BG61041B1 - Метод за произвеждане на нечовешки трансгенетични животни чрез въвеждане на екзогенна днк в соматични и зародишни клетки на жи- вотните - Google Patents
Метод за произвеждане на нечовешки трансгенетични животни чрез въвеждане на екзогенна днк в соматични и зародишни клетки на жи- вотните Download PDFInfo
- Publication number
- BG61041B1 BG61041B1 BG94777A BG9477791A BG61041B1 BG 61041 B1 BG61041 B1 BG 61041B1 BG 94777 A BG94777 A BG 94777A BG 9477791 A BG9477791 A BG 9477791A BG 61041 B1 BG61041 B1 BG 61041B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- sperm
- dna
- oocytes
- animal
- incubated
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 28
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 title claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 title 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 3
- 230000009027 insemination Effects 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 abstract 1
- 238000010420 art technique Methods 0.000 abstract 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 241000258955 Echinodermata Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004034 genetic regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 1
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Методът е приложим в генното инженерство и биотехнологията. С него се създава възможност
за изучаване генната регулация за химични и терапевтични цели и при развъждането на животни.
Създават се трансгенетични животни, при които трайно е интегрирана информация, произхождаща
от друга генетична система, чужда за генома на индивида. По метода екзогенна ДНК се вкарва в
соматични и зародишни клетки, като предварително се модифицира по известните техники за
рекомбинантни ДНК, след което се вкарва в сперматозоиздите на животните, които ще се
модифицират и вследствие на това яйцеклетките се оплождат.
Description
ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Настоящото изобретение се отнася до метод за произвеждане на нечовешки трансгенични животни чрез въвеждане на екзогенна ДНК в соматични и зародишни клетки на животни.
По-специално, методът се състои във въвеждане на ДНК, екзогенна или модифицирана, съгласно познатите техники за рекомбинантна ДНК, в главата на сперматозоида на животното, което трябва да бъде модифицирано, и в използване на модифицирания сперматозоид за оплождане на яйцеклетка в съответствие с известните техники за изкуствено осеменяване.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Създаването на трансгенетични животни, т.е. на животни, при които са интегрирани трайно генетични информации, чужди за техните собствени геноми и произхождащи от други генетични системи, е било и все още е обект от първостепенно значение за изучаване на генетичната регулация както за химически, така и за терапевтични цели и за развъждане на домашни животни, риби, ехинодерми и амфибии.
Наистина е възможно да се създадат животни с отделни преимуществени характеристики, такива като скорост на растеж, или устойчивост към някои заболявания, в случай на животни за разплод, или обратно - предразположение към някои заболявания, в случай на животни, използвани за експериментиране на нови лекарства. Първите опити за получаване на трансгенетични животни датират от средата на седемдесетте години.
Тези опити са свързани главно с манипулации на ембриони от мишки или с клетъчни култури и с директното въвеждане на ДНК (например SV40) в бластоцитните кухини на мишки, както е описано от M.H.L. & А.Мс Laren е Experimental Cell Research (1924) 86, 1-8 и от R.Jaenisch & В.Mintz (1974) в
Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1974) 71, 1250-54.
Получените резултати обаче са незадоволителни, по-специално поради трудността на използваните техники.
През 1980 г. John W.Gordon и други описват в Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1980), 77 № 12, 7380-84 една нова техника за генетично трансформиране на ембриони от мишка чрез микроинжектиране на клонирана ДНК в пронуклеите на оплодени ооцити.
Така тренираните зиготи се реимплантират в матката псевдобременна майка и бременността се довежда до край.
С помощта на тази техника, която е подобрена през последните години, се показва, че е възможно екзогенна ДНК да се въведе в соматични и зародишни клетки на мишка при получаване на трансгенетични животни.
Типичен пример за трансгенетични животни, получени с техниката на микроинжектирането на екзогенна ДНК в оплодени яйца и използвани за експериментална антитуморна терапия, са мишките, описани в US 4 736 866, които показват в техните соматични и зародишни клетки наличие на онкогенна последователност.
Микроинжекционната техника се експериментира в областта на развъждането, но няма достатъчно информация за постигнатите крайни резултати.
Микроинжектирането на ДНК в оплодени ооцити е във всеки случай сложна и скъпа техника, със слаба ефективност, поради високата степен на аборти, на мозъчност при получените животни и изразената им стерилност.
