した管に次々と導入し、管にコロニー形成するの に使用する原始形態の細胞を含有する溶液を用いてそれぞれの管に注入する。

代替的に、管系の他の部分、例えは網状組織精巣の管腔に注入することによって 原始形態の細胞を導入することもてきる。網状組織精巣に注入するため、供与体 の原始形態の細胞を装填した微細なステンレス鋼針または微細な引伸ばしたガラ スキャピラリーを使用することかできる。ミクロマニピュレータを使用し、この 種の器具の先端を指向させて網状組織精巣を貝通させる。細胞を放出し、精細管 を埋め戻し得る。

細胞の導入のために他の系も適切に使用することができる。これらには、最小の 外傷で精巣被覆体の内部の精細管を切断する外科的技術か含まれ、これにより注 入した細胞か管の切１ｔｌｉ端部に入るのか可能となる。例えば、微細な外科用 糸を多数の管の回りに巻回した後に堅く引張り、管を切断する。その後に供与体 細胞セ濁物を精巣に注入する。

代替的に、なお発生途上にある新生児の精巣（ｌまたは複数）を使用することか できる。この場合、新しい細胞の注入のために、新生児の精巣（１または複数） を露呈させる外科的手段を使用する。新生児マウスを麻酔のために氷上で冷却す る。微小な精巣を外科的に露呈させ、小さい刃の器具を使用して管構造を破壊す る。供与体細胞を注入し、１ω復の際に取込ませるものとする。その後、存在す る場合は内生細胞と共にこれらの細胞を精巣の成熟に参与させる。

前記銘記したように、管に入る原始形態の細胞は、一般に管の内部管腔の免疫学 的に免除された環境により破壊から保護されている。細胞は動物にとっては外来 性のものであるため、管から漏れ出す細胞は、典型的には宿主の免疫系によって 破壊される。好適な態様では、供与体細胞および受容体オスの組織和合性の非類 似性を使用して、漏れ出した細胞の迅速な破壊を促進するが、これは絶対的に必 要なものではない。

管の管腔の外部ての細胞の破壊は、原始形態の幹細胞は悪性生育へと形質転換を 受ける高い傾向を有するため、望ましいものである。しかし、この望ましくない 性質を原始形態の細胞から除去したならば、コロニー形成の部位の外部における 原始形態の細胞の破壊は重要てないものとし得る。

この発明の態様では、同一または異なる種の抗原的に異なる動物からの細胞に対 して寛容な動物系統を使用することができる。例えば、胸腺誘導細胞を付さない ヌードマウス、および低レベルのＢ細胞およびＴ細胞の両者を有する５ＣＴＤマ ウス（ボスマら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、１ｍｍ、（１９９１）９：３２３−５０）を 受容体として使用することかできる。

原始形態の細胞の導入の結果は、移植手順からオスか回復した後にモニターする 。公知のように、使用した動物の種に依存して、精子形成のための期間は約３０ 〜６０日てあり、精子の精巣上体成熟のためには更に１０〜１５日か必要である 。例えば、　「家畜の再生産Ｊ第４版、アカト・プレス（１９９１）、ピー・ク プス編を参照することができる。したかって、使用する種に依存して、この発明 により原始形態の細胞を受容したオスは、細胞移入の後約２か月で始めて検査す ることかできる。

本発明は、ヒトを含む動物の全ゆる種に適用し得るものであり、この場合オスは 、限定されるものではないか導入遺伝子を含む精巣を有する。この発明は、哺乳 動物種に限定されるものでもない。単一または多数の新規な遺伝的修飾または新 規な特性を備える多くの種類の動物および動物系統を提供するのにこれを使用す ることができる。本発明を適用することのできる動物には、Ｈ（ＩＩ動物（例え ばマウス、ラット等）のような動物が含まれ、これらを修飾して細胞診断または 検定においてこれらの使用を可能とすることができる。本発明は、農場動物、例 えば家畜化した反銘動物または家禽類（例えば畜生、鶏、七面鳥、馬、豚等）に も有利に適用され、これらの動物に有利な遺伝的修飾または特性を入れ込むこと ができる。

最初の受精の事態か一旦達成され、結果的に得られる子孫か受精能力のあるもの であれば、その新規な遺伝的修飾または特性を備える動物系統か確立され、そし て新規な遺伝的修飾または特性はオスおよびメスの子孫の両者に存在する。よっ て、本発明によれは、その精巣精細管を再集団化することにより、その動物にと って原生ではない生物学的に機能性の生殖細胞をその精巣のみに宿す動物を産生 することかできる。この（親）動物は子孫を産生ずることかできる。子孫におけ る全ゆる細胞は、親動物と比較して遺伝的に非原生である。

