JPH04330295A - マウス−ヒトキメラ抗体 - Google Patents
マウス−ヒトキメラ抗体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、悪性腫瘍に特異的にみ
られる癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと称することもある
）に対する特異的抗体であって、その定常領域部分のア
ミノ酸配列がヒト抗体に由来し、可変領域がマウス抗体
に由来するキメラ抗体に関する。
られる癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと称することもある
）に対する特異的抗体であって、その定常領域部分のア
ミノ酸配列がヒト抗体に由来し、可変領域がマウス抗体
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【０００２】
【従来技術】１９６５年Ｇｏｌｄらにより見いだされた
ＣＥＡ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １２２，４６７（１
９６５））は、現在最も確立した腫瘍マーカーである。 その癌マーカーとしての有用性としては、（１）消化器
癌を中心としていろいろな悪性腫瘍に出現するマーカー
であること、（２）癌の早期診断に役立つもしくは、悪
性疾患か良性疾患かの診断には不可欠なものであること
、（３）外科手術後の患者のモニターリング、ことに根
治手術の成否の判断や再発の早期発見にはなはだ有用で
あること、（１）悲観血的治療法の効果判定に有用であ
ること等が挙げられる（松岡，生化学，６２，３５２，
（１９９０））。
ＣＥＡ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １２２，４６７（１
９６５））は、現在最も確立した腫瘍マーカーである。 その癌マーカーとしての有用性としては、（１）消化器
癌を中心としていろいろな悪性腫瘍に出現するマーカー
であること、（２）癌の早期診断に役立つもしくは、悪
性疾患か良性疾患かの診断には不可欠なものであること
、（３）外科手術後の患者のモニターリング、ことに根
治手術の成否の判断や再発の早期発見にはなはだ有用で
あること、（１）悲観血的治療法の効果判定に有用であ
ること等が挙げられる（松岡，生化学，６２，３５２，
（１９９０））。
【０００３】この（ＣＥＡ）に対する抗体は上述の診断
を可能にするばかりでなく、治療薬としても利用するこ
とが可能である。治療薬としての利用法としては最初は
受動的免疫療法を期待したマウスモノクローナル抗体の
単独投与が行われたが、最近ではモノクローナル抗体の
特異的結合能を利用したいわゆるミサイル療法や、他薬
剤との併用が主流になりつつある（Ｄ．Ｓｃｈｅｉｂｅ
ｒｇ ＄ Ａ． Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｏｎｃｏｌｏｇ
ｙ，１，３１（１９８７））。
を可能にするばかりでなく、治療薬としても利用するこ
とが可能である。治療薬としての利用法としては最初は
受動的免疫療法を期待したマウスモノクローナル抗体の
単独投与が行われたが、最近ではモノクローナル抗体の
特異的結合能を利用したいわゆるミサイル療法や、他薬
剤との併用が主流になりつつある（Ｄ．Ｓｃｈｅｉｂｅ
ｒｇ ＄ Ａ． Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｏｎｃｏｌｏｇ
ｙ，１，３１（１９８７））。
【０００４】
【発明の解決しようとする問題点】上述の目的に使用で
きるＣＥＡに特異的に結合するマウスモノクローナル抗
体は現在までに多数取得されているが、そのアミノ酸配
列、更には塩基配列を決定している例は、ジェネンテッ
ク社の特許出願（特開昭６０−１５５１３２号）がある
程度で、未だ非常に少ない。黒木らは約１５０種類の抗
ＣＥＡ抗体をＣＥＡのどの微小領域に結合するかをしら
べることにより、２５のサブグループに分類した（黒木
ら，Ｊｐｎ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒｒｅｓ．７８，３８６
，（１９８７））。このことは、実際に診断薬あるいは
治療薬としてモノクローナル抗体を使用する場合にはサ
ブグループの違いによりその効果は著しく異なることが
予測される。
きるＣＥＡに特異的に結合するマウスモノクローナル抗
体は現在までに多数取得されているが、そのアミノ酸配
列、更には塩基配列を決定している例は、ジェネンテッ
ク社の特許出願（特開昭６０−１５５１３２号）がある
程度で、未だ非常に少ない。黒木らは約１５０種類の抗
ＣＥＡ抗体をＣＥＡのどの微小領域に結合するかをしら
べることにより、２５のサブグループに分類した（黒木
ら，Ｊｐｎ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒｒｅｓ．７８，３８６
，（１９８７））。このことは、実際に診断薬あるいは
治療薬としてモノクローナル抗体を使用する場合にはサ
ブグループの違いによりその効果は著しく異なることが
予測される。
【０００５】一方、ＣＥＡ治療薬としては、現在主にマ
ウスモノクローナル抗体が使われているが、マウスモノ
クローナル抗体を人体に投与すると、血中での半減期が
ヒト抗体に比べると著しく短く、またマウスモノクロー
ナル抗体は患者にとって外来の異物として認識されるの
で、免疫応答に起因するアナフラトキシーなどの副作用
を引き起こし、連続投与を難しくさせることが明らかに
なった（Ａ． Ｌｏ Ｂｕｇｌｉら，Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．，８
６，４２２０，（１９８９））。
ウスモノクローナル抗体が使われているが、マウスモノ
クローナル抗体を人体に投与すると、血中での半減期が
ヒト抗体に比べると著しく短く、またマウスモノクロー
ナル抗体は患者にとって外来の異物として認識されるの
で、免疫応答に起因するアナフラトキシーなどの副作用
を引き起こし、連続投与を難しくさせることが明らかに
なった（Ａ． Ｌｏ Ｂｕｇｌｉら，Ｐｒｏｃ． Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．，８
６，４２２０，（１９８９））。
【０００６】Ｍ． Ｓ． Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ らはマ
ウス抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置き換えた
マウス−ヒトキメラ抗体を作製することによってこの問
題を解決しようと試みている （Ｍ． Ｓ． Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ， ３１４，２６８，（１
９８５））。彼らは可変領域のゲノムＤＮＡと定常領域
のゲノムＤＮＡをイントロンをはさんだ状態で連結する
ことによってキメラ化を行っている。
ウス抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置き換えた
マウス−ヒトキメラ抗体を作製することによってこの問
題を解決しようと試みている （Ｍ． Ｓ． Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ， ３１４，２６８，（１
９８５））。彼らは可変領域のゲノムＤＮＡと定常領域
のゲノムＤＮＡをイントロンをはさんだ状態で連結する
ことによってキメラ化を行っている。
【０００７】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上記特
開昭６０−１５５１３２号公報記載の抗ＣＥＡマウスモ
ノクローナル抗体とはＨ鎖で１２０アミノ酸中２４アミ
ノ酸が、Ｌ鎖で１０９アミノ酸中２０アミノ酸が異なる
新規な抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体をコードする
ｃＤＮＡを取得し、該抗体の可変領域をコードするｃＤ
ＮＡとヒト抗体の定常領域のｃＤＮＡとを、イントロン
を介さずに直接連結することによってキメラ化を行い、
ｃＤＮＡに特異的に結合する新規なマウス−ヒトキメラ
抗体を作製することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
開昭６０−１５５１３２号公報記載の抗ＣＥＡマウスモ
ノクローナル抗体とはＨ鎖で１２０アミノ酸中２４アミ
ノ酸が、Ｌ鎖で１０９アミノ酸中２０アミノ酸が異なる
新規な抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体をコードする
ｃＤＮＡを取得し、該抗体の可変領域をコードするｃＤ
ＮＡとヒト抗体の定常領域のｃＤＮＡとを、イントロン
を介さずに直接連結することによってキメラ化を行い、
ｃＤＮＡに特異的に結合する新規なマウス−ヒトキメラ
抗体を作製することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００８】即ち、本発明の要旨はヒト癌胎児性抗原に
特異的に結合するマウス抗体の可変領域とヒト抗体の定
常領域とを結合して成るマウス−ヒトキメラ抗体であっ
て、該ヒト癌胎児性抗原に特異的に結合するマウス抗体
の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が夫々、配列番号：１
の第１番〜第１２０番及び配列番号：２の第１番〜第１
０９番で表わされるアミノ酸配列を有することを特徴と
するマウス−ヒトキメラ抗体に存する。
特異的に結合するマウス抗体の可変領域とヒト抗体の定
常領域とを結合して成るマウス−ヒトキメラ抗体であっ