През 1987 г. е предложена друга техника /WO 87/05325/, използваща способността на спермите да пренасят в яйцеклетките субстанции, прикрепени към тяхната повърхност.
Съответният генетичен материал, под формата на нуклеинови киселини, се улавя в изкуствени мехурчета (везикули) или се процедира със специфични протеини и неорганични соли под формата на гранули. Така получените обвивки, съдържащи генетичния материал, след това се прикрепят към повърхността на спермата и с нея се пренасят в яйцеклетката.
Няма доказателства за използването на посочената техника, която е сложна, поради множеството материали и операции, които се изискват за осъществяването й.
li
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Основният технически проблем, който се решава с настоящото изобретение е въвеждането на ДНК, третирана в съответствие с познатите техники за рекомбинантна ДНК, в клетките на животно, принадлежащо към животински видове, които фактически не притежават типичните последователности на въвежданата екзогенна ДНК, при условие, че генетичната информация, съдържаща се в посочената рекомбинантна ДНК, се интегрира трайно в генома на третирания индивид и поради това може да бъде пренасяна в поколението на индивида.
Методът за въвеждане на клонирана ДНК в клетките на различните видове съгласно изобретението се основава на експерименталното наблюдение, а именно изненадващата леснина, с която молекули, дори и с големи размери, успяват да проникнат в главата на сперматозоида.
Това свойство, типично за сперматозоидите, както на бозайници, така и на други животински видове, се използва за модифициране на сперматозоидите, въвеждайки в тях клонираната ДНК, която трябва да бъде пренесена.
С модифицираните сперматозоиди след това се оплождат съответните ооцити чрез техниките за изкуствено осеменяване, използвани при немодифицирани сперматозоиди.
Съгласно изобретението сперматозоидите на видовете, в които се желае да се въведе генетична информация, външна за техния собствен геном и изхождаща от други системи, се използват като вектори за пренасяне на чуждата ДНК.
Един от възможните пътища за провеждане на този процес съгласно настоящото изобретение включва следните етапи:
(a) изготвяне на водна суспензия от сперматозоиди;
(b) трансформиране на сперматозоидите с клонирана ДНК;
(c) оплождане in vitro на ооцити с помощта на модифицираните сперматозоиди;
(d) имплантиране на оплодените ооцити в псевдобременни женски от избраните видове.
Съгласно друг вариант на изобретени10 ето модифицираните сперматозоиди могат да бъдат използвани директно за оплождане на животни, без да се преминава през оплождане in vitro на ооцита и последващо имплантиране на същия в псевдобременни женски.
Тази форма за реализиране на изобретението е особено удобна в случай, че методът се използва в развъждането.
Методът, съгласно изобретението, е много по-прост, много по-бърз и не така скъп, както техниката на микроинжектиране и не води до аборти, които са твърде чести при техниката на микроинжектирането.
Следва подробно описание на изобретението във връзка с модифицирането на сперматнозоиди от мишки.
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Използват се мишки, т.к. цялата лабораторна техника за тяхното оплождане in vitro и за изучаване на интегрирането и експресията на техните гени са обстойно докладвани в научната литература.
Като екзогенна ДНК се използва р SV2 CAT, Dolyoma и човешки растежен ген, защото техните рестрикционни карти са описани в литературата и съдържат основни последователности, които естествено не са представени в генома на мишката.
Идентифицирането на тези последователности при позитивни мишки, т.е. при мишки, получени от яйце, оплодено с третирани сперматозоиди, позволява да се установи без съмнение, че клонираната ДНК е наистина въведена в главата на третираните сперматозоиди и чрез тях - в оплодените яйца и следователно е интегрирана в генома на получените трансгенетични индивиди.
(а) Приготвяне на сперматозоидите
Приготвя се суспензия от сперматозоиди чрез притискане на епидидима на мъжка мишка в 1 ml РМ буфер (приготвен, както е описано от D.G.Whittingam.Culture of Mouseove-(1971)-J.Reprod.Fert.Supp,14, p.7-21).
Суспензията от сперматозоиди се центрофугира така, че да се отделят сперматозоидите, които се ресуспендират в 1 ml буфер.
