ES2267708T3

ES2267708T3 - Procedimiento para evacuar la viabilidad de una celula.

Info

Publication number: ES2267708T3
Application number: ES01901270T
Authority: ES
Inventors: Henry John The University of York LEESE; Francesca Dawn The University of York HOUGHTON; Peter Gordon The University of York HUMPHERSON
Original assignee: University of York
Current assignee: University of York
Priority date: 2000-01-19
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2021-01-19
Also published as: DK1248852T3; US20080145888A1; WO2001053518A3; JP5265832B2; US7202395B2; AU2001226929A1; DE60122106T2; JP2003520047A; EP1248852A2; US20030091977A1; ATE335838T1; US20100223681A1; WO2001053518A2; PT1248852E; US7615677B2; EP1248852B1; DE60122106D1

Abstract

Un procedimiento para evaluar la viabilidad de una célula en el que dicha célula es un gameto, un embrión, un carioplasto no humano, una supuesta población de células madre no humanas, una población de precursores de células madre no humanas o una población de células madre no humanas, comprendiendo dicho procedimiento incubar la célula en un medio de cultivo que incluye una pluralidad de aminoácidos y determinar el cambio en la concentración en el medio de al menos un aminoácido.

Description

Procedimiento para evaluar la viabilidad de una célula.

Ámbito de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para evaluar la viabilidad de una célula.

Antecedentes de la invención

Se ha demostrado que los aminoácidos mejoran el desarrollo de embriones antes de su implantación in vitro en una variedad de especies, tales como el ratón (Gardner y Lane, 1993^{1}), la rata (Zhang y Amstrong, 1990^{2}; Myoshi y col., 1995^{3}), la oveja (Gardner y col., 1994)^{4} y la vaca (Takahashi y First, 1992^{5}; Rosenkrans y First, 1994^{6}, Keskintepe y col., 1995^{7}); Lane y Gardner informaron de que los aminoácidos esenciales de Eagle incrementaban el número de células de la masa interna de celular (ICM) de embriones murinos cultivados a partir del estado de zigoto.

Los embriones in vivo obtienen aminoácidos exógenos a partir de fluidos uterinos y del oviducto. Se ha detectado un total de 20 aminoácidos en fluido del oviducto bovino (Stanke y col., 1974)^{9}, y se han detectado 25 en el fluido uterino bovino (Fahning y col., 1967)^{10}. Moore y Bondioli (1993)^{11} descubrieron que los dos aminoácidos más predominantes en el fluido del oviducto bovino eran glicina y alanina y que el suplemento de estos aminoácidos potenciaba el desarrollo del embrión bovino en presencia de células del oviducto. Suh y col. (1995)^{12} informaron de que significativamente más zigotos bovinos cultivados en medio CR2 con glicina alcanzaban el estadio de blastocisto. Rieger y Loskutoff (1994)^{13} han demostrado que la glutamina y la glicina son consumidas por óvulos desnudos y la glutamina es absorbida durante el desarrollo temprano anterior a la implantación (Rieger y col., 1992)^{14}.

Aunque los estudios en esta área se han concentrado en la administración de aminoácidos radiomarcados individuales o pares de los mismos, los embriones en el interior del tracto genital femenino estarán expuestos a una mezcla de aminoácidos (Leese, 1988)^{15}. Lamb y Leese (1994)^{16} midieron el consumo de una mezcla fisiológica de 20 aminoácidos por blastocistos murinos y descubrieron que 9 de ellos disminuían de forma significativa.

Frei y col. (1989)^{17} han investigado el destino de los aminoácidos en embriones bovinos midiendo la tasa de incorporación de metionina radiomarcada en proteínas. Descubrieron una disminución cuantitativa en la tasa de síntesis proteica entre los estadios de zigoto y de 8 células, seguida de un incremento progresivo a partir de este punto hasta el estadio de blastocisto. El incremento cuantitativo en la utilización de aminoácidos observado alrededor de estos estadios de desarrollo podría estar relacionado con el inicio de la transcripción del genoma embrional bovino que se produce en el estadio de desarrollo de 8-16 células (Telford y col., 1990)^{18}.

