WO2001081401A1 - Nouvelles collectines - Google Patents

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WO2001081401A1
WO2001081401A1 PCT/JP2001/003468 JP0103468W WO0181401A1 WO 2001081401 A1 WO2001081401 A1 WO 2001081401A1 JP 0103468 W JP0103468 W JP 0103468W WO 0181401 A1 WO0181401 A1 WO 0181401A1
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gly
amino acid
seq
protein
pro
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PCT/JP2001/003468
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Inventor
Nobutaka Wakamiya
Hiroyuki Keshi
Katsuki Ohtani
Takashi Sakamoto
Yuichiro Kishi
Original Assignee
Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4726—Lectins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/785—Alveolar surfactant peptides; Pulmonary surfactant peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • the present invention relates to a novel isolated human and mouse collectin (described herein).
  • the present invention also relates to pharmaceutical, diagnostic, and research compositions containing CL-1L2s, and to methods for their production and use. Furthermore, the present invention relates to a method for screening a drug using an agonist and an antagonist of a CL-L2s protein and a CL-L2s. Furthermore, the present invention relates to an expression vector containing the CL-L2s gene, a transformed cell transformed with the expression vector, an antibody against CL-L2s protein, and a cell producing the antibody.
  • the complement system which plays an important role in host defense, uses immunoglobulin as a recognition molecule and uses the classical pathway to activate C1, the first component of complement, as well as foreign substances such as bacteria.
  • a second pathway to which certain C3 directly binds is known.
  • a lectin that activates the complement system by directly recognizing and binding to the sugar chains on the surface of foreign bodies by mannose-binding protein hereinafter referred to as “MBP”
  • MBP mannose-binding protein
  • MBP is specific to mannose, N-acetyl dalcosamine, etc. in the presence of Ca. It is a C-type lectin that binds differentially, and its structure contains at least a collagen-like domain consisting of (Gly-Xaa-Yaa) n and a sugar chain recognition domain (CRD). Lectins having a collagen-like region and a CRD like MBP are collectively referred to as collectins (Malhotora, R. et al .; Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992). 143 (CL-43), surfactant protein A (SP-A), surfactant protein D (SP-D) and glycone glutinin (BKg).
  • SP-A surfactant protein A
  • SP-D surfactant protein D
  • BKg glycone glutinin
  • Collectin has opsonin activity and is thought to be involved in basic immunity to various microorganisms including bacteria and viruses (Kawasaki, N. et al .; J. Biochem., 106, 483-489). J. Biol. Chem., 262, 7451-7454, 1987; Ohta, M. et al .; J. Biol. Cem., 265, 1980-1984, 1990, Ikeda, K. et al. Summerfield, JA et al .; Lancet, 345, 886, 1995).
  • collectins are known to be composed of basic structures including characteristic regions such as (1) CRD and (2) collagen-like region, as shown in Fig. 1 (a). (Malhortra et al .; Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992), this basic structure forms a subunit by forming a triple helix in the collagen-like region. It forms an oligomer structure such as trimer, tetramer, hexamer, etc.
  • collectins are involved in nonspecific immune responses, such as neutralizing or eliminating various microorganisms in infants with insufficiently developed maternal antibodies and specific defense systems. Have been reported to play an important role (Super et al .; Lancet, 2, 1236-1239, 1989). Furthermore, the role of these collectins in host defense is discussed, for example, in the low blood levels of MBP due to mutations in the MBP gene. The following report reports that the host is more susceptible to infection (Sumiya et al .; Lancet, 337, 1569-1570, 1991). In addition, the serum MBP content of opsonized dysfunction shows low values (Madsen, H. 0.
  • MBP MBP is c present inventors which may be considered to play an important role in the immune system, previously BK g and MB P Inhibit H1 and H3 influenza A virus infection and hemagglutination activity (akamiya et al .; Glycoconjugate J., 8, 235, 1991; Wakamiya et al .; Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1270-1278, 199 2).
  • collectin is expected to be useful in elucidating the biological defense mechanism and useful as a physiologically active substance, and the discovery of a new molecular species belonging to this family is expected to be effective in treating infectious diseases. In addition, it will greatly contribute to various fields of medicine and biology.
  • the present invention is intended to elucidate the functions of basic immunity, elucidate the mechanism of onset of various diseases such as bacterial infectious diseases, etc., and further develop diagnostic, preventive and therapeutic methods, and reagents and medicaments for them.
  • the purpose is to provide what can be used for
  • the present invention has the following (1) to (33) as its gist.
  • a protein having an amino acid sequence consisting of amino acids 271 shown in amino acid numbers 1-271 of SEQ ID NO: 2, or shown in SEQ ID NO: 2 A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having the same properties as a protein having the amino acid sequence shown in amino acid numbers 1-271 of SEQ ID NO: 2 Quality, or derivatives and fragments thereof.
  • SEQ ID NO: 45 (corresponding to base numbers 265-10777 of SEQ ID NO: 1), the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-271 of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof Or a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to these nucleotide sequences or a nucleotide sequence complementary to these nucleotide sequences, and that has an amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-271 of SEQ ID NO: 2.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 46 (corresponding to base numbers 141 to 875 in SEQ ID NO: 3), the amino acid sequence shown in amino acid numbers 1 to 245 in SEQ ID NO: 4 or a fragment thereof is Or a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to these nucleotide sequences or to a nucleotide sequence complementary to these nucleotide sequences and to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-245 of SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 47 (corresponds to amino acid numbers 11 13 to 27 1 of SEQ ID NO: 2) A protein having an amino acid sequence consisting of 159 amino acids shown in the above), or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and A protein having a property equivalent to that of the protein having the amino acid sequence of amino acids 11 to 27 of SEQ ID NO: 2, or a derivative or fragment thereof.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 48 (corresponding to nucleotide numbers 61 to 1077 of SEQ ID NO: 1); an amino acid sequence represented by amino acid numbers 11 13 to 271 of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof Or a base sequence encoding these sequences or a base sequence complementary to these base sequences under stringent conditions, and having the amino acid number 113 to 271 of SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 48 corresponding to nucleotide numbers 61 to 1077 of SEQ ID NO: 1
  • amino acid sequence represented by amino acid numbers 11 13 to 271 of SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof Or a base sequence encoding these sequences or a base sequence complementary to these base sequences under stringent conditions, and having the amino acid number 113 to 271 of SEQ ID NO: 2
  • Xaa and Yaa may be the same amino acid residue or different amino acid residues).
  • a protein further comprising:
  • a protein further comprising:
  • SEQ ID NO: 5 (corresponding to base numbers 141 to 731 of SEQ ID NO: 5) A nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-197 of SEQ ID NO: 6 or a fragment thereof. A nucleotide sequence that hybridizes under conditions and encodes a protein having properties equivalent to those of the protein having the amino acid sequence of amino acids 1 to 197 of SEQ ID NO: 6.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 56 (corresponding to nucleotide numbers 141 to 803 of SEQ ID NO: 7), the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 221 of SEQ ID NO: 8, or a fragment thereof Or a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence or the nucleotide sequence complementary to these nucleotide sequences, and the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-221 of SEQ ID NO: 8.
  • a protein having an amino acid sequence consisting of amino acids 22 1 shown in amino acid numbers 1 to 22 1 of SEQ ID NO: 10, or in the amino acid sequence shown in amino acid numbers 1 to 22 1 of SEQ ID NO: 10 A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having the same properties as the protein having the amino acid sequence shown in amino acid numbers 1-221 of SEQ ID NO: 10, or These derivatives And fragments.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 57 (corresponding to nucleotide numbers 141 to 803 of SEQ ID NO: 9); the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1 to 221 of SEQ ID NO: 10 or a fragment thereof Or a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence encoding the same or to a nucleotide sequence complementary to these nucleotide sequences or these nucleotide sequences, and to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-221 of SEQ ID NO: 10.
  • a protein having an amino acid sequence consisting of the amino acid 271-2 represented by amino acid numbers 1-271 of SEQ ID NO: 13, or the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-271 of SEQ ID NO: 13 A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having the same properties as the protein having the amino acid sequence shown in amino acid numbers 1-271 of SEQ ID NO: 13, or Derivatives and fragments of these.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 58 (corresponding to nucleotide numbers 1557 to 969 of SEQ ID NO: 12), the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 271 of SEQ ID NO: 13 Or a nucleotide sequence encoding a fragment thereof, or a nucleotide sequence which hybridizes with these nucleotide sequences or a nucleotide sequence complementary to these nucleotide sequences under stringent conditions, and which is represented by amino acid numbers 1-271 of SEQ ID NO: 13
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 59 (corresponding to base numbers 26 to 93 of SEQ ID NO: 36), the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 23 of SEQ ID NO: 37 Or a nucleotide sequence encoding a fragment thereof, or a nucleotide sequence complementary to these nucleotide sequences or these nucleotide sequences under stringent conditions, and represented by amino acid numbers 1-223 of SEQ ID NO: 37
  • a protein having an amino acid sequence consisting of amino acids 2 to 47 shown in amino acid numbers 1 to 247 of SEQ ID NO: 39, or an amino acid sequence shown in amino acids 1 to 247 of SEQ ID NO: 39 A protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having the same properties as the protein having the amino acid sequence shown in amino acid numbers 1-247 of SEQ ID NO: 39, or Derivatives or fragments of these.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 60 (corresponding to nucleotide numbers 265-1005 of SEQ ID NO: 38); the amino acid sequence represented by amino acid numbers 1-247 of SEQ ID NO: 39 or An amino acid sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleotide sequence encoding the fragment, or to a nucleotide sequence complementary to these nucleotide sequences or to a nucleotide sequence thereof, and to the amino acids 1 to 247 of SEQ ID NO: 39 A nucleotide sequence encoding a protein having the same properties as a protein having a sequence.
  • a protein having an amino acid sequence consisting of 7 amino acids, or SEQ ID NO: 41 An amino acid sequence comprising the amino acid sequence of amino acids 1 to 247 of SEQ ID NO: 41, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having the amino acid sequence of amino acids 1 to 247 of SEQ ID NO: 41
  • (26) encodes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61 (corresponding to base numbers 265 to 1005 of SEQ ID NO: 40), the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 247 of SEQ ID NO: 41, or a fragment thereof Equivalent to a protein that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence or a nucleotide sequence complementary thereto or a nucleotide sequence complementary to these nucleotide sequences, and has the amino acid sequence of amino acids 1 to 247 of SEQ ID NO: 41
  • a method for producing a protein which comprises culturing cells transformed with the nucleotide sequence described in the above, and collecting the produced hCL-L2s protein.
  • a method for producing a protein comprising culturing cells transformed with the nucleotide sequence according to (20), and collecting the produced mCL-L2s protein.
  • the cell is Escherichia coli, an animal cell or an insect cell; Or the production method according to (30).
  • FIG. 1 shows the basic structures (a) and FIG. 1 is a view showing an overview of proteins and proteins (MBP, SP-A and SP-D).
  • FIG. 2 is a diagram showing the first half of the alignment of the amino acid sequences of four types of collectins that have been reported hitherto.
  • FIG. 3 is a diagram showing the latter half of the same alignment as FIG.
  • FIG. 4 is a diagram (a) and (b) showing each primer used for determining the nucleotide sequence of the novel collectin of the present invention, and the obtained novel collectin.
  • FIG. 5 is a diagram showing the first half of an alignment of the amino acid sequences of four collectins that have been reported hitherto and the novel collectin (hCL-L2-1) of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the latter half of the same alignment as FIG.
  • FIG. 7 is a diagram showing the organ distribution of the novel collectin hCL-L2 of the present invention, showing the results of analyzing the distribution of mRNA in various human tissues.
  • FIG. 8 is a diagram showing a genetic phylogenetic tree of various collectins.
  • FIG. 9 is a graph showing the organ distribution of the novel collectin (hCL-L2-1 and hCL-L2-2) of the present invention, showing the results of analyzing the distribution of mRNA in various tissues of humans. It is.
  • FIG. 10 is a diagram showing the sugar-binding properties of the novel collectin of the present invention: CL-L2-1.
  • the present inventors have successfully cloned novel human and mouse collectin genes (hCL-L2 and mCL-L2).
  • a CRD amino acids 11 to 27 of SEQ ID NOS: 2 and 13; amino acids of 87 of SEQ ID NO: 4
  • a collagen-like region having the (Gly-Xaa-Yaa) n structure amino acid numbers 41 to 112 of SEQ ID NOS: 2 and 13; amino acid numbers 18 to 86 of SEQ ID NO: 4).
  • hCL-L2 contains two types of proteins (CL-L2-1 and CL-L2- 2) existed. Specifically, N-terminal amino acids (positions 1 to 43) of CL-L2-1 (shown in SEQ ID NO: 2) and N-terminal amino acids (positions 1 to 4) of CL-L2-2 (shown in SEQ ID NO: 4) (Positions 1 to 17) Amino acids were different and the rest were the same. Furthermore, the signal sequence and the collagen structure for one turn were contained in positions 1 to 43 of the N-terminal amino acid of CL-L2-1. The signal sequence and one turn of collagen-like structure were absent at positions 1-17.
  • CL-L2-2 contained three proteins generated by alternative splicing of mRNA. They are called CL—L2-2V1 (SEQ ID NOs: 5, 6), CL-L2-2 V2 (SEQ IDs 7, 8) and CLL2-2V3 (SEQ IDs 9, 10). Call it.
  • CL—L2-2V1 SEQ ID NOs: 5, 6
  • CL-L2-2 V2 SEQ IDs 7, 8
  • CLL2-2V3 SEQ IDs 9, 10
  • CL-L2-2v2 is deleted between amino acids 18-41 of CL_2-2 shown in SEQ ID NO: 4 (shown in SEQ ID NO: 3).
  • CL-L2-2 is deleted between base numbers 192-263
  • CL-L2-2v3 is the amino acid of CL-L2_2 shown in SEQ ID NO: 4. It is a deletion between acid numbers 42 to 65 (deletion between base numbers 264 to 3335 of CL-L2-2 shown in SEQ ID NO: 3).
  • CL-1L2-1 contained three proteins generated by alternative splicing of mRNA.
  • CL-L2-1V1 SEQ ID NOs: 36, 37
  • CL-L2-1v2 SEQ ID NOs: 38, 39
  • CL-L2-1 V3 SEQ ID NO: 40
  • CL-L2-lvl is the amino acid number of CL-L2-1 shown in SEQ ID NO: 2. No.
  • CL-L2-1 ⁇ 2 is CL-L21 shown in SEQ ID NO: 2 between amino acids 44-67 deleted (CL-L2-1 shown in SEQ ID NO: 1 between nucleotides 394-465 deleted) Yes
  • CL-L2-1v3 is deleted between amino acids 68-91 of CL_L2-1 shown in SEQ ID NO: 2 (base number of CL-L2-1 shown in SEQ ID NO: 1) Between 46 6 and 5 3 7). All three proteins were caused by differences in splicing within the collagen-like region of CL-L2-1.
  • the hCL-L2 gene used in the present specification refers to hCL-L2-1 shown in SEQ ID NO: 1, hCL-L2-2 shown in SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5, respectively.
  • the hCL-L2 protein used in the present specification is the hCL-L2-1 shown in SEQ ID NO: 2, the hCL-L2-2 shown in SEQ ID NO: 4, and the SEQ ID NO: 6, respectively.
  • It also includes their homologues, variants, modifications and polymorphic variants (these are collectively referred to as "derivatives"), and fragments thereof. These can be natural or artificial.
  • the present invention includes all of the above.
  • mCL-L2 gene unless otherwise specified, MCL-L2 shown in SEQ ID NO: 12.
  • the mCL-L2 protein used herein includes mCL-L2 shown in SEQ ID NO: 13 unless otherwise specified. It also includes homologues, mutants, modified forms and polymorphic variants thereof (these are generally referred to as "derivatives"), and fragments thereof. These may be natural or artificial.
  • the present invention includes all of the above.
  • the present invention substantially includes SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 10, 13, 37, 39 or 41, SEQ ID NO: 47 (amino acid numbers 113 to 2 of SEQ ID NO: 2). Or equivalent to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and the amino acid sequence similar to that of SEQ ID NO: 13, and substantially SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 13 , 37, 39 or 41, SEQ ID NO: 47 (corresponding to amino acid numbers 11 13 to 27 1 of SEQ ID NO: 2) or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 to amino acids 11 to 27 1 A nucleotide sequence encoding an amino acid sequence similar to the above is also included. Furthermore, proteins having these amino acid sequences are also included.
  • SEQ ID NO: 2 4, 6, 8, 10, 10, 13, 37, 39 or 41
  • SEQ ID NO: 47 (corresponding to amino acid numbers 11 13 to 271 of SEQ ID NO: 2) or SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence substantially similar to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 11 to 27 of SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 13, 13, 37, 39 or 41.
  • SEQ ID NO: 47 (corresponding to amino acid numbers 113 to 271 of SEQ ID NO: 2) or a protein equivalent to the protein containing the amino acid sequence represented by amino acid numbers 113 to 271 of SEQ ID NO: 13
  • the term refers to an amino acid sequence having substitutions, deletions, additions, and modifications such as Z or insertion of one or several amino acids within the scope of the above. These can be natural or artificial.
  • Such deletions, substitutions and / or additions of one or more amino acids are largely due to the hydrophilicity / hydrophobicity, acidicity / basicity, group content, etc. No change in the amino acid deficiency to a small extent without altering (1) the sugar recognition structure-like region (CRD) that requires Ca2 + and (2) the basic characteristics of each of the collagen-like regions. Loss, substitution and Z or addition.
  • CCD sugar recognition structure-like region
  • Loss, substitution and Z or addition Based on the amino acid sequences and structures of collectin family proteins reported to date, for example, (1) about 1 to 10 in the Cad2 + -requiring sugar recognition structure-like region (CRD), (2) It is considered that about 1 to 50, preferably 1 to 15 amino acids can be deleted, substituted and Z- or added in the collagen-like region.
  • Equivalent properties refer to properties unique to proteins including the amino acid sequence before modification, for example, properties relating to the tertiary structure of proteins.
  • SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 23, 36, 39 or 41 SEQ ID NO: 48 (SEQ ID NO: 1 Or a nucleic acid sequence comprising the nucleic acid sequence of any of base numbers 493 to 969 of SEQ ID NO: 12 or a fragment thereof, or a nucleic acid sequence complementary thereto (hereinafter referred to as a specific sequence) and a string
  • nucleic acid sequences capable of hybridizing under gentle conditions are also included.
  • Stringent conditions in the present invention include, for example, 5XSSC, 5% Denhardt's solution (0.1% BSA, 0.1% Ficol 1400, 0.1% PVP), 0.5% SDS and 20 ⁇ gZmL denatured salmon sperm; Incubate overnight at 37 in a solution containing DNA and then wash at room temperature with 2 XSSC containing 0.1% SDS.
  • SSPE may be used as appropriate instead of SSC.
  • the nucleic acid sequence thus obtained is considered to have at least 50% or more homology (homology) with the specific sequence.
  • Many proteins encoded by a nucleic acid sequence that can hybridize with a specific sequence under stringent conditions are considered to have properties similar to those of CL-L2s protein, and are equivalent to CL-L2s protein. Gender The protein is also included in the present invention as long as it has quality.
  • amino acid sequence of hCL-L2-1 (amino acid numbers 1-271) shown in SEQ ID NO: 2 is a protein consisting of 271 amino acids, and the nucleotide sequence encoding it (SEQ ID NO: 45) Consists of 8 13 bases.
  • the sequence had a characteristic amino acid sequence such as a signal sequence, a collagen-like domain, and a CRD domain.
  • the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence of hCL-L2-2 (amino acids 1 to 245) shown in SEQ ID NO: 4 is a protein consisting of 245 amino acids, and the nucleotide sequence encoding it (SEQ ID NO: 46) is It consists of 73.5 bases.
  • the sequence contained a characteristic amino acid sequence such as a collagen-like domain and a CRD domain.
  • the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 3.
  • amino acid sequence of hCL-L2-2V1 (amino acids 1 to 197) shown in SEQ ID NO: 6 is a protein consisting of 197 amino acids, and the nucleotide sequence encoding it (SEQ ID NO: 5) 5) consists of 591 bases.
  • the sequence had a characteristic amino acid sequence such as a collagen-like domain and a CRD domain.
  • the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 5.
  • amino acid sequence of hCL-L2-2V2 (amino acid numbers 1-221) shown in SEQ ID NO: 8 is a protein consisting of 22 1 amino acids, and the nucleotide sequence encoding it (SEQ ID NO: 5) 6) consists of 663 bases.
  • the sequence had a characteristic amino acid sequence such as a collagen-like domain and a CRD domain.
  • the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 7.
  • hCL-L2-2v3 (SEQ ID NO: 10)
  • the amino acid sequence of 2 2 1) is a protein consisting of 2 2 1 amino acids, and the base sequence encoding it (SEQ ID NO: 57) consists of 663 bases.
  • the sequence had a characteristic amino acid sequence such as a collagen-like domain and a CRD domain.
  • the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 9.
  • amino acid sequence of hCL—L2-1V1 (amino acid numbers 1-223) shown in SEQ ID NO: 37 is a protein consisting of 223 amino acids, and the nucleotide sequence encoding it (SEQ ID NO: 5 9) consists of 6 69 bases.
  • the sequence had a characteristic amino acid sequence such as a collagen-like domain and a CRD domain.
  • the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 36.
  • amino acid sequence of hCL-L2-1V2 (amino acid numbers 1-247) shown in SEQ ID NO: 39 is a protein consisting of 247 amino acids, and the base sequence encoding it ( SEQ ID NO: 60) is composed of 741 bases.
  • the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 38.
  • amino acid sequence of hCL-L2-1V2 (amino acid numbers 1-247) shown in SEQ ID NO: 41 is a protein consisting of 247 amino acids, and the nucleotide sequence encoding it (SEQ ID NO: 6 1) consists of 741 bases. The sequence had a characteristic amino acid sequence such as a collagen-like domain and a CRD domain. The nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 40.