Посочената по-горе обработка се повтаря 5 пъти, за да се промият сперматозоидите и да се осигури пълното отстраняване на семен3
Il ната течност. Буферът се модифицира чрез отстраняване на натриевия лактат, пеницилина и стрептомицина, като мононатриевият фосфат се замества с 0,15 тМ двунатриев фосфат и като се изменя количеството натриев хлорид на 120 шМ. След това суспензията от сперматозоиди се разрежда до концентрация от 1 -2 милиона/ ml и се инкубира в течение на 30 min до 3 h при температура от 20 до 37°С във въздух, съдържащ над 5 до 10% въглероден диоксид.
(b) ДНК трансформиране на сперматозоидите
Към разредената суспензия от сперматозоиди, в части от 500 μΐ, co добавя разтворът от клонираната, циркулярна ДНК, която е предназначена за въвеждане в сперматозоидите, след което сместа се инкубира отново за наймалко 30 min при температура от 0 до 37°С във въздух, съдържащ над 5% до 10% въглероден диоксид.
Поради намалената активност на ендогенната нуклеаза на сперматозоидите, въвеждането на ДНК в сперматозоидите е по-лесно при по-ниско температура, на времето за инкубация се удължава над 30 min.
Разтворът на клонираната циркулярна ДНК се добавя в такова количество, че да се получи крайна концентрация на сместа на клонираната ДНК между 0,4 и 2 pg/ml.
(c) Оплождане на яйцеклетката
Полово зрели женски мишки се довеждат до суперовулация чрез човешки хорионов гонадотропин и яйцеклетките се извличат от яйцепровода 14,5 h след инжектирането (съгласно метода, описан от В.Hogan и други в “Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratoty Manual” C.S.M. New York, 1986).
Извлечените от яйцепровода яйцеклетки се въвеждат в части от 500 μΙ от трансформираните сперматозоиди и се инкубират в течение на 5 до 10 h при температура от 20 до 37°С във въздух, съдържащ над 5 до 10% въглероден диоксид. В края на споменатия период яйцата се промиват с М16 буфер (приготвен както е описано от Whittingam, виж т. (а) погоре) и се оставят цяла нощ в 50 μΐ от същия буфер.
След 24 h ембрионите се пренасят хирургически в стадий на две клетки в яйцепроводите на псевдобременни женски.
Потомците, произхождащи от тези имплантати, на възраст от 3 седмици, се подлагат на ампутация на крайния опашен фрагмент, от който се екстрахира ДНК, която се анализира с помощта на Southeru blot (пренос по Southern) описано в книгата “Molecular 5 Cloning”: A Laboratory Manual” от T.Maniatis et al., C.S.M., New York 1984.
Този анализ позволява да се идентифицират позитивни индивиди, т.е. онези, чийто геном притежава интегрирани или в епизомична форма, една или повече копия от същата клонирана ДНК, въведена в изходните сперматозоиди.
Добивът на позитивни индивиди, получени, като се следва методът съгласно настоящото изобретение, е винаги по-висок от 30 co 70% и, нещо повече, между тях няма стерилни индивиди.
Последващото генетично характеризиране на позитивните животни се извършва с два аналитични метода - рестрикционен и секвениране.
Анализът на геномната ДНК при позитивните мишки се извършва по два метода:
Рестрикционен анализ
Рестрикционният анализ на ДНК се извършва чрез специфични рестрикционни ензими, които позволяват подразделянето на геномната ДНК на фрагменти. Получените фрагменти след това се фракционират чрез електрофореза и се пренасят върху нитроцелулозен филтър съгласно известната Southeru blot техника. След това филтърът се третира с пробата, специфична за първоначалната клонирана ДНК, използвана за трансформиране на сперматозоидите, радиобелязана с Р32 и експонирана върху чувствителен на Х-лъчи филм.
Филмът се експонира в съответствие с местата, където радиоактивната проба е била свързана с филтъра, т.е. в съответствие с всяка радиоактивна ДНК връзка, като се оставя сигнал за всеки ДНК фрагмент.
Наличието на един или повече сигнали, техният брой и размерите на ДНК фрагментите, които те представят, позволяват да се направи изводът, че съществуват последователности, които са аналогични на позитивната проба на миши геном и да се определи рестрикционна карта.
Аналогията между тази карта и онази на клонираната ДНК, въведена в сперматозоидите, от които произхожда позитивната
Ill:
мишка доказва, че изходните последователности на клона са интегрирани в трансгенетичния миши геном.