て、該ヒト癌胎児性抗原に特異的に結合するマウス抗体
の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が夫々、配列番号：１
の第１番〜第１２０番及び配列番号：２の第１番〜第１
０９番で表わされるアミノ酸配列を有することを特徴と
するマウス−ヒトキメラ抗体に存する。
【０００９】以下、本発明を説明するに、本発明のＤＮ
Ａ断片は、まず、抗ＣＥＡ特異抗体生産株（ミエローマ
細胞及び脾細胞より得られるハイブリドーマ）を得、該
生産株からチオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法（
ｃａｓａｒａ ら， ＤＮＡ，２，３２９（１９８３）
）に記載の方法でｍＲＮＡを調製して、アマーシャム社
製のｃＤＮＡ合成システムキット等によりそのｃＤＮＡ
ライブラリーを作製する。次いで、該ライブラリーから
マウス抗体重（Ｈ）鎖定常領域及び軽（Ｌ）鎖定常領域
の塩基配列部分をプローブとして常法に従いハイブリダ
イゼーションを行い、ｃＤＮＡをクローニングできる。 該ｃＤＮＡが抗ＣＥＡ特異抗体のｃＤＮＡであることの
確認は、別に上記ハイブリドーマが生産する抗体を常法
に従い分離精製し、常法に従いＮ末端アミノ酸配列を決
定し、その結果との一致により行った。こうして得られ
たＤＮＡ断片とヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡ
とをアミノ酸置換とフレームシフトがおきないように正
確に連結することによりキメラ化マウス抗ＣＥＡ抗体Ｄ
ＮＡが得られる。
Ａ断片は、まず、抗ＣＥＡ特異抗体生産株（ミエローマ
細胞及び脾細胞より得られるハイブリドーマ）を得、該
生産株からチオシアン酸グアニジン−塩化リチウム法（
ｃａｓａｒａ ら， ＤＮＡ，２，３２９（１９８３）
）に記載の方法でｍＲＮＡを調製して、アマーシャム社
製のｃＤＮＡ合成システムキット等によりそのｃＤＮＡ
ライブラリーを作製する。次いで、該ライブラリーから
マウス抗体重（Ｈ）鎖定常領域及び軽（Ｌ）鎖定常領域
の塩基配列部分をプローブとして常法に従いハイブリダ
イゼーションを行い、ｃＤＮＡをクローニングできる。 該ｃＤＮＡが抗ＣＥＡ特異抗体のｃＤＮＡであることの
確認は、別に上記ハイブリドーマが生産する抗体を常法
に従い分離精製し、常法に従いＮ末端アミノ酸配列を決
定し、その結果との一致により行った。こうして得られ
たＤＮＡ断片とヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡ
とをアミノ酸置換とフレームシフトがおきないように正
確に連結することによりキメラ化マウス抗ＣＥＡ抗体Ｄ
ＮＡが得られる。
【００１０】上記の様にして作製されたキメラ抗体をコ
ードする遺伝子を公知の種々の発現ベクターに導入して
適当な宿主中で発現させることにより本発明のマウス−
ヒトキメラ抗体が得られる。
ードする遺伝子を公知の種々の発現ベクターに導入して
適当な宿主中で発現させることにより本発明のマウス−
ヒトキメラ抗体が得られる。
【００１１】
１）培地
ＲＰＭＩ１６４０培地に、リラシリン１００μｍ／ｍｌ
、ストレプトマイシン１００μｍ／ｍｌ、グルタミン２
ｍＭ、炭酸水素ナトリウム１．６ｇ／ｍｌを加えた後、
二酸化炭素を吹き込みｐＨ７．２前後として牛胎児血清
（ＦＣＳ）を１０％となるように加えて使用した。
、ストレプトマイシン１００μｍ／ｍｌ、グルタミン２
ｍＭ、炭酸水素ナトリウム１．６ｇ／ｍｌを加えた後、
二酸化炭素を吹き込みｐＨ７．２前後として牛胎児血清
（ＦＣＳ）を１０％となるように加えて使用した。
【００１２】２）ミエローマ細胞
Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の骨髄細胞ＭＯ−ＰＣ−２１の
株化細胞δアザグアニン耐性のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ−δ
Ｕ／（Ｐ３ＵＩ）を用いた。
株化細胞δアザグアニン耐性のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ−δ
Ｕ／（Ｐ３ＵＩ）を用いた。
【００１３】３）抗原感作
ヒトＣＥＡ（三菱化成社製）をフロイント完全アジュバ
ンドと混合した抗原をＢａｌｂ／ｃマウスに１匹当り０
．２５ｍｇ／０．５ｍｌずつ腹腔に接種し、一次感作し
た。５週間後、更に抗原を０．５ｍｇ／０．５ｍｌずつ
腹腔または、０．３ｍｇ／０．３ｍｌずつ尾静脈に接種
二次感作した。その４日後の脾臓細胞を上記ミエローマ
細胞株と下記４）の様にして細胞融合させた。
ンドと混合した抗原をＢａｌｂ／ｃマウスに１匹当り０
．２５ｍｇ／０．５ｍｌずつ腹腔に接種し、一次感作し
た。５週間後、更に抗原を０．５ｍｇ／０．５ｍｌずつ
腹腔または、０．３ｍｇ／０．３ｍｌずつ尾静脈に接種
二次感作した。その４日後の脾臓細胞を上記ミエローマ
細胞株と下記４）の様にして細胞融合させた。
【００１４】４）細胞融合法
ミエローマ細胞、脾臓細胞共に食塩燐酸緩衝液（１０ｍ
Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．５、０．９％食塩、ＰＢＳ）で３
回洗浄後、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に浮遊さ
せ、細胞数を算定した。１×１０６ 個のＰ３Ｕ１に対
して７．５〜１０×１０８ 個の脾細胞を２〜３時間培
養した。次にＲＰＭＩ１６４０で遠心洗浄し、ＦＣＳを
除きガラススピッツ遠心管に細胞を集める。上清を完全
に取り去った後、ペレット上の細胞をほぐし、予め３７
℃に温めておいた４２．５％ポリエチレングリコール塩
（ＰＥＧ）を０．５ｍｌ加え、室温で１分間反応させた
後、３７℃のＲＰＭＩ１６４０、１ｍｌを３０秒毎に１
０回加えた。その間、試験管をゆっくり回転し続ける。 この様に、細胞融合させた細胞を遠心洗浄し、Ｐ３Ｕ１
細胞数が、５〜１０×１０５ 個／ｍｌになるようにＲ
ＰＭＩ１６４０，１０％ＦＣＳを加える。その０．２ｍ
ｌをマイクロタイタープレートに分注した。２４時間培
養して上清を半量捨てＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノ
プテリン及びチミヂンを含有）培地を加える。以後のこ
の操作を４８時間毎に２週間繰り返す。ミエローマ細胞
及び脾細胞は共にＨＡＴ培地中では増殖できないので、
増殖してくる細胞は、ハイブリドーマと考えられる。従
って、１０〜１４日後増殖してきたハイブリドーマの存
在の認められる培養液について抗体活性を調べる。
Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７．５、０．９％食塩、ＰＢＳ）で３
回洗浄後、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０に浮遊さ
せ、細胞数を算定した。１×１０６ 個のＰ３Ｕ１に対
して７．５〜１０×１０８ 個の脾細胞を２〜３時間培
養した。次にＲＰＭＩ１６４０で遠心洗浄し、ＦＣＳを
除きガラススピッツ遠心管に細胞を集める。上清を完全
に取り去った後、ペレット上の細胞をほぐし、予め３７
℃に温めておいた４２．５％ポリエチレングリコール塩
（ＰＥＧ）を０．５ｍｌ加え、室温で１分間反応させた
後、３７℃のＲＰＭＩ１６４０、１ｍｌを３０秒毎に１
０回加えた。その間、試験管をゆっくり回転し続ける。 この様に、細胞融合させた細胞を遠心洗浄し、Ｐ３Ｕ１
細胞数が、５〜１０×１０５ 個／ｍｌになるようにＲ
ＰＭＩ１６４０，１０％ＦＣＳを加える。その０．２ｍ
ｌをマイクロタイタープレートに分注した。２４時間培
養して上清を半量捨てＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノ
プテリン及びチミヂンを含有）培地を加える。以後のこ
の操作を４８時間毎に２週間繰り返す。ミエローマ細胞
及び脾細胞は共にＨＡＴ培地中では増殖できないので、
増殖してくる細胞は、ハイブリドーマと考えられる。従
って、１０〜１４日後増殖してきたハイブリドーマの存
在の認められる培養液について抗体活性を調べる。
【００１５】５）抗体活性のスクリーニング抗体活性の
スクリーニングは次に示すようなエンザイムイムノアッ
セイにより行った。■ ＰＢＳに溶解した抗原（１ｍ
ｇ／ｍｌ）を５０μｌマイクロタイタープレート（９６
穴、Ｆａｌｃｏｎ３１２９）に吸着させた。（４℃、一
晩）■ 抗原溶液を除き、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２
０を含んだＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により４回洗浄した後、
５％牛アルブミン（ＢＳＡ）を含んだＰＢＳを１００μ
ｌ加え３７℃１時間放置した。
スクリーニングは次に示すようなエンザイムイムノアッ
セイにより行った。■ ＰＢＳに溶解した抗原（１ｍ
ｇ／ｍｌ）を５０μｌマイクロタイタープレート（９６
穴、Ｆａｌｃｏｎ３１２９）に吸着させた。（４℃、一
晩）■ 抗原溶液を除き、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２
０を含んだＰＢＳ（ＰＢＳＴ）により４回洗浄した後、
５％牛アルブミン（ＢＳＡ）を含んだＰＢＳを１００μ
ｌ加え３７℃１時間放置した。
【００１６】■ ＢＳＡ溶液を除いた後、ＰＢＳＴよ
り４回洗浄する。次に、ハイブリドーマの培養上清を５
０μｌ加え、二時間反応させた。
り４回洗浄する。次に、ハイブリドーマの培養上清を５
０μｌ加え、二時間反応させた。
【００１７】■ ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗マウス１ｇＧ抗体を５０μｌ加え、３７℃、