También se ha demostrado que los aminoácidos mejoran el desarrollo de zigotos bovinos fertilizados in vitro hasta mórulas y blastocistos e incrementan el número total de células en el estadio de blastocisto (Takahashi y First, 1992^{5}; Rosenkrans y First, 1994^{6}; Keskintepe y col., 1995^{7}). No está claro cómo los aminoácidos administrados de forma exógena ayudan al desarrollo del embrión in vitro; algunos, como la glutamina, podrían actuar como fuentes de energía (Rieger y Guay, 1988^{19}; Rieger, 1992^{14}), otros podrían incrementar el tamaño de la reserva de aminoácidos endógenos y estimular de esta forma la síntesis de proteínas de novo (Zhang y Armstrong, 1990^{2}). Van Winkle y Dickinson (1995)^{20} han demostrado que hay diferencias significativas entre el contenido en aminoácidos de embriones que se desarrollan in vitro y aquellos que se desarrollan in vivo.

Partridge y Leese (1996)^{21} investigaron embriones bovinos que se habían cultivado con 19 aminoácidos a concentraciones que se usan rutinariamente para suplementar el medio de fluido de oviducto sintético (SOF; Tervit y col., 1972)^{22}. Se estudiaron grupos de embriones fertilizados in vitro desde el supuesto estadio de zigoto hasta el estadio de blastocisto y blastocistos recién obtenidos por lavado a partir del útero en el Día 7 después de la fertilización (obtenidos in vivo). Se midieron las tasas de disminución de 17 de los aminoácidos durante un periodo de 12 horas, detectando los aminoácidos individuales mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) seguida de derivación fluoromética.

Partrige y Leese (1996)^{21} descubrieron una disminución de glutamina en el supuesto estadio de zigoto (0,76\pm0,05 pmol zigoto^{-1} h^{-1}) y en el estadio de 4 células (0,94\pm0,1 pmol zigoto^{-1} h^{-1}).

Sin embargo, no se observó una mayor disminución de glutamina en el estadio de blastocisto, lo que contrastaba con los resultados de Rieger y col. (1992)^{14}, quienes midieron la absorción de glutamina radiomarcada dada como un sustrato de aminoácido único en medio B2 por embriones bovinos.

Respecto a la disminución de aminoácidos, un resultado más intrigante de Partridge y Leese (1996)^{21} fue la disminución de treonina en cantidades significativas en todos los estadios de desarrollo in vitro así como por los blastocistos obtenidos in vitro. Se desconoce el destino de la treonina, pero podría actuar como un sustrato energético, entrando en el ciclo de Krebs como acetil-coenzima A (CoA) o succinil-coenzima A.

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Todos los estadios de embriones producidos in vitro y embriones obtenidos in vivo producían alanina. Van Winkle y Dickinson (1995)^{20} formularon la hipótesis de que la alanina podría actuar como una ruta para que los embriones secuestraran nitrógeno residual dado que se descubrieron concentraciones muy altas en blastocistos murinos cultivados in vitro. Además, Gardner y Lane (1993)^{1} han demostrado que la toxicidad por amonio es un problema potencial para los embriones de ratón cultivados in vitro. El gran incremento en la concentración externa de alanina que se observó durante el cultivo de embriones bovinos producidos in vitro y obtenidos in vivo en el presente estudio lleva a sugerir que la alanina puede formarse de hecho en el embrión para prevenir la formación de iones amonio tóxicos. Donay y Leese (1999)^{23} investigaron el metabolismo embrional durante la reexpansión de blastocistos bovinos producidos in vitro colapsados con citocalasina D e incubados en presencia y ausenta de ouabaina, un inhibidor de la bomba de Na^{+}/K^{+}. Se observaron pocas variaciones en la absorción y liberación de aminoácidos por los embriones, sin embargo había poca salida de alanina en presencia de ouabina 1 nM y 1 \muM.

La inclusión de aminoácidos en medio de cultivo previo a la implantación humano se ha vuelto más prevaleciente desde el comienzo de la transferencia de blastocistos y el requerimiento de un desarrollo embrional incrementado más allá del estadio de 4 a 8 células. A pesar de ello, sigue sabiéndose poco sobre qué aminoácidos utiliza realmente el embrión en diversos estadios de desarrollo.

Los procedimientos actuales para la producción de embriones in vitro incluyen la fecundación in vitro y la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI). La producción de embriones puede seguir también las técnicas de conservación criogénica y biopsia embrional.