Анализ на последователността
За да се анализира последователността на базите, състоящи позитивния миши геном, равни количества (15 gg) геномна ДНК на позитивна мишка и на pUC13 плазмида, резистентен на ампицилин, се скъсват с рестрикционен ензим EcoRI.
Двете скъсани ДНК след това се смесват, рециркулират се и се въвеждат в бактерии Escherichia coli НВ101, които след това се култивират върху Агар + Ампицилин.
Положителните колонии (т.е. тези, които съдържат клониран фрагмент) се отделят, амплифицират и пречистват. След това, клонираният фрагмент се отделя от pUC13 вектора чрез смилане с EcoRI и 626 бази се секвенират от него, като се използва методът на Лангер.
По този начин става възможно да се установи, че изходният клон е пренесен от сперматозоидите в оплоденото яйце и след това интегриран в генома на получения в резултат индивид.
Освен двата метода, посочени по-горе, се анализират сперматозоидите след тяхното трансформиране с клонираната ДНК до доказване разполагането на екзогенната ДНК.
За тази цел се използва белязана с Н3 ДНК и различни съизмерими части от сперматозоидните разтвори, след тяхната инкубация с белязаната ДНК, се радиоавтографират с оптичен и електронен микроскоп.
Получените резултати показват, че клонираната ДНК е специфично локализирана вътре в главата на сперматозоидите в субекваториално положение.
Следите от радиоактивност в другите зони на сперматозоидите са незначителни.
Тъй като е известно, че акрозомалната реакция на сливане между сперматозоид и ооцит, в момента на оплождане, (с пренасяне на генетичен материал от сперматозоида в яйцето) настъпва точно в тази зона, то се приема също, че екзогенната ДНК се пренася в същото време и по същия начин, както собствената за видовете ДНК. Този механизъм може да обясни изненадващата ефективност на метода, съгласно изобретението.
Claims (6)
- Патентни претенции1. Метод за произвеждане на нечовешки трансгенетични животни, чиито зародишни и соматични клетки съдържат последователност на екзогенна ДНК и споменатото животно е способно да възпроизвежда плодоносни потомства, характеризиращ се с това, че ооцити се оплождат със сперматозоиди на животното, предназначено за модифициране, като сперматозоидите първо се модифицират чрез въвеждане в главата на сперматозоида на екзогенна ДНК, след което се използват за оплождане на ооцитите, а ембрионите се пренасят директно, не хирургически, в животното реципиент.
- 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че сперматозоидите на животното, предназначено за модифициране, се модифицират чрез въвеждане в главата на сперматозоида на екзогенна ДНК, след което модифицираните сперматозоиди се използват директно за изкуствено оплождане на животното, без преминаване през in vitro оплождане на ооцити и без хирургическа или нехирургическа имплантация на оплодените ооцити или ембриони.
- 3. Метод, съгласно претенции 1 и 2, при който се получават сперматозоиди, приготвя се водна суспензия от тях чрез буферен разтвор, суспензията се инкубира с клонирана ДНК и получените модифицирани сперматозоиди се използват за оплождане на ооцитите.
- 4. Метод, съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че водната суспензия от сперматозоиди се буферира с FM буфер, разрежда се до концентрация на сперматозоидите от 1-2 милиона/ml и се инкубира при температура 20 до 37°С за период от 30 min до 3 h, във въздух, съдържащ над 5% до 10% въглероден диоксид.
- 5. Метод съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че разтворът на клонираната ДНК, подлежащ на въвеждане в сперматозоидите, се добавя към споменатата инкубирана водна суспензия от сперматозоиди и се инкубира допълнително за най-малко 30 min при температура от 0 до 37°С, като разтворът се добавя в такова количество, че крайната концентрация на клонираната ДНК в сместа да е от 0,4 до 2 gg/ml.II!.