２時間反応させた。
ＳＡを含むＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダ
ーゼ結合抗マウス１ｇＧ抗体を５０μｌ加え、３７℃、
２時間反応させた。
【００１８】■ ＰＢＳＴにより４回洗浄した後、０
．５Ｍクエン酸１．２２ｍｌ，０．５Ｍ燐酸二ナトリウ
ム２．５６ｍｌ，オルトフェニレンジアミン１０ｍｇ，
３０％過酸化水素水１０μｌ／２５ｍｌを５０μｌ加え
発色させた。十分発色した後、２Ｍ硫酸を５０μｌ加え
発色を停止させる。
．５Ｍクエン酸１．２２ｍｌ，０．５Ｍ燐酸二ナトリウ
ム２．５６ｍｌ，オルトフェニレンジアミン１０ｍｇ，
３０％過酸化水素水１０μｌ／２５ｍｌを５０μｌ加え
発色させた。十分発色した後、２Ｍ硫酸を５０μｌ加え
発色を停止させる。
【００１９】■ 発色は、イムノリーダーにより光学
的に測定した。■ 抗原に特異的な抗体を生産してい
る細胞のうち、特に結合能力の強い抗体を生産している
株一株を分離しクローニング操作を重ねた上でその抗体
ｃＤＮＡを取るハイブリドーマ細胞として保存した。
的に測定した。■ 抗原に特異的な抗体を生産してい
る細胞のうち、特に結合能力の強い抗体を生産している
株一株を分離しクローニング操作を重ねた上でその抗体
ｃＤＮＡを取るハイブリドーマ細胞として保存した。
【００２０】〔抗ＣＥＡ抗体遺伝子の取得〕１）ｍＲＮ
Ａの調製 該ハイブリドーマ細胞約１０９ 個の細胞よりチオシア
ン酸グアニジン−塩化リチウム法（Ｃａｓａｒａら、Ｄ
ＮＡ，２，３２９（１９８３））に従いポリＡを有する
ＲＮＡを下記のごとく調製した。
Ａの調製 該ハイブリドーマ細胞約１０９ 個の細胞よりチオシア
ン酸グアニジン−塩化リチウム法（Ｃａｓａｒａら、Ｄ
ＮＡ，２，３２９（１９８３））に従いポリＡを有する
ＲＮＡを下記のごとく調製した。
【００２１】該ハイブリドーマ細胞約１０９ 個の細胞
を直ちに液体窒素により凍結した。これを液体窒素と共
に、ワーリングブレンダーに入れ３，０００ｒｐｍ ２
分間にて粉砕した。これに５Ｍチオシアン酸グアニジン
、１０ｍＭＥＤＴＡ，５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７）及
び８％β−メルカプトエタノールからなる溶液１００ｍ
ｌ中でホモゲナイザー（５ｒｐｍ）にて更に破砕し、可
溶化した。この可溶化物２０ｍｌを遠心管中の５．７Ｍ
ＣｓＣｌ溶液１０ｍｌ上に静かに乗せ、日立ＲＰＳ２８
−２ローターにて２７，０００ｒｐｍ ，２０時間遠心
後ＲＮＡを沈澱として回収した。このＲＮＡの沈澱を０
．１％ラウリル硫酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）からなる溶液１０ｍＭに
溶解しフェノールクロロホルムで注出後、エタノール沈
澱により回収した。得られたＲＮＡ約３．９５ｍｇを１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭＥＤＴＡか
らなる溶液１ｍｌに溶かした。６５℃、５分間保温し０
．１ｍｌの５Ｍ食塩を加えた。混合物をオリゴｄＴセル
ロースカラム（ＰＬバイオケミカル社）クロマトグラフ
ィー（カラム体積０．５１ｍｌ）にかけた。吸着したポ
リＡＲＮＡを１ｍＭＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス塩酸（
ｐＨ７．５）からなる溶液で溶出し、ポリＡを有するｍ
ＲＮＡ約１００μｇを得た。
を直ちに液体窒素により凍結した。これを液体窒素と共
に、ワーリングブレンダーに入れ３，０００ｒｐｍ ２
分間にて粉砕した。これに５Ｍチオシアン酸グアニジン
、１０ｍＭＥＤＴＡ，５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７）及
び８％β−メルカプトエタノールからなる溶液１００ｍ
ｌ中でホモゲナイザー（５ｒｐｍ）にて更に破砕し、可
溶化した。この可溶化物２０ｍｌを遠心管中の５．７Ｍ
ＣｓＣｌ溶液１０ｍｌ上に静かに乗せ、日立ＲＰＳ２８
−２ローターにて２７，０００ｒｐｍ ，２０時間遠心
後ＲＮＡを沈澱として回収した。このＲＮＡの沈澱を０
．１％ラウリル硫酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）からなる溶液１０ｍＭに
溶解しフェノールクロロホルムで注出後、エタノール沈
澱により回収した。得られたＲＮＡ約３．９５ｍｇを１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）及び１ｍＭＥＤＴＡか
らなる溶液１ｍｌに溶かした。６５℃、５分間保温し０
．１ｍｌの５Ｍ食塩を加えた。混合物をオリゴｄＴセル
ロースカラム（ＰＬバイオケミカル社）クロマトグラフ
ィー（カラム体積０．５１ｍｌ）にかけた。吸着したポ
リＡＲＮＡを１ｍＭＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス塩酸（
ｐＨ７．５）からなる溶液で溶出し、ポリＡを有するｍ
ＲＮＡ約１００μｇを得た。
【００２２】２）相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成上記
のごとく分離精製したポリＡｍＲＮＡを用いアマーシャ
ム社製のｃＤＮＡ合成システムキットを用い、その説明
書に従いｃＤＮＡを合成した。 ３）ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記のごとく合成したｃＤＮＡを用い、アマーシャム社
製のｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔ１０キットを
使用し、その説明書に従いｃＤＮＡライブラリーを作製
した。
のごとく分離精製したポリＡｍＲＮＡを用いアマーシャ
ム社製のｃＤＮＡ合成システムキットを用い、その説明
書に従いｃＤＮＡを合成した。 ３）ｃＤＮＡライブラリーの作製 上記のごとく合成したｃＤＮＡを用い、アマーシャム社
製のｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔ１０キットを
使用し、その説明書に従いｃＤＮＡライブラリーを作製
した。
【００２３】４）プラークハイブリダイゼーション上記
のごとく作製したλファージよりなるｃＤＮＡライブラ
リーを１５ｃｍのシャーレにＬＢ軟寒天培地〔１％バク
トトリプトン、５％イーストイクストラクト、０．５％
塩化ナトリウム、及び０．７％寒天沫〕と共に、１６枚
のシャーレにおよそ２４万のクローンをまき、一晩培養
した後、培地中のλファージクローンをナイロン膜であ
るジーンスクリーニングプラス（デュポン社）上に移し
取った。一枚のシャーレあたりナイロン膜２枚の割合で
移し取り、その様にしてできたナイロン膜を０．５Ｍ水
酸化ナトリウムが浸み込んだろ紙上に２分間静置し別に
用意した乾いたろ紙上で水分を除いた後、同じ操作を再
び繰り返した。次に、同様に１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７
．５）を浸み込ませたろ紙上でこのナイロン膜を静置し
乾いたろ紙上で風乾した後、同じ操作を再び繰り返した
。 こうして処理したナイロン膜は、次にナイロン膜１枚当
り５ｍｌのプレハイブリダイゼーション液〔１Ｍ塩化ナ
トリウム、１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＭＡ
〕に６５℃１時間浸した。次に既にその遺伝子が取得さ
れているマウス抗体Ｈ鎖遺伝子定常領域塩基配列（５’
ＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴ３’、アプライドバ
イオシステム３８０ＡＤＮＡ合成機により常法に従い合
成）、Ｌ鎖遺伝子定常領域塩基配列（５’ＴＧＧＡＴＧ
ＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧ３’ 、アマーシャム社より購
入）から常法に従い作製した３２Ｐ標識プローブを含む
ハイブリダイゼーション液〔１Ｍ塩化ナトリウム、１％
ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、１０％硫酸デ
キストラン、１０ｎｇ／ｍｌ３２Ｐ標識プローブＤＮＡ
〕中で５５℃で１８時間保温した。その後、ナイロン膜
を取り出し、０．１％のＳＤＳを含んだ２倍の濃度のＳ
ＳＣ溶液〔２０倍の濃度のＳＳＣ溶液；３Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム〕中で室温で３０分
間２回洗い、０．１％のＳＤＳを含んだ０．１倍の濃度
のＳＳＣ溶液で４２℃３０分間２回洗った後、オートラ
ジオグラフィーを行った。２枚１組のナイロン膜のオー
トラジオグラム上のシグナルが一致したものはＨ鎖の場
合１８個ありＬ鎖の場合１０個であった。そのうちＨ鎖
４個、Ｌ鎖６個は同じ制限酵素による切断のパターンが
同一のｃＤＮＡを含んでいた。
のごとく作製したλファージよりなるｃＤＮＡライブラ
リーを１５ｃｍのシャーレにＬＢ軟寒天培地〔１％バク
トトリプトン、５％イーストイクストラクト、０．５％
塩化ナトリウム、及び０．７％寒天沫〕と共に、１６枚
のシャーレにおよそ２４万のクローンをまき、一晩培養
した後、培地中のλファージクローンをナイロン膜であ
るジーンスクリーニングプラス（デュポン社）上に移し
取った。一枚のシャーレあたりナイロン膜２枚の割合で
移し取り、その様にしてできたナイロン膜を０．５Ｍ水
酸化ナトリウムが浸み込んだろ紙上に２分間静置し別に
用意した乾いたろ紙上で水分を除いた後、同じ操作を再
び繰り返した。次に、同様に１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７