El entendimiento de la forma en la que los embriones modifican una mezcla de aminoácidos puede proporcionar una pista para entender por qué el embrión producido in vitro es menos resistente que su homólogo in vivo. Estos problemas resultan particularmente evidentes en programas de fecundación in vitro humana (IVF) en los que la tasa media de éxito en el Reino Unido es actualmente de aproximadamente el 17% o 1 de cada 6.

Un programa de IVF típico implica la administración de hormonas ováricas de producción y liberación de óvulos a la mujer. Estos óvulos se recogen y se inseminan con esperma para generar aproximadamente diez embriones. Hasta tres (en el Reino Unido) de estos embriones fecundados se volverán a transferir a la mujer, y si el programa tiene éxito, al menos uno se implantará por sí mismo en útero y continuará su desarrollo.

En un esfuerzo para reducir la administración de hormonas, se pueden recoger los óvulos en los primeros estadios de la ovogénesis. La posterior maduración de los óvulos tiene lugar in vitro. Después de la inseminación de los óvulos madurados in vitro, los embriones fecundados se vuelven a transferir a la mujer para su implantación.

Actualmente se usa de forma cada vez más frecuente el procedimiento de la inyección intracitoplasmática de esperma para la fecundación. Después de la administración de hormonas ováricas de producción y liberación de óvulos, se liberan los óvulos rodeados por células cumulares. La capa protectora oculta el óvulo y debe retirarse para descubrir un óvulo que se somete entonces a un sistema de graduado visual antes de llevarse a cabo la inyección del esperma.

Hasta la fecha no existe ningún procedimiento por el que se puedan seleccionar de forma eficaz y fiable embriones u óvulos con un potencial de desarrollo incrementado, aunque se ha usado el consumo de glucosa y la producción de lactato en el ratón con este propósito. Los estudios comparativos de parámetros fisiológicos tales como consumo de glucosa, piruvato u oxígeno en embriones u óvulos sanos o detenidos no han podido proporcionar una solución al problema. Donnay y col. (1999)^{24} discuten la necesidad de identificar marcadores metabólicos adecuados para seleccionar embriones viables antes de su transferencia. El informe subraya diversos criterios que debería cumplir un marcador de este tipo, pero concluye que tal marcador no existe en la práctica. Los procedimientos actuales se basan en la selección morfológica por lo que los embriones y óvulos se someten a un sistema de graduación.

A causa de la gran incertidumbre en la determinación de los embriones y óvulos más viables, resulta evidente la necesidad de volver a transferir más de un embrión a la madre para su implantación después de la inseminación artificial. Este procedimiento compensa la probabilidad de que uno o más de los embriones puedan no desarrollarse y sirve para aumentar las limitadas oportunidades de éxito.

Incrementar la fiabilidad de la selección del óvulo o del embrión tendría importantes proyecciones sobre los programas de IVF en su conjunto, pudiéndose seleccionar y transferir los embriones más viables para su posterior implantación. La transferencia de un único embrión viable protege frente a la posibilidad de nacimientos múltiples, lo que conlleva el riesgo de nacimiento prematuro y problemas perinatales.

Debería entenderse que cualquier pruebe no debe ser precisa o fiable al 100% sino que debería implemente proporcionar un procedimiento no invasivo para indicar consistentemente la viabilidad de un único óvulo o embrión.

Una prueba adecuada debería implicar un periodo de selección lo más corto posible para que puedan tener lugar la transferencia y la implantación del embrión tan pronto como sea posible después de la fecundación in vitro. Esto minimiza cualquier riesgo que pueda estar asociado con la exposición prolongada del embrión en desarrollo a las condiciones de cultivo artificiales. Un periodo de selección más corto también resulta beneficioso desde el punto de vista económico ya que se pueden minimizar los costes de una operación intensiva de laboratorio y recursos de otra forma necesarios.

Se ha centrado también un considerable interés de investigación sobre la generación de embriones por transferencia nuclear (TN). Tales embriones se crean inyectando el núcleo de una célula donante (carioplasto) en un óvulo enucleado (ovoplasto) y usando entonces un pulso eléctrico para desencadenar el desarrollo embrionario. Se ha usado una variedad de carioplastos para la transferencia nuclear, incluyendo células madre, que se obtienen de la masa celular interna del blastocisto y que son las células precursoras de todos los tejidos del cuerpo. Sin embargo, las células madres derivadas de embrión (células ES) sólo han podido aislarse de forma concluyente en ratones y humanos y se buscan intensamente procedimientos para producirlas en otras especies incluyendo las especies domésticas. En el caso de "Dolly", el carioplasto era una célula somática (adulta) de glándula mamaria.