- 6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ооцитите, подлежащи на оплождане, се добавят към инкубираната водна суспензия от сперматозоиди и сместа се инкубира за 5 до 10 h при температура от 20 до 37°С във въздух, съдържащ над 5% до 10% въглероден диоксид.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT8919050A IT1228210B (it) | 1989-01-10 | 1989-01-10 | Procedimento per la introduzione di dna esogeno nelle cellule somatiche e germinali di animali. |
| PCT/EP1990/000032 WO1990008192A1 (en) | 1989-01-10 | 1990-01-08 | Process for the introduction of exogenous dna in somatic and germ animal cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG94777A BG94777A (bg) | 1993-12-24 |
| BG61041B1 true BG61041B1 (bg) | 1996-09-30 |
Family
ID=11154128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG94777A BG61041B1 (bg) | 1989-01-10 | 1991-07-08 | Метод за произвеждане на нечовешки трансгенетични животни чрез въвеждане на екзогенна днк в соматични и зародишни клетки на жи- вотните |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0453458B1 (bg) |
| JP (1) | JPH04504352A (bg) |
| AT (1) | ATE121458T1 (bg) |
| AU (1) | AU643672B2 (bg) |
| BG (1) | BG61041B1 (bg) |
| BR (1) | BR9007015A (bg) |
| CA (1) | CA2045138A1 (bg) |
| DE (1) | DE69018813T2 (bg) |
| DK (1) | DK0453458T3 (bg) |
| ES (1) | ES2074560T3 (bg) |
| FI (1) | FI913266A0 (bg) |
| GR (1) | GR900100012A (bg) |
| HU (1) | HUT58818A (bg) |
| IE (1) | IE67617B1 (bg) |
| IL (1) | IL93024A (bg) |
| IT (1) | IT1228210B (bg) |
| NO (1) | NO912621L (bg) |
| PL (1) | PL162962B1 (bg) |
| WO (1) | WO1990008192A1 (bg) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL92529A0 (en) * | 1989-12-03 | 1990-08-31 | Yissum Res Dev Co | Generation of transgenic vertebrates by employing transformed sperm cells via artificial insemination |
| AU2146092A (en) * | 1992-05-28 | 1993-12-30 | Scientific Dimensions Usa, Inc. | Transgenic animal production with biolistically transformed spermatozoa |
| JPH10304790A (ja) * | 1995-09-29 | 1998-11-17 | Hoechst Japan Ltd | トランスジェニック動物の作成方法 |
| US6734338B1 (en) | 1997-11-14 | 2004-05-11 | Cedars-Sinai Medical Center | Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies |
| EP1030929B1 (en) * | 1997-11-14 | 2009-03-18 | Cedars-Sinai Medical Center | Transfection and transfer of non-human male germ cells for generation of transgenic non-human mammals |
| US7294755B1 (en) | 1997-11-14 | 2007-11-13 | Cedars-Sinai Medical Center | Genetic modification of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies |
| EP1129205A1 (en) * | 1998-11-13 | 2001-09-05 | Cedars-Sinai Medical Center | Transfection of male germ cells for generation of selectable transgenic stem cells |
| AU4077199A (en) * | 1998-11-13 | 2000-06-05 | Cedars-Sinai Medical Center | A method for depopulating of vertebrate testis and for generation of transgenic species |
| JP3694734B2 (ja) * | 2000-02-24 | 2005-09-14 | 国立大学法人京都大学 | トランスジェニック動物の作製方法、トランスジェニック動物 |
| US7067308B1 (en) | 2000-03-28 | 2006-06-27 | Bioagri Corporation | Vector for genetically modifying non-human animals |
| US7053187B2 (en) | 2000-03-28 | 2006-05-30 | Gioagri Corporation | Sperm-specific monoclonal antibody, mAbC |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3636991A1 (de) * | 1986-03-03 | 1987-09-24 | Transgene Gmbh | Verfahren zur uebertragung organischer und/oder anorganischer substanzen auf ei- und/oder somazellen von tieren sowie entsprechende zusammensetzungen |
-
1989
- 1989-01-10 IT IT8919050A patent/IT1228210B/it active
-
1990
- 1990-01-08 WO PCT/EP1990/000032 patent/WO1990008192A1/en active IP Right Grant
- 1990-01-08 DK DK90901579.4T patent/DK0453458T3/da active
- 1990-01-08 CA CA002045138A patent/CA2045138A1/en not_active Abandoned
- 1990-01-08 JP JP2501478A patent/JPH04504352A/ja active Pending
- 1990-01-08 BR BR909007015A patent/BR9007015A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-01-08 HU HU901033A patent/HUT58818A/hu unknown