  • amino acid sequence of mCL-L2 (amino acids 1-271) shown in SEQ ID NO: 13 is a protein consisting of 271 amino acids, and the nucleotide sequence encoding it (SEQ ID NO: 58) is Consists of 8 13 bases.
  • the nucleotide sequence encoding this protein is shown in SEQ ID NO: 12.
  • a homolog is a nucleic acid or amino acid sequence having a high homology, and having a homology of at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more.
  • a search can be performed using the multiple alignment method (product name: S ⁇ DH ⁇ , Fujitsu).
  • the homology search algorithm the strictest Smith-Waterman algorithm can be used.
  • it can be used through the Internet, such as FASTA and BLAST.
  • the mutants include, for example, alleles (alleles) and single nucleotide polymorphisms (SNPs).
  • the nucleic acid sequence of the present invention includes a mutation in the nucleic acid sequence which is changed within the range of codon degeneracy. Modification of a part of the codon of the nucleic acid sequence is performed by a site-directed mutagenesis method using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification (Mark, DF et al., Proc. Natl. Acad. USA., 81, 5662, 1984), etc., and the resulting artificial gene variants are also included in the nucleic acid sequence of the present invention.
  • the mutated amino acid translated by the mutated codon has properties similar to those of a normal amino acid.
  • Modifications as used herein include, for example, acetylation, acylation, ADP-liposylation, amidation, myristoylation, glycosylation, hydroxylation, phosphorylation, sulphation, formylation, methylation, Modification of polyethylene glycol, lipid bond, nucleotide bond, metal bond (calcium adduct, etc.), fusion with many proteins (albumin, etc.), dimer, etc. can be performed using ordinary techniques. .
  • glycosylation does not occur in E. coli, so if glycosylation is intended, it should be expressed in eukaryotic cells. Insect cells can be used for post-translational glycosylation, similar to mammalian cells.
  • polymorphic variant refers to, for example, a polymorphism caused by a difference in the structure or morphology of chromosomal DNA, a polymorphism caused by a certain gene being changed to an allele, and the like.
  • eukaryotic genes often show polymorphism, which may result in the replacement of one or more amino acids, and even in that case, the activity of the protein is preserved. May be carried.
  • SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 13, 3, 37, 39 or 41 SEQ ID NO: 47 (corresponding to amino acid numbers 11 13 to 27 1 of SEQ ID NO: 2) or sequence Amino acid number 1 1 3 of number 13
  • SEQ ID NO: 47 corresponding to amino acid numbers 11 13 to 27 1 of SEQ ID NO: 2
  • sequence Amino acid number 1 1 3 of number 13 To a gene encoding a protein obtained by artificially modifying the gene encoding the amino acid sequence shown in any one of (1) to (27), wherein the protein has a characteristic function of the gene of the present invention. As long as they are included in the present invention.
  • the protein obtained by artificially modifying the amino acid sequence represented by any one of the amino acid numbers 11 to 27 of 13 is included in the present invention as long as it has the characteristics of the protein of the present invention. Modifications are understood to include substitutions, deletions, additions and / or insertions.
  • the fragment used in the present specification means, for example, any fragment in the amino acid sequence of the above-mentioned CL-L2s, for example, an extracellular domain, an intracellular domain, a transmembrane domain, a collagen-like domain. And a CRD domain, a collectin-like domain, a hydrophobic domain (such as a transmembrane domain), a hydrophilic domain (other than the hydrophobic domain), and the like, and a fragment obtained by fusing these fragments.
  • a fragment having the amino acids of about 113 to 271 forming the CRD domain, a CRD domain and a collagen-like domain are formed. Fragments having about 41-271 amino acids and fragments having about 41-112 amino acids forming a collagen-like domain can be mentioned.
  • a fragment having the 18th to 24th amino acids forming the CRD domain and the collagen-like domain, and about 18 amino acids forming the collagen-like domain A fragment having amino acids Nos.
  • the CL-L2s gene of the present invention can be obtained by any method. May be.
  • the nucleotide sequence encoding CL-L2s of the present invention can be obtained by preparing mRNA from cells expressing the protein and converting it to double-stranded DNA by a conventional method.
  • a guanidine isothiocyanate-calcium chloride method (Chirwin, et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979) can be used.
  • Preparation of poly (A) + RNA from total RNA can be performed using an oligo (dT) -bound carrier, such as affinity chromatography using sepharose or latex particles.
  • RNA obtained as described above is transformed into type III, and the oligo (dT) or random primer or the CL—L2s amino acid sequence complementary to the poly (A) chain present at the 3 ′ end is obtained.
  • a part of the synthetic oligonucleotide was treated with reverse transcriptase as a primer (Mol. Cell Biol., 2, 161, 1982, Mol. Cell Biol., 3, 280, 1983, Gene, 25, 263, 1983).
  • the thus obtained cDNA chain is treated with, for example, E. coli RNaseH, E. coli DNA polymerase 1, and E. coli DNA ligase, and converted into a DNA chain, thereby obtaining a double-stranded cDNA.
  • a cDNA library can be prepared by incorporating this cDNA into a plasmid vector, phage vector, or cosmid vector, transforming E. coli, or performing in vitro packaging, and then transfecting into E. coli. .
  • the plasmid vector that can be used here is not particularly limited as long as it can be replicated and maintained in the host, and the phage vector is not particularly limited as long as it can be propagated in the host.
  • the cloning vector 'for example, P BR 3 2 2, pUC 1 9, ⁇ gt 1 0 ⁇ gt 1 1 , and the like.
  • the vector is preferably a vector having a promoter capable of expressing the CL_L2s gene in a host.
  • a method of incorporating cDNA into a plasmid the method of Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition) can be considered.
  • the method for incorporating cDNA into a phage vector the method of Hyunh et al. (DNA cloning, a practical approach, 1, 9, 1985) can be referred to.
  • Methods for introducing the above expression vector into host cells include, for example, methods such as lipopolyamine method, DEAE-dextran method, Hanahan method, lipofectin method, transfection by calcium phosphate method, microinjection and electroporation. , A Laboratory Manual, second edition). In vitro tronocaging can be easily performed by using a commercially available kit (Stratagene, Amersham).
  • the method of isolating the cDNA encoding the CL-L2s protein from the cDNA library prepared by the above method can be performed by a combination of general cDNA screening methods.
  • a probe labeled with 32 P is prepared, and the colony hybridization method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961, 1975), the plaque hybridization—Millon method (Molecular) Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 2, 108, 1989) can be used to screen for clones containing the desired cDNA.
  • clones can be selected by PCR.
  • a target clone can be selected by using an antibody that recognizes CL-L2s.
  • the cells expressing the CL-L2s gene may be transformed with SDS or proteinase K. Dissolve and perform phenol treatment. Digest unused RNA with liponuclease. The obtained DNA is digested with a restriction enzyme, and the obtained DNA fragment is amplified with phage or cosmid to prepare a library. Then, the target clone is selected, and the CL-L2s gene can be obtained.
  • the nucleotide sequence of the DNA obtained in this manner can be determined by the Maxam-Gilbert method roc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977) or the Sanger method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977).
  • the CL-L2s gene can be obtained by cutting out the above-obtained clone with a restriction enzyme or the like.
  • CL-L2s-expressing cell poly (A) + RNA can be transformed into type III and cloned by the RT-PCR method. It is. Instead of PCR, a probe can be prepared and synthesized based on the CL-L2s base sequence, and a cDNA library can be directly screened to obtain a desired cDNA.
  • the gene of the present invention can be selected from the genes obtained by these methods by confirming the nucleotide sequence of the gene.
  • the gene of the present invention is produced according to a conventional method using nucleic acid chemical synthesis such as the phosphoimidite method (MaUencci, M, D. et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 3185, 1981). You can also.
  • the invention also relates to a vector, characterized in that it comprises a CL-L2s nucleic acid sequence.
  • the vector is not particularly limited as long as it can express the CL-L2s protein, but a plasmid vector, an RNA vector, a DNA vector, a virus vector, a phage vector and the like can be used.
  • pB ADZ manufactured by Invitrogen H is, p RS ETA, pc DN A 2.1, p T rc H is 2 A, p Y
  • CL-L2ScDNA sequence ligated to the expression vector is operably linked to the open motor.
  • Promoters include, for example, phage
  • promoters for use in eukaryotic cells include the CMV promoter, the HSV promoter, the SV40 early and late promoters, the retroviral LTR promoter, the RSV promoter, and the meta-mouthletone promoter.
  • the expression vector may also contain a marker and an enhancer that allow the transformed host to be selected. Markers include a dihydrofolate reductase gene, a neomycin resistance gene, an ampicillin resistance gene, and the like. Enhancers include SV40 Enhansa, cytomegalovirus early Enhansa promoter, adenovirus Enhansa and others.
  • the present invention provides a transformed cell which carries the base sequence of the present invention carried by the vector so that it can be expressed by the above-described vector.
  • the host cells used for the transformed cells in the present specification are preferably animal cells and insect cells, but all host cells capable of expressing the CL-L2s protein in the expression vector of the present invention are used. Cells (including microorganisms).
  • a cell derived from human, a cell derived from fly or silkworm, respectively, can be mentioned.
  • CHO cells For example, CHO cells, COS cells, BHK cells, Vero cells, myeloma cells, HEK293 cells, HeLa cells, Jurkat cells, mouse L cells, mouse C127 cells, mouse FM3A cells Mouse fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes, S2, Sf9, Sf21, High Five (registered trademark) cells, and the like.
  • the microorganism in the present specification includes Escherichia coli, yeast, and the like. For introduction into these hosts, the method described above can be used.
  • the CL-L2s-expressing cell of the present invention can be used for analyzing a collectin pathway involved in infectious disease, immunity and the like. It can also be used for the production of CL-L2s protein or CL-L2s protein having a sugar chain. It can also be used for screening to obtain an agonist or an antagonist for the CL-L2s protein.
  • the present invention also relates to a method for producing a CL-L2s protein, which comprises culturing cells transformed with the above-described nucleotide sequence of the present invention and collecting the produced CL-L2s.
  • Cell culture, protein separation and purification can also be performed by methods known per se.
  • the protein of the present invention itself can be expressed as a recombinant fusion protein for easy isolation, purification and recognition.
  • the recombinant fusion protein is a protein expressed by adding an appropriate peptide chain to the N-terminal side or the C-terminal side or the N-terminal side of a protein expressed by a nucleic acid sequence encoding a target protein.
  • it may be expressed as a fusion protein having an extracellular secretion signal.
  • proteins can be obtained from various raw materials, for example, from protein-producing raw materials such as cultured cells, cultured tissues, transformed cells, etc.
  • Salt precipitation such as ammonium precipitation, gel filtration using Sephadex, etc.
  • ion exchange chromatography hydrophobic chromatography
  • dye gel chromatography electrophoresis
  • dialysis ultrafiltration
  • affinity affinity It can be obtained using a known purification method such as a chromatography method and a high performance liquid chromatography method.
  • SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 36, 38 or 40 SEQ ID NO: 48 (corresponding to base numbers 61 to 107 of SEQ ID NO: 1) or SEQ ID NO: 1
  • a probe for detecting the CL-L2s gene can be set based on the base sequence described in any one of base numbers 493 to 969 of No. 2.
  • primers for amplifying DNA or RNA containing these base sequences can be set.
  • One skilled in the art routinely sets probes and primers based on a given sequence.
  • An oligonucleotide having the set base sequence can be obtained by chemical synthesis. If an appropriate label is added to the oligonucleotide, it can be used for various types of hybridization assays.
  • the oligonucleotide used for the primer should have a length of at least 10 bases, preferably 15 to 50 bases, and the oligonucleotide used for the probe should have a length of 100 bases to full length. desirable.
  • it can be used for detection of a mutation in the gene encoding the CL-L2s protein, detection of SNP, and the like, and thus can be used for diagnosis of a disease caused by a mutation in the CL-L2s gene. For example, it is expected that it can be used for diagnosis of various diseases such as bacterial infectious diseases. It is also useful for gene therapy by introducing and expressing the CL-L2s gene in vivo.
  • the promoter region and enhancer region of the CL-L2s gene present in the genome are the same as JP-A No. 6-181767, J. Immunol., 155, 2477, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 92, 3561, 1995) and the like. These control areas can be obtained by the method described in (1).
  • the promoter region refers to a DNA region that controls the expression of a gene located upstream of the transcription start site
  • the enhancer region refers to an intron, 5 ′ untranslated region, or 3 ′ untranslated region. A DNA region that enhances gene expression.
  • the CL-L2s protein of the present invention is used to elucidate the functions of basic immunity, elucidate the mechanism of onset of various diseases such as bacterial infections, and to further diagnose, prevent and treat the diseases, and could be used for the development of new reagents and medicines. It can also be used as an antigen when producing an antibody against CL-L2s. Furthermore, it can also be used for a screening method for agonist or antagonist.
  • the present invention also relates to agonists that stimulate the activity or activation of CL-L2s of the present invention.
  • the present invention also relates to an antagonist that inhibits the activity or activation of CL-L2s of the present invention.
  • the screening of angonist can be performed using, for example, a competitive experimental system in which a candidate inhibitor and mannose or an antibody are allowed to act on cells expressing the CL-L2s protein, and the candidate ratio is determined based on the binding ratio with mannose.
  • Inhibitors can be screened.
  • Antagonists also include antisense nucleic acids that inhibit expression of the CL_L2s gene.
  • Other screening methods include receptor screening A method of measuring a change in extracellular pH caused by activation (Science, 246, 181-296, 1989) can be mentioned.
  • the present invention relates to a transgenic non-human animal having an altered expression level of the CL-L2s gene.
  • (-1 ⁇ 23 gene includes cDNA encoding hCL-L2s or mCL-L2s, genomic DNA or synthetic DNA.
  • transcription and translation The transgenic non-human animal according to the present invention may be used for studying the function or expression regulation of CL-L2, elucidating the mechanism of a disease in which CL-L2s is expected to be involved, and pharmaceuticals. Screening ⁇ Useful for the development of disease model animals for safety testing.
  • mutations such as deletion, substitution, addition, and Z or insertion are performed at some important sites (enhancers, promoters, introns, etc.) that normally regulate gene expression.
  • the gene By causing the gene to be raised, the gene can be artificially modified so as to increase or decrease as compared with the original gene expression level.
  • This mutation can be introduced by a known method, and a transgenic animal can be obtained.
  • a transgenic animal is an animal in which a foreign gene has been artificially introduced into germ cells by genetic recombination in a narrow sense.In a broad sense, the function of a specific gene is suppressed using antisense RNA. Exogenous genes, including those in which specific genes have been knocked out using embryonic stem cells (ES cells) and those in which point-mutated DNA has been introduced.
  • ES cells embryonic stem cells
  • transgenic animal is taken in a broad sense to include all vertebrates other than humans.
  • Transgenic in the present invention Animals are useful for studying the function or expression regulation of CL-L2s, elucidating the mechanisms of cell-related diseases expressed in humans, and developing disease model animals for drug screening and safety testing It is.
  • Methods for producing transgenic animals include a method in which a gene is directly introduced into a nucleus of a pronuclear stage egg with a micropipette under a phase-contrast microscope (microinjection method, US Pat. No. 4,873,191). Methods include the use of embryonic stem cells (ES cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • a method of introducing a gene into a retrovirus vector or an adenovirus vector and infecting an egg, and a sperm vector method of introducing a gene into an egg via sperm have been developed.
  • the sperm vector method is a gene recombination method in which a foreign gene is introduced into sperm cells by a method such as attachment or electroporation to sperm and then fertilized by an egg to introduce the foreign gene.
  • a method such as attachment or electroporation to sperm and then fertilized by an egg to introduce the foreign gene.
  • site-specific recombination in vivo by the FLP recombinase system of bacteriophage P1 crEZ1OXP recombinase system Saccharomyces cerevisiae can be used.
  • a method of introducing a transgene of a target protein into a non-human animal using a retrovirus there has been reported.
  • the method for producing a transgenic animal by the microinjection method is performed, for example, as follows.
  • a transgene consisting essentially of a promoter involved in the regulation of expression, a gene encoding a specific protein, and a polyA signal is required.
  • the expression mode and expression level of the specific molecule are affected.
  • the transgenic animals created differ between strains depending on the copy number of the introduced transgene and the introduced site on the chromosome. Confirm the expression mode and expression level with. Since it has been found that the expression level changes due to untranslated region ⁇ splicing, an intron sequence to be spliced may be introduced before the polyA signal. It is important to use as high a gene as possible to introduce a gene into a fertilized egg. Animals used include fertilized egg collection mice (5-6 weeks old), mating male mice, pseudopregnant female mice, vasectomy male mice, and the like.
  • ovulation may be induced by gonadotropin or the like.
  • the fertilized egg is collected, and the gene in the injection pit is injected into the male pronucleus of the egg by microinjection.
  • the transgene was then introduced into the newborn mouse to determine whether the transgene had been introduced. It can be confirmed by a positive cloning method in which a marker gene that is activated only at certain times is inserted.
  • the transcript derived from the transgene is detected by the Northern method or the RT-PCR method.
  • Western blotting may be performed using a specific antibody against the protein or a fragment thereof.
  • the knockout mouse of the present invention has been treated so that the function of the CL-L2s gene is lost.
  • a knockout mouse is a transgenic mouse in which any gene is disrupted by homologous recombination technology to lose its function.
  • embryonic stem cells in which one allele has been modified or destroyed can be selected to produce knockout mice. For example, we manipulated genes during the blastocyst and morula stages of fertilized eggs. Embryonic stem cells are injected to obtain chimeric mice in which cells derived from embryonic stem cells are mixed with cells derived from embryos.
  • this chimeric mouse (a chimera is a single individual formed from somatic cells based on two or more fertilized eggs) is bred to a normal mouse, all of one allele is altered A zygote mouse can be produced. Furthermore, homozygous mice can be produced by crossing heterozygous mice.
  • Homologous recombination refers to recombination that occurs between two genes having the same or very similar nucleotide sequences in the genetic recombination mechanism.
  • PCR can be used to select for cells that have undergone homologous recombination. By performing PCR using a part of the inserted gene and a part of the region expected to be inserted as primers, it can be found that homologous recombination has occurred in the cells in which the amplification product was produced.
  • neomycin resistance gene can be linked to the transgene, and the cells can be selected by neomycin resistance after transfection. Selection can be made easily using known methods and their modifications.
  • the present invention also provides an antibody that recognizes CL-L2s or a fragment thereof.
  • Antibodies of the present invention include, for example, SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 10, 13, 37, 39 or 41, SEQ ID NO: 47 (amino acid numbers 11 3 to 27 of SEQ ID NO: 2). 1) or an antibody against a protein or a fragment thereof having the amino acid sequence of amino acids 11 to 27 of SEQ ID NO: 13 ( an antibody against CL-L2s or a fragment thereof (for example, polyclonal antibody, monoclonal antibody)
  • Antibodies, peptide antibodies) or antisera can be produced by using CL-L2s or a fragment thereof of the present invention as an antigen, according to a method for producing antibodies or antisera known per se.
  • Antibodies that can be controlled eg, antibodies that recognize CRD and collagen-like domains
  • the CL-L2s or a fragment thereof of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a diluent or carrier at a site where the antibody can be produced by administration.
  • complete Freund's adjuvant ⁇ ⁇ incomplete Freund's adjuvant may be administered.
  • Administration is usually performed once every 1 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheds, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • Rats are preferably Wistar and SD rats and BALB / c, C57BLZ6 and ICR mice are preferably used.
  • monoclonal antibody-producing cells When preparing monoclonal antibody-producing cells, select a warm-blooded animal immunized with the antigen, for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained in the above with myeloma cells.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled CL-1L2s described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion procedure can be performed by known methods, for example, the method of Kayla and Milstein (Nature, 256, 495, 1975) and its variants (J. Immunol. Method, 39, 285, 1980, Eur. J. Biochem., 118, 437, 1981, Nature, 285, 446, 1980).
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • lectin poly-L-lysine or DMSO can be appropriately added.
  • myeloma cells include X-63Ag8, NS-1, P3U1, SP2Z0, AP-1 and the like, and preferably SP2Z0.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is 1:20 to 20: 1, and PEG (preferably PEG100 to PEG600) is used. ) Is added at a concentration of about 10 to 80%, and the mixture is incubated at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes, so that cell fusion can be carried out efficiently.
  • Various methods can be used to screen anti-CL-L2s antibody-producing hybridomas. For example, CL-L2s antigen is hybridized directly or together with a carrier to a solid phase (for example, a microplate).
  • Anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or enzyme if mouse used for cell fusion, anti-mouse immunoglobulin antibody is used
  • protein A To detect anti-CL-L2s antibody bound to the solid phase, add the hybridoma culture supernatant to the solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, and label with radioactive substances, enzymes, etc. Then, a method of detecting the anti-CL-L2s monoclonal antibody bound to the solid phase by adding the obtained CL-1L2s, and the like can be mentioned.
  • Selection and cleaning of the anti-CL-L2s monoclonal antibody can be performed by a method known per se or a method analogous thereto. Usually performed in animal cell culture medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Sorting, as the medium for black-learning and breeding, High Priestess dormer good c example with whatever medium so long as it can grow, 1-2 0%, preferably from 1 0 to 2 0% fetal bovine serum , A GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum, a serum-free medium for hybridoma culture, and the like.
  • the culture temperature is preferably about 37 ° C. Culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week Between ⁇ 2 weeks.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the anti-CL-L2s antibody titer in the antiserum described above. That is, as a measurement method, a radioimmunoassay (RIA) method, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, a FIA (fluorescence immunoassay) method, a plaque measurement method, an agglutination reaction method, and the like can be used. A preferred ELISA method is preferred.
  • Screening by the ELISA method can be performed according to the following method. Immobilize the protein prepared by the same procedure as the immunizing antigen on the surface of each well of the ELISA plate. Next, to prevent non-specific adsorption, BSA, MSA, OVA, KLH, gelatin or skim milk are immobilized on each well. The culture supernatant of the hybridoma is added to each of the wells, and the mixture is left for a certain period of time to allow an immune reaction. Wash each well using PBS etc. as a washing solution. It is preferable to add a surfactant to this cleaning solution. An enzyme-labeled secondary antibody is added and left for a certain period of time.