．５）を浸み込ませたろ紙上でこのナイロン膜を静置し
乾いたろ紙上で風乾した後、同じ操作を再び繰り返した
。 こうして処理したナイロン膜は、次にナイロン膜１枚当
り５ｍｌのプレハイブリダイゼーション液〔１Ｍ塩化ナ
トリウム、１％ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＭＡ
〕に６５℃１時間浸した。次に既にその遺伝子が取得さ
れているマウス抗体Ｈ鎖遺伝子定常領域塩基配列（５’
ＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴ３’、アプライドバ
イオシステム３８０ＡＤＮＡ合成機により常法に従い合
成）、Ｌ鎖遺伝子定常領域塩基配列（５’ＴＧＧＡＴＧ
ＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧ３’ 、アマーシャム社より購
入）から常法に従い作製した３２Ｐ標識プローブを含む
ハイブリダイゼーション液〔１Ｍ塩化ナトリウム、１％
ＳＤＳ、２５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡ、１０％硫酸デ
キストラン、１０ｎｇ／ｍｌ３２Ｐ標識プローブＤＮＡ
〕中で５５℃で１８時間保温した。その後、ナイロン膜
を取り出し、０．１％のＳＤＳを含んだ２倍の濃度のＳ
ＳＣ溶液〔２０倍の濃度のＳＳＣ溶液；３Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム〕中で室温で３０分
間２回洗い、０．１％のＳＤＳを含んだ０．１倍の濃度
のＳＳＣ溶液で４２℃３０分間２回洗った後、オートラ
ジオグラフィーを行った。２枚１組のナイロン膜のオー
トラジオグラム上のシグナルが一致したものはＨ鎖の場
合１８個ありＬ鎖の場合１０個であった。そのうちＨ鎖
４個、Ｌ鎖６個は同じ制限酵素による切断のパターンが
同一のｃＤＮＡを含んでいた。
【００２４】これらの中からＨ鎖、Ｌ鎖とも一つずつク
ローンを選びｃＤＮＡの塩基配列の決定をＳａｎｇｅｒ
らのジデオキシ法によって行った。求める抗体のｃＤＮ
Ａであることの確認は、別にこのハイブリドーマ細胞の
生産する抗体を常法に従い分離精製し、常法に従いＮ末
端アミノ酸配列を決定し、その結果との一致により行っ
た。
ローンを選びｃＤＮＡの塩基配列の決定をＳａｎｇｅｒ
らのジデオキシ法によって行った。求める抗体のｃＤＮ
Ａであることの確認は、別にこのハイブリドーマ細胞の
生産する抗体を常法に従い分離精製し、常法に従いＮ末
端アミノ酸配列を決定し、その結果との一致により行っ
た。
【００２５】決定した塩基配列から予想される重鎖及び
軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を夫々、配列番号：１の
第１番〜第１２０番及び配列番号：２の第１番〜第１０
９番で示す。尚、配列番号：１の第−１番〜第−１９番
及び配列番号：２の第−１番〜第−２０番はシグナル配
列を示す。また過去にジェネンテック社から報告されて
いる抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列
との違いを図１及び図２に示す。図１では、配列番号１
で表される重鎖可変領域アミノ酸の全配列を上段に示し
、下段にはジェネンテック社から報告されている抗ＣＥ
Ａマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列のうち配列
番号１で表されるアミノ酸配列とは一致しないアミノ酸
残基のみを示した。図２では、軽鎖可変領域アミノ酸配
列について同様の形式で示した。
軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を夫々、配列番号：１の
第１番〜第１２０番及び配列番号：２の第１番〜第１０
９番で示す。尚、配列番号：１の第−１番〜第−１９番
及び配列番号：２の第−１番〜第−２０番はシグナル配
列を示す。また過去にジェネンテック社から報告されて
いる抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列
との違いを図１及び図２に示す。図１では、配列番号１
で表される重鎖可変領域アミノ酸の全配列を上段に示し
、下段にはジェネンテック社から報告されている抗ＣＥ
Ａマウスモノクローナル抗体のアミノ酸配列のうち配列
番号１で表されるアミノ酸配列とは一致しないアミノ酸
残基のみを示した。図２では、軽鎖可変領域アミノ酸配
列について同様の形式で示した。
【００２６】本発明に於て我々が取得した抗ＣＥＡマウ
スモノクローナル抗体の塩基配列は、ジェネンテック社
が報告した抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体とはＨ鎖
で１２０アミノ酸中２４アミノ酸が、Ｌ鎖で１０９アミ
ノ酸中２０アミノ酸が異なっており、ＣＥＡに特異的に
結合する新規のマウスモノクローナル抗体をコードする
ｃＤＮＡを取得したことが分る。
スモノクローナル抗体の塩基配列は、ジェネンテック社
が報告した抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体とはＨ鎖
で１２０アミノ酸中２４アミノ酸が、Ｌ鎖で１０９アミ
ノ酸中２０アミノ酸が異なっており、ＣＥＡに特異的に
結合する新規のマウスモノクローナル抗体をコードする
ｃＤＮＡを取得したことが分る。
【００２７】このアミノ酸配列及び塩基配列が明らかに
されたＤＮＡ断片は、上述の様な方法を繰返すことなく
、ＤＮＡ合成機により再現性良く取得することができる
。
されたＤＮＡ断片は、上述の様な方法を繰返すことなく
、ＤＮＡ合成機により再現性良く取得することができる
。
【００２８】〔マウス抗体遺伝子のキメラ化〕上記の様
にして得られる抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の可
変（Ｖ）領域の遺伝子と、プラスミドｐＳＶ２ Ｈｇｐ
ｔ−ＨｕＧ と ｐＳＶ１８４ Δ Ｈｎｅｏ−Ｈｕκ
（Ｖ． Ｔ． Ｏｉ ＆Ｓ． Ｌ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，２１４，（１９
８６））（ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメ
トリー・システム社から入手可能）のヒトＩｇＧ１ の
定常（Ｃ）領域またはヒトκのＣ領域の遺伝子とを、ア
ミノ酸置換とフレームシフトがおきないように正確に連
結することによってマウス抗ＣＥＡ抗体のキメラ化を行
うことができる。
にして得られる抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体の可
変（Ｖ）領域の遺伝子と、プラスミドｐＳＶ２ Ｈｇｐ
ｔ−ＨｕＧ と ｐＳＶ１８４ Δ Ｈｎｅｏ−Ｈｕκ
（Ｖ． Ｔ． Ｏｉ ＆Ｓ． Ｌ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，２１４，（１９
８６））（ベクトン・ディッキンソン・イムノサイトメ
トリー・システム社から入手可能）のヒトＩｇＧ１ の
定常（Ｃ）領域またはヒトκのＣ領域の遺伝子とを、ア
ミノ酸置換とフレームシフトがおきないように正確に連
結することによってマウス抗ＣＥＡ抗体のキメラ化を行
うことができる。
【００２９】具体的には、例えば、マウス可変領域の３
’末端塩基配列とヒト定常領域の５’末端塩基配列から
なる図３および図４で示した合成リンカーを使ってマウ
ス可変領域の３’末端とヒト定常領域の５’末端を連結
する。そのためには、それぞれの末端塩基配列中に全塩
基配列を通じて１箇所しか存在しないような制限酵素認
識部位が必要である。そこでＤＮＡ配列上に部位特異的
変異を導入することによって新たに上記の目的にかなう
制限酵素認識部位を作り出す。部位特異的変異の導入に
はアマーシャム社のｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍを使用して行うことができ
る。
’末端塩基配列とヒト定常領域の５’末端塩基配列から
なる図３および図４で示した合成リンカーを使ってマウ
ス可変領域の３’末端とヒト定常領域の５’末端を連結
する。そのためには、それぞれの末端塩基配列中に全塩
基配列を通じて１箇所しか存在しないような制限酵素認
識部位が必要である。そこでＤＮＡ配列上に部位特異的
変異を導入することによって新たに上記の目的にかなう
制限酵素認識部位を作り出す。部位特異的変異の導入に
はアマーシャム社のｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍを使用して行うことができ
る。
【００３０】即ち、図３に示したように、マウスＨ鎖の
ｃＤＮＡのＶ領域の３’末端付近にＡ→Ｇへの１塩基置
換をおこない、Ｂｓｔ ＥＩＩ切断部位（ Ｇ↓ＧＴ
ＮＡＣＣ） を導入した。このＢｓｔ ＥＩＩ部位と
、ヒトＨ鎖のＣ領域の５’末端付近にもとから存在する
Ａｐａ Ｉ部位（ ＧＧＧＣＣ↓Ｃ）を合成リンカー
をはさんで連結することによってキメラＨ鎖を得ること
ができる。
ｃＤＮＡのＶ領域の３’末端付近にＡ→Ｇへの１塩基置
換をおこない、Ｂｓｔ ＥＩＩ切断部位（ Ｇ↓ＧＴ
ＮＡＣＣ） を導入した。このＢｓｔ ＥＩＩ部位と
、ヒトＨ鎖のＣ領域の５’末端付近にもとから存在する
Ａｐａ Ｉ部位（ ＧＧＧＣＣ↓Ｃ）を合成リンカー
をはさんで連結することによってキメラＨ鎖を得ること
ができる。
【００３１】また、Ｌ鎖は、図４に示したように、マウ
スＬ鎖のｃＤＮＡのＶ領域の３’末端付近にＧ→Ｔの１
塩基置換を行うことにより生じたＨｉｎ ｄ ＩＩＩ部
位（ Ａ↓ＡＧＣＴＴ）と、ヒトＬ鎖のＣ領域の５’末
端付近にＴ→Ｇ、Ａ→Ｇの２塩基置換を行うことにより