La generación de embriones no humanos por transferencia nuclear, especialmente a partir de células madre, es la vía preferida hacia la producción de animales transgénicos no humanos y para la "clonación terapéutica" de células, la producción de nuevas células y tejidos para sustituir aquellos que han enfermado o han dejado de funcionar adecuadamente. No obstante, los procedimientos actuales para la producción e identificación de carioplastos, células madre, precursores de células madre y embriones de transferencia nuclear viables son laboriosos y requieren tiempo.

Existe una necesidad de marcadores bioquímicos que simplificarían la identificación de una célula tal como un gameto (que puede estar en cualquier estadio de desarrollo), un embrión (que puede haberse creado por transferencia nuclear), un carioplasto, una supuesta población de células madre, una población precursora de células madre o una población de células madre.

Como se usa en este documento, el término "óvulo" se refiere a un óvulo en cualquier estadio de la ovogénesis e incluye óvulos madurados in vitro.

Declaraciones de la invención

Según la presente invención se proporciona un procedimiento para evaluar la viabilidad de una célula que comprende incubar la célula en una medio de cultivo que incluye una pluralidad de aminoácidos y determinar el cambio de la concentración en el medio de al menos un aminoácido.

Si la invención se aplica a seres humanos (por ejemplo, en IVF), el término célula se usa en su sentido más amplio y se refiere a un gameto (que puede estar en cualquier estadio de desarrollo) o a un embrión.

Si la invención se aplica a animales no humanos, el término célula también se refiere a un embrión (que puede haberse creado por transferencia nuclear), a un carioplasto, a una supuesta población de células madre, una población precursora de células madre o una población de células madre.

El término viabilidad se usa en su sentido más amplio para englobar, entre otras cosas, el desarrollo de un embrión al estadio de blastocisto, la implantación con éxito de un embrión y procedimientos de detección selectiva previos a la implantación de un embrión.

Preferiblemente, el procedimiento de la presente invención comprende adicionalmente las etapas de seleccionar la célula si el cambio cumple con un criterio predeterminado.

Preferiblemente, un óvulo que se selecciona para su posterior desarrollo se fecunda in vitro. En una forma de realización de la invención, el óvulo es un óvulo madurado in vitro. Se puede usar un carioplasto, una supuesta población de células madre, una población precursora de células madre, una población de células madre o un embrión para producir un organismo transgénico no humano con características deseables tales como resistencia a enfermedades, elevada masa de inclinación y capacidad para producir productos médicos para humanos en su leche.

Preferiblemente, el medio de cultivo comprende solución salina equilibrada de Earle (EBSS) suplementada con glucosa, L-lactato, piruvato y una mezcla fisiológica de aminoácidos.

Preferiblemente, las concentraciones de glucosa, L-lactato y piruvato oscilan desde 0,5 mM a 1,5 mM, 4 mM a 6 mM 7 y 0,37 mM a 0,57 mM, respectivamente y las concentraciones de aminoácidos individuales oscilan desde 0,005 mM a 1,0 mM. Más preferiblemente, las concentraciones de glucosa, L-lactato y piruvato son 1 mM, 5 mM y 0,47 mM.

Preferiblemente, se cultiva un embrión (que puede haberse creado por transferencia nuclear), óvulo, carioplasto, una supuesta población de células madre, una población precursora de células madre o una población de células madre en gotas de aproximadamente 4 \mul de medio de cultivo. La concentración de aminoácidos en el medio gastado se mide usando HPLC, preferiblemente seguida de derivatización con o-ftaldialdehído, y se general el perfil de consumo y producción de aminoácidos.

Para conseguir la dilución precisa de las muestras de microlitros para su uso en la HPLC, se introduce un patrón interno en el medio. Preferiblemente, el patrón interno es ácido D-alfa-aminobutírico.