  • i3_galactosidase alkaline phosphatase, peroxidase, and the like can be used. After washing each well with the same washing solution, add the substrate solution of the used labeling enzyme and allow the enzyme reaction to proceed. If the target antibody is present in the added supernatant of the hybridoma culture, the enzyme reaction proceeds and the color of the substrate solution changes.
  • Cloning can be usually performed by a method known per se such as a semi-solid agar method or a limiting dilution method. Specifically, after confirming the level of the antibody producing the target antibody by the above-mentioned method, cloning is performed. To obtain a single clone.
  • a cloning method a limiting dilution method or the like in which hybridoma cells are diluted and cultured so that one colony is formed per 1 well of the culture plate may be used.
  • Cloning by limiting dilution involves using feeder cells to enhance colony formation or using interleukin 6 Cell growth factors may be added.
  • cloning can be performed using FACS and single cell manipulation.
  • the cloned hybridoma is cultured, preferably in a serum-free medium, and an optimal amount of antibody is added to the supernatant.
  • a single hybridoma obtained in this manner can be cultured in a large amount using a flask or a cell culture device, or cultured in the abdominal cavity of an animal (J. Immunol. Meth., 53, 313, 1982), whereby a monoclonal antibody can be obtained.
  • a cell culture medium containing 0 to 20% FCS IMDM, DMEM, RPMI164, MEM, etc.
  • the monoclonal antibody according to the present invention can be made not to cross with other proteins by selecting an antibody that recognizes a peptide specific to CL-L2s.
  • an epitope represented by an amino acid sequence of at least 5 or more consecutive amino acid residues, preferably 7 to 20 amino acids in the amino acid sequence constituting the protein is unique to the protein. It is said to show epitopes.
  • SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 13, 13, 37, 39 or 41 SEQ ID NO: 47 (corresponding to amino acid numbers 11 13 to 271 of SEQ ID NO: 2) Or an amino acid sequence selected from the amino acids described in any of the proteins or fragments thereof having the amino acid sequence of amino acids 11 to 27 of SEQ ID NO: 13 and comprising at least 5 consecutive amino acid residues
  • Monoclonal antibodies that recognize peptides composed of peptides The body can be said to be a monoclonal antibody specific for hCL-L2s or mCL-L2s in the present invention.
  • CL-1L2s You can choose a common episode. Alternatively, if it is a region containing an amino acid sequence specific to each sequence, a monoclonal antibody capable of identifying each protein can be selected.
  • Separation and purification of the anti-CL-L2s monoclonal antibody can be performed according to the immunoglobulin separation and purification method in the same manner as ordinary polyclonal antibody separation and purification.
  • Known purification methods include, for example, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ammonium sulfate precipitation method, adsorption / desorption method using an ion exchanger (for example, DEAE), ultracentrifugation method, and gel filtration.
  • a method such as a specific purification method in which an antibody alone is collected using an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dissociated to obtain the antibody can be performed.
  • human serum albumin is added at a concentration of 0.05 to 2% in order to prevent the formation of aggregates and a decrease in antibody titer during the purification process.
  • amino acids such as glycine and hyaranine, particularly basic amino acids such as lysine, arginine and histidine, sugars such as glucose and mannitol, and salts such as sodium chloride may be added.
  • an IgM antibody since it is known that it is particularly easy to aggregate, it may be treated with 3-propionylactone and acetic anhydride.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier-protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described monoclonal antibody production method. Collect antibodies containing the protein or its fragments. Then, the antibody can be produced by separating and purifying the antibody. Regarding the complex of the immunizing antigen and the carrier protein used for immunizing warm-blooded animals, the type of carrier protein and the mixing ratio between the carrier and the hapten are determined by cross-linking the carrier with the hapten that has been immunized.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced.
  • serum serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of 1 to hapten.
  • About 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 are used.
  • various condensing agents can be used for coupling of the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiopyridyl group, or the like is used. It is possible.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Monoclonal and polyclonal antibodies against CL-L2s or a fragment thereof can be used for diagnosis and treatment of diseases associated with cells expressing CL-L2s.
  • the CL-L 2 s of the present invention can be used for immunological binding to a fragment thereof.
  • One L2s or a fragment thereof can be measured.
  • a method for measuring CL-L2s or a fragment thereof using these antibodies includes, for example, CL-L2s or a fragment thereof using an antibody bound to an insoluble carrier and a labeled antibody.
  • a sandwich method for detecting a sandwich complex formed by reacting fragments, or by reacting a labeled CL-L2s with CL-L2s or a fragment thereof in a sample competitively with an antibody and reacting with the antibody A method of measuring CL-L2s or a fragment thereof in a sample using a competition method for measuring CL-L2s or a fragment thereof in a sample from the amount of labeled antigen thus obtained is exemplified.
  • the immobilized antibody is allowed to react with CL-L2s or a fragment thereof, and then unreacted substances are completely removed by washing, and labeling is performed.
  • Add antibody to form immobilized antibody-CL-L2s-labeled antibody Two-step method or one-step method of simultaneously mixing immobilized antibody, labeled antibody and CL-1L2s or a fragment thereof Can be used.
  • the insoluble carrier used for the measurement examples include synthetic resins such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyester, polyacrylate, nylon, polyacetyl, and fluororesins; and polysaccharides such as cellulose and agarose. , Glass, metal and the like.
  • synthetic resins such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyester, polyacrylate, nylon, polyacetyl, and fluororesins
  • polysaccharides such as cellulose and agarose.
  • Glass, metal and the like As the shape of the insoluble carrier, various shapes such as a tray, a sphere, a fiber, a bar, a disk, a container, a cell, and a test tube can be used.
  • the antibody-adsorbed carrier is stored in a cool place in the presence of a preservative such as sodium azide as appropriate.
  • a known chemical bonding method or physical adsorption method can be used.
  • the chemical conjugation method include a method using dartalaldehyde, N-succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-one-strand lipoxylate and N-succinimidyl-2-maleimidoacetate.
  • Maleimide method used 1-ethyl- 3— (3 —Dimethylaminopropyl) carbodiimide Carpimide method using hydrochloric acid and the like.
  • the maleimide benzoyl-N-hydroxysuccinimide ester method the N-succimidyl-13- (2-pyridyldithio) propionic acid method, the bisdiazobenzidine method, and the dipalmityl lysine method are exemplified.
  • an enzyme As the labeling substance, it is preferable to use an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioactive substance, a metal chelate and the like.
  • enzymes include peroxidase, alkaline phosphatase,] 3-D-galactosidase, lignoic acid dehydrogenase, staphylococcal nuclease, delta-5-steroid isomerase, ⁇ -glycerol phosphate dehydrogenase, and trio.
  • Monophosphate isomerase horseradish peroxidase, asparaginase, glucose oxidase, liponuclease, urease, force cod, glucose-16-phosphate dehydrogenase, dalcoamylase, acetylcholinesterase, etc.
  • fluorescent substance include, for example, fluorescein isocyanate, phycopyriprotein, oral damine, phycoerythrin, phycocyanin, alophycocynin, and orthophthalaldehyde.
  • Isoluminol as a luminous material, lucigenin, luminol, aromatic ⁇ chestnut Gini ⁇ beam ester, imidazole, Akurijiniumu salts and modified esters, luciferin, luciferase, Ekuorin.
  • radioactive substance 1 2 5 I, 1 2 7 I, 1 3 1 I, 1 4 C, 3 H, 3 2 P, although 3 5 S and the like, in particular as long as it can be used in immunoassays not limited to Not limited.
  • a low-molecular-weight hapten such as biotin, dinitrophenyl, pyridoxal, or fluorescamine may be bound to the antibody.
  • horseradish peroxidase is used as the labeling enzyme. This enzyme can react with many substrates and can be easily bound to the antibody by the periodate method.
  • the labeling agent is an enzyme
  • use a substrate and, if necessary, a color former to measure its activity When peroxidase is used as the enzyme, H 2 O 2 is used as a substrate solution, and 2,2′-azino-di- [3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid] ammonium salt (ABTS) is used as a color former.
  • ABTS 2,2′-azino-di- [3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid] ammonium salt
  • ABTS 2,2′-azino-di- [3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid] ammonium salt
  • ABTS 2,2′-azino-di- [3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid] ammonium salt
  • phytate para-nitrophenyl phosphoric acid, etc.
  • i3-D-galactosidase is used as an enzyme
  • fluorescein mono (] 3-D-galactobilanoside) or 4- Methylenverifeniru j3-D-galactopyranoside can be used.
  • the present invention also includes kits of the above-described monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and reagents.
  • Crosslinking agents include N, N'-ortho-phenylenedimaleimide, 4- (N-maleimide methyl) cyclohexanoic acid / N-succinimide ester, 6-maleimidohexanoic acid / N-succinimide ester, 4,4'-one Dithiopyridine and other known crosslinking agents can be used.
  • the reaction of these cross-linking agents with enzymes and antibodies may be performed according to known methods depending on the properties of each cross-linking agent. In some cases, a fragment thereof, for example, Fab ′, Fab, F (ab ′) 2 is used as the antibody.
  • Enzyme-labeled products can be obtained by the same treatment regardless of whether the antibody is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the enzyme-labeled product obtained using the above crosslinking agent is purified by a known method such as affinity chromatography. If manufactured, an immunoassay system with higher sensitivity will be possible.
  • the purified enzyme-labeled antibody is added with thimerosal or glycerin as a stabilizer, or freeze-dried and stored in a cold place.
  • the measurement target is not limited as long as it is a sample containing CL-L2s, such as plasma, serum, blood, urine, tissue fluid, body fluid such as cerebrospinal fluid, various cells and tissues.
  • CL-L2s such as plasma, serum, blood, urine, tissue fluid, body fluid such as cerebrospinal fluid, various cells and tissues.
  • human monoclonal antibodies can be prepared by a method involving transformation with Epstein-Barr virus (EBV), and by fusing the transformed cells with parent cells. And methods for producing chimeric antibodies and humanized antibodies using genetic engineering.
  • a chimeric antibody is an antibody produced by linking immunoglobulin gene fragments of different animals, and a humanized antibody is a mouse or other modified human antibody that is different from that of humans, and determines the complementarity between H and L chains.
  • An antibody in which the primary structure other than the part (CDR) is replaced by the corresponding primary structure of a human antibody.
  • a mouse is first immunized, an antibody variable region (V region) that binds to an antigen is cut out from the mouse monoclonal antibody gene, and a human myeloma-derived antibody constant region (C region) gene To form the chimera gene.
  • V region antibody variable region
  • C region human myeloma-derived antibody constant region
  • a humanized antibody is a method in which only the gene sequence of the antigen binding site (CDR: complementarity determining region) of the antibody molecule is transplanted (CDR grafting) to the human antibody gene, and the CDR of the antibody molecule is removed. This is an antibody obtained by humanizing all the molecules. It is said that this antibody has less antigenicity and higher safety than human, mouse, and chimeric antibodies because it has fewer mouse antibody parts.
  • CDR complementarity determining region
  • the parental cells for the production of human monoclonal antibodies can be compared with the parental cells of the mouse using the SHM-D33 strain (ATC C CRL 168) or the RF-S1 strain, which is a human / mouse heteromyeloma. An equivalent high fusion efficiency is obtained. Eight hybridomas obtained using these parent cells can be cloned without a single feeder cell, and can produce IgG type antibodies relatively stably and in large quantities. For parental cell culture, an ERDF medium supplemented with 15% FCS is used, and the other procedures are the same as for the mouse. In order to prepare an IgG type human monoclonal antibody, it is preferable to use human lymphocytes sufficiently sensitized with an antigen from peripheral blood.
  • the CL-L2s polynucleotide or protein may be used for diagnosis, prevention and treatment of various diseases such as bacterial infections and the like, and development of reagents and medicaments therefor.
  • the components of the pharmaceutical composition of the present invention include CL-L2s polynucleotide or protein, a substance that stimulates or inhibits the function of CL-L2s protein, a substance such as an antibody against CL-L2s protein. (Hereinafter referred to as CL-L2s related substances).
  • CL-L2s related substances can be used as it is or after being subjected to various treatments such as dilution in water, but can be used by blending it with pharmaceuticals, quasi-drugs, and the like.
  • the compounding amount of the substance is appropriately selected depending on the product. However, in the case of a whole administration preparation, it is usually 0.001 to 50% by weight, particularly 0.01 to 1% by weight. If it is less than 0.001%, satisfactory tear secretion-promoting action may not be observed. Etc. may be impaired.
  • transmucosal administration in addition to the oral administration and intravenous administration described above, transmucosal administration, transdermal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, rectal administration and the like can be appropriately selected.
  • the CL-L2s-related substance of the present invention may be contained in the preparation as a salt.
  • Pharmaceutically acceptable salts include, for example, salts with bases such as inorganic bases and organic bases, and acid addition salts such as inorganic acids, organic acids, basic or acidic amino acids, and the like.
  • bases such as inorganic bases and organic bases
  • acid addition salts such as inorganic acids, organic acids, basic or acidic amino acids, and the like.
  • the inorganic base include sodium metal, alkaline metal such as potassium, alkaline earth metal such as calcium and magnesium, aluminum, ammonium, and the like.
  • Examples of the organic base include primary amines such as ethanolamine, getylamine, and jetanoyl. Lamine, dicyclohexylamine, N, N '
  • tertiary amines such as triamine, trimethylamine, triethylamine, pyridin, picoline, and triethanolamine.
  • the inorganic acid include hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • Organic acids include, for example, formic acid, acetic acid, lactic acid, trifluoroacetic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, benzoic acid, citric acid, succinic acid, malic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid , Benzenesulfonic acid, P-toluenesulfonic acid and the like.
  • the basic amino acid include arginine, lysine, ordinine and the like.
  • the acidic amino acid include aspartic acid and glutamic acid.
  • the dosage form for oral administration includes powders, granules, capsules, pills, tablets, elixirs, suspensions, emulsions, syrups, and the like, and can be appropriately selected.
  • these preparations can be modified such as sustained release, stabilization, easy disintegration, difficult disintegration, enteric coating, and easy absorption.
  • a dosage form for topical administration in the oral cavity there are a chewable agent, a sublingual agent, a puccal agent, a troche, an ointment, a patch, a liquid, and the like, which can be appropriately selected.
  • these preparations can be modified such as sustained release, stabilization, easy disintegration, difficult disintegration, enteric coating, and easy absorption.
  • DDS drug delivery system
  • the components of a DDS are basically drugs, drug release modules, Each component is preferably a drug with a short half-life, in which the blood concentration decreases rapidly when release is stopped, and a sheath that does not react with the living tissue at the site of administration is preferable. It is preferable to have a treatment program that maintains the best drug concentration over a given period.
  • the drug release module basically has a drug reservoir, a release controller, an energy source and a release hole or release surface. It is not necessary to have all of these basic components, and the best mode can be selected by adding or deleting as appropriate.
  • Materials that can be used for DDS include polymers, cyclodextrin derivatives, lecithin, and the like.
  • Polymers include insoluble polymers (silicone, ethylene / biel acetate copolymer, ethylene / vinyl alcohol copolymer, ethyl cellulose, cellulose acetate, etc.), water-soluble polymers and hydroxygel-forming polymers (polyacrylamide) , Polyhydroxyethyl methacrylate cross-linked product, polyacryl cross-linked product, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, water-soluble cellulose derivative, cross-linked poloxamer, chitin, chitosan, etc., slowly soluble polymer (ethyl cellulose, methyl vinyl acetate) Gastric soluble polymers (hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropyl cellulose, carmellose sodium, macrogol, polyvinylpyrrolidone, methacrylate methacrylate) Aminoethyl / methyl methacryl
  • partial esters of silicone, ethylene / vinyl acetate copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, methyl vinyl ether / maleic anhydride copolymer can be used for controlling drug release, and cellulose acetate is used for osmotic pumps.
  • Ethyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose can be used as a membrane material for sustained-release preparations, and crosslinked polyacryl can be used as a mucoadhesive.
  • solvents, excipients, coatings, bases, binders, lubricants, etc. depend on the dosage form (known dosage forms such as oral dosage forms, injections, suppositories, etc.).
  • stearic acid and its salts talc, waxes, wheat starch, macrogol, hydrogenated vegetable oils, sucrose fatty acid esters, polyethylene glycol,
  • Thickener Carmellose sodium, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl alcohol, tragacanth, gum arabic, sodium alginate,
  • [Soothing agent] Proforce hydrochloride, lidocaine, benzyl alcohol, [Preservatives] Benzoic acid and its salts, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, inverted soap, benzyl alcohol, phenol, thiromesal, [Flavoring agent] sucrose, saccharin, canzo extract, sorbitol, xylitol, glycerin,
  • Example 1 a search of the EST (Expressed Sequence Tags) database (Example 1), screening of a novel human collectin from a human liver-derived cDNA library by PCR and determination of the nucleotide sequence (Example 2), Screening and base sequence determination by PCR from human kidney cap site cDNA library (Example 3), homology search of new human collectin (Example 4), acquisition of cDNA of novel mouse collectin (Example 4) Example 5), analysis of expression distribution of novel human collectin in human tissues (Example 6), genetic analysis of novel human collectin (Example 7), novel collectin CL-L2-1 and CL-L2-1 (2) Expression distribution analysis in human tissues (Example 8), Construction of novel collectin expression vector PCDNA3.1 / Myc-His (+)-CL-L2-1,2 (Example 9), New collectin Preparation of a stable expression cell line (Example 10) and analysis of the sugar specificity of the novel collectin (Example 11) will be described below.
  • EST
  • Fig. 1 known collectins having a common structure, namely human MBP, human SP-A and human SP-D, and a collectin CL-L derived from human liver that the present inventors have recently successfully isolated.
  • 2 and 3 show the homology of the amino acid residues of No. 1 (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-206 3777).
  • Amino acid residue portions that are recognized are boxed.
  • an overnight search based on EST was performed using the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) of the CRD (sugar chain recognition region) responsible for the lectin activity of CL-L1.
  • Example 2 Screening of human liver-derived cDNA library by PCR and determination of nucleotide sequence
  • a consensus sequence was prepared from the nucleotide sequences of the 10 clones described above (SEQ ID NO: 15), and the consensus sequence obtained in Example 1 was cloned to clone the 5 ′ upstream region of the cDNA of the novel human collectin.
  • CAP1 (5'-agattttattgtatagciigg-3 '(SEQ ID NO: 16), CAP 2 (5'-ctgggtaataattacataatg-3' (SEQ ID NO: 17)) and cDNA derived from human liver Primer of a part of the vector region of the library- ⁇ TriplEx-Fl (5'-aagc tccgagatc tggacgag-3 '(SEQ ID NO: 18)), ⁇ TriplEx-F2 (5'-ctcgggaagcgcgccat tgtg-3' (SEQ ID NO: 1) 9)) the PE App It was synthesized using 392 ADN AZ RNA synthesizer manufactured by lied Biosystems and screened by PCR as follows (Fig. 4).
  • the first PCR was performed using a cDNA library derived from human liver (manufactured by Clontech) as a template for screening by PCR.
  • the reaction mixture consisted of a total volume of 50 U trowel, LA PCR Buffer II (without Mg 2 + ), 2.5 mM MgC 12, 2 ⁇ M ⁇ A each of dATP, d CTP, d GTP and d TTP ( As described above, all the products were manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. and contained l / L, a human liver-derived cDNA library (manufactured by Clontech), 0.5 zMATripl Ex-Fl primer, and 0.5 M CAP1 primer.
  • PCR was performed by heat denaturation at 95 ° C for 20 seconds, annealing at 20 ° C for 20 seconds, and extension reaction at 90 ° C for 90 seconds for 35 cycles. The activity was performed at 95 ° C for 5 minutes and finally at 72 ° C for 5 minutes. After the end of the first CRC, the second CRC was performed.
  • the 1st PCR product lL was type I
  • the primer used was ⁇ TriplEx-II primer and CAP2 primer
  • the same reaction composition and program as the 1st PCR was used (however, the number of cycles was 25 ).
  • the above PCR was performed by GeneAmp PCR System 9700 manufactured by PE Applied Bios ystenis.
  • the band was excised from the gel, frozen at 180 ° C for 10 minutes, and centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes. The supernatant was purified by ethanol precipitation.
  • the purified DNA fragment was inserted into Novagen pT7Blue Vector, and the vector was transformed into competent cell XL1-Blue cells.
  • the transformant was cultured in an LB medium (100 g / mL ampicillin), the plasmid was extracted by the alkaline SDS method, and the base was extracted with a BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit (PE Applied Biosystems) and an ABI PRISM 377 sequencer. The sequence was determined.
  • Primers are M13 Universal Primer (5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3 '(SEQ ID NO: 20)) and M13 Reverse primer (5'-caggaaacagc tgac-3' (SEQ ID NO: 21)) (both primers were synthesized in the same manner as the CAP1 primer) ) Was used.
  • the resulting nucleotide sequence was found to be a sequence that is 575 bases longer from the 3 'end to the N-terminal side of the CAP2 primer (the amino acid number of CL-L2-10RF shown in Fig. 4). 68-271, or the region corresponding to amino acid numbers 42-245 of CL-L2-20RF).
  • a slight difference was recognized from the base sequence of the 5 ′ terminal region of the consensus sequence of EST obtained in Example 1.
  • CAP3 (5'-ggtcctatgtcaccggaatc-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • CAP4 (5'-ttccatgacgacccacactgc-3' (SEQ ID NO: 23)) were obtained using a 392A DNA / RNA synthesizer manufactured by PE Applied Biosystems. It was synthesized and screened by PCR using capsite cDNA as follows (Fig. 4).
  • Cap Site cDNA and Human Kidney were used to perform the first PCR using the attached 1RC2 primer (5'-caagg cgccacagcgtatg-3 '(SEQ ID NO: 24)) and CAP3 primer. went.