本発明により与えられた親動物およびその子孫の両者は、農業および生体医学（ ヒト遺伝子治療を含む）における用途を含む極めて多様な用途を存する。本発明 の例示的な農業用途は、価値ある種馬動物の交配潜在力を増加させることに関す る。この用途では、価値ある種馬動物からの精巣生検体を使用して、受容体動物 の（ブスルファン（商標名）または放射線等により）処理した精巣に移入するた めに幹細胞を取得する。その後受容体動物は、価値ある種馬に遺伝的に由来する 精子を産生し、この受容体オスを用いる自然な交尾により、価値ある種馬由来の 射精物を用いる人工受精の代替が提供される。この例示的な技術は、価値ある種 馬動物の病気、ケガまたは死亡に対する保険として特に有用である。

本発明の池の例示的な適用は、生体医学または農業で有用な（キメラ）動物を創 製するためのその適用である。本発明は、既存の遺伝子導入技術の有利な補足物 を提供するものである。

既存の遺伝子導入技術は、実験室マウス以外の動物に適用した場合、胚を回収す ることの困難性、異なる種の胚における異なる特性、与えられた種における再生 産時期の特異性についての知識の欠如、現在の技術の経済性等によりしばしば阻 害される。本発明は、発生学的遺伝子導入の仕事の困難性および費用を回避する ことを可能とするものである。

本発明によれば、積厚幹細胞を遺伝的に修飾し、その後受容体精巣に移入するこ とができる。結果的に得られる生殖細胞に存在する価値ある遺伝的特性を、受容 体種馬の（遺伝子導入）子孫に渡すことかできる。本発明のこの特定の適用は、 大型の農業用動物の遺伝子操作に特に重要である。

本発明は、ヒトの遺伝子治療を含む遺伝子治療にも適用性を有する。例えば、心 身に有害な遺伝的特性を有する患者は精巣の生検を受け得る。単離した幹細胞を 遺伝的に修飾し、心身に有害な特性を修正することができる。その後患者は、例 えば精巣の特異的な照射により、自分の精巣から残る生殖細胞を除去する処置を 受ける。その後自分の精巣（今や生殖細胞が全くない）を、自分自身の遺伝的に 修正した幹細胞により再度コロニー形成させることかできる。その後患者は、自 分の子孫に遺伝的疾患を渡すかもしれないという心配から開放されて更に子孫を 作ることかできる。

移入した原始形態の細胞において表面抗原または内部酵素のような従来の細胞マ ーカーを用いて、精巣の生検標本中てのその存在の検出を促進することかできる 。マーカーの特性を備える精子の射精物における存在は、成功したことの信頼し 得る表示である。よって、好適な態様によれば、少なくとも１つの遺伝的マーカ ーを好ましくは使用し、宿主オスから生起し得る残余の精子から、導入した細胞 を識別するものとする。例えば、供与体マーカー細胞として働く精子細胞におい て特徴的な染色を生成し得る遺伝子導入マウス系統を使用することかできる。

精子細胞を発生させるのに活性な遺伝子に由来するプロモーター（Ｚｆｙ−１ま たは相同体）を使用し、遺伝子導入マウス中で細菌酵素β−ガラクトシダーゼ（ １ａｃＺ）についての遺伝子の発現を誘導する。試薬Ｘ−ｇａｌの存在下で、こ れらの遺伝子導入マウス由来の精子細胞は、正常なマウス由来のものと異なり、 青色に染色される。よって、供与体として作用した場合、これらの細胞は宿主細 胞から容易に識別することかでき、分析のためのマーカーとして働く。

供与体として使用する幹細胞への意図する遺伝子およびマーカー遺伝子の両者の 同時挿入は、次の例示に従って実施することかできる。前記したＺｆｙ−１／β −ガラクトシダーゼ構成体を溶液中で意図する遺伝的構成体と混合し、卵に同時 注入して遺伝子導入マウスを産生して最終的な供与体細胞を与えるが、または組 織培養細胞に形質移入して供与体として使用するものとする。結果的に得られる 動物または細胞系統のある割合か両者の構成体を含有することとなり、容易に検 出し得るマーカー並びに意図する遺伝子を有する供与体細胞を与える。