También se describe un kit de diagnóstico que incluye medios para incubar una célula en un medio de cultivo y medios para determinar el cambio en la concentración en el medio de al menos un aminoácido. El kit de diagnóstico genera un perfil de aminoácidos que muestra el consumo o la producción de aminoácidos en el medio de cultivo en el que se incuba la célula de prueba. Preferiblemente, el kit de diagnóstico permite la comparación del perfil de aminoácidos de la célula incubada con "huellas" de perfiles de aminoácidos predeterminados de células detenidas y sanas de un organismo de estudio particular. De acuerdo con esto, los perfiles de aminoácidos se usan como un marcador de selección en la selección de las células más viables.

El perfil de consumo y producción de aminoácidos se puede usar para verificar la presencia de una supuesta población de células madre, una población precursora de células madre o una población de células madre que estará caracterizada por un perfil particular de aminoácidos. La supuesta población de células madre, población precursora de células madre o población de células madre se puede usar entonces en manipulación genética para producir organismos transgénicos. El procedimiento de la presente invención representa una enorme ventaja respecto a las técnicas actuales proporcionando un marcador bioquímico para la identificación y selección de células madre.

En una forma de realización de la invención, la "huella" de perfil de aminoácidos se usa en su conjunto como un marcador de selección para seleccionar una célula viable para una especie particular. En una forma de realización de la invención distinta, la selección de la célula más viable se basa sobre un grupo más pequeño de aminoácidos, que comprende típicamente uno a cinco o dos a siete aminoácidos, cuyo perfil de consumición o producción es indicativo de una célula sana de esa especie.

El procedimiento de la invención se puede usar para una diversidad de organismos incluyendo humanos, vacas, cerdos, ovejas y muchos otros animales domésticos. Los aminoácidos usados para un marcador de selección pueden incluir cualquier o una pluralidad de aminoácidos. En una forma de realización de la invención, el procedimiento se usa para humanos y los aminoácidos usados para un marcador de selección incluyen cualquiera o una combinación de los aminoácidos alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. En una forma de realización de la invención, el aminoácido usado para el marcador de selección es alanina.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá a continuación únicamente a modo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1 muestra el perfil medio de consumo o producción de aminoácidos (pmol/embrión/h) de 27 embriones humanos que detuvieron su desarrollo en el estadio de 8 células. Los aminoácidos que fueron consumidos o producidos de forma significativa están marcados con un asterisco.

la figura 2 muestra el perfil medio de consumo o producción de aminoácidos (pmol/embrión/h) de 22 embriones humanos en el estadio de compactación de 8 células que se desarrollaron hasta el estadio de blastocisto. Los aminoácidos que fueron consumidos o producidos de forma significativa están marcados con un asterisco.

la figura 3 es una superposición de los datos de las figuras 1 y 2 y compara el consumo o la producción de aminoácidos (pmol/embrión/h) para embriones humanos que detuvieron su desarrollo en el estadio de 8 células (barras sombreadas) y embriones que se desarrollaron hasta el estadio de blastocisto (barras no sombreadas). Se usaron pruebas de la T para comparar los datos de consumo o producción de cada aminoácido de cada grupo de embriones detenidos o en desarrollo. Se consideró significativo un valor de p menor de 0,05. Los datos de los aminoácidos marcados con los superíndices a, b, c o d 8alanina, asparagina, glicina y lisina, respectivamente) son significativamente diferentes para los dos conjuntos de pruebas.

la figura 4 es una superposición de datos para comparar el consumo o producción de aminoácidos (pmol/embrión/h) para embriones humanos del día 2 al día 3 después de la fecundación que detuvieron su desarrollo en el estadio de 8 células (barras sombreadas) y embriones humanos desde el día 2 al día 3 después de la fecundación que se desarrollaron hasta el estadio de blastocisto (barras no sombreadas).

la figura 5 muestra la suma de la utilización de cinco aminoácidos en embriones humanos en desarrollo y detenidos desde el día 2 al día 3 después de la fecundación.

la figura 6 es una superposición de datos para comparar el consumo o producción de aminoácidos (pmol/embrión/h) de embriones ICSI que dieron como resultado un embarazo (barras no sombreadas) y que no dieron como resultado un embarazo (barras sombreadas) desde el día 1 al día 2 de desarrollo.

la figura 7 muestra la suma de la aparición de Gly, Ala y Trp para embriones ICSI que dieron y no dieron como resultado un embarazo, desde el día 1 al día 2 de desarrollo.