  • the reaction mixture was made up of a total volume of 50 trowels, LA PCR Buffer II (without Mg 2 + ), 2.5 mM MgC12, and 200 / M each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (hereinafter 1L, Cap Site cDNA Human Kidney, 0.1RC2 primer (all NIPPON GENE), and 0.5M CAP3 primer.
  • PCR heat denaturation 95: 20 seconds, annealing Ring 20 seconds at 60 ° C, elongation reaction 7 35 cycles of 60 seconds at 2 ° C, and heat denaturation at 95 ° C 5 minutes before repeated reaction, and finally elongation reaction 72 ° C was performed with a program that included 10 minutes.
  • the second PCR was performed.
  • the 1st PCR product was made 1 L and the primer was the same as the 1st PCR, using the attached 2R C2 primer (5'-gtacgccacagcgtatgatgc-3 '(SEQ ID NO: 25)) and CAP4 primer.
  • the reaction was performed using the reaction composition and program (the number of cycles was 25).
  • the above PCR was performed using GeneAmp PCR System 9700 manufactured by PE Applied Biosystems. After confirming the obtained PCR product by agarose gel electrophoresis, the band was excised from the gel, frozen at 180 ° C for 10 minutes, and then centrifuged at 150,000 rpm for 10 minutes. The supernatant was purified by ethanol precipitation.
  • the purified DNA fragment was inserted into Novagen pT7Blue Vector, and this vector was transformed into competent cell XL Blue cells.
  • the transformant was cultured in an LB medium (100 xg / ml ampicillin), the plasmid was extracted by the SDS method, and the BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit and ABI PRIS M377 sequencer manufactured by PE Applied Biosystems were used. The nucleotide sequence was determined.
  • M13 Universa 1 primer (5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3 '(SEQ ID NO: 20)) and M13 Reverse primer (5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NO: 21)) were used.
  • the two types of base sequences obtained as a result are a sequence (SEQ ID NO: 1) that is N-terminally longer by 492 bases than the base sequence obtained in Example 2 and the base sequence obtained in Example 2 It was found that the sequence was 274 bases longer on the side (SEQ ID NO: 3).
  • the CL-L2 obtained here has an ORF (transcribing frame) of 813 bases (SEQ ID NO: 1), and the amino acid of 271 shown in SEQ ID NO: 2 CDNA encoding CL (L—L 2—1), and 735 bases
  • ORF transcription open reading frame
  • SEQ ID NO: 3 Two types of cDNA having ORF (transcription open reading frame) of the present invention (SEQ ID NO: 3) and encoding 245 amino acids shown in SEQ ID NO: 4 were obtained.
  • a variant encoded by amino acids 141 to 731 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 in which the 18th to 65th amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 have been deleted (SEQ ID NO: 6)
  • a variant encoded by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 which is deleted by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 from which the amino acid sequence at positions 18 to 41 is deleted (SEQ ID NO: 8)
  • a variant encoded by nucleotides 141 to 803 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 in which the amino acids at positions 42 to 65 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 have been deleted (SEQ ID NO: 10 ) was gotten.
  • the mouse liver cDNA library MCL_L2 gene could be obtained by performing the above screening.
  • the resulting cDNA clone of mCL-L2 has a ⁇ RF (transcription open reading frame) of 813 bases (SEQ ID NO: 12) and encodes the 271 amino acid shown in SEQ ID NO: 13. Was confirmed.
  • Example 6 Analysis of expression distribution of novel collectin in human tissues
  • RTF1 5′-agat tccggtgacataggacc-3 ′ (distribution! J number 26)
  • RTR1 can be used to amplify the sugar chain recognition region from the neck region of the obtained cDNA of the novel collectin.
  • RNA from various human tissues (1) brain, (2) heart, (3) kidney, (4) liver, (5) lung, (6) trachea, (7) bone marrow, (8) colon, ( 9) small intestine, (10) spleen, (1 1) stomach, (12) thymus, (13) mammary gland, (14) prostate, (15) skeletal muscle, (16) testis, (17) ) Uterus, (18) cerebellum, (19) fetal brain, (20) fetal liver, (21) spinal cord, (22) placenta, (23) adrenal gland, (24) kidney, (2) 5) RT-PCR was performed using MALA PCR KIT (AMV) VER1.1 (Takara Shuzo) using salivary glands and (26) thyroid as templates. First, a reverse transcription reaction was performed with the following reaction composition.
  • AMV MALA PCR KIT
  • VER1.1 Takara Shuzo
  • reaction composition 1 ⁇ / L RNase inhibitor, 2 g RNA, total volume
  • the volume was adjusted to 40 L with RNase-free distilled water.
  • the reaction composition not containing reverse transcriptase was also adjusted to serve as a negative control.
  • a reverse transcription reaction was performed.
  • LAPCR was performed in 28 cycles and 35 cycles, respectively, with the following reaction composition. 2.
  • the reaction products were separated by 1.5% agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide solution (0.1 gZmL), and the electrophoresis pattern was confirmed with a transilluminator to identify the expressed tissues.
  • RT-PCR was performed to amplify a part of the i3-actin gene in each tissue, and the RNA was corrected.
  • the method was the same as above, and the reverse transcription reaction and PCR were performed to make a determination.
  • the results are shown in FIG. 7, where the novel collectin of the present invention is strongly expressed in the kidney (lane 3) by 28 cycles of PCR, and is otherwise expressed in the liver (lane 4), the small intestine (lane 9), and the thymus (lane). 12), fetal liver (lane 20), spinal cord (lane 21), adrenal gland (lane 23), and expression in tongue (lane 24).
  • the expression of the novel collectin was strong or weak, ubiquitous expression was confirmed in all tissues tested.
  • Example 7 Genetic analysis of a novel collectin
  • hCL-L2-1 SEQ ID NO: 1
  • mCL-L2 SEQ ID NO: 12
  • the collectins analyzed were proteins of one of the various collectin families shown in Fig. 8 (in the figure, CL-Ll and CL-P1 were recently isolated by the present inventors). Based on the data obtained by searching each amino acid sequence from the Bank database, multiple alignments were created by the clustalw method using the lectin domain-containing region, and the NJ method was used based on these. (neighbor-joiningfe), a genetic phylogenetic tree was created using the Pyl ipversion 3.57cpackage program.
  • one cluster was formed by SP-D, P-CL-43, and P-con glutinin, and clusters were separately formed by MBP and SP_A, respectively.
  • the gene did not belong to these clusters, but belonged to the same cluster as CL-L1 and was presumed to be a homologue of CL_L1.
  • CL-L2-1 SEQ ID NO: 1 of the present invention shows kidney (lane 3), liver (lane 4) and small intestine (lane 9) in 28 cycles of PCR. High expression in the thymus (lane 12), fetal liver (lane 20), spinal cord (lane 21), adrenal gland (lane 23), kidney (lane 24), and 35 cycles of P Although the expression of CL-L2-1 (SEQ ID NO: 1) was observed in CR, ubiquitous expression was confirmed in all tissues tested.
  • CL-L2-2 SEQ ID NO: 3) is strongly expressed in the kidney (lane 3) in PCR of 28 cycles, and CL-L2-2 (SEQ ID NO: 3) in PCR of 35 cycles. Expression of 3) is low in the kidney (lane 3) and in the prostate (lane 14), testis (lane 16), spinal cord (lane 21) and placenta (lane 22). Was confirmed.
  • the transformant was cultured in LB medium (100 ⁇ g / ml ampicillin), the plasmid was extracted by the alkaline SDS method, and the base sequence was sequenced using a BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit manufactured by PE Applied Biosystems and ABI PRISM 377 sequencer. Made a decision.
  • the primers are M13 Universal primer (5'-cgacgt tgtaaaacgacggccagt-3 '(system D number 20)) and M13 Reverse frimmer (b-caggaaacagctatgac-3' (system Column numbers 2 1)) were used.
  • the nucleotide sequence obtained as a result is a mutant of CL-L2-2 (SEQ ID NO: 3) obtained in Example 2, CL_L2-2—V1, CL—L2—2v2 And CL-L2—2 V3.
  • CL-L2-1 shown in SEQ ID NO: 2 contained three types of proteins due to alternative splicing of mRNA.
  • CL-L2-1 V1 SEQ ID NOS: 36, 37
  • CL-L2-lv2 SEQ ID NOs: 38, 39
  • CL-L2-1 V3 SEQ ID NO: No. 40, 4 1).
  • CL—L2—1 V1 has a deletion between amino acid numbers 44 to 91 of CL—L2 — 1 shown in SEQ ID NO: 2 (base number 394 to CL—L2—1 of SEQ ID NO: 1).
  • the amino acid sequence is encoded by nucleotides 25 to 93 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36 (SEQ ID NO: 59).
  • CL-L2_lv2 has a deletion between amino acid numbers 44 to 67 of CL-L2-1 shown in SEQ ID NO: 2 (base number 394 to CL-L2-1 shown in SEQ ID NO: 1).
  • the translation region of CL-L2-1 (SEQ ID NO: 1) was replaced with the CL-L2-1F primer (5-gggaagct tcgatcaggatgagggggaatctggccctggig-3 '(configuration' J number: 33)).
  • d_L2-1R primer (5'-gggctcgagcatgt tctcct tgtcaaactcac-3 '(SEQ ID NO: 34)), and the translation region of the novel collectin (SEQ ID NO: 3) to the CL-L2-2F flymer (3 ⁇ 4-gggaagct Using t ccagcacaatgtggtgggtgcciccga gtc-3 'SEQ ID NO: 35)) and CL-L2-1R primer (SEQ ID NO: 34), a human kidney-derived cDNA library was designated as type III and PCR (Yukara: Amplified by Takara Thermal Cycler MP).
  • the obtained CL-L2-1c DNA was ligated to pT7Blue T-Vector (Novagen) and transformed into E. coli XLI-Blue.
  • the plasmid containing CL-L2-lc DNA was purified from the resulting clone, the nucleotide sequence was confirmed with a sequencer, and the plasmid without errors was digested with the restriction enzymes Hind III and Xho I. Ligation was performed on pcDNA3.1 / Myc-His (+) A vector (manufactured by Invitrogen) digested with the enzyme and purified.
  • the ligated plasmid was transformed into Escherichia coli XLI_Blue, the resulting clone was cultured, the plasmid was purified, and the expression vector pcDNA3.1 / Myc-His (+) A-CL-L2- 1 and 2.
  • the mutants of CL-L21 and CL-L2-2 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 40
  • an expression vector was prepared.
  • the expression vector pcDNA3.1 / Myc-His (+) A-CL-L2-1 and pEGFP-F vector (Clontech) obtained in Example 9 were combined with LIPOFECTAMINE 2000 (LF2 00) Reagent ( The cells were cotransfected into CH0 cells using GIBCOBRL) to cause transient expression.
  • LIPOFECTAMINE 2000 (LF2 00) Reagent The cells were cotransfected into CH0 cells using GIBCOBRL) to cause transient expression.
  • LF2000 Reagent solution LF2000 Reagen t301, utrient Mixture F-12 Ham (Ham's F-12 medium) (manufactured by Sigma)
  • incubate at room temperature for 5 minutes, and prepare the Vector-1 solution.
  • the medium was replaced with Ham's F-12 medium (containing 5% FCS, 0.4 mg / ml Geneticin (manufactured by GI BCOBRL)), and culturing was further performed for 10 days. Medium exchange was performed once during the course.
  • the membrane was washed three times with 100 ml of 0.05% Tween 20 / TBS buffer at room temperature for 20 minutes X 3 times, and detected using a TMB Membrane Peroxidase substrate system (Funakoshi). After confirming the clones with strong color development, the cells in the corresponding 24-well plate were used as a stable expression cell line (CH0 / CL-L2-1).
  • Example 10 1 L of the culture supernatant of the cell line (CH0 / CL-L2-1) that stably expressed the novel collectin prepared in Example 10 was concentrated to 50 ml using VIVAP0RE10 (manufactured by Funakoshi), and then Ni-NTA agarose (Qiagen) was used. Was added to Ni-NTA agarose by incubating overnight at 4 ° C with infiltration at 4 ° C.
  • Ni-NTA Agarosu Poly- filled in Prep Chromatogr aphy Columns Bio-Rad
  • 50 mM of 5ml NaH 2 P0 4, 300mM NaCK 20mM imidazole washed 3 times with 0.05% Tween20 (pH8.0)
  • 20 0 1 of 50mM NaH 2 P0 4, 300mM NaCK 250mM imidazo Ichiru was purified by eluting 5 times with 0.05% Tween20 ( ⁇ .0).
  • the purified new collectin was quantified and used for sugar specificity analysis.
  • the purified novel collectin (l ⁇ g) was dot-blotted using Bio-Dot Microfiltration Apparatus (BIO-RAD) to Immobilon-P membrane (Millipore) for the type of glycan probe whose binding characteristics were to be examined. I After that, each dot was cut into 1 cm pieces, immersed in Blockace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and incubated at room temperature for 1 hour.
  • TBS buffer was diluted to 1 g / ml with various sugar chain probes (first 0 view) solution
  • Tween 20 5 mM CaCl 2 and TBS buffer three times.
  • the CL-1 L2s protein of the present invention has a collectin structure, it is considered to be a substance exhibiting a specific effect on them, and clarification of the functions of basic immunity, various diseases including bacterial infections, etc. It can be used for elucidation of the onset mechanism of diseases and the like, and for its diagnosis, prevention and treatment, and development of reagents and medicaments therefor.

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Description

新規コ
〔技術分野〕
本発明は、 単離されたヒトおよびマウスの新規コレクチン （本明細書 明