コロニー形成は通常は幾つかの管のみにおいて生起するため、結果的に精子の数 は少なくなり得る。しかしなから、幾分かの移入した原始形態の細胞か成熟精子 へと発生した全ゆるオスは、少ない数の精子を用いて動物で受精を達成するため の多様な従来の技術が存在するため、本発明により有用なものである。これらの 技術には、限定されるものではないか、ホルモン処理、禁断（ａｂｓｔｉｎｅｎ ｃｅ）、人工受精、試験管内受精、帯状ｔｌｌｉ種（ｚｏｎａ　ｄｒｉｌｌｉｎ ｇ　）および卵への精子のミクロ導入が含まれる。

この発明の幾つかの態様の限定的でない説明の目的のために提供する以下に記載 する実験は、この発明により移入した細胞の生存、分化および精子形成の後期段 階への発生を示し、この発明の交差系統を重性を示すものであり、これにより本 発明の交差種潜在能力の強力な証拠を提供するものである。

導入 通常は３〜１０日齢の極めて若いオスのマウスの精巣から、移入のための外来潜 在性幹細胞を単離した。これらの細胞は、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（Ｉ ａｃＺ）遺伝子をコードするレポーターまたはマーカー遺伝子を担持していた。

この遺伝子はマウスゲノムには正常には存在しないものである。しかしながら、 細胞かこの遺伝子を含有する場合、これは酵素β−ガラクトシダーゼを作ること となる。試薬Ｘ−ｇａｌの存在下で、その後細胞は青色に染色されることとなる 。加えて、これらの細胞中の導入遺伝子は、１ａｃＺ構造遺伝子がＺＦと命名さ れたプロモーターまたは活性化ＤＮＡ配列の制御川下にあるため、精子形成の後 期段階、球形の精子細胞および後期段階においてのみ活性となる。このような精 子形成の後期段階は新生児の精巣には存在しない。したかって、導入遺伝子は新 生児の精巣では活性ではなく、これらの細胞は青色に染色され得ず、またこの初 期日齢てはいずれの細胞も成熟精子の出現を有さない。この実験手順の結果、移 入した細胞は生存するのみならず、精子形成の後期段階となって青色に染色され るへく分化および発生を受ける筈である。更に、移入した細胞の子孫は、内生細 胞は青色に染色し得ないため、受容体宿主マウスの全ゆる内生精子細胞（何らか のものが存在したとしても）から容易に識別することがてきる。

導入遺伝子を含有せずＸ−ｇａｌにより処理した成体対照マウスの精巣に由来す る精細管の断面の例を図１に示す。青色または暗色の染色を示す細胞はない。

これに対して、ＩａｃＺ導入遺伝子を含有しＸ−ｇａｌにより処理した成体マウ スの精巣に由来する精細管の断面を図２に示す。精子形成の全ての成熟段階にお いて強い青色（暗色）の染色があり、これは管の中心を占めている。図１および ２は、それぞれ陰性および陽性の対照の例を示す。これらは実験の説明において 以下で言及する。

移入のための細胞は、新生児マウス（３〜ＩＯ日齢）から、その分化の未成熟段 階のため、それらか何らかの染色を示し得る前の時点で取得した。これらの細胞 はレポーター細胞であり、導入遺伝子ＺＦ−１ａｃＺを担持するが、これらはＣ ５７ＢＬ／６およびＳＪＬマウス由来の抗原決定基を担持する雑種マウスの精巣 から取得する。その後精巣表面上の幾つかの部位で、受容体または宿主マウスの 精細管にこれらの細胞を注入した。

幾つかの種類の受容体マウスは次の通りとした：１、Ｃ５７ＢＬ／６ＸＳＪＬ親 系統の雑種マウス。これらのマウスは供与体細胞に免疫学的に寛容であり、これ らを拒絶しない筈である。ブスルファン（商標名）を用いて処理してその内生精 子細胞を破壊することにより宿主マウスを調製した。

２、Ｗ変異を担持するマウス。この遺伝子のある種の対立遺伝子についてのホモ 接合体および複合へテロ接合体は、成体における精子細胞を完全に欠如する。

したかって、その精細管内の全ゆる精子細胞は、移入した細胞の分化に由来する 筈である。更に、これらのマウスは、ＷマウスかＣ５７を背景とするものであっ てＺＦ−１ａｃＺ導入遺伝子を含存する細胞の表面上のＳＪＬ抗原に寛容ではあ り得ないため、マウスの供与体細胞系統とは免疫学的に不和合性である。