En experimentos iniciales, embriones humanos de reserva fecundados in vitro se colocaron individualmente en gotas de 4 \mul de medio de cultivo hasta que alcanzaron el estadio de blastocisto. Se cultivaron embriones individualmente para simular las condiciones que encontraría un embrión que se desarrollase in vivo. El medio de cultivo comprendía gotas de 4 \mul de EBSS suplementado con glucosa 1 mM, L-lactato 5 mM, piruvato 0,47 mM y una mezcla fisiológica de 20 aminoácidos. Las concentraciones individuales de los aminoácidos estaban en el intervalo de 0,005 mM a 1,0 mM.

Durante la incubación, se midió simultáneamente la concentración de 18 aminoácidos en el medio gastado usando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) después de derivatización con o-ftaldialdehído. Los resultados se usaron para recopilar los perfiles de consumo y producción de aminoácidos como se ilustra en las figuras 1 a 3.

Para conseguir una dilución precisa de las muestras de microlitros para su uso en la HPLC, se introdujo un patrón interno en el medio en forma del aminoácido no metabolizable, ácido D-alfa-aminobutírico, a una concentración de 1 a 49 partes por volumen. Este patrón interno permitió recoger las diferencias de minutos que ocurrían en los embriones en descanso y que se habrían perdido de otra forma en el "ruido de fondo". Se podía distinguir claramente el pico en la HPLC atribuible al marcador y se usó para calcular la dilución correcta.

Como se muestra en la figura 2, los únicos aminoácidos que disminuían en el medio durante el estadio de compactación de 8 células hasta el estadio de mórula fueron serina, arginina, isoleucina y leucina. Se produjeron de forma significativa alanina, aspartato, glutamato y triptófano. La parición de alanina aumentó desde 1,087\pm0,161 pmol/embrión/h para embriones cultivados entre el estadio de compactación de 8 células hasta el estadio de mórula en comparación con 1,390\pm0,123 pmol/embrión/h para embriones cultivados desde el estadio de mórula hasta el de blastocisto.

Los embriones que se detuvieron en el estadio de compactación de 8 células produjeron significativamente más alanina (1,722\pm0,144 pmol/embrión/h, p=0,0028) que los embriones en desarrollo del mismo estadio (figuras 1 a 3). También se produjo glutamato de forma significativa durante la transición desde mórula a blastocisto.

Aunque se sabe que un embrión provocará cambios en la concentración de aminoácidos de un medio de cultivo en el que se incuba, las diferencias significativas en los cambios producidas por embriones sanos y detenidos han pasado previamente desapercibidas. Se debe entender que los resultados de los experimentos con embriones son altamente indicativos de aquellos que serían de esperar de un óvulo, carioplasto, célula madre, precursor de célula madreo embrión credo por transferencia nuclear sujetos a las mismas condiciones de incubación. De acuerdo con esto, el cambio en la concentración de al menos un aminoácido en el medio de cultivo se puede usar para dar una indicación respecto a la viabilidad de un embrión, óvulo, carioplasto, célula madre, precursor de célula madre o embrión creado por transferencia nuclear. Esto representa un avance principal en la selección de embriones u óvulos para su posterior implantación, y la selección de carioplastos, células madre, precursores de células madre o embriones creados por transferencia nuclear para su manipulación genética.

El incremento de la producción de alanina en los embriones detenidos por ejemplo resulta sorprendente y anti-intuitivo. Si se usa la alanina como una vía para secuestrar nitrógeno residual y es formada por el embrión par prevenir la formación de iones amonio tóxicos, se podría esperar que los embriones más sanos fuesen los más activos metabólicamente y produjesen mayores cantidades de alanina en comparación con los embriones detenidos. Sorprendentemente, los resultados demuestran que los embriones más sanos son metabólicamente más "tranquilos" y que los embriones que no se desarrollan metabolizan comparativamente más proteína exportando los grupos amino al medio de cultivo en forma de alanina.

Los resultados indican que el embrión humano antes de su implantación es capaz de usar los aminoácidos de forma selectiva en diferentes estadios de su desarrollo y que la aparición de alanina en el medio puede usarse como un marcador potencial de la viabilidad de un embrión, carioplasto, célula madre, precursor de célula madre o embrión creado por transferencia nuclear.

El procedimiento de la presente invención podría usarse antes de la implantación en la detección sistemática de enfermedades tales como la fenilcetonuria (PKU), la fibrosis quística y otras anomalías genéticas o cromosómicas.