生じたＢｂｅ Ｉ部位（ ＧＧＣＧＣ↓Ｃ ） を合
成リンカーで連結することによってキメラ化することが
できる。いずれの塩基置換も、アミノ酸に対応するコド
ンの３文字目でありアミノ酸配列には影響を与えない。
スＬ鎖のｃＤＮＡのＶ領域の３’末端付近にＧ→Ｔの１
塩基置換を行うことにより生じたＨｉｎ ｄ ＩＩＩ部
位（ Ａ↓ＡＧＣＴＴ）と、ヒトＬ鎖のＣ領域の５’末
端付近にＴ→Ｇ、Ａ→Ｇの２塩基置換を行うことにより
生じたＢｂｅ Ｉ部位（ ＧＧＣＧＣ↓Ｃ ） を合
成リンカーで連結することによってキメラ化することが
できる。いずれの塩基置換も、アミノ酸に対応するコド
ンの３文字目でありアミノ酸配列には影響を与えない。
【００３２】本発明においては、ＤＮＡのシークエンス
により、キメラ抗体をコードする遺伝子の連結が正確に
行われていることを確認した。
により、キメラ抗体をコードする遺伝子の連結が正確に
行われていることを確認した。
【００３３】〔発現ベクターの構築〕上記の様にして作
製されたキメラ抗体をコードする遺伝子を公知の種々の
発現ベクターに導入して発現させることにより、本発明
のキメラ抗体を得ることができる。例えば、動物細胞に
おける発現ベクターとして、図５および６に示した手順
でｐＫＣＲＨ２（三品ら，Ｎａｔｕｒｅ， ３０７，６
０５，（１９８４））からｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨとｐＫ
ＣＲＤ を構築することができる。
製されたキメラ抗体をコードする遺伝子を公知の種々の
発現ベクターに導入して発現させることにより、本発明
のキメラ抗体を得ることができる。例えば、動物細胞に
おける発現ベクターとして、図５および６に示した手順
でｐＫＣＲＨ２（三品ら，Ｎａｔｕｒｅ， ３０７，６
０５，（１９８４））からｐＫＣＲ（ΔＥ）／ＨとｐＫ
ＣＲＤ を構築することができる。
【００３４】ｐＫＣＲＨ２のＥｃｏ ＲＩ／Ｓａｌ
Ｉ断片中には、ＳＶ４０のプロモーター、ウサギβグ
ロビンのイントロン、ＳＶ４０のターミネーターからな
る一組の発現単位が存在する。ｐＫＣＲＨ２のＥｃｏ
ＲＩ部位にＥｃｏ ＲＩ／Ｓａｌ Ｉ断片を更に
挿入することにより作製したｐＫＣＲＤ は、この発現
単位を２組持ち、加えて、前方の発現単位にはＥｃｏ
ＲＩ、後方の発現単位にはＨｉｎ ｄ ＩＩＩ を
用いて任意のＤＮＡ配列を挿入できるようにデザインし
た。
Ｉ断片中には、ＳＶ４０のプロモーター、ウサギβグ
ロビンのイントロン、ＳＶ４０のターミネーターからな
る一組の発現単位が存在する。ｐＫＣＲＨ２のＥｃｏ
ＲＩ部位にＥｃｏ ＲＩ／Ｓａｌ Ｉ断片を更に
挿入することにより作製したｐＫＣＲＤ は、この発現
単位を２組持ち、加えて、前方の発現単位にはＥｃｏ
ＲＩ、後方の発現単位にはＨｉｎ ｄ ＩＩＩ を
用いて任意のＤＮＡ配列を挿入できるようにデザインし
た。
【００３５】上記で作製したキメラＨ鎖遺伝子の両端に
Ｈｉｎ ｄ ＩＩＩ 部位を付加し、ｐＫＣＲ（ΔＥ
）／ＨのＨｉｎ ｄ ＩＩＩ 部位に挿入することに
より、ｃｈｉ−Ｈ／ｐＫＣＲ（ΔＥ）／Ｈ（以下「プラ
スミドＨ」という。）を得た（図７）。キメラＬ鎖遺伝
子の両端にはＥｃｏ ＲＩ部位を付加し、ｐＫＣＲＤ
のＥｃｏ ＲＩ部位に挿入することによりｃｈｉ−
Ｌ／ｐＫＣＲＤ （以下「プラスミドＬ」という。）を
得た（図７）。
Ｈｉｎ ｄ ＩＩＩ 部位を付加し、ｐＫＣＲ（ΔＥ
）／ＨのＨｉｎ ｄ ＩＩＩ 部位に挿入することに
より、ｃｈｉ−Ｈ／ｐＫＣＲ（ΔＥ）／Ｈ（以下「プラ
スミドＨ」という。）を得た（図７）。キメラＬ鎖遺伝
子の両端にはＥｃｏ ＲＩ部位を付加し、ｐＫＣＲＤ
のＥｃｏ ＲＩ部位に挿入することによりｃｈｉ−
Ｌ／ｐＫＣＲＤ （以下「プラスミドＬ」という。）を
得た（図７）。
【００３６】選択マーカー遺伝子ＤＨＦＲ及びＮＥＯ
は、プラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒ （Ｆ． Ｌｅｅら，
Ｎａｔｕｒｅ， ２９４，２２８，（１９８１））、ｐ
ＳＶ２ｎｅｏ （Ｐ． Ｊ． Ｓｏｕｔｈｅｎら，Ｊ．
Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １，３２７
，（１９８２））から各々切り出し、両端にＳａｌ
Ｉリンカーを付けて、プラスミドＨまたはプラスミドＬ
のＳａｌ Ｉ部位に挿入することにより、図８に示す
プラスミドＨ／ＮＥＯ 、図７に示すプラスミドＬ／Ｄ
ＨＦＲおよび図８に示すプラスミドＬ／ＮＥＯ を構築
した。
は、プラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒ （Ｆ． Ｌｅｅら，
Ｎａｔｕｒｅ， ２９４，２２８，（１９８１））、ｐ
ＳＶ２ｎｅｏ （Ｐ． Ｊ． Ｓｏｕｔｈｅｎら，Ｊ．
Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．， １，３２７
，（１９８２））から各々切り出し、両端にＳａｌ
Ｉリンカーを付けて、プラスミドＨまたはプラスミドＬ
のＳａｌ Ｉ部位に挿入することにより、図８に示す
プラスミドＨ／ＮＥＯ 、図７に示すプラスミドＬ／Ｄ
ＨＦＲおよび図８に示すプラスミドＬ／ＮＥＯ を構築
した。
【００３７】〔キメラ抗ＣＥＡ抗体遺伝子のマウスＬ細
胞への導入〕かくして得られる発現ベクターを宿主中で
発現させることにより本発明のキメラ抗体を得ることが
できる。以下に具体的に示す。約１０６ 個のマウスＬ
細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｔｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃ
ｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，
ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９））に対
して、プラスミドＬ３６μｇとプラスミド Ｈ／ＮＥＯ
３．６μｇを同時にリン酸カルシウム法 （Ｆ． Ｌ．
Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ａ． Ｊ． ｖａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６，（１９７
３））で導入した。遺伝子導入から２４時間後にネオマ
イシンのアナログであるＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ 社）を
培地に加えると、ＮＥＯ耐性遺伝子を獲得したＬ細胞だ
けが増殖可能となる（小田、蛋白質 核酸 酵素、
３０、１０９６（１９８５））。プラスミドＨ／ＮＥＯ
を取り込んだＬ細胞はＮＥＯ遺伝子とＨ鎖遺伝子を獲
得するが、プラスミドＬを同時に取り込んだＬ細胞もあ
る割合で存在することが期待される。遺伝子導入から２
週間後に２４個のクローンを選んでＥＩＡにより抗体の
発現の有無を調べると、２個のクローン（Ｌ５、Ｌ１５
）で抗体の発現が確認された。
胞への導入〕かくして得られる発現ベクターを宿主中で
発現させることにより本発明のキメラ抗体を得ることが
できる。以下に具体的に示す。約１０６ 個のマウスＬ
細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｔｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃ
ｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，
ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， （１９８９））に対
して、プラスミドＬ３６μｇとプラスミド Ｈ／ＮＥＯ
３．６μｇを同時にリン酸カルシウム法 （Ｆ． Ｌ．
Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ａ． Ｊ． ｖａｎ ｄｅｒ
Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６，（１９７
３））で導入した。遺伝子導入から２４時間後にネオマ
イシンのアナログであるＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ 社）を
培地に加えると、ＮＥＯ耐性遺伝子を獲得したＬ細胞だ
けが増殖可能となる（小田、蛋白質 核酸 酵素、
３０、１０９６（１９８５））。プラスミドＨ／ＮＥＯ
を取り込んだＬ細胞はＮＥＯ遺伝子とＨ鎖遺伝子を獲
得するが、プラスミドＬを同時に取り込んだＬ細胞もあ
る割合で存在することが期待される。遺伝子導入から２
週間後に２４個のクローンを選んでＥＩＡにより抗体の
発現の有無を調べると、２個のクローン（Ｌ５、Ｌ１５
）で抗体の発現が確認された。
【００３８】この２個のクローンについて産生細胞のク
ローニングを行ったところ、Ｌ１５とクローニングの途
中に抗体産生能を失ったが、産生量４００ｎｇ／ｍｌ／
ｄａｙ のＬ５から２μｇ／ｍｌ／ｄａｙ の産生量を
示すＬ５−２を得ることに成功した。Ａｍｅｒｓｈａｍ
社のＢｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを
使用したウエスタンブロット法により本発明のキメラ抗
体のＨ鎖及びＬ鎖の発現を確認した。
ローニングを行ったところ、Ｌ１５とクローニングの途
中に抗体産生能を失ったが、産生量４００ｎｇ／ｍｌ／
ｄａｙ のＬ５から２μｇ／ｍｌ／ｄａｙ の産生量を
示すＬ５−２を得ることに成功した。Ａｍｅｒｓｈａｍ
社のＢｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを
使用したウエスタンブロット法により本発明のキメラ抗
体のＨ鎖及びＬ鎖の発現を確認した。
【００３９】〔キメラ抗ＣＥＡ抗体遺伝子の ＣＨＯｄ
ｈｆｒ− への導入〕約１０６ 個の ＣＨＯｄｈｆｒ
− （Ｇ． Ｕｒｌａｕｂ ＆ Ｌ． Ａ． Ｃｈａｓ
ｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ，７７，４２１６，（１９８０））に対して
、プラスミドＬ／ＤＨＦＲ ３．６μｇとプラスミド
Ｈ ３６μｇを同時にリン酸カルシウム法で導入した
。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を欠失している
ＣＨＯｄｈｆｒ− はヌクレオシドを含まないＭＥＭα
培地（Ｓｉｇｍａ 社）では増殖できないが、ＤＨＦＲ
遺伝子を獲得したものはこの培地中で増殖できる（（小
田、蛋白質 核酸 酵素、３０、１０９６（１９８
５））。
ｈｆｒ− への導入〕約１０６ 個の ＣＨＯｄｈｆｒ
− （Ｇ． Ｕｒｌａｕｂ ＆ Ｌ． Ａ． Ｃｈａｓ
ｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ，７７，４２１６，（１９８０））に対して
、プラスミドＬ／ＤＨＦＲ ３．６μｇとプラスミド
Ｈ ３６μｇを同時にリン酸カルシウム法で導入した
。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を欠失している
ＣＨＯｄｈｆｒ− はヌクレオシドを含まないＭＥＭα
培地（Ｓｉｇｍａ 社）では増殖できないが、ＤＨＦＲ
遺伝子を獲得したものはこの培地中で増殖できる（（小
田、蛋白質 核酸 酵素、３０、１０９６（１９８
５））。
【００４０】遺伝子導入から２週間後に１２個のクロー
ンを選んでＥＩＡにより抗体の発現の有無を調べ、６個
のクローン（Ｃ５、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１
２）で抗体の発現が確認できた（最高６μｇ／ｍｌ／ｄ
ａｙ）。しかし、このクローンの産生する抗体はＣＥＡ
に対する抗原結合能がなく（ＥＩＡにより確認）、ウエ
スタンブロット法によりＨ鎖が産生されていないことが
明らかになった。
ンを選んでＥＩＡにより抗体の発現の有無を調べ、６個
のクローン（Ｃ５、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１
２）で抗体の発現が確認できた（最高６μｇ／ｍｌ／ｄ
ａｙ）。しかし、このクローンの産生する抗体はＣＥＡ
に対する抗原結合能がなく（ＥＩＡにより確認）、ウエ
スタンブロット法によりＨ鎖が産生されていないことが
明らかになった。
【００４１】そこでＨ鎖の産生量が最も多かったＣ９株
にプラスミドＬ／ＮＥＯ を導入し、Ｃ９−１１、Ｃ９
−１９を得た。これらのクローンではウエスタンブロッ
ト法により本発明のキメラ抗体のＨ鎖及びＬ鎖の発現を
確認した。
にプラスミドＬ／ＮＥＯ を導入し、Ｃ９−１１、Ｃ９
−１９を得た。これらのクローンではウエスタンブロッ
ト法により本発明のキメラ抗体のＨ鎖及びＬ鎖の発現を
確認した。
【００４２】
【発明の効果】本発明の新規なキメラ抗体は、ＣＥＡに
特異的に反応するので、その診断薬あるいは治療薬とし
て使用し得る。
特異的に反応するので、その診断薬あるいは治療薬とし
て使用し得る。
【００４３】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：１３９
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
細胞の種類：抗ＣＥＡ特異抗体産生ハイブリドーマ細胞
配列 Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
−１５ −１０
−５ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ １
５
１０ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
１５
２０ ２
５ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
３０ ３５
４０ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ ４５
５０
５５ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐ
ｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ
６０
６５ ７０
Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ ７５
８０
８５ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａ
ｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙ
ｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
９０
９５
１００ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅ
ｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ
１０５ １
１０ １１５ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ １２０ 配列番号：２ 配列の長さ：１２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 細胞の種類：抗ＣＥＡ特異抗体産生ハイブリドーマ細胞
配列 Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｍｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ −２０
−１５
−１０ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ −５
１
５ １０ Ｍ
ｅｔ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ
Ｌｙｓ Ａｌａ
１５ ２０
２５ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ ３０
３５
４０ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
４５
５０
５５ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ
６０
６５
７０ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓ
ｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
７５
８０ ８５ Ｔ
ｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｇｌｙ
９０ ９０
１００ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ａｒｇ １０５
配列番号：３ 配列の長さ：５５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 細胞の種類：抗ＣＥＡ特異抗体産生ハイブリドーマ細胞
配列 ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＴＣ ＧＧＧ ＴＴＣ ＡＧＣ Ｔ
ＴＧ ＡＴＴ ＴＴＣ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＴＴ ＧＴ
Ｔ ＴＡＡ ＡＡＡ ６０ ＧＧＴ ＧＴＣ Ｃ
ＡＧ ＴＧＴ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＡ
１２０ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧ
Ｇ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ
ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ １８０ ＴＴ
Ｃ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＣＣ
ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＡＧ
ＡＣＴ ＣＣＡ ２４０ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＧＧ
ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＣＣ
ＡＴＴ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＧＣ
３００ ＡＣＣ ＴＡＣ ＴＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ
ＡＧＴ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＧＡ ＴＴＣ Ａ
ＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ３６０ ＧＡＴ
ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＡＴＣ ＣＴＧ Ｔ
ＡＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＴ
Ｇ ＡＧＧ ４２０ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣ Ａ
ＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＣ
Ａ ＡＧＡ ＧＴＣ ＣＡＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ４
８０ ＧＡＴ ＡＧＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＡ
Ｃ ＴＡＣ ＴＧＧ ＧＧＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＣ
ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ５４０ ＧＴＣ ＴＣ
Ｃ ＴＣＡ ＧＣＣ
５５２ 配列番号：４ 配列の長さ：５０７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 細胞の種類：抗ＣＥＡ特異抗体産生ハイブリドーマ細胞
配列 ＡＴＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＡＧ Ｇ
ＴＣ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＡＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴ
Ｇ ＴＧＧ ＴＴＧ ６０ ＴＣＴ ＧＧＴ Ｇ
ＴＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＡＴ
Ｇ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＴＴＣ
１２０ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＡ ＧＴ
Ａ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＧＣ ＧＴＣ
ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＣＣ １８０ ＡＧ
Ｔ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＴＧ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ
ＧＴＡ ＧＣＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＡ ＣＡＧ
ＡＡＡ ＣＣＡ ２４０ ＧＧＧ ＣＡＡ ＴＣＴ
ＣＣＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＴＴ ＡＡＣ
ＴＣＧ ＧＣＡ ＴＣＣ ＴＡＣ ＣＧＧ ＴＡＣ
３００ ＡＧＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＣＴ ＧＡＴ
ＣＧＣ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＡ Ｔ
ＣＴ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ３６０ ＴＴＣ
ＡＣＴ ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＡＴ Ｇ
ＴＧ ＣＧＧ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＣ
Ａ ＧＡＧ ４２０ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＧＴ Ｃ
ＡＧ ＣＡＡ ＴＡＴ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＣ
Ｔ ＣＴＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ４
８０ ＧＧＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡ
Ａ ＡＴＡ ＡＡＡ ＣＧＧ
５０７
配列 Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌ
ｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ
−１５ −１０
−５ Ｇｌｙ Ｖ
ａｌ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅ
ｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ １
５
１０ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
１５
２０ ２
５ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ａｌａ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
３０ ３５
４０ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ ４５
５０
５５ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐ
ｈｅ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ
６０
６５ ７０
Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｌ
ｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ ７５
８０
８５ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａ
ｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｃｙ
ｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
９０
９５
１００ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅ
ｔ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ
１０５ １
１０ １１５ Ｖａ
ｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ １２０ 配列番号：２ 配列の長さ：１２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 細胞の種類：抗ＣＥＡ特異抗体産生ハイブリドーマ細胞
配列 Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｖ
ａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｍｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅ
ｕ Ｔｒｐ Ｌｅｕ −２０
−１５
−１０ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ −５
１
５ １０ Ｍ
ｅｔ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓ
ｐ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｃｙｓ
Ｌｙｓ Ａｌａ
１５ ２０
２５ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ ３０
３５
４０ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ
４５
５０
５５ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇ
ｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｐ
６０
６５
７０ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓ
ｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｓ
ｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
７５
８０ ８５ Ｔ
ｙｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｓ
ｎ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｇｌｙ
９０ ９０
１００ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ａｒｇ １０５
配列番号：３ 配列の長さ：５５２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 細胞の種類：抗ＣＥＡ特異抗体産生ハイブリドーマ細胞
配列 ＡＴＧ ＡＡＣ ＴＴＣ ＧＧＧ ＴＴＣ ＡＧＣ Ｔ
ＴＧ ＡＴＴ ＴＴＣ ＣＴＴ ＧＴＣ ＣＴＴ ＧＴ
Ｔ ＴＡＡ ＡＡＡ ６０ ＧＧＴ ＧＴＣ Ｃ
ＡＧ ＴＧＴ ＧＡＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＴ
Ｇ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＡ
１２０ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＧ
Ｇ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＡＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ
ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ １８０ ＴＴ
Ｃ ＡＣＴ ＴＴＣ ＡＧＴ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＣＣ
ＡＴＧ ＴＣＴ ＴＧＧ ＧＴＴ ＣＧＣ ＣＡＧ
ＡＣＴ ＣＣＡ ２４０ ＧＡＧ ＡＡＧ ＡＧＧ
ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＧＣＡ ＴＣＣ
ＡＴＴ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＡＧＣ
３００ ＡＣＣ ＴＡＣ ＴＡＴ ＣＣＡ ＧＡＣ
ＡＧＴ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ ＣＧＡ ＴＴＣ Ａ
ＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ３６０ ＧＡＴ
ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＡＴＣ ＣＴＧ Ｔ
ＡＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＴ
Ｇ ＡＧＧ ４２０ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＡＣ Ａ
ＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＴ ＧＣ
Ａ ＡＧＡ ＧＴＣ ＣＡＴ ＴＡＣ ＴＡＣ ４
８０ ＧＡＴ ＡＧＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＡ
Ｃ ＴＡＣ ＴＧＧ ＧＧＴ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＣＣ
ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＣＣ ５４０ ＧＴＣ ＴＣ
Ｃ ＴＣＡ ＧＣＣ
５５２ 配列番号：４ 配列の長さ：５０７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 細胞の種類：抗ＣＥＡ特異抗体産生ハイブリドーマ細胞
配列 ＡＴＧ ＧＡＧ ＴＣＡ ＣＡＧ ＡＣＴ ＣＡＧ Ｇ
ＴＣ ＴＴＴ ＣＴＡ ＴＡＣ ＡＴＧ ＴＴＧ ＣＴ
Ｇ ＴＧＧ ＴＴＧ ６０ ＴＣＴ ＧＧＴ Ｇ
ＴＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ＡＴ
Ｇ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＴＴＣ
１２０ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＡ ＧＴ
Ａ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＧＣ ＧＴＣ
ＡＣＣ ＴＧＣ ＡＡＧ ＧＣＣ １８０ ＡＧ
Ｔ ＣＡＧ ＡＡＴ ＧＴＧ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ
ＧＴＡ ＧＣＣ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＡＡ ＣＡＧ
ＡＡＡ ＣＣＡ ２４０ ＧＧＧ ＣＡＡ ＴＣＴ
ＣＣＴ ＡＡＡ ＧＣＡ ＣＴＧ ＡＴＴ ＡＡＣ
ＴＣＧ ＧＣＡ ＴＣＣ ＴＡＣ ＣＧＧ ＴＡＣ
３００ ＡＧＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＣＣＴ ＧＡＴ
ＣＧＣ ＴＴＣ ＡＣＡ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＧＡ Ｔ
ＣＴ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ３６０ ＴＴＣ
ＡＣＴ ＣＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＡＴ Ｇ
ＴＧ ＣＧＧ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＴＧ ＧＣ
Ａ ＧＡＧ ４２０ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＧＴ Ｃ
ＡＧ ＣＡＡ ＴＡＴ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＣＣ
Ｔ ＣＴＣ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＴＣ ＧＧＡ ４
８０ ＧＧＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡ
Ａ ＡＴＡ ＡＡＡ ＣＧＧ
５０７
【図１】本発明の抗ＣＥＡ抗体の重鎖可変領域のアミノ
酸配列（上段）と公知の抗ＣＥＡ抗体の重鎖可変領域の
アミノ酸配列（下段：相違する部分のアミノ酸残基のみ
を記載。）を示す。
酸配列（上段）と公知の抗ＣＥＡ抗体の重鎖可変領域の
アミノ酸配列（下段：相違する部分のアミノ酸残基のみ
を記載。）を示す。
【図２】本発明の抗ＣＥＡ抗体の軽鎖可変領域のアミノ
酸配列（上段）と公知の抗ＣＥＡ抗体の軽鎖可変領域の
アミノ酸配列（下段：相違する部分のアミノ酸残基のみ
を記載。）を示す。
酸配列（上段）と公知の抗ＣＥＡ抗体の軽鎖可変領域の
アミノ酸配列（下段：相違する部分のアミノ酸残基のみ
を記載。）を示す。
【図３】マウスＶ領域とヒトＣｒ１ 領域とのＨ鎖の結
合部分の塩基配列を示す。
合部分の塩基配列を示す。
【図４】マウスＶ領域とヒトＣｒ１ 領域とのＬ鎖の結
合部分の塩基配列を示す。
合部分の塩基配列を示す。
【図５】本発明で使用したベクターｐＫＣＲＤ の構築
の概略図を示す。
の概略図を示す。
【図６】本発明で使用したベクターｐＫＣＲＤ 及びｐ
ＫＣＲ（ΔＥ）／Ｈの構築の概略図を示す。
ＫＣＲ（ΔＥ）／Ｈの構築の概略図を示す。
【図７】本発明７で使用したプラスミドＬ，Ｈ及びＬ／
ＤＨＦＲの概略図を示す。
ＤＨＦＲの概略図を示す。
【図８】本発明で使用したプラスミドＨ／ＮＥＯ 及び
Ｌ／ＮＥＯ の概略図を示す。
Ｌ／ＮＥＯ の概略図を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】 ヒト癌胎児性抗原に特異的に結合する
マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域とを結合し
て成るマウス−ヒトキメラ抗体であって、該ヒト癌胎児
性抗原に特異的に結合するマウス抗体の重鎖可変領域及
び軽鎖可変領域が夫々、配列番号：１の第１番〜第１２
０番及び配列番号：２の第１番〜第１０９番で表される
アミノ酸配列を有することを特徴とするマウス−ヒトキ
メラ抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP40881190A JPH04330295A (ja) | 1990-12-28 | 1990-12-28 | マウス−ヒトキメラ抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP40881190A JPH04330295A (ja) | 1990-12-28 | 1990-12-28 | マウス−ヒトキメラ抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04330295A true JPH04330295A (ja) | 1992-11-18 |
Family
ID=18518217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP40881190A Pending JPH04330295A (ja) | 1990-12-28 | 1990-12-28 | マウス−ヒトキメラ抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04330295A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7985833B2 (en) | 2000-04-21 | 2011-07-26 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Collectin |
-
1990
- 1990-12-28 JP JP40881190A patent/JPH04330295A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7985833B2 (en) | 2000-04-21 | 2011-07-26 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Collectin |
| US8604162B2 (en) | 2000-04-21 | 2013-12-10 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Collectin |
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