- 1990-01-08 DE DE69018813T patent/DE69018813T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-08 EP EP90901579A patent/EP0453458B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-08 AT AT90901579T patent/ATE121458T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-01-08 AU AU48107/90A patent/AU643672B2/en not_active Ceased
- 1990-01-08 ES ES90901579T patent/ES2074560T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-09 PL PL28325790A patent/PL162962B1/pl unknown
- 1990-01-09 GR GR900100012A patent/GR900100012A/el unknown
- 1990-01-09 IE IE8590A patent/IE67617B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-01-10 IL IL9302490A patent/IL93024A/en not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-07-04 NO NO91912621A patent/NO912621L/no unknown
- 1991-07-05 FI FI913266A patent/FI913266A0/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-07-08 BG BG94777A patent/BG61041B1/bg unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT58818A (en) | 1992-03-30 |
| EP0453458A1 (en) | 1991-10-30 |
| IL93024A (en) | 1995-08-31 |
| DK0453458T3 (da) | 1995-06-26 |
| DE69018813T2 (de) | 1995-08-17 |
| ATE121458T1 (de) | 1995-05-15 |
| FI913266A0 (fi) | 1991-07-05 |
| ES2074560T3 (es) | 1995-09-16 |
| PL162962B1 (pl) | 1994-01-31 |
| IE900085L (en) | 1990-07-10 |
| NO912621L (no) | 1991-08-28 |
| BG94777A (bg) | 1993-12-24 |
| AU643672B2 (en) | 1993-11-25 |
| BR9007015A (pt) | 1991-11-12 |
| AU4810790A (en) | 1990-08-13 |
| WO1990008192A1 (en) | 1990-07-26 |
| IT8919050A0 (it) | 1989-01-10 |
| CA2045138A1 (en) | 1990-07-11 |
| IL93024A0 (en) | 1990-11-05 |
| IT1228210B (it) | 1991-06-05 |
| JPH04504352A (ja) | 1992-08-06 |
| IE67617B1 (en) | 1996-04-17 |
| EP0453458B1 (en) | 1995-04-19 |
| NO912621D0 (no) | 1991-07-04 |
| DE69018813D1 (de) | 1995-05-24 |
| GR900100012A (el) | 1991-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Krimpenfort et al. | Generation of transgenic dairy cattle using ‘in vitro’embryo production | |
| KR20010040370A (ko) | 성체의 체세포 핵으로 재구성된 탈핵 난모세포로부터의동물의 전기간 발달 | |
| Sato et al. | Adenophostin, a potent agonist of the inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor, is useful for fertilization of mouse oocytes injected with round spermatids leading to normal offspring | |
| CA2259908A1 (en) | In vivo electroporation method for early animal embryo | |
| BG61041B1 (bg) | Метод за произвеждане на нечовешки трансгенетични животни чрез въвеждане на екзогенна днк в соматични и зародишни клетки на жи- вотните | |
| US8119785B2 (en) | Nucleic acid sequences and homologous recombination vectors for distruption of a Fel D I gene | |
| US6498285B1 (en) | Methods for producing transgenic pigs by microinjecting a blastomere | |
| AU673990B2 (en) | Repopulation of testicular seminiferous tubules with foreign cells | |
| CN1735338A (zh) | 利用体细胞核转移胚胎作为细胞供体进行附加核转移的方法和系统 | |
| US10626417B2 (en) | Method of genetically altering and producing allergy free cats | |
| JP2966016B2 (ja) | トランスジェニックラット及びその作製方法 | |
| KR20060057528A (ko) | 동물에서 체세포 핵 전이와 연관된 유사분열 방추 결함을교정하는 방법 | |
| JPH0614945A (ja) | 豚の繁殖方法 | |
| Lian et al. | Application status of genome-editing tools in sheep and goats | |
| Ogura et al. | Microinsemination using spermatogenic cells in mammals | |
| Pinkert | Genetic engineering of farm mammals | |
| JP2002045085A (ja) | クローン豚の作出方法 | |
| CN118222568A (zh) | 一种wnt1突变基因敲入大鼠成骨不全动物模型的构建方法和应用 | |
| Ogura et al. | Microinsemination and nuclear transfer with male germ cells | |
| Douglas et al. | The effects of electric field-mediated transfer of nonpermeable molecules of meiosis, fertilization, and early embryo development | |
| Ramadan | Essay On Cloning in mammals | |
| Fennessy | Embryos, Closing and Transgenics | |
| JP2002125669A (ja) | 多重包埋処理胚 | |
| JP2005525098A (ja) | ウサギの核クローニング方法並びにその用法 | |
| JP2002125516A (ja) | クローン非ヒト動物の作出方法 |