において各々 「h CL— L 2」 および 「mCL— L 2」 と称し、 両者を 区別しない場合は単に 「CL一 L 2細」 と称する。 ）遺伝子およびタンパク 質、 それらの相同体、 変異体、 修飾体および多形性変種 (これらを総じ て 「誘導体」 と称する） 、 それらの断片 （以下、 それら全てを 「CL一 L 2 s」 と称する） ならびにそれらの検出に関する。 また、 CL一 L 2 sを含む医薬用、 診断用、 研究用組成物、 それらの製造方法および使用 に関する。 更には、 C L— L 2 sタンパク質のァゴニストおよびアン夕 ゴニスト、 C L _ L 2 sを用いた薬物のスクリ一ニング方法に関する。 更には、 CL— L 2 s遺伝子を含む発現べクタ一、 該発現べクタ一によ つて形質転換された形質転換細胞、 CL一 L 2 sタンパク質に対する抗 体および該抗体を産生する細胞に関する。
〔背景技術〕
生体防御に重要な役割を担っている補体系は免疫グロプリンを認識分 子とし、 補体第一成分である C 1が活性化される古典的経路および細菌 等の異物に補体第三成分である C 3が直接結合する第二経路が知られて いる。 近年これらの補体活性化経路に加えて、 血清レクチンであるマン ノース結合蛋白質 （以下、 MB Pと称する） が異物表面の糖鎖を直接認 識し結合することにより補体系を活性化させるレクチン経路が明らかに された （Sato, T. et al. ； Int. Immunol. , 6, 665-669, 1994) 。
MB Pは C a存在下、 マンノースや N—ァセチルダルコサミン等に特 異的に結合する C型レクチンであり、 その構造は少なくとも（Gly-Xaa-Ya a)nから成るコラーゲン様領域、 糖鎖認識領域 （C RD) を含んでいる。 MB Pと同様にコラーゲン様領域および C RDを有するレクチンはコレ クチンと総称され （Malhotora, R. et al. ； Eur. J. Immunol. , 22, 14 37-1445, 1992) 、 M B P以外にコレクチン一 4 3 (C L— 4 3) 、 サ一 ファクタント蛋白質 A (S P - A) 、 サ一ファクタント蛋白質 D (S P — D) およびゥシコングルチニン （BKg) 等を挙げることができる。 コレクチンはォプソニン活性を有し、 細菌、 ウィルスを始めとする様々 な微生物に対する基礎免疫に関与していると考えられている （Kawasaki, N. et al. ； J. Biochem. , 106, 483-489, 1989、 Ikeda, K. et al. ； J. Biol. Chem. , 262, 7451-7454, 1987、 Ohta, M. et al. ； J. Biol. C em. , 265, 1980-1984, 1990、 Summerf ield, J. A. et al. ； Lancet, 345, 886, 1995) 。
これらのコレクチンは、 第 1図 （a) に示すような、 （1 ) CRDおよ び （2 ) コラーゲン様領域等の特徴的な領域を含む基本構造から構成さ れていることが知られており （Malhortra et al. ； Eur. J. Immunol. , 22, 1437-1445, 1992) 、 この基本構造がコラーゲン様領域においてトリ プルヘリックスを構成することによりサブュニットを形成し、 さらにこ のサブユニットが 3量体、 4量体、 6量体等のオリゴマー構造を形成し ている。
最近、 コレクチンによる非特異的な免疫応答への関与が示唆され、 例 えば、 母親の移行抗体や特異的防御システムが十分に発達していない小 児に対し、 種々の微生物の中和作用や排除に重要な役割を果たしている との報告がなされている （Super et al. ； Lancet, 2, 1236-1239, 198 9) 。 さらに、 宿主の生体防御におけるこれらのコレクチンの役割につい て、 例えば、 MB Pの遺伝子上の変異に起因した MB Pの血中濃度の低 下によつて、 宿主が感染を受けやすくなるという研究結果が報告されて いる （Sumiya et al. ； Lancet, 337, 1569-1570, 1991) 。 また、 ォプ ソニン化不全の血清中 MB P含量は低値を示し （Madsen, H. 0. et al. ； Immuno genetics, 40, 37-44, 1994) 細菌感染を起こしやすいという 報告があり （Garred, P. et al. ； Lancet, 346, 941-943, 1995) 、 M B Pは免疫機構において重要な役割を担っていると考えることができる c 本発明者らは、 以前に B K gおよび MB Pが H 1および H 3タイプの インフルエンザ A型ウィルスの感染や赤血球凝集活性を阻害することを 見出した ( akamiya et al. ； Glycoconj ugate J. , 8， 235, 1991、 Waka miya et al. ； Biochem. Biophys. Res. Comm. , 187, 1270-1278, 199 2) 。 その後さらに、 BKgをコードする c DNAクローンを取得し、 B K gと S P— D等との関連性も見出されている （Suzuki et al. ； Bioch em. Biophys. Res. Comm. , 191, 335-342, 1993) 。
このように、 コレクチンは、 生体防御機構の解明における有用性およ び生理活性物質としての有用性等が期待される物質であり、 このフアミ リーに属する新規分子種の発見は、 感染症の治療の他、 種々の医療分野 そして生物学の分野にも寄与するところ大である。
〔発明の開示〕
本発明は、 基礎免疫の機能の解明、 細菌感染症等を始めとする各種疾 患等の発症機構の解明、 さらにその診断、 予防および治療法、 並びにそ れらのための試薬や医薬の開発に利用できるものを提供することを目的 とする。
すなわち、 本発明は以下の （ 1) 〜 （3 3) をその要旨とするもので ある。
( 1) 配列番号 2のアミノ酸番号 1〜2 7 1に示すアミノ酸 2 7 1個 から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 2に示す アミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは 付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有する夕 ンパク質、 あるいはこれらの誘導体および断片。
( 2 ) 配列番号 4 5 (配列番号 1の塩基番号 2 6 5〜 1 0 7 7に相当） に示す塩基配列、 配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸 配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列も しくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下 でハイブリダィズし、 かつ配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示す アミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコ ードする塩基配列。
( 3 ) 配列番号 4のアミノ酸番号 1〜 2 4 5に示すアミノ酸 2 4 5個 から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 4のアミ ノ酸番号 1〜 2 4 5に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列 番号 4のアミノ酸番号 1〜 2 4 5に示すアミノ酸配列を有するタンパク 質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体および断 片。
( 4 ) 配列番号 4 6 (配列番号 3の塩基番号 1 4 1〜 8 7 5に相当） に示す塩基配列、 配列番号 4のアミノ酸番号 1〜 2 4 5に示すアミノ酸 配列またはその断片をコ一ドする塩基配列、 または、 これら塩基配列も しくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下 でハイプリダイズし、 かつ配列番号 4のアミノ酸番号 1〜 2 4 5に示す アミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコ ードする塩基配列。
( 5 ) 配列番号 4 7 (配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1に相 当） に示すアミノ酸 1 5 9個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミ ノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列 番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1に示すアミノ酸配列を有するタン パク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体およ び断片。
(6) 配列番号 48 (配列番号 1の塩基番号 6 0 1〜 1 0 77に相当） に示す塩基配列、 配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜2 7 1に示すアミ ノ酸配列またはその断片をコ一ドする塩基配列、 または、 これら塩基配 列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条 件下でハイブリダィズし、 かつ配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜2 7 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパ ク質をコードする塩基配列。
(7) (5) に記載のタンパク質の N末端側に （Gly- Xaa-Yaa) n. (伹し nは 1以上 5 0以下の整数を示し、 Xaaおよび Yaaはアミノ酸残基を示し、
Xaaと Yaaは同一アミノ酸残基であっても異なるアミノ酸残基であっても 良い） の構造をさらに含むことを特徴とするタンパク質。
(8) (7) における （Gly-Xaa_Yaa) nが下記群、 すなわち、
Gly-Leu-Lys-Gly-Asp-Al -Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly- Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Met-Gly-Asp- Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly-Lys-Ile-Gly-Pro-Ile- Gly-Ser-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly- Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 49 (配列番号 2 ： ァミノ 酸番号 41〜 1 1 2に相当） ） 、
Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly- Arg- Val- Gly- Pro- Thr- Gly- Glu- Lys-Gly- Asp- Met-Gly- Asp-Lys- Gly- Gin - Lys - Gly - Ser Val_Gly- Arg - His - Gly_Lys - 1 le - Gly - Pro- lie - Gly - Ser - Lys - Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-G.ly- Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 50 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 44〜 1 1 2、 もしくは配列番号 4 ：アミノ酸番号 1 8〜 86に相当） ） 、 Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly- Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 5 1 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 92〜 1 1 2、 もしくは配列番号 4 ： アミノ酸番号 66〜86に相当） ） 、 Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly- Lys-Ile-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp- Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 5 2 (配列番号 2 ： ァミノ酸番号 6 8〜 1 1 2、 もしくは配列番号 4 ： アミ ノ酸番号 42〜8 6に相当） ） 、
Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly- Arg-Val-Gly-Pro-T r-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp- Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 1 1 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 44〜 6 7ぉょび9 2〜 1 1 2、 もしくは 配列番号 4 ： アミノ酸番号 1 8〜41および 6 6〜86に相当） ） 、 Gly-Leu-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly- Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 43 (配列番号 2 ：ァミノ 酸番号 41〜43および 92〜 1 1 2に相当） ） 、
Gly-Leu-Lys-Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly- Arg-His-Gly-Lys-Ile-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp- Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 42 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 4 ：!〜 43および 6 8〜 1 1 2に相当） ） 、 または
Gly-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly- Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp- Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro
(配列番号 44 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 4 1〜6 7ぉょび92〜 1
1 2に相当） ）
を含む配列から選択されることを特徴とする （7) のタンパク質。
(9) (7) または （8) に記載のタンパク質をコードする塩基配列。
( 1 0) (7) または （8) に記載のタンパク質の （Gly- Xaa- Yaa) n の構造の N末端に以下のアミノ酸配列すなわち、
Met-Arg-Gly-Asn-Leu-Ala-Leu-Val-Gly-Val-Leu-I le-Ser-Leu-Ala-Phe- Leu-Ser-Leu-Leu-Pro-Ser-Gly-His-Pro-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala- Cys-Ser-Val-Gln-Ile-Leu-Val-Pro (配列番号 5 3 (配列番号 2 ：ァミノ 酸番号 1〜40に相当） ） をさらに含むことを特徴とするタンパク質。
( 1 1) (7) または （8) に記載のタンパク質の （Gly- Xaa-Yaa) n の構造の N末端に以下のアミノ酸配列すなわち、
Met-Trp-Trp-Val-Pro-Pro-Ser-Pro-Tyr-Gly-Cys-Leu-Pro-Cys-Ala-Leu- Pro (配列番号 54 (配列番号 4 ： アミノ酸番号 1〜 1 7に相当） ） をさ らに含むことを特徴とするタンパク質。
( 1 2) ( 1 0) または （ 1 1) に記載のタンパク質をコードする塩 基配列。
( 1 3) 配列番号 6のアミノ酸番号 1〜 1 9 7に示すアミノ酸 1 9 7 個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 6に示 すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしく は付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番号 6のアミノ酸番号 1 〜 1 9 7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有する タンパク質、 あるいはこれらの誘導体および断片。
(14) 配列番号 5 5 (配列番号 5の塩基番号 141〜 7 3 1に相当） に示す塩基配列、 配列番号 6のアミノ酸番号 1〜 1 9 7に示すアミノ酸 配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列も しくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下 でハイプリダイズし、 かつ配列番号 6のアミノ酸番号 1〜 1 9 7に示す アミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコ ードする塩基配列。
( 1 5 ) 配列番号 8のアミノ酸番号 1〜2 2 1に示すアミノ酸 2 2 1 個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 8のァ ミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配 列番号 8のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸配列を有するタンパ ク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体および 断片。
( 1 6 ) 配列番号 5 6 (配列番号 7の塩基番号 1 4 1〜8 0 3に相当） に示す塩基配列、 配列番号 8のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸 配列またはその断片をコ一ドする塩基配列、 または、 これら塩基配列も しくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下 でハイブリダィズし、 かつ配列番号 8のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示す アミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコ ードする塩基配列。
( 1 7 ) 配列番号 1 0のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸 2 2 1個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 1 0 のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か つ配列番号 1 0のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸配列を有する タンパク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体 および断片。
( 1 8 ) 配列番号 5 7 (配列番号 9の塩基番号 1 4 1〜 8 0 3に相当） に示す塩基配列、 配列番号 1 0のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ 酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列 もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件 下でハイプリダイズし、 かつ配列番号 1 0のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に 示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質 をコードする塩基配列。
( 1 9 ) 配列番号 1 3のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸 2 7 1個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 1 3 のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か つ配列番号 1 3のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸配列を有する タンパク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体 および断片。
( 2 0 ) 配列番号 5 8 (配列番号 1 2の塩基番号 1 5 7〜 9 6 9に相 当） に示す塩基配列、 配列番号 1 3のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すァ ミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基 配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件下でハイブリダィズし、 かつ配列番号 1 3のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパ ク質をコ一ドする塩基配列。
( 2 1 ) 配列番号 3 7のアミノ酸番号 1〜2 2 3に示すアミノ酸 2 2 3個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 3 7 のアミノ酸番号 1〜 2 2 3に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か つ配列番号 3 7のアミノ酸番号 1〜2 2 3に示すアミノ酸配列を有する タンパク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体 または断片。
( 2 2 ) 配列番号 5 9 (配列番号 3 6の塩基番号 2 6 5〜 9 3 3に相 当） に示す塩基配列、 配列番号 3 7のアミノ酸番号 1〜 2 2 3に示すァ ミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基 配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな 条件下でハイプリダイズし、 かつ配列番号 3 7のアミノ酸番号 1〜 2 2 3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパ ク質をコ一ドする塩基配列。
( 2 3 ) 配列番号 3 9のアミノ酸番号 1〜2 4 7に示すアミノ酸 2 4 7個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 3 9 のアミノ酸番号 1〜 2 4 7に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か つ配列番号 3 9のアミノ酸番号 1〜 2 4 7に示すアミノ酸配列を有する タンパク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体 または断片。
( 2 4 ) 配列番号 6 0 (配列番号 3 8の塩基番号 2 6 5〜 1 0 0 5に 相当） に示す塩基配列、 配列番号 3 9のアミノ酸番号 1〜 2 4 7に示す アミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩 基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェント な条件下でハイブリダイズし、 かつ配列番号 3 9のアミノ酸番号 1〜 2 4 7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタン パク質をコードする塩基配列。
( 2 5 ) 配列番号 4 1のアミノ酸番号 1〜 2 4 7に示すアミノ酸 2 4
7個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 4 1 のアミノ酸番号 1〜247に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 か つ配列番号 41のアミノ酸番号 1〜 247に示すアミノ酸配列を有する 夕ンパク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体 または断片。
(2 6) 配列番号 6 1 (配列番号 40の塩基番号 26 5〜 1 0 0 5に 相当） に示す塩基配列、 配列番号 4 1のアミノ酸番号 1〜 247に示す アミノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩 基配列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつ配列番号 4 1のアミノ酸番号 1〜 2 47に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタン パク質をコードする塩基配列。
(2 7) (2) 、 （4) 、 （6) 、 （9) 、 （ 1 2) 、 （ 14) 、 (1 6) 、 （ 1 8) 、 （2 0) 、 （22) 、 （24) または （2 6) に記載 の塩基配列を含むことを特徴とするベクタ一。
(2 8) (2) 、 （4) 、 （6) 、 （9) 、 （ 1 2) 、 （ 14) 、 (1 6) 、 （ 1 8) 、 （20) 、 （2 2) 、 （24) または （2 6) に記載 の塩基配列を発現可能に保持する形質転換細胞。
(29) (2) 、 （4) 、 （6) 、 （9) 、 （1 2) 、 （ 14) 、 (1 6 ) 、 （ 1 8) 、 （2 2) 、 （24) または （2 6) に記載の塩基配列 で形質転換した細胞を培養し、 産生された h CL— L 2 sタンパク質を 採取することを特徴とするタンパク質の製造法。
( 3 0 ) ( 2 0 ) 記載の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、 産生 された mCL— L 2 sタンパク質を採取することを特徴とするタンパク 質の製造法。
(3 1) 細胞が大腸菌、 動物細胞または昆虫細胞である、 （2 9) ま たは （30) に記載の製造法。
(3 2) CL-L 2 s遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェ ニック非ヒト動物。
(3 3) mCL -L 2 s遺伝子の機能を欠損させたノックァゥトマゥ ス。
(34) ( 1) 、 （3) 、 （ 5) 、 （7) 、 （8) 、 （ 1 0) 、 ( 1 1 ) 、 （ 1 3) 、 （1 5) 、 （ 1 7) 、 （ 1 9) 、 （2 1 ) 、 (2 3) または （2 5) に記載のタンパク質またはその断片に対する抗体。
(3 5) ポリクローナル抗体、 モノクロ一ナル抗体またはペプチド抗 体である （34) 記載の抗体。
( 3 6 ) (34) または （3 5) に記載の抗体と CL— L 2 sタンパ ク質またはその断片との免疫学的な結合に基づいて、 該タンパク質また はその斬片を測定する方法。
(3 7) (1) 、 （3) 、 （5) 、 （7) 、 （8) 、 （ 1 0) 、 (1 1) 、 （ 1 3) 、 （ 1 5) 、 （ 1 7) 、 （ 1 9) 、 （2 1) 、 (2 3) または （2 5) に記載のタンパク質の機能を刺激するァゴニスト。
(3 8) (1) 、 （3) 、 （5) 、 （7) 、 （8) 、 （1 0) 、 (1 1) 、 （ 1 3) 、 （ 1 5) 、 （ 1 7) 、 （ 1 9) 、 （2 1 ) 、 (2 3) または （2 5) に記載のタンパク質の機能を阻害するアン夕ゴニスト。
(3 9) (1) 、 （3) 、 （ 5) 、 （7) 、 （8) 、 （ 1 0) 、 (1
1 ) 、 （ 1 3) 、 （1 5) 、 （ 1 7) 、 （ 1 9) 、 （2 1 ) 、 (2 3) または （2 5) に記載のタンパク質を用いることを特徴とする薬物のス クリ一ニング方法。