３．１２９／ＳＶ系統の同系交配マウス。これらのマウスは供与体細胞とは免疫 学的に不和合性であるが、これはこの細胞かＣ５７ＢＬ／６およびＳＪＬ抗原を 含存し、＋２９／ＳＶマウスは両者の系統を外来性として認識し得るためである 。外来細胞は、皮膚または器官移植組織のような通常の環境に存在する場合は、 マウスにより拒絶されて破壊され得る。しかしながら、精巣の幾つかの部分、特 に精細管の内部領域は、ある程度の免疫学的免除を有すると考えられる（すなわ ち、これらは、他の体の部位のように容易に外来組織を拒絶しない。子宮は、オ ス抗原を担持する胎児を拒絶しないため、免疫学的に免除された部位の最良の例 である）。

この発明の手段および用途を以下の例に具体化したが、得られた結果はこの発明 の幾つかの重要な観点の証明を与えるものてあった。この発明の詳細な説明する 例は以下の通りである。

実験。

１、原始形態の幹細胞または精子を１つの動物から他の宿主動物に移入すること かでき、供与体細胞は生存し、分裂しかつ分化し得る。ＺＦ−１ａｃＺ導入遺伝 子を含有する雑種マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＳＪＬ）の新生児の精巣から細胞を 取り、ブスルファン（商標名）処理した雑種（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＳＪＬ）マウス の精細管にこれらの細胞をミクロ注入した。注入後の種々の時間（日乃至月）に 宿主の精巣を除去し、１ａｃＺ染色の存在について精巣を分析することにより、 供与体動物由来の細胞の存在について検査した。供与体細胞の移入並びに生存、 分裂および分化の成功を明らかに示した多数の動物が認められた。図３にこれら の精巣の１つからの断面を示すが、多数の管が青色（暗色）に染色されているの が明らかである。これは図２で認められたのと同一の種類の染色であり、したか って内生細胞の再生（これは染色され得ず図１のように見えることとなる）では なく、供与体細胞の子孫を表している。更に、成熟した精子か幾つかの管に認め られた。図」は、図３からの管の１つの高倍率のものである。管の中心に向かう 細い暗色の核として成熟した精子か明らかに認められる（矢印）。この倍率では 青色の染色（暗色）は極めて明瞭である。この結果を達成するためには、供与体 細胞の生存、分裂および分化が生起していなければならない。供与体細胞は、未 成熟であるため染色され得ず、内生細胞（何らかで再生したとしても）は、導入 遺伝子を欠如するため染色され得ず、また供与体細胞には成熟した精子は存在し ていなかった。少数の移入された幹細胞が分裂して分化し、宿主動物内のこの精 細管を満たしたものである。

２、この発明の第２の手段では、雑種マウスに由来しＺＦ−１ａｃＺ導入遺伝子 を担持する前記したのと同一の種類の細胞を、Ｗ変異マウスの精細管に移入した 。これらのマウスは内生精子細胞を欠如する。手順の成功を図５に示すが、これ は供与体細胞を受容した管の断面を示すものである。この断面には細胞の青色の 染色があり、これらが供与体細胞から誘導されたことを示す。更に、この変異動 物は精子細胞を生成することがてきない。この発明のこの態様では、供与体細胞 は、供与体マウス系統に免疫学的に寛容ではない動物における完全に滅菌された 精巣にコロニー形成した。精巣の環境は、この発明の適用において考えたように 免疫学的保護を与えた。供与体細胞の移入の１２０日後にこの精巣の検査を行っ たが、細胞の生存、分裂および分化は長期間（恐らく死亡まで）宿主内で継続す ることを示すものであった。

３、この発明の第３の手段ては、同一の種類の供与体細胞を１２９／ＳＶ同系交 配マウスの精細管に移入した。マウスは、予めブスルファン（商標名）により処 理して内生精子細胞を破壊したものとした。結果を図６に示す。この場合も供与 体細胞（青色または暗色に染色される）がこの管にコロニー形成した。前記例の 限りにおいては分化は進行しなかったが、これは恐らく移入が最初に行ったもの であった一方で改良がなお進行中であったためである。しかしながら、この例は 、極めて強い免疫学的相異にも拘らず、管内における外来細胞の寛容性を示すも のである。供与体細胞の移入の１１０日後にこの精巣の検査を行ったが、極めて 長い期間の供与体細胞の生存を示すものであった。

この発明をここに十分に説明したが、ここに記載したこの発明の精神または範囲 から逸脱することなく、これに対して多くの変更および改変をなし得ることは当 業者に明らかであろう。

フロントページの続き （７２）発明者　シマーマン、ジエイムズ・ダブり二一アメリカ合衆国、ペンシ ルヴエニア州 １９１４７　、　フィラデルフィア、サウス・オリアンナ・ストリート　６１３