Actualmente, en el Reino Unido se realizan pruebas de fenilcetonuria a todos los bebés pocos días después de su nacimiento midiendo el nivel de fenilalanina en la sangre usando cromatografía o una prueba de crecimiento bacteriano. Es probable que aquellos embriones u óvulos que estén predestinados a tener PKU se caractericen por un perfil de aminoácidos diferente comparado con el producido por un embrión u óvulo sano. De acuerdo con esto, el procedimiento de la presente invención conlleva un enorme potencial para futuros programas de análisis genético colectivo.

El procedimiento de la presente invención puede tener además un inmenso valor en la determinación del sexo de animales domésticos dado que los embriones de diferente sexo pueden estar caracterizados por un cierto perfil de aminoácidos.

Debe entenderse que el procedimiento de la presente invención tiene aplicaciones de amplio alcance y no se limita al uso de un embrión humano, óvulo, carioplasto no humano, célula madre no humana, precursor de célula madre no humano, o embrión no humano creado por transferencia nuclear. Un procedimiento típico en la cría de ganado es la administración de hormonas inductoras de óvulos a una vaca de alto valor genético seguida de la inseminación natural que conduce a la producción de 6 a 8 embriones en el útero del animal. Los embriones se extraen por "lavado" de la vaca y se transfieren individualmente a animales de menor valor para su desarrollo posterior. Debido a los riesgos de un lavado inadecuado, esta técnica no es ética para su uso en seres humanos.

De forma alternativa, se induce hormonalmente la producción de óvulos en una vaca de valor y después de la retirada (recogida de los óvulos), los óvulos se inseminan artificialmente usando esperma de alta calidad y se cultivan hasta el estadio de blastocisto antes de volver a transferirlos a un receptor. También se pueden generar embriones de ganado a partir de ovocitos obtenidos de ovarios de mataderos.

Tales programas de cría de ganado son de interés multinacional y cualquier procedimiento de selección por el que se puedan seleccionar los óvulos o embriones más viables para su transferencia representan un avance industrial principal.

Otros animales a los que podría aplicarse esta tecnología incluyen ovejas, cerdos, todos los animales domésticos y especies raras y amenazadas. La tecnología de clonación usada en la producción de "Dolly" se alcanzó con bajas tasas de éxito, con 276 intentos fallidos anteriores. El programa de "Dolly" implicó también un gasto considerable de esfuerzo de investigación para generar células de oveja apropiadas para producir animales transgénicos.

El procedimiento de la presente invención proporciona ahora un enfoque racional de la selección de la célula más viable para su uso en la posterior transferencia de embrión u óvulo y de la selección de carioplastos, supuestas poblaciones de células madre, poblaciones de precursores de células madre, poblaciones de células madre y embriones creados por transferencia nuclear. Representa un avance principal en técnicas de mejora de animales de granja que implican micro-manipulación, transferencia nuclear y la adición de constructos genéticos.

Debe entenderse que el perfil de aminoácidos de una célula de un organismo particular puede ser altamente particular, diferenciándose en detalles respecto a qué aminoácidos particulares son consumidos y producidos y también qué aminoácidos particulares son consumidos y producidos en células detenidas y en desarrollo cuando se comparan con el perfil generado para una célula de un organismo diferente. Aunque los resultados sugieren que la alanina se puede usar como un marcador potencial de la viabilidad de células humanas, investigaciones adicionales pueden revelar que otros aminoácidos son marcadores más adecuados para otras especies. De hecho, la investigación adicional del embrión humano revela que otros aminoácidos además de la alanina también son adecuados para su uso como un marcador de selección.

El estudio inicial se basó en embriones humanos desde el día 3 al día 4 después de la inseminación. Como se muestra en la figura 3, los embriones detenidos producen lisina y los embriones sanos la consumen. Esto puede tener potencial de selección. De forma similar, los resultados de asparagina y glicina son significativos. Se sospechó que cuando se lleven a cabo más pruebas, las diferencias significativas entre consumo y producción de aminoácidos de embriones detenidos y en desarrollo pueden incrementarse.

Los estudios se ampliaron a embriones humanos desde el día 2 al día 3 después de la inseminación. La evaluación temprana se consideró ventajosa ya que es preferible minimizar todo lo posible la exposición del embrión en desarrollo a condiciones artificiales de cultivo. Los resultados de estos experimentos se ilustran en las figuras 4 y 5.