(40) ( 3 9 ) に記載のスクリーニング方法によって得られた薬物。 〔図面の簡単な説明〕
第 1図は、 従来報告されている主なコレクチンの基本構造 （a) およ びタンパク質 （MB P、 S P— Aおよび S P— D) の概観を示す図であ る。 第 2図は、 従来報告されている 4種のコレクチンのアミノ酸配列の アラインメントの前半部分を示す図である。 第 3図は、 第 2図と同様の アラインメントの後半部分を示す図である。 第 4図は、 本発明の新規コ レクチンの塩基配列を決定するために使用した各プライマ一と、 得られ た新規コレクチンを示す図 （a) 、 (b) である。 第 5図は、 従来報告 されている 4種のコレクチンと、 本発明の新規コレクチン （h CL— L 2— 1 ) のアミノ酸配列のァラインメントの前半部分を示す図である。 第 6図は、 第 5図と同様のアラインメントの後半部分を示す図である。 第 7図は、 本発明の新規コレクチン h CL— L 2の臓器分布を示す、 ヒ トの種々の組織における mRNAの分布の分析結果を示す図である。 第 8図は、 種々のコレクチンの遺伝的系統樹を示す図である。 第 9図は、 本発明の新規コレクチン （h CL— L 2— 1および h CL—L 2— 2) の臓器分布を示す、 ヒ卜の種々の組織における mRNAの分布の分析結 果を示す図である。 第 1 0図は、 本発明の新規コレクチン: CL— L 2 - 1の糖結合特性を示す図である。
〔発明を実施するための最良の形態〕
本発明者らはヒトおよびマウス新規コレクチン遺伝子 （h CL— L 2 および mCL— L 2) のクロ一ニングに成功した。 新規 CL一 L 2の C 末端側には、 基礎免疫に関与すると考えられる CRD (配列番号 2およ び 1 3のァミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1、 配列番号 4のァミノ酸番号 8 7 〜245) ならびに （Gly- Xaa- Yaa) n構造を有するコラーゲン様領域 （配 列番号 2および 1 3のアミノ酸番号 4 1〜 1 1 2、 配列番号 4のァミノ 酸番号 1 8〜86) を有していた。
また、 h CL— L 2には第 4図に示したように、 N末端側のアミノ酸 配列が異なる 2種類のタンパク質 （CL一 L 2— 1および CL— L 2— 2) が存在していた。 具体的には、 CL— L 2— 1 (配列番号 2に示す） の N末端側 （第 1〜43位） アミノ酸と CL— L 2— 2 (配列番号 4に 示す） の N末端側 （第 1〜 1 7位） アミノ酸が異なっており、 その余は 同一であった。 さらに、 C L— L 2— 1の N末端側アミノ酸の第 1〜4 3位にはシグナル配列およびコラーゲン構造 1巻分等が含有されていた が、 CL— L 2— 2の N末端側アミノ酸第 1〜 1 7位にはシグナル配列 およびコラーゲン様構造一巻分は存在しなかった。
加えて、 CL一 L 2— 2には mRN Aのオル夕一ナティブスプライシ ングによって生じる 3種のタンパク質が存在していた。 それらを CL— L 2 - 2 V 1 (配列番号 5、 6) 、 CL-L 2 - 2 V 2 (配列番号 7、 8 ) および C L-L 2 - 2 V 3 (配列番号 9、 1 0) と称す。 C L一 L
2— 2 V 1は、 配列番号 4に示す C L - L 2 - 2のアミノ酸番号 1 8〜 6 5間が欠失 （配列番号 3に示す C L一 L 2 - 2の塩基番号 1 92〜 3
3 5間が欠失） したものであり、 CL— L 2— 2 v 2は、 配列番号 4に 示す C L_ 2— 2のアミノ酸番号 1 8〜4 1間が欠失 （配列番号 3に 示す C L - L 2 - 2の塩基番号 1 9 2〜 2 6 3間が欠失） したものであ り、 CL— L 2— 2 v 3は、 配列番号 4に示す C L— L 2 _ 2のァミノ 酸番号 42〜 6 5間が欠失 （配列番号 3に示す C L— L 2— 2の塩基番 号 2 64〜 3 3 5間が欠失） したものである。 これら 3種のタンパク質 は、 すべて C L一 L 2— 2のコラーゲン様領域内のスプライシングの差 異により生じていた。
さらに、 C L一 L 2— 1には mRN Aのオルターナティブスプライシ ングによって生じる 3種のタンパク質が存在していた。 それらを C L— L 2 - 1 V 1 (配列番号 3 6、 3 7) 、 C L一 L 2— 1 ν 2 (配列番号 3 8, 3 9 ) および C L一 L 2— 1 V 3 (配列番号 40, 41) と称す。 CL— L 2— l v lは、 配列番号 2に示す CL— L 2― 1のアミノ酸番 号 44〜9 1間が欠失 （配列番号 1に示す CL一 L 2 - 1の塩基番号 3 94〜 5 3 7間が欠失） したものであり、 CL一 L 2— 1 ν 2は、 配列 番号 2に示す C L— L 2一 1のアミノ酸番号 44〜 6 7間が欠失 （配列 番号 1に示す C L一 L 2— 1の塩基番号 3 94〜 46 5間が欠失） した ものであり、 CL— L 2— 1 ν 3は、 配列番号 2に示す C L _ L 2— 1 のアミノ酸番号 6 8〜 9 1間が欠失 （配列番号 1に示す C L一 L 2— 1 の塩基番号 4 6 6〜 5 3 7間が欠失） したものである。 これら 3種の夕 ンパク質は、 すべて C L一 L 2— 1のコラーゲン様領域内のスプライシ ングの差異により生じていた。
本明細書において使用する h CL— L 2遺伝子とは、 特記しない限り、 それぞれ配列番号 1に示す h C L— L 2— 1、 配列番号 3に示す h C L — L 2— 2、 配列番号 5に示す h CL— L 2— 2 v l、 配列番号 7に示 す h CL - L 2— 2 v 2、 配列番号 9に示す h C L— L 2— 2 v 3、 配 列番号 3 6に示す h C L— L 2— 1 V 1、 配列番号 3 8に示す h C L - L 2 - 1 V 2 , および配列番号 40に示す h C L— L 2— 1 V 3を包含 する。 本明細書において使用する h CL— L 2タンパク質とは、 特記し ない限り、 それぞれ配列番号 2に示す h C L— L 2— 1、 配列番号 4に 示す h CL— L 2— 2、 配列番号 6に示す h CL— L 2— 2 V 1、 配列 番号 8に示す h CL— L 2— 2 v 2、 配列番号 1 0に示す h C L - L 2 一 2 V 3、 配列番号 3 7に示す h CL— L 2— l v l、 配列番号 3 9に 示す h CL— L 2— 1 ν 2、 および配列番号 4 1に示す h C L - L 2— l v 3を包含する。 また、 それらの相同体、 変異体、 修飾体および多形 性変種 （これらを総じて 「誘導体」 と称する） 、 並びにそれらの断片を 含むものとする。 これらは天然または人工的作製を問わない。 本発明に は前記記載の全てが包含される。
本明細書において使用する mCL— L 2遺伝子とは、 特記しない限り、 配列番号 1 2に示す mCL— L 2を包含する。 本明細書において使用す る mCL— L 2タンパク質とは、 特記しない限り、 それぞれ配列番号 1 3に示す mCL— L 2を包含する。 また、 それらの相同体、 変異体、 修 飾体および多形性変種 （これらを総じて 「誘導体」 と称する） 、 並びに それらの断片を含むものとする。 これらは天然または人工的作製を問わ ない。 本発明には前記記載の全てが包含される。
また、 本発明には、 実質的に配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 47 (配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1に相当） または配列番号 1 3のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1に示すアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列、 および実質的に配列番 号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 4 7 (配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1に相当） または配列番号 1 3のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1に示すアミノ酸配列に類似するアミ ノ酸配列をコードする塩基配列も含まれる。 さらにこれらのアミノ酸配 列を有するタンパク質も含まれる。 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 47 (配列番号 2のアミノ酸番 号 1 1 3〜 2 7 1に相当） または配列番号 1 3のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1示すアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列とは、 配列番 号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 4 7 (配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜2 7 1に相当） または配列番号 1 3のアミノ酸番号 1 1 3〜2 7 1に示すアミノ酸配列を含むタンパク 質と同等の性質を有する範囲内で、 1もしくは数個のアミノ酸の置換、 欠失、 付加および Zまたは挿入等の改変を有するアミノ酸配列をいう。 これらは天然または人工的作製を問わない。
かかる 1または複数のアミノ酸の欠失、 置換及び または付加とは、 新規コレクチンの親水性 ·疎水性、 酸性 ·塩基性、 含有基などに大幅な 変化をきたさず、 （ 1) C a 2+要求性の糖認識構造様領域 （CRD) 及 び （2) コラーゲン様領域の有する各々の基本的な特徴を変えることが 少ない範囲でのアミノ酸の欠失、 置換及び Zまたは付加を称する。 これ までに報告されているコレクチンフアミリーのタンパク質のアミノ酸配 列とその構造に基づき、 例えば （1) C a 2+要求性の糖認識構造様領域 (CRD) において 1〜 1 0程度、 （2) コラーゲン様領域において 1 〜5 0程度、 好ましくは 1〜 1 5のアミノ酸の欠失、 置換及び Zまたは 付加が許容されると考えられる。
そして同等の性質とは、 改変前のアミノ酸配列を含む夕ンパク質固有 の性質、 例えばタンパク質三次構造に関わる特性を称するものとする。 さらに、 本発明には、 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 2、 3 6、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 48 (配列番号 1の塩基番号 6 0 1〜 1 0 7 7に相当） または配列番号 1 2の塩基番号 49 3〜 9 6 9のいずれかに 記載の核酸配列またはその断片を含む核酸配列、 またはこれらに相補的 な核酸配列 （以下、 特定配列と称する） とストリンジェントな条件下八 イブリダイズすることができる核酸配列も含まれる。 本発明におけるス トリンジェントな条件とは、 例えば、 5 XS S C、 5 %デンハート溶液 (0. 1 % B SA、 0. 1 % Ficol 1400、 0. 1 % PVP) 、 0. 5 % SD Sおよび 2 0 ^ gZmL変性サケ精子； DN Aを含有する溶液中で、 37 にて一夜インキュベートし、 ついで室温にて 0. 1 % SD S含有 2 X S S Cで洗浄する条件である。 S S Cの代わりに適宜 S S P Eを使 用してもよい。 この様にして得られた核酸配列は、 少なくとも特定配列 と 5 0 %以上の相同性 （ホモロジ一） を有すると考えられる。 特定配列 とストリンジェントな条件下ハイプリダイズすることができる核酸配列 によってコードされるタンパク質は、 C L一 L 2 sタンパク質と同等の 性質を持つものが多いと考えられ、 CL— L 2 sタンパク質と同等の性 質を有する限り、 該タンパク質も本発明に含まれる。
特に、 配列番号 2に示す h CL-L 2 - 1 (アミノ酸番号 1〜 2 7 1 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 2 7 1個から成るタンパク質であり、 それを コードする塩基配列 （配列番号 4 5) は塩基数 8 1 3個から成る。 該配 列にはシグナル配列、 コラーゲン様ドメイン、 C RDドメイン等の特徴 的なアミノ酸配列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配 列を配列番号 1に示した。
また、 配列番号 4に示す h CL— L 2— 2 (アミノ酸番号 1〜 24 5 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 2 4 5個から成るタンパク質であり、 それを コードする塩基配列 （配列番号 4 6) は塩基数 7 3 5個から成る。 該配 列にはコラーゲン様ドメイン、 CRDドメイン等の特徴的なアミノ酸配 列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号 3 に示した。
また、 配列番号 6に示す h C L— L 2— 2 V 1 (アミノ酸番号 1〜 1 9 7 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 1 9 7個から成るタンパク質であり、 それをコードする塩基配列（配列番号 5 5)は塩基数 5 9 1個から成る。 該配列にはコラーゲン様ドメイン、 C RDドメイン等の特徴的なアミノ 酸配列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配列を配列番 号 5に示した。
また、 配列番号 8に示す h CL— L 2— 2 V 2 (アミノ酸番号 1〜 2 2 1 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 2 2 1個から成るタンパク質であり、 それをコードする塩基配列（配列番号 5 6)は塩基数 6 6 3個から成る。 . 該配列にはコラーゲン様ドメイン、 C RDドメイン等の特徴的なアミノ 酸配列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配列を配列番 号 7に示した。
また、 配列番号 1 0に示す h CL -L 2 - 2 v 3 (アミノ酸番号 1〜 2 2 1 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 2 2 1個から成るタンパク質であり、 それをコ一ドする塩基配列（配列番号 5 7 )は塩基数 6 6 3個から成る。 該配列にはコラーゲン様ドメイン、 C R Dドメイン等の特徴的なアミノ 酸配列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配列を配列番 号 9に示した。
また、 配列番号 3 7に示す h C L— L 2 - 1 V 1 (アミノ酸番号 1〜 2 2 3 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 2 2 3個から成るタンパク質であり、 それをコードする塩基配列（配列番号 5 9 )は塩基数 6 6 9個から成る。 該配列にはコラーゲン様ドメイン、 C R Dドメイン等の特徴的なアミノ 酸配列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配列を配列番 号.3 6に示した。
また、 配列番号 3 9に示す h C L— L 2— 1 V 2 (アミノ酸番号 1〜 2 4 7 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 2 4 7個から成るタンパク質であり、 それをコ一ドする塩基配列（配列番号 6 0 )は塩基数 7 4 1個から成る。 該配列にはコラーゲン様ドメイン、 C R Dドメイン等の特徵的なアミノ '酸配列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配列を配列番 号 3 8に示した。
また、 配列番号 4 1に示す h C L— L 2— 1 V 2 (アミノ酸番号 1〜 2 4 7 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 2 4 7個から成るタンパク質であり、 それをコードする塩基配列（配列番号 6 1 )は塩基数 7 4 1個から成る。 該配列にはコラーゲン様ドメイン、 C R Dドメイン等の特徴的なアミノ 酸配列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配列を配列番 号 4 0に示した。
さらに、 配列番号 1 3に示す m C L— L 2 (アミノ酸番号 1〜 2 7 1 ) のアミノ酸配列はアミノ酸 2 7 1個から成るタンパク質であり、 それを コードする塩基配列 （配列番号 5 8 ) は塩基数 8 1 3個から成る。 該配 列にはコラーゲン様ドメイン、 CRDドメイン等の特徵的なアミノ酸配 列が存在していた。 このタンパク質をコードする塩基配列を配列番号 1 2に示した。
本明細書中で使用する相同体とは、 ホモロジ一が高い核酸配列または アミノ酸配列であり、 ホモロジ一が少なくとも 5 0 %以上、 好ましくは 7 0 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上のものをいう。 配列中に欠失や 挿入が存在する場合には、 ギヤップ結合を許した相同性検索を行うと良 い。 例えば、 マルチプル ·ァライメント （商品名： S〇DH〇、 富士通） の手法を用いて検索することができる。 また、 相同性検索のァルゴリズ ムには、 最も厳密な Smith-Watermanアルゴリズムを用いることができる。 その他、 F A S T Aや B L A S T等、 インタ一ネットを通じて利用する ことができる。
本明細書中で使用する変異体とは、 例えば、 対立遺伝子 （アレル） 、 一ヌクレオチド多型 （Single Nucleotide Polymorphism： S N P) 等を 挙げることができる。 また、 核酸配列の変異はコドンの縮重の範囲内で 変化したものも本発明の核酸配列に含まれる。 核酸配列のコドンの一部 改変は、 常法に従い、 所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチド から成るプライマーを利用した部位特異的変異導入法 （Mark, D. F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 81, 5662, 1984) 等に従って行う ことができる、 得られた人工的遺伝子変異体も本発明の核酸配列に含ま れる。 また、 コドンの縮重の範囲を超えた場合であっても、 変異したコ ドンによって翻訳された変異アミノ酸が、 正常アミノ酸と類似の性質で あることが好ましい。 例えば、 脂肪族アミノ酸であるァラニン、 バリン、 ロイシンおよびイソロイシン間での変異、 中性アミノ酸であるダリシン、 ァラニン、 セリン、 卜レオニン、 バリン、 ロイシン、 イソロイシン、 シ スティン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 プロリン、 トリ ブトファン、 ァスパラギンおよびグルタミン間での変異、 酸性アミノ酸 であるァスパラギン酸およびグルタミン酸間での変異、 塩基性アミノ酸 であるアルギニン、 リジンおよびヒスチジン間での変異、 水酸基を有す るセリンおよび卜レオニン間での変異、 芳香環を有するフエ二ルァラ二 ンおよびチロシン間での変異等、 アミノ酸の性質 ·機能 ·特性等が類似 のものであるのが好ましい。 これら人工的または天然に変異したタンパ ク質も本発明のタンパク質の含まれる。 人工的には、 P C R法を用いて 部位特異的変異を起こすことができ、 その他公知の方法を用いて任意の 場所に変異を起こさせることができる。
本明細書中で使用する修飾体とは、 例えば、 ァセチル化、 ァシル化、 A D P —リポシル化、 アミド化、 ミリストイル化、 グリコシル化、 水酸 化、 リン酸化、 硫酸化、 ホルミル化、 メチル化、 ポリエチレングリコ一 ル化、 脂質結合、 ヌクレオチド結合、 金属結合 （カルシウム付加体等） 、 多のタンパク質 （アルブミン等） との融合体、 二量体等の改変を通常の 技術を用いて施すことができる。 例えば、 グリコシル化は宿主が大腸菌 では起こらないため、 グリコシル化を企図する場合には、 真核細胞に発 現すると良い。 昆虫細胞も哺乳細胞と同様に翻訳後にグリコシル化を行 うため使用することができる。
本明細書中で使用する多型性変種とは、 例えば、 染色体 D N Aの構造 や形態の差異により生じる多型性、 ある遺伝子が対立遺伝子に変化した ために生じる多型性等をいう。 一般に真核生物の遺伝子は多形現象を示 すことが多く、 この現象によって 1個あるいはそれ以上のアミノ酸が置 換される塲合もあり、 また、 その場合であってもタンパク質の活性が保 持される場合もある。 ゆえに、 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0もしくは 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 4 7 (配列番号 2のアミノ酸 番号 1 1 3〜 2 7 1に相当） または配列番号 1 3のアミノ酸番号 1 1 3 〜 2 7 1のいずれかに示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を人工 的に改変したものを用いて得られたタンパク質をコードする遺伝子は、 該タンパク質が本発明の遺伝子の特徴的な機能を有する限り全て本発明 に含まれる。 さらに、 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0もしくは 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 47 (配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1に相当） または配列番号 1 3のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1 のいずれかに示されるアミノ酸配列を人工的に改変したタンパク質は、 本発明のタンパク質の特徴を有する限り全て本発明に含有される。 改変 とは、 置換、 欠失、 付加および/または挿入を含むと解する。
本明細書中で使用する断片とは、 例えば、 上述した C L一 L 2 sが 有するアミノ酸配列中の任意の断片を意味し、例えば、細胞外ドメイン、 細胞内ドメイン、 膜貫通ドメイン、 コラーゲン様ドメイン、 CRDドメ イン、 コレクチン様ドメイン、 疎水性ドメイン （膜貫通ドメイン等） 、 親水性ドメイン （疎水性ドメイン以外） 等を挙げることができ、 またこ れら断片を融合させた断片挙げることができる。
例えば、 配列番号 2に示す h C L-L 2 - 1アミノ酸配列において、 CRDドメインを形成する約 1 1 3〜 2 7 1番目のアミノ酸を有する断 片、 C RDドメインおよびコラ一ゲン様ドメインを形成する約 4 1〜 2 7 1番目のアミノ酸を有する断片、 コラーゲン様ドメインを形成する約 4 1〜 1 1 2番目のアミノ酸を有する断片を挙げることができる。 さら に、 配列番号 4に示す h C L— L 2— 2アミノ酸配列において、 CRD ドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約 1 8〜24 5番目の アミノ酸を有する断片、 コラーゲン様ドメインを形成する約 1 8〜 8 6 番目のアミノ酸を有する断片；配列番号 6に示す h C L-L 2 - 2 v l アミノ酸配列において、 C RDドメインおよびコラ一ゲン様ドメインを 形成する約 1 8〜 1 9 7番目のアミノ酸を有する断片、 コラーゲン様ド メインを形成する約 1 8〜3 8番目のアミノ酸を有する断片；配列番号 8に示す h C L - L 2 - 2 V 2アミノ酸配列において、 C RDドメイン およびコラーゲン様ドメインを形成する約 1 8〜2 2 1番目のアミノ酸 を有する断片、 コラーゲン様ドメインを形成する約 1 8〜 6 2番目のァ ミノ酸を有する断片；配列番号 1 0に示す h C L— L 2— 2 v 3アミノ 酸配列において、 C RDドメインおよびコラ一ゲン様ドメインを形成す る約 1 8〜2 2 1番目のアミノ酸を有する断片、 コラーゲン様ドメイン を形成する約 1 8〜6 2番目のアミノ酸を有する断片を挙げることがで きる。 そして、 配列番号 3 7に示す h C L— L 2— 1 V 1アミノ酸配列 において、 C RDドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約 4 1〜2 2 3番目のアミノ酸を有する断片、 コラーゲン様ドメインを形成 する約 4 1〜6 4番目のアミノ酸を有する断片；配列番号 3 9に示す h C L -L 2 - l v 2アミノ酸配列において、 C RDドメインおよびコラ 一ゲン様ドメインを形成する約 4 1〜2 4 7番目のアミノ酸を有する断 片、 コラーゲン様ドメインを形成する約 4 1〜 8 8番目のアミノ酸を有 する断片；配列番号 4 1に示す h CL— L 2 - 1 V 3アミノ酸配列にお いて、 C RDドメインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約 4 1〜 24 7番目のアミノ酸を有する断片、 コラーゲン様ドメインを形成する 約 4 1〜8 8番目のアミノ酸を有する断片を挙げることができる。 また、 配列番号 1 3に示す mC L— L 2アミノ酸配列において、 CRDドメイ ンを形成する約 1 1 3〜2 7 1番目のアミノ酸を有する断片、 C RDド メインおよびコラーゲン様ドメインを形成する約 4 ；!〜 2 7 1番目のァ ミノ酸を有する断片、 コラーゲン様ドメインを形成する約 4 1〜1 1 2 番目のアミノ酸を有する断片を挙げることもできる。
CL -L 2 s遺伝子取得方法
本発明の C L - L 2 s遺伝子は、 いかなる方法で得られるものであつ ても良い。 例えば、 本発明の CL一 L 2 sをコードする塩基配列は、 該 タンパク質を発現している細胞から mRN Aを調製して、 常法により二 本鎖 DNAに変換して得ることができる。 mRNAの調製にはグァニジ ンイソチオシァネート ·塩化カルシウム法 （Chirwin, et al.， Biochemi stry, 18, 5294, 1979) 等を用いることができる。 全 RNAからのポリ (A) +RNAの調製は、 オリゴ （dT) を結合した担体、' 例えばセファ ロースあるいはラテックス粒子等を用いたァフィ二ティークロマトグラ フィ一等を用いて行うことができる。 上記のごとくして得られた RN A を铸型にして、 3 ' 末端に存在するポリ （A) 鎖に相補的なオリゴ （d T) またはランダムプライマ一あるいは CL— L 2 sのアミノ酸配列の 一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして逆転写酵素 で処理し (Mol. Cell Biol., 2, 161， 1982、 Mol. Cell Biol., 3, 280, 1983、 Gene, 25, 263, 1983) 、 この様にして得られた c D N A鎖を、 例えば E.coli RNaseH、 E. col i DNA polymerase 1、 E. col i DNA ligaseで 処理し、 DNA鎖に変換することにより、 二本鎖 c DNAを得ることが できる。 この c DNAをプラスミドベクタ一、 ファージベクター、 コス ミドベクタ一に組み込み、 大腸菌を形質転換して、 あるいはインビトロ パッケージングを施した後、 大腸菌にトランスフエクトすることにより c DNAライブラリーを作製することができる。
ここで用いることができるプラスミ ドベクターとしては、 宿主内で複 製保持されるものであれば特に制限されなく、 ファ一ジベクタ一につい ても宿主内で増殖できるものであれば特に制限されない。 クローニング 用ベクターとして、 '例えば、 P BR 3 2 2、 pUC 1 9、 λ g t 1 0 λ g t 1 1等が挙げられる。 また、 免疫学的スクリーニングに供する場 合には、 宿主内で C L _ L 2 s遺伝子を発現させることができるプロモ 一夕一を有するベクターであることが好ましい。 プラスミドに c DNAを組み込む方法としては、 Maniatisらの方法 （M olecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition) 等を 考に することができる。 また、 ファージベクタ一に c DN Aを組み込む方法 としては、 Hyunhらの方法（DNA cloning, a practical approach, 1， 9, 1985) 等を参考にすることができる。