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的に機能性の非原生生殖細胞を、その原生の精細管に宿すことを特徴 とする非ヒト動物。
2. ２．前記動物が哺乳動物である請求項１記載の動物。
3. ３．前記動物が齧歯動物である請求項１記載の動物。
4. ４．前記動物が農業用動物である請求項１記載の動物。
5. ５．請求項１記載の動物を交配させることにより得られることを特徴とする動物 系統またはその子孫。
6. ６．前記動物が哺乳動物である請求項５記載の動物系統。
7. ７．動物にとって原生ではない原始形態の細胞を用いて動物の精巣を再集団化す ることからなることを特徴とする生殖細胞の作製方法。
8. ８．前記再集団化が、 （ｉ）前記動物の精細管内の内生の生殖細胞集団を破壊し、前記管内の支持細胞 は化物学的に機能性のままとし、かつ（ｉｉ）前記原始形態の細胞を用いて前記 管にコロニー形成することからなる請求項７記載の方法。
9. ９．前記工程（ｉ）が、前記管を物理的処理に供することからなる請求項８記載 の方法。
10. １０．前記物理的処理が放射線処理である請求項９記載の方法。
11. １１．前記工程（ｉ）が、前記管を化学的処理に供することからなる請求項８記 載の方法。
12. １２．前記化学的処理が、ブスルファン（商標名）を用いる処理である請求項１ １記載の方法。
13. １３．前記支持細胞がセルトリ細胞からなる請求項８記載の方法。
14. １４．前記原始形態の細胞が全能性幹細胞である請求項７記載の方法。
15. １５．前記工程（ｉｉ）が、前記管または前記精巣の管系の他の部分に前記原始 形態の細胞を含有する溶液を注入することからなる請求項８記載の方法。
16. １６．前記動物が農場動物である請求項１５記載の方法。
17. １７．請求項１記載の動物を飼養するか交配させ、その生殖細胞の少なくとも幾 分かを補集することからなることを特徴とする生殖細胞の取得方法。
18. １８．請求項１記載の動物から得られたことを特徴とする生殖細胞。
19. １９．（ｉ）動物にとって原生ではない原始形態の細胞を用いて動物の精細管を 再集団化し、かつ （ｉｉａ）前記動物を飼養し、かつ （ｉｉｂ）前記動物の精子の少なくとも幾分かを補集するか、または（ｉｉｉａ ）前記動物を交配させて子孫を取得し、かつ（ｉｉｉｂ）前記子孫の精子の少な くとも幾分かを補集することからなる方法により製造したことを特徴とする精子 。
20. ２０．動物にとって原生ではない原始形態の細胞を用いて動物の精巣の精細管を 再集団化することからなることを特徴とする、生物学的に機能性の非原生生殖細 胞を宿す動物の作製方法。
21. ２１．前記精細管が、生物学的に機能性の内生生殖細胞を含有しない請求項２０ 記載の方法。
22. ２２．請求項２１て取得した非原生生殖細胞を宿す動物を交配させることからな ることを特徴とする動物系統の取得方法。
23. ２３．前記哺乳動物および前記生殖細胞が同一の種のものである請求項２記載の 動物。
24. ２４．前記哺乳動物および前記生殖細胞が異なる哺乳動物種のものである請求項 ２記載の動物。
25. ２５．前記生殖細胞が種馬動物から由来する請求項４記載の動物。
26. ２６．その必要性の際に動物の遺伝子治療を行うに際し、（ｉ）前記動物の精細 管内の内生の生殖細胞集団を破壊し、前記管内の支持細胞は生物学的に機能性の ままとし、かつ（ｉｉ）前記必要性を生起した心身に有害な遺伝的特性を含まな い幹細胞を用いて前記管にコロニー形成する 工程からなることを特徴とする、その必要性の際の動物の遺伝子治療のための方 法。
27. ２７．前記動物がヒトである請求項２６記載の方法。
28. ２８．前記動物が農業用動物である請求項２６記載の方法。
29. ２９．（ｉ）動物の精細管内の内生の生殖細胞集団を破壊し、前記管内の支持細 胞は化物学的に機能性のままとし、かつ（ｉｉ）前記動物にとって原生ではない 原始形態の細胞を用いて前記管にコロニー形成する工程からなる方法により取得 したことを特徴とする、生物学的に機能性の非原生生殖細胞をその精細管に宿す 非ヒト動物。
30. ３０．請求項２９の記載による哺乳動物。
31. ３１．請求項２９の記載による齧歯動物。
32. ３２．請求項２９の記載による農業用動物。