Los siguientes estudios implicaron la recogida de datos de embarazo. Se analizaron embriones ICSI desde el día 1 al día 2 de desarrollo, antes de la siguiente transferencia a pacientes. La elección de embriones ICSI frente a embriones IVF se debió al hecho de que el cúmulo de un embrión ICSI se ha eliminado, facilitando de esta forma la evaluación. Ahora el objetivo no era tanto la identificación de embriones sanos, antes de la implantación, sino si el embrión se implantaría en el interior de la madre (es decir, un movimiento hacia el lado clínico).

Se incubaron los embriones ICSI en medio de cultivo que comprendía EBSS suplementado con glucosa 1 mM, L-lactato 5 mM, piruvato 0,47 mM y una mezcla fisiológica de 20 aminoácidos. Las concentraciones individuales de los aminoácidos estaban en el intervalo de 0,005 a 1,0 mM.

Los resultados de esta línea de investigación fueron particularmente alentadores y proporcionan una evidencia que corrobora la eficacia del procedimiento de evaluación.

El procedimiento de la presente invención permite la generación de "huellas" de perfiles de aminoácidos que son característicos de una especie particular y que se pueden usar para seleccionar la célula más viable de dicha
especie.

Dado que no se sabe qué embrión culminará su desarrollo, habitualmente se vuelven a transferir dos o tres embriones a la madre después de la inseminación artificial. El procedimiento de la presente invención reduce la probabilidad de embarazo múltiple proporcionando una prueba bioquímica para la selección de un solo embrión. Esto es considerablemente más preciso que los procedimientos de selección morfológicos.

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Referencias

1. Gardner DK y Lane M (1993). Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture. Biology of Reproduction 48, 377-385.

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Claims

1. Un procedimiento para evaluar la viabilidad de una célula en el que dicha célula es un gameto, un embrión, un carioplasto no humano, una supuesta población de células madre no humanas, una población de precursores de células madre no humanas o una población de células madre no humanas, comprendiendo dicho procedimiento incubar la célula en un medio de cultivo que incluye una pluralidad de aminoácidos y determinar el cambio en la concentración en el medio de al menos un aminoácido.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de seleccionar dicha célula para su desarrollo posterior si el cambio cumple un criterio predeterminado.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que la célula es un óvulo y el óvulo se fecunda in vitro.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio de cultivo comprende solución salina equilibrada de Earle suplementada con glucosa, L-lactato, piruvato y una mezcla fisiológica de aminoácidos.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que las concentraciones de glucosa, L-lactato y piruvato oscilan de 0,5 mM a 1,5 mM, 4 mM a 6 mM y 0,37 mM a 0,57 mM respectivamente y las concentraciones de los aminoácidos individuales oscilan desde 0,005 mM a 1,0 mM.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que las concentraciones de glucosa, L-lactato y piruvato son 1 mM, 5 mM y 0,47 mM.

7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de aminoácidos en el medio gastado se mide usando HPLC seguida de derivatización con o-ftaldialdehído.

8. Un procedimiento según la reivindicación 7, en el que se introduce un patrón interno en el medio de muestreo para conseguir una dilución precisa de las muestras de microlitros para su uso en la HPLC.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el patrón interno es ácido D-alfa-aminobutírico.

10. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que se genera un perfil de consumo o producción de aminoácidos.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho perfil de consumo o producción de aminoácidos se usa en su conjunto como un marcador de selección al evaluar la viabilidad de una célula.

12. Un procedimiento según la reivindicación 10 en el que la selección de la célula más viable se basa en un grupo de aminoácidos, que comprende típicamente de dos a siete aminoácidos, cuyo perfil de consumo o producción es indicativo de una célula sana en desarrollo de esa especie.

13. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que la selección de la célula más viable se basa en un único aminoácido, cuyo perfil de consumo o producción es indicativo de una célula sana en desarrollo de esa especie.

14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula se obtiene de cualquier organismo, incluyendo humanos, vacas, cerdos, ovejas, cualquier animal doméstico o una especie rara y amenazada.

15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que el procedimiento se usa para humanos.

16. Un procedimiento según la reivindicación 15, en el que el aminoácido usado para un marcador de selección incluye uno o una combinación de alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina.

17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que el aminoácido usado para un marcador de selección es alanina.