上記発現ベクターの宿主細胞への導入法としては、 例えば、 リポポリ アミン法、 DEAE—デキストラン法、 ハナハン法、 リポフエクチン法、 リン酸カルシウム法によるトランスフエクシヨン、 マイクロインジェク ションおよびエレクトロポーレーション等の方法 （Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition) がある。 インビ卜ロノ ソケージ ングは、 市販のキット （Stratagene社製、 Amersham社製） を用いること によって簡便に行うことができる。
上記方法によって作製された c DN Aライブラリーから、 CL— L 2 sタンパク質をコードする c DN Aを単離する方法は、 一般的な c DN Aスクリーニング方法を組み合わせて行うことができる。 例えば、 32 P で標識したプロ一ブを作製し、 コロニーハイブリダィゼーシヨン法 （Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961, 1975) 、 プラークハイブリダィゼ —シヨン法 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second editio n、 Cold Spring Harbor Laboratory, 2， 108， 1989) により目的の c D NAを含有するクローンをスクリーニングすることができる。 また、 P C R法によりクローンを選択することもできる。 さらに、 c DNAを発 現しうるベクタ一を用いて c DNAライブラリーを作製した場合には、 CL-L 2 sを認識する抗体を用いることにより目的のクローンを選択 することができる。
また、 C L _ L 2 s遺伝子を発現する細胞より C L— L 2 s遺伝子を 単離する際には、 例えば、 該発現細胞を SD Sまたはプロテナ一ゼ Kを 用いて溶解し、 フエノール処理を行う。 不用の RN Aをリポヌクレア一 ゼにより消化する。 得られる DNAを制限酵素により消化し、 得られる DNA断片をファージまたはコスミ ドで増幅してライブラリ一を作製す る。 その後、 目的のクローンを選択し、 CL一 L 2 s遺伝子を取得する ことができる。
この様にして得られた DNAの塩基配列はマキサム ·ギルバ一ト法 roc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977) またはサンガー法 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977) によって決定することができ る。 CL一 L 2 s遺伝子は、 上記得られたクローンから制限酵素等によ つて切り出すことにより得ることができる。
C L— L 2塩基配列をもとに合成したプライマ一を用いて、 CL—L 2 s発現細胞ポリ （A) +RNAを铸型にして RT— P CR法によりクロ 一二ングすることも可能である。 また、 P CRによらず、 CL一 L 2 s 塩基配列をもとにプローブを作製 ·合成し、 直接 c DNAライブラリー をスクリーニングし、 目的とする c DNAを得ることもできる。 本発明 の遺伝子を、 これらの方法により得られた遺伝子の中から、 その遺伝子 の塩基配列を確認することにより選択することができる。 本発明の遺伝 子は、 例えばホスホイミダイト法 （MaUencci, M, D. et al. , J. Am. C hem. Soc. , 130, 3185, 1981) 等の核酸化学合成を用いる常法に従って 製造することもできる。
発現ベクターの作製方法
本発明はまた、 CL— L 2 s核酸配列を含むことを特徴とするベクタ 一にも関する。 ベクタ一は例えば、 CL— L 2 sタンパク質を発現する ことができるものであれば特に制限されないが、 プラスミ ドベクタ一、 RNAベクター、 DNAベクター、 ウィルスベクター、 ファージベクタ 一等を用いることができる。 具体的には、 Invitrogen社製の p B ADZ H i s , p RS ETA、 p c DN A 2. 1、 p T r c H i s 2 A、 p Y
E S 2、 pBlueBac4. 5、 p c D NA 3. 1、 pSecTag2、 Novagen社製 の p ET、 p BAC、 Promega社製の p G EM、 Stratagene社製の pBlues criptIK p B S , P agescript, p S G、 p S V 2 C A Tもしくは Farma cia社製の p GEX、 pUC l 8/ 1 9 , pBPV、 p SVK3、 p S V
L等が挙げられる。
発現べクタ一にライゲ一ションした CL— L 2 s c DNA配列は、 プ 口モーターに機能的に連結させる。 プロモ—ターは例えば、 ファージ入
PLプロモーター、 E. co li l a c、 t r p、 t a cプロモーター、 SV 40初期および後期プロモータ一、 T 7および T 3プロモーター、 レト ロウィルス LTRプロモーターが挙げられる。 特に、 真核細胞に使用す るプロモータ一としては、 CMVプロモータ一、 HSVプロモーター、 S V 40初期および後期プロモータ一、 レトロウィルス LTRプロモー 夕一、 R SVプロモーター、 メタ口チォネインプロモーターがある。 ま た、 発現べクタ一は、 形質転換した宿主を選択可能にすべきマーカーお よびェンハンサーを含有しても良い。 マ一カーには、 ジヒドロ葉酸還元 酵素遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子、 アンピシリン耐性遺伝子等があ る。 ェンハンサ一には、 S V40ェンハンサ一、 サイトメガロウィルス 初期ェンハンサ一プロモーター、 アデノウイルスェンハンサ一等がある。
形質転換細胞の作製方法
さらに、 本発明は上記したようなベクタ一によりこれらが保持する本 発明の塩基配列を発現可能に保持する形質転換細胞を提供する。 本明細 書における形質転換細胞に用いる宿主細胞としては、 好ましくは動物細 胞および昆虫細胞であるが、 本発明の発現ベクター中の CL一 L 2 s夕 ンパク質を発現することが可能な全ての細胞 （微生物を含む） が挙げら れる。 本明細書における動物細胞もしくは昆虫細胞としては、 それぞれヒト 由来の細胞、 ハエもしくはカイコ由来の細胞が挙げられる。 例えば、 C HO細胞、 COS細胞、 BHK細胞、 V e r o細胞、 ミエローマ細胞、 HEK 2 9 3細胞、 H e L a細胞、 Jurkat細胞、 マウス L細胞、 マウス C 1 2 7細胞、 マウス FM 3 A細胞、 マウス繊維芽細胞、 骨芽細胞、 軟 骨細胞、 S 2、 S f 9, S f 2 1、 High Five (登録商標）細胞等がある。 本明細書における微生物とは、 大腸菌もしくは酵母等が含まれる。 これ ら宿主への導入は上記記載した方法を用いることができる。
本発明の C L一 L 2 s発現細胞は、 感染症、 免疫等に関わるコレクチ ン経路を解析するために用いることができる。 また、 CL— L 2 sタン パク質または糖鎖のある CL— L 2 sタンパク質の製造に利用すること ができる。 CL一 L 2 sタンパク質に対するァゴニストまたはアンタゴ ニストの取得のためのスクリ一二ングにも利用できる。
質取得方法
本発明は、 上記したような本発明の塩基配列で形質転換した細胞を培 養し、 産生された CL一 L 2 sを採取する、 C L一 L 2 sタンパク質の 製造法にも関する。 細胞の培養、 タンパク質の分離、 精製も、 自体公知 の方法によって行うことができる。
本発明のタンパク質は、 それ自体、 単離 ·精製 ·認識しやすいように 組換え融合タンパク質として発現させることができる。 組換え融合タン パク質とは目的タンパク質をコードする核酸配列により発現されたタン パク質の N末端側またはノおよび C末端側に適当なぺプチド鎖を付加し て発現させたタンパク質である。 発現したタンパク質の精製を容易にす る目的で、 細胞外分泌シグナルを有する融合タンパク質として発現させ ても良い。 また、 タンパク質は、 各種原料、 例えば培養細胞、 培養組織、 形質転換細胞等のタンパク質産生原料から従来公知の方法、 例えば硫酸 アンモニゥム沈殿法等の塩析、 セフアデックス等によるゲル濾過法、 ィ オン交換クロマトグラフィー法、 疎水性クロマトグラフィー法、 色素ゲ ルクロマトグラフィー法、 電気泳動法、 透析、 限外濾過法、 ァフィニテ ィ一クロマトグラフィ一法および高速液体クロマトグラフィ一法等の公 知の精製方法を用いて得ることができる。
遺伝子利用方法
配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 2、 3 6、 3 8もしくは 4 0、 配列 番号 4 8 (配列番号 1の塩基番号 6 0 1〜 1 0 7 7に相当） または配列 番号 1 2の塩基番号 4 9 3〜 9 6 9のいずれかに記載の塩基配列に基づ いて、 C L— L 2 s遺伝子を検出するためのプローブを設定することが できる。 あるいは、 これらの塩基配列を含む D N Aや R N Aを増幅する ためのプライマーを設定することができる。 与えられた配列をもとにプ ローブやプライマ一を設定することは、 当業者が日常的に行っている。 設定された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを化学合成によって得 ることができる。 そしてそのオリゴヌクレオチドに適当な標識を付加す れば、 様々な形式のハイプリダイゼ一ションアツセィに利用することが できる。 あるいは P C Rの様な核酸の合成反応に利用することができる。 プライマーに利用するオリゴヌクレオチドは少なくとも 1 0塩基、 好適 には 1 5〜 5 0塩基の長さとするのが望ましく、 プローブに利用するォ リゴヌクレオチドは 1 0 0塩基から全長の長さであることが望ましい。 また、 C L一 L 2 sタンパク質をコードする遺伝子変異の検出および S N Pの検出等にも用いることができことから、 C L— L 2 s遺伝子変異 によって生ずる疾患の診断に用いることができる。 例えば、 細菌感染症 等を始めとする各種疾患等の診断に利用できるものと予想される。 また、 C L - L 2 s遺伝子を生体内に導入し発現させることによる遺伝子治療 にも有用である。 さらに、 本発明が提供する C L— L 2 sの c D N A塩基配列に基づい て、 ゲノム中に存在する C L一 L 2 s遺伝子のプロモーター領域、 ェン ハンサー領域を取得することも可能である。 具体的には特開平 6— 1 8 1 7 6 7号、 J. Immuno l . , 155, 2477, 1995、 Proc. Na t l . Acad. Sc i , USA. , 92, 3561 , 1995) 等と同様の方法でこれらの制御領域の取得が可 能である。 本明細書中で言うプロモーター領域とは転写開始部位の上流 に存在する遺伝子の発現を制御する D N A領域を、 ェンハンサ一領域と はイントロン、 5 ' 非翻訳領域、 または 3 ' 非翻訳領域に存在する遺伝 子の発現を増強する D N A領域を言う。
質利用方法
本発明の C L— L 2 sタンパク質は、 基礎免疫の機能の解明、 細菌感 染症等を始めとする各種疾患等の発症機構の解明、 さらにその診断、 予 防および治療法、 並びにそれらのための試薬や医薬の開発に利用できる 可能性がある。 また、 C L一 L 2 sに対する抗体を作製する際の抗原と して用いることができる。 さらに、 ァゴニス卜またはアンタゴニス卜の スクリーニング方法にも利用できる。
ァゴニストおよびアン夕ゴニスト
本発明は、 また、 本発明の C L— L 2 sの活性または活性化を刺激す るァゴニストにも関する。 本発明は、 また、 本発明の C L一 L 2 sの活 性または活性化を阻害するアン夕ゴニストにも関する。 アン夕ゴニスト のスクリーニングは、 例えば、 C L— L 2 sタンパク質を発現させた細 胞に候補阻害剤とマンノースまたは抗体を作用させる競合的実験系を用 いることができ、 マンノースとの結合割合から候補阻害剤をスクリー二 ングすることができる。 その他、 自体公知の方法により行うことができ る。 また、 アンタゴニストには C L _ L 2 s遺伝子の発現を阻害するァ ンチセンス核酸も含まれる。 他のスクリーニング方法として、 受容体の 活性化によって生じる細胞外 pHの変化を測定する方法 （Science, 246, 181-296, 1989) などを挙げることができる。
トランスジエニック非ヒト動物
本発明は、 CL一 L 2 s遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジ エニック非ヒト動物に関する。 ここで、 （ ー1^ 2 3遺伝子とは、 h C L - L 2 sもしくは mCL— L 2 sをコードする c DNA、 ゲノム DN Aあるいは合成 DNAを含む。 また、 遺伝子の発現には転写と翻訳のい ずれのステップも含まれる。 本発明によるトランスジエニック非ヒト動 物は、 C L— L 2の機能あるいは発現調節の研究、 CL— L 2 sが関与 すると予想される疾患のメカニズム解明、 医薬品のスクリーニング ·安 全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
, 本発明においては、 遺伝子の発現を正常に調節しているいくつかの重 要な部位 (ェンハンサ一、 プロモーター、 イントロン等） の一部に欠失、 置換、 付加および Zまたは挿入などの変異を起こさせることにより、 本 来の遺伝子の発現レベルと比較して上昇または下降するように人工的に 修飾することができる。 この変異の導入は、 公知の方法により行うこと ができ、 トランスジエニック動物を得ることができる。
トランスジエニック動物とは狭義には遺伝子組換えにより、 外来遺伝 子が生殖細胞に人為的に導入された動物のことをいい、 広義にはアンチ センス RN Aを用いて特定の遺伝子の機能を抑えたアンチセンス · トラ ンスジエニック動物や、 胚性幹細胞 （E S細胞） を用いて特定の遺伝子 をノックアウトした動物、 点突然変異 DNAを導入した動物を含み、 個 体発生の初期に外来遺伝子が安定して染色体に導入され、 その子孫に遺 伝形質として伝達され得る動物のことをいう。
本明細書中でいうトランスジエニック動物とはヒト以外のすべての脊 椎動物を含む広義の意味に解する。 本発明におけるトランスジエニック 動物は、 C L— L 2 sの機能あるいは発現調節の研究、 ヒトにおいて発 現している細胞に関連する疾患のメカニズムの解明、 医薬品のスクリ一 ニング ·安全性試験に用いる疾患モデル動物の開発に有用である。
トランスジエニック動物の作製方法は、 位相差顕微鏡下で前核期卵子 の核に、 微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法 （マイクロインジェ クション法、 米国特許第 4 8 7 3 1 9 1号） 、 胚性幹細胞 （E S細胞） を使用する方法などがある。 その他、 レトロウイルスベクターまたはァ デノウィルスべクタ一に遺伝子を揷入し、卵子に感染させる方法、 また、 精子を介して遺伝子を卵子に導入する精子ベクター法等が開発されてい る。
精子べクタ一法とは、 精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレ ーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、 卵子に受精させる ことにより、 外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である （M. Lav i t ran oe t ら、 Ce l l , 57, 717, 1989) 。 あるいはバクテリオファ一ジ P 1の c r e Z 1 o X Pリコンビナーゼ系ゃサッカロマイセス ·セレビシァェ （S accharomyces cerev i s i ae) の F L Pリコンビナ一ゼ系等による i n vivo における部位特異的遺伝子組換えを用いることもできる。 また、 レトロ ウィルスを使用して、 非ヒト動物へ目的タンパク質のトランスジーンを 導入する方法も報告されている。
マイクロインジェクション法によるトランスジエニック動物作製方法 は、 例えば、 以下に示すようにして行われる。
まず、 発現制御に関わるプロモーター、 特定のタンパク質をコードす る遺伝子、 ポリ Aシグナルから基本的に構成されるトランスジ一ンが必 要である。 プロモーター活性により特定分子の発現様式や発現量が左右 され、 また、 導入トランスジーンのコピー数や染色体上の導入部位によ り作製されたトランスジエニック動物が系統間で異なるため、 各系統間 で発現様式 ·発現量を確認する。 非翻訳領域ゃスプライシングにより発 現量が変化することが判明しているため、 予めポリ Aシグナルの前にスプ ライシングされるィントロン配列を導入してもよい。 受精卵に導入する 遺伝子はできるだけ純度の高いものを使用することが重要である。 使用 する動物としては、 受精卵採取用マウス （ 5〜 6週齢） 、 交配用雄マウ ス、 偽妊娠雌マウス、 輸精管結紮雄マウス等が用いられる。
効率よく受精卵を得るために、 ゴナドトロピン等により排卵を誘発し てもよい。 受精卵を回収し、 マイクロインジェクション法にて卵子の雄 性前核にィンジェクションピぺット中の遺伝子を注入する。 注入した卵 子を輸卵管に戻すための動物 （偽妊娠雌マウス等） を用意し、 一匹に対 して約 1 0〜 1 5個を移植する。 その後、 誕生したマウスにトランスジ ーンが導入されているか否かを、 尾の先端部からゲノム D N Aを抽出し、 サザン法あるいは P C R法により トランスジーンを検出するか、 あるい は相同組み換えが起こったときのみに活性化するマーカー遺伝子を揷入 したポジティブクローニング法により確認することができる。 さらに、 トランスジーンの発現を確認するため、 ノザン法もしくは R T— P C R 法により トランスジーン由来転写産物を検出する。 または、 タンパク質 またはその断片に対する特異的抗体によって、 ウェスタンブロッテイン グを行ってもよい。
ノックァゥ卜マウス
本発明のノックアウトマウスは、 C L— L 2 s遺伝子の機能が失われ るように処理されたものである。 ノックァゥトマウスとは相同組換え技 術により任意の遺伝子を破壊し、 機能を欠損させたトランスジエニック マウスをいう。 E S細胞を用いて相同組換えを行い、 一方の対立遺伝子 を改変 ·破壊した胚性幹細胞を選別し、 ノックアウトマウスを作製する ことができる。 例えば、 受精卵の胚盤胞や桑実胚期に遺伝子を操作した 胚性幹細胞を注入して、 胚性幹細胞由来の細胞と胚由来の細胞が混ざつ たキメラマウスを得る。 このキメラマウス （キメラとは、 2個以上の受精 卵に基づいた体細胞で形成される単一個体をいう） と正常マウスを交配 すると、 一方の対立遺伝子の全てが改変 '破壊されたへテロ接合体マウス を作製することができる。 さらに、 ヘテロ接合体マウス同士を交配する ことで、 ホモ接合体マウスが作製できる。
相同組換えとは、 遺伝子組換え機構で塩基配列が同じ、 または非常に 類似している 2つの遺伝子間で起こる組換えのことをいう。 相同組換え を起こした細胞の選別には P C Rを使用することができる。 挿入遺伝子 の一部と揷入が期待される領域の一部をプライマーとして用いる P C R を行い、 増幅産物ができた細胞で相同組換えを起こしていることが判明 できる。 また、 胚幹細胞で発現している遺伝子に相同組み換えを起こさ せる場合には、 導入遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を結合させておき、 導入後に細胞をネオマイシン耐性にさせることにより選択することがで きる等、 公知の方法およびそれらの変法を用いて容易に選択することが できる。
抗体の作製方法
本発明はまた、 C L— L 2 sまたはその断片を認識する抗体を提供す る。 本発明の抗体には例えば、 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 4 7 (配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1 ) または配列番号 1 3のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1のァ ミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片に対する抗体が含まれる ( C L - L 2 sまたはその断片に対する抗体 （例えばポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体、 ペプチド抗体） または抗血清は、 本発明の C L— L 2 sまたはの断片等を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清 の製造法に従って製造することができる。 特に、 C L一 L 2 sの機能を 制御できる抗体 （例えば C R Dおよびコラーゲン様ドメイン等を認識す る抗体） は抗体含有医薬品として有用である。
本発明の CL一 L 2 sまたはその断片は、 投与により抗体産生が可能 な部位にそれ自体または希釈剤、 担体と共に温血動物に対して投与され る。 投与に際して抗体産生を高めるために、 完全フロイントアジュバン トゃ不完全フロイントアジュバントを投与しても良い。 投与は通常 1〜 6週毎に 1回づつ、 計 2〜 1 0回程度行われる。 用いられる温血動物と しては、 例えばサル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒ ッジ、 ャギ、 ニヮトリ等が挙げられるが、 マウスおよびラットが好まし くは用いられる。 ラットには Wistarおよび SD系ラット等が好ましく、 マウスには BALB/c、 C 5 7 BLZ6および I C R系マウス等が好 ましく用いられる。
モノクロ一ナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温 血動物、 例えばマウスから抗体価の認められる個体を選択し、 最終免疫 の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産 生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生 ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば後記の標識化 CL一 L 2 sと抗血清とを反応させた後、 抗体に結 合した標識剤の活性を測定することによりなされる。 融合操作は既知の 方法、 例えばケーラ一とミルスタインの方法 （Nature, 256, 495, 1975) やその変法 (J. Immunol. Method, 39, 285, 1980、 Eur. J. Biochem. , 118, 437, 1981、 Nature, 285, 446, 1980) に従い実施できる。 融合促 進剤としてはポリエチレングリコール （P E G) やセンダイウィルス等 が挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 さらに融合効率を高 めるために、 適宜レクチン、 ポリ一 L—リジンもしくは DMS Oを添加 することもできる。 骨髄腫細胞としては例えば X— 6 3 A g 8、 NS— 1、 P 3U 1、 S P 2Z0、 AP— 1等が挙げられるが、 好ましくは S P 2Z0が用いら れる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ま しい比率は 1 ： 2 0〜2 0 ： 1であり、 P EG (好ましくは P EG 1 0 0 0〜PEG 6 0 0 0 ) を 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加し、 20〜4 0°C、 好ましくは 3 0〜 3 7°Cで 1〜 1 0分間インキュベートすること により効率よく細胞融合を実施できる。 抗 CL— L 2 s抗体産生ハイブ リ ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、 例えば、 C L一 L 2 s抗原を直接または担体と共に吸着させた固相 （例えば、 マイ クロプレート） にハイブリ ド一マ培養上清を添加し、 次に放射性物質や 酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞 がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプ 口ティン Aを加え、 固相に結合した抗 CL— L 2 s抗体を検出する方法、 抗免疫グロプリン抗体またはプロティン Aを吸着させた固相にハイプリ ドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素等で標識した CL一 L 2 s を加え、 固相に結合した抗 CL— L 2 sモノクローナル抗体を検出する 方法等が挙げられる。
抗 CL— L 2 sモノクローナル抗体の選別およびクロ一ニングは、 自 体公知またはそれに準じる方法に従って行うことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジン） を添加した動物細 胞用培地で行われる。 選別、 クロ一ニングおよび育種用培地としては、 ハイプリ ドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い c 例えば、 1〜 2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む RP M l培地、 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地、 またはハイプリ ドーマ培養用無血清培地等を用いることができる。 培養温度は、 好まし くは約 3 7 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週 間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行われる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗 CL一 L 2 s抗体価の 測定と同様にして測定できる。 すなわち、 測定方法としてはラジオィム ノアッセィ （R I A) 法、 酵素免疫測定法 （EL I S A) 法、 F I A (蛍 光ィムノアツセィ） 法、 プラーク測定法、 凝集反応法等を用いることが できるが、 以下に示すような EL I S A法が好ましい。
EL I S A法によるスクリーニングは以下の方法に準じて行うことが できる。 免疫抗原と同様の操作で調製したタンパク質を EL I SAプレ ートの各ゥエルの表面に固定化する。 次に、 非特異的吸着を防止する目 的で、 B SA、 MSA, OVA, KLH、 ゼラチンもしくはスキムミル ク等を各ゥエルに固定化する。 この各ゥエルにハイプリ ド一マ培養上清 液を添加し、 一定時間放置し免疫反応を行わせる。 P B S等を洗浄液と して各ゥエルを洗浄する。 この洗浄液中には界面活性剤を添加すること が好ましい。 酵素標識二次抗体を添加し一定時間放置する。 標識酵素と しては、 i3 _ガラクトシダーゼ、 アル力リフォスファタ一ゼ、 ペルォキ シダ一ゼ等を用いることができる。 同じ洗浄液で各ゥエルを洗浄後、 使 用した標識酵素の基質溶液を添加し酵素反応を行わせる。 添加したハイ プリ ドーマ培養上清液中に目的とする抗体が存在する塲合は酵素反応が 進行し基質溶液の色が変化する。
クローニングは、 通常半固体ァガ一法や限界希釈法等のそれ自体公知 の方法で行うことができ、 具体的には前記の方法で目的とする抗体を産 生するゥエルを確認した後、 クローニングを行いシングルクローンを得 る。 クローニング法としては、 培養プレート 1ゥエル当たりに 1個のコ ロニ一が形成するようにハイプリ ドーマ細胞を希釈して培養する限界希 釈法等を用いると良い。 限界希釈法によるクロ一エングには、 コロニー 形成能と高めるために支持細胞を用いるか、 インターロイキン 6などの 細胞増殖因子を添加しても良い。 その他、 F A C Sおよびシングルセル マ二プレーション法を用いてクローニングすることができる。 クローン 化されたハイプリ ドーマを、 好ましくは無血清培地中で培養し、 至適量 の抗体をその上清に加える。 この様にして得られた単一のハイプリ ドー マは、 フラスコや細胞培養装置を用いて大量培養を行うか、 動物の腹腔 内で培養する （J . Immuno l . Me th. , 53, 313, 1982) ことにより、 モノ クロ一ナル抗体を得ることができる。 フラスコ内で培養を行う場合は、 0〜 2 0 %の F C Sを含む細胞培養用培地 （ I M D M、 D M E M、 R P M I 1 6 4 0および M E M等） を用いて行うことができる。 動物の腹腔 内で培養する場合は、 細胞融合に使用した骨髄腫細胞の由来となった動 物と同種、 同系統の動物または胸腺欠損ヌードマウス等を使用すること が好ましく、 予めプリスタン等の鉱物油を投与してからハイプリ ドーマ を移植する。 1〜 2週間後腹腔内に骨髄腫細胞が増殖し、 モノクローナ ル抗体を含む腹水を得ることができる。
本発明によるモノクローナル抗体は、 C L一 L 2 sに特異的なェピト —プを認識するものを選択することによって、 他のタンパク質と交差し ないものとすることができる。 一般的にそのタンパク質を構成するアミ ノ酸配列の中から、 連続する少なくとも 5以上のアミノ酸残基、 望まし くは 7〜 2 0アミノ酸のアミノ酸配列によって提示されるェピトープは, そのタンパク質に固有のェピトープを示すと言われている。 従って、 例 えば配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1、 配列番号 4 7 (配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1に相当） また は配列番号 1 3のアミノ酸番号 1 1 3〜 2 7 1のアミノ酸配列を有する タンパク質またはその断片のいずれかに記載されたアミノ酸から選択さ れ、 かつ連続する少なくとも 5アミノ酸残基から成るアミノ酸配列を持 つべプチドによって構成されるェピト一プを認識するモノクローナル抗 体は、 本発明における h C L— L 2 sもしくは m C L - L 2 s特異的な モノクローナル抗体といえる。 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 3、 3 7、 3 9もしくは 4 1に記載されたアミノ酸配列の間で保存されたァ ミノ酸配列を選べば、 C L一 L 2 sに共通のェピト一プを選択すること ができる。 あるいは各配列に特異的なアミノ酸配列を含む領域であれば、 それぞれのタンパク質の識別が可能なモノクローナル抗体を選択するこ とができる。
抗 C L一 L 2 sモノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクロ一 ナル抗体の分離精製と同様に免疫グロプリンの分離精製法に従って行う ことができる。 公知の精製法としては、 例えば、 塩析法、 アルコール沈 殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 硫安沈殿法、 イオン交換体 （例えば D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲル濾過法、 抗原結合固相また はプロティン Aもしくはプロテイン G等の活性吸着剤により抗体のみを 採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法のような手法を施す ことができる。 精製過程において凝集物の形成や抗体価の低下を防止す る目的で、 例えばヒト血清アルブミンを 0 . 0 5〜 2 %の濃度で添加す る。 その他、 グリシン、 ひ—ァラニン等のアミノ酸類、 特にリジン、 ァ ルギニンおよびヒスチジン等の塩基性アミノ酸、 グルコースやマンニト ール等の糖類または塩化ナトリウム等の塩類を添加しても良い。 I g M 抗体の場合、 特に凝集しやすいことが知られているため、 ]3—プロピオ ニラクトンおよび無水酢酸で処理しても良い。
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる 方法に従って製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗 原） 自体、 あるいはそれとキャリア一タンパク質との複合体を作り、 上 記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、 該免 疫動物から本発明のタンパク質またはその断片に対する抗体含有物を採 取して、 抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。 温血 動物を免役するために用いられる免疫抗原とキヤリァータンパク質との 複合体に関し、 キヤリァータンパク質の種類およびキヤリァ一とハプテ ンとの混合比は、 キヤリァ一に架橋させて免役したハプテンに対して抗 体が効率よくできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させても良 いが、 例えばゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニ ン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜 2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカップリングさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキ ャリア一のカツプリングには、 種々の縮合剤を用いることができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミ ド活性エステル、 チォ ール基、 ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬などが用いられ る。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自 体あるいは担体、 希釈剤と共に投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバ ントを投与しても良い。 投与は、 通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行われる。 ポリクロ一ナル抗体は上記の方法で免役された温 血動物の血液、 腹水等、 好ましくは血液から採取することができる。 抗 血清中のポリクロ一ナル抗体価の測定は、 上記血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノ クローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従つ て行うことができる。
抗体の利用方法
C L - L 2 sまたはその断片に対するモノクローナル抗体ならびにポ リクローナル抗体は、 C L— L 2 sを発現している細胞に関連する疾病 の診断や治療に利用することが可能である。 これらの抗体を用いて、 本 発明の C L— L 2 sまたはその断片との免疫学的な結合に基づき、 C L 一 L 2 sまたはその断片を測定することができる。 具体的にこれらの抗 体を用いて C L一 L 2 sまたはその断片を測定する方法としては、 例え ば、 不溶性担体に結合させた抗体と標識化抗体とにより C L— L 2 sま たはその断片を反応させて生成したサンドィツチ錯体を検出するサンド ィツチ法、 また、 標識化 C L - L 2 sと検体中の C L— L 2 sまたはそ の断片を抗体と競合的に反応させ、 抗体と反応した標識抗原量から検体 中の C L一 L 2 sまたはその断片を測定する競合法を利用して検体中の C L - L 2 sまたはその断片を測定する方法が挙げられる。
サンドイッチ法による C L— L 2 sまたはその断片の測定においては、 まず、 固定化抗体と C L— L 2 sまたはその断片とを反応させた後、 未 反応物を洗浄によって完全に除去し、 標識化抗体を添加して固定化抗体 - C L - L 2 s標識化抗体を形成させる 2ステツプ法もしくは固定化抗 体、 標識化抗体および C L一 L 2 sまたはその断片を同時に混合する 1 ステップ法などを用いることができる。
測定に使用される不溶性担体は、例えばポリスチレン、ポリエチレン、 ポリプロピレン、 ポリ塩化ビニル、 ポリエステル、 ポリアクリル酸エス テル、 ナイロン、 ポリアセ夕一ル、 フッ素樹脂等の合成樹脂、 セルロー ス、 ァガロース等の多糖類、 ガラス、 金属等が挙げられる。 不溶性担体 の形状としては、 例えば卜レイ状、 球状、 繊維状、 棒状、 盤状、 容器状、 セル、 試験管等の種々の形状を用いることができる。 抗体を吸着した担 体は、 適宜アジ化ナトリウム等の防腐剤の存在下、 冷所に保存する。
抗体の固層化には、 公知の化学的結合法または物理的吸着法を用いる ことができる。 化学的結合法としては例えばダルタルアルデヒドを用い る方法、 N—スクシニイミジル— 4— ( N—マレイミドメチル） シクロ へキサン— 1一力ルポキシレ一トおよび N—スクシニイミジル— 2—マ レイミドアセテートなどを用いるマレイミド法、 1ーェチルー 3— （ 3 —ジメチルァミノプロピル） カルポジィミド塩酸などを用いるカルポジ イミド法が挙げられる。 その他、 マレイミ ドベンゾィル—N—ヒドロキ シサクシニミドエステル法、 N—サクシミジル一 3— ( 2—ピリジルジ チォ） プロピオン酸法、 ビスジァゾ化べンジジン法、 ジパルミチルリジ ン法が挙げられる。 あるいは、 先に被検出物質とェピトープの異なる 2 種類の抗体を反応させて形成させた複合体を、 抗体に対する第 3の抗体 を上記の方法で固層化させておいて捕捉することも可能である。
標識物質としては、 酵素、 蛍光物質、 発光物質、 放射性物質および金 属キレ一卜等を使用するのが好ましい。 酵素としては、 例えばペルォキ シダ一ゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 ]3— D—ガラクトシダーゼ、 リ ンゴ酸デヒドロゲナ一ゼ、 ブドウ球菌ヌクレア一ゼ、 デルター 5—ステ ロイドイソメラーゼ、 α—グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、 トリオ一スホスフエートイソメラーゼ、 西洋わさびパーォキシダーゼ、 ァスパラギナ一ゼ、 グルコースォキシダ一ゼ、 リポヌクレアーゼ、 ウレ ァーゼ、力タラ一ゼ、 グルコース一 6—ホスフエ一トデヒドロゲナ一ゼ、 ダルコアミラーゼ、 アセチルコリンエステラーゼ等が挙げられ、 蛍光物 質としては、 例えばフルォレセインイソチアネート、 フィコピリプロテ イン、 口一ダミン、 フィコエリ トリン、 フィコシァニン、 ァロフィコシ ァニン、 オルトフタルアルデヒド等が挙げられ、 発光物質としてはイソ ルミノール、 ルシゲニン、 ルミノール、 芳香族ァクリジニゥムエステル、 イミダゾール、 ァクリジニゥム塩およびその修飾エステル、 ルシフェリ ン、 ルシフェラーゼ、 ェクオリン等が挙げられ、 放射性物質としては1 2 5 I、 1 2 7 I、 1 3 1 I、 1 4 C、 3 H、 3 2 P、 3 5 S等が挙げられるが、 これら に限らず免疫学的測定法に使用することができるものであれば特に限定 されない。 さらに、 抗体にピオチン、 ジニトロフエニル、 ピリ ドキサ一 ルまたはフルォレサミンの様な低分子ハプテンを結合させても良い。 好 ましくは西洋わさびペルォキシダ一ゼを標識化酵素として用いる。 本酵 素は多くの基質と反応することができ、 過ヨウ素酸法によって容易に抗 体に結合させることができる。
標識化剤が酵素である場合には、 その活性を測定するために基質、 必 要により発色剤を用いる。 酵素としてペルォキシダ一ゼを用いる場合に は、 基質溶液として H 2 0 2を用い、 発色剤として 2， 2 ' 一アジノ―ジ 一 [ 3—ェチルベンズチアゾリンスルホン酸] アンモニゥム塩 （A B T S ) 、 5—ァミノサリチル酸、 オルトフエ二レンジァミン、 4—ァミノ アンチピリン、 3 , 3 ' , 5， 5 ' ーテトラメチルベンジジン等を使用 することができ、 酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質 としてオルト二トロフエニルフォスフエ一ト、 パラ二トロフエ二ルリン 酸等を使用することができ、 酵素に i3— D—ガラクトシダ一ゼを用いる 場合は基質としてフルォレセイン一ジー （]3— D—ガラクトビラノシド）、 4ーメチルゥンベリフエ二ルー j3— D—ガラクトピラノシド等を使用す ることができる。 本発明には、 また、 前述のモノクローナル抗体、 ポリ クローナル抗体および試薬類をキット化したのものも含まれる。
架橋剤としては、 N， N ' —オルトフエ二レンジマレイミド、 4— ( N 一マレイミ ドメチル）シクロへキサン酸 · N—スクシンィミ ドエステル、 6—マレイミドへキサン酸 · N—スクシンイミドエステル、 4 , 4 ' 一 ジチォピリジン、 その他公知の架橋剤が利用可能である。 これらの架橋 剤と酵素および抗体との反応は、 それぞれの架橋剤の性質に応じて既知 の方法に従って行えばよい.。 また、 抗体としては、 場合によっては、 そ のフラグメント、 例えば F a b ' 、 F a b , F ( a b ' ) 2を用いる。 また、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体にかかわらず同様の処 理により酵素標識体を得ることができる。 上記架橋剤を用いて得られる 酵素標識体をァフィ二ティークロマトグラフィー等の公知の方法にて精 製すれば、 更に感度の高い免疫測定系が可能となる。 精製した酵素標識 化抗体は、 安定剤としてチメロサールもしくはグリセリン等を加えて、 あるいは凍結乾燥して冷喑所に保存する。
測定対象は、 血漿、 血清、 血液、 尿、 組織液、 脳脊髄液等の体液、 各種細胞、 組織等、 C L— L 2 sを含む試料であれば限定されない。
ヒト化抗体の作製方法
ヒトに任意の抗原を免疫して抗体を製造することは倫理上不可能であ る。 また、 マウスモノクローナル抗体をヒトの体内に投与すると、 ヒト にとつては異種夕ンパクであるので種々の副作用が起こる危険性がある そこで、 ヒトに抗体を投与する場合にはヒトに対し抗原性を低くした抗 体が好ましい。
ヒトモノクローナル抗体の作製方法には細胞融合法以外にも、 ェプス タイン ·バール （Ep s t e i n- Bar r) ウィルス （E B V ) で形質転換する方 法、 さらにはその形質転換した細胞を親細胞と融合させる方法、 遺伝子 工学を利用しキメラ抗体、 ヒト化抗体を作製する方法などがある。 キメ ラ抗体とは異種の動物の免疫グロプリン遺伝子断片をつなげて作製され た抗体であり、 ヒト化抗体とはマウスなどにヒトにとって異種の抗体を 改変して、 H鎖と L鎖の相補性決定部 （C D R ) 以外の一次構造をヒト の抗体の対応する一次構造に置換した抗体をいう。
キメラ抗体の作製方法として、 まずマウスに免疫し、 そのマウスモノ クローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変部 （V領域） を切 り出し、 ヒト骨髄腫由来の抗体定常部 （C領域） 遺伝子と結合してキメ ラ遺伝子を作製する。 このキメラ遺伝子を宿主細胞で発現させれば、 ヒ ト ·マウス ·モノクローナル抗体が産生できる。 キメラ抗体はヒトに対 する抗原性が少ないため、 ヒト体内に投与する治療用や画像診断用モノ クローナル抗体等として利用できる。 公知のキメラ抗体の関連技術とし て、 特開平 0 5— 3 049 8 9号、 特開平 04— 3 3 0 2 9 5号、 W0910 6649、 特開昭 6 3— 0 3 6 7 8 6号、 特公平 0 6— 9 8 0 2 1号等があ る。
また、 最近キメラ抗体よりも有用であるといわれるヒト化抗体が開発 された。 ヒト化抗体とは抗体分子の抗原結合部位 （CD R ： Complementa ry determining reagion, 相補性決定領域） の遺伝子配列のみをヒト抗 体遺伝子に移植 （CDRグラフティング） し、 抗体分子の CD Rを除い た全分子をヒト化した抗体である。 本抗体はヒト ·マウス ·キメラ抗体 より、 マウスの抗体部分が少ないため、 抗原性が少なく安全性が高いと 言われている。 ヒトモノクローナル抗体作製用の親細胞は、 ヒト/マウ スのヘテロミエ口一マである SHM— D 3 3株 （ATC C CRL 1 6 6 8 ) または RF— S 1株を用いるとマウスの親細胞と同等の高い融 合効率が得られる。 これらの親細胞を用いて得られた八イブリ ドーマは フィーダ一細胞なしでクローニングが可能であり、 I g Gタイプの抗体 を比較的安定にしかも大量に産生することができる。 親細胞の培養には、 1 5 % F C Sを加えた E RD F培地を用い、 その他の操作はマウスの場 合と同様である。 また、 I g Gタイプのヒトモノクローナル抗体を作製 するには抗原で充分に感作されたヒトリンパ球を末梢血から採取して用 いるのが好ましい。 充分に抗原で感作されたリンパ球の取得が困難な場 合には in vitroで抗原感作を行うこともできる。 我が国では現在、 成人 性 T細胞白血病に対するヒト化抗体の臨床試験が行われている。 ヒト化抗 体の製造方法およびその関連技術については、 米国 Genentech社 （W09222 653、 W09845332, W09404679, W09837200, W09404679, ) および英国 Cell tech社 (W0942945U W0942935K 09413805. WO930623K WO9201059, WO 9116927、 W09116928, W09109967、 W08901974, W08901783) 等が特許出願 している。 上記示した方法等を用いることにより、 本発明の抗体をヒト化するこ とができ、 ヒトに投与する場合には非常に有用である。
組成物
C L - L 2 sポリヌクレオチドまたはタンパク質は、 細菌感染症等を 始めとする各種疾患等の診断、 予防および治療法、 並びにそれらのため の試薬や医薬の開発に利用できる可能性がある。
本発明の医薬組成物の成分には、 C L— L 2 sポリヌクレオチドまた はタンパク質、 C L一 L 2 sタンパク質の機能を刺激する物質もしくは 阻害する物資、 C L一 L 2 sタンパク質に対する抗体等の物質 （以下、 C L - L 2 s関連物質） が含まれる。 C L— L 2 s関連物質は、 そのま まあるいは水に希釈する等の各種処理を施して使用することができるが， 医薬品、 医薬部外品等に配合して使用することができる。 この場合、 該 物質の配合量は製品に応じて適宜選択されるところではあるが、 通常全 身投与製剤の場合には、 0 . 0 0 1〜 5 0重量％、 特に 0 . 0 1〜 1 0 重量％とすることができ、 0 . 0 0 1 %より少ないと満足する涙液分泌 促進作用が認められない可能性があり、 また、 5 0 %を越えると製品そ のものの安定性や香味等の特性が損なわれる可能性がある。
投与経路は前記示した経口投与および静脈内投与以外に、 経粘膜投与、 経皮投与、 筋肉内投与、 皮下投与、 直腸内投与等が適宜選択できる。
本発明の C L一 L 2 s関連物質は塩として製剤中に含有されていても よい。 薬剤学的に許容される塩としては、 例えば無機塩基、 有機塩基等 の塩基との塩、 無機酸、 有機酸、 塩基性または酸性アミノ酸などの酸付 加塩等が挙げられる。 無機塩基としては、 例えば、 ナトリウム、 力リウ ム等のアル力リ金属、カルシウム、マグネシウム等のアル力リ土類金属、 アルミニウム、 アンモニゥム等が挙げられる。 有機塩基としては、 例え ば、 エタノールァミン等の第一級ァミン、 ジェチルァミン、 ジェタノ一 ルァミン、 ジシクロへキシルァミン、 N， N '
ミン等の第二級ァミン、 トリメチルァミン、 トリェチルァミン、 ピリジ ン、 ピコリン、 トリエタノールァミン等の第三級ァミン等が挙げられる。 無機酸としては、 例えば、 塩酸、 臭化水素酸、 硝酸、 硫酸、 リン酸等が 挙げられる。 有機酸としては、 例えば、 ギ酸、 酢酸、 乳酸、 トリフルォ 口酢酸、 フマ一ル酸、 シユウ酸、 酒石酸、 マレイン酸、 安息香酸、 クェ ン酸、 コハク酸、 リンゴ酸、 メタンスルホン酸、 エタンスルホン酸、 ベ ンゼンスルホン酸、 P-トルエンスルホン酸等が挙げられる。 塩基性アミ ノ酸としては、 例えば、 アルギニン、 リジン、 オル二チン等が挙げられ る。 酸性アミノ酸としては、 例えば、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸等 が挙げられる。
経口投与を行う場合の剤型として、 散剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 丸剤、 錠剤、 エリキシル剤、 懸濁剤、 乳剤およびシロップ剤等があり、 適宜選 択することができる。 また、 それら製剤について徐放化、 安定化、 易崩 壌化、 難崩壊化、 腸溶性化、 易吸収化等の修飾を施すことができる。 ま た、 口腔内局所投与を行う場合の剤型として、 咀嚼剤、 舌下剤、 パッカ ル剤、 トロ一チ剤、 軟膏剤、 貼布剤、 液剤等があり、 適宜選択すること ができる。 また、 それら製剤について徐放化、 安定化、 易崩壌化、 難崩 壌化、 腸溶性化、 易吸収化等の修飾を施すことができる。
前記示した剤型について、 公知のドラッグデリバリーシステム （D D S ) の技術を採用することができる。 本明細書に言う D D S製剤とは、 除法化製剤、 局所適用製剤 （トローチ、 バッカル錠、 舌下錠等） 、 薬物 放出制御製剤、 腸溶性製剤および胃溶性製剤等、 投与経路、 バイオアベ イラピリティ一、 副作用等を勘案した上で、 最適の製剤形態にした製剤 を言う。
D D Sの構成要素には基本的に薬物、 薬物放出モジュール、 覆いおよ び治療プログラムから成り、 各々の構成要素について、 特に放出を停止 させた時に速やかに血中濃度が低下する半減期の短い薬物が好ましく、 投与部位の生体組織と反応しないおおいが好ましく、 さらに、 設定され た期間において最良の薬物濃度を維持する治療プログラムを有するのが 好ましい。 薬物放出モジュールは基本的に薬物貯蔵庫、 放出制御部、 ェ ネルギ一源および放出孔または放出表面を有している。 これら基本的構 成要素は全て揃っている必要はなく、 適宜追加あるいは削除等を行い、 最良の形態を選択することができる。
D D Sに使用できる材料としては、 高分子、 シクロデキストリン誘導 体、 レシチン等がある。 高分子には不溶性高分子 （シリコーン、 ェチレ ン '酢酸ビエル共重合体、 エチレン · ビニルアルコール共重合体、 ェチ ルセルロース、 セルロースアセテート等） 、 水溶性高分子およびヒドロ キシルゲル形成高分子 （ポリアクリルアミド、 ポリヒドロキシェチルメ タクリレート架橋体、 ポリアクリル架橋体、 ポリビニルアルコール、 ポ リエチレンォキシド、 水溶性セルロース誘導体、 架橋ポロキサマー、 キ チン、 キトサン等） 、 徐溶解性高分子 （ェチルセルロース、 メチルビ二 ルエーテル，無水マレイン酸共重合体の部分エステル等） 、 胃溶性高分 子 （ヒドロキシプロピルメチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセル口 ース、 カルメロースナトリゥム、 マクロゴール、 ポリビニルピロリ ドン、 メタァクリル酸ジメチルアミノエチル · メタアクリル酸メチルコポリマ 一等） 、 腸溶性高分子 （ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレー ト、 酢酸フタルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチルセル口一スァセ テートサクシネート、 カルポキシメチルェチルセルロース、 アクリル酸 系ポリマー等） 、 生分解性高分子 （熱凝固または架橋アルブミン、 架橋 ゼラチン、 コラーゲン、 フイブリン、 ポリシァノアクリレート、 ポリグ リコール酸、 ポリ乳酸、 ポリ；3ヒドロキシ酢酸、 ポリ力プロラクトン等） があり、 剤型によって適宜選択することができる。
特に、 シリコーン、 エチレン ·酢酸ビニル共重合体、 エチレンービニ ルアルコール共重合体、 メチルビニルエーテル ·無水マレイン酸共重合 体の部分エステルは薬物の放出制御に使用でき、 セルロースァセテ一ト は浸透圧ポンプの材料として使用でき、 ェチルセルロース、 ヒドロキシ プロピルメチルセル口一ス、 ヒドロキシプロピルセルロース、 メチルセ ルロ一スは徐放性製剤の膜素材として使用でき、 ポリアクリル架橋体は 粘膜付着剤として使用できる。
また、 製剤中にはその剤形 （経口投与剤、 注射剤、 座剤等の公知の剤 形） に応じて、 溶剤、 賦形剤、 コ一ティング剤、 基剤、 結合剤、 滑沢剤、 崩壊剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 粘稠剤、 乳化剤、 安定剤、 緩衝剤、 等 張化剤、 無痛化剤、 保存剤、 矯味剤、 芳香剤、 着色剤等の添加剤を加え て製造することができる。
上記添加剤をそれぞれ具体例を挙げて例示するが、 これらに特に限定 されるものではない。
〔溶剤〕 精製水、 注射用水、 生理食塩水、 ラッカセィ油、 エタノール、 グリセリン、
〔賦形剤〕 デンプン類、 乳糖、 ブドウ糖、 白糖、 結晶セル口一ス、 硫酸 カルシウム、 炭酸カルシウム、 タルク、 酸化チタン、 トレハロース、 キ シリ トール、
〔コーティング剤〕 白糖、 ゼラチン、 酢酸フ夕ル酸セルロースおよび上 記記載した高分子、
〔基剤〕 ワセリン、 植物油、 マクロゴール、 水中油型乳剤性基剤、 油中 水型乳剤性基剤、
〔結合剤〕 デンプンおよびその誘導体、 セルロースおよびその誘導体、 ゼラチン、 アルギン酸ナトリウム、 トラガント、 アラビアゴム等の天然 高分子化合物、 ポリビニルピロリ ドン等の合成高分子化合物、 デキスト リン、 ヒドロキシプロピルスターチ、
〔滑沢剤〕 ステアリン酸およびその塩類、 タルク、 ワックス類、 コムギ デンプン、 マクロゴール、 水素添加植物油、 ショ糖脂肪酸エステル、 ポ リエチレングリコール、
〔崩壊剤〕 デンプンおよびその誘導体、 寒天、 ゼラチン末、 炭酸水素ナ トリウム、 セルロースおよびその誘導体、 カルメロースカルシウム、 ヒ ドロキシプロピルスターチ、 カルポキシメチルセル口一スおよびその塩 類ならびにその架橋体、 低置換型ヒドロキシプロピルセルロース、 〔溶解補助剤〕 シクロデキストリン、 エタノール、 プロピレングリコー ル、 ポリエチレングリコ一ル、
〔懸濁化剤〕 アラビアゴム、 トラガント、 アルギン酸ナトリウム、 モノ ステアリン酸アルミニウム、 クェン酸、 各種界面活性剤、
〔粘稠剤〕 カルメロ一スナトリウム、 ポリビニルピロリ ドン、 メチルセ ルロース、 ホドロキシプロピルメチルセルロース、 ポリビニルアルコー ル、 トラガント、 アラビアゴム、 アルギン酸ナトリウム、
〔乳化剤〕 アラビアゴム、 コレステロール、 トラガント、 メチルセル口 —ス、 各種界面活性剤、 レシチン、
〔安定剤〕 亜硫酸水素ナトリウム、 ァスコルビン酸、 トコフエロール、 キレート剤、 不活性ガス、 還元性物質、
〔緩衝剤〕 リン酸水素ナトリウム、 酢酸ナトリウム、 ホウ酸、
〔等張化剤〕 塩化ナトリウム、 ブドウ糖、
〔無痛化剤〕 塩酸プロ力イン、 リ ドカイン、 ベンジルアルコール、 〔保存剤〕 安息香酸およびその塩類、 パラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブ夕ノール、 逆性石けん、 ベンジルアルコール、 フエノール、 チ ロメサール、 〔矯味剤〕 白糖、 サッカリン、 カンゾゥエキス、 ソルビトール、 キシリ トール、 グリセリン、
〔芳香剤〕 トウヒチンキ、 ローズ油、 ならびに
〔着色剤〕 水溶性食用色素、 レーキ色素。
[実施例〕
以下に、 本発明の新規コレクチンに関して、 実施例に沿って詳細に説 明するが、 これら実施例の開示によって、 本発明が限定的に解釈される べきでないことは勿論である。
すなわち、 E ST (Expressed Sequence Tags)データベースの検索（実 施例 1) 、 新規ヒトコレクチンのヒト肝臓由来 cDNAライブラリーからの P CRによるスクリーニングと塩基配列の決定 （実施例 2) 、 新規ヒト コレクチンのヒト腎臓由来キャップサイト c DN Aライブラリーからの P CRによるスクリーニングと塩基配列の決定 （実施例 3) 、 新規ヒト コレクチンの相同性検索 （実施例 4) 、 新規マウスコレクチンの c DN Aの取得 （実施例 5) 、 新規ヒトコレクチンのヒトの組織における発現 分布解析（実施例 6)、新規ヒトコレクチンの遺伝学的解析（実施例 7)、 新規コレクチン C L一 L 2— 1および C L一 L 2— 2のヒトの組織にお ける発現分布解析 （実施例 8) 、 新規コレクチンの発現べクタ一 PCDNA3. 1/Myc- His(+)- CL- L2-1, 2の構築 （実施例 9 ) 、 新規コレクチンの安定発 現細胞株の作成 （実施例 1 0) 、 新規コレクチンの糖特異性の解析 （実 施例 1 1) について以下に説明する。
[実施例 1 ： E S Tデータベースの検索]
第 1図に示した様に共通の構造を有する既知のコレクチンすなわちヒ ト MB P、 ヒト S P— A、 ヒト S P—Dと本発明者が最近単離に成功し たヒト肝臓由来コレクチン CL一 L 1 (特開平 1 1一 2 0 6 3 7 7号参 照） のアミノ酸残基の相同性を第 2および 3図に示した。 図中、 相同と 認められるアミノ酸残基部分に囲みを付した。 この図中、 CL一 L 1 の レクチン活性を担う C RD (糖鎖認識領域） のアミノ酸配列 （配列番号 1 4) を用い、 E S T (Expressed Sequence Tags) デ一夕ベースの検索 を行った。
その結果、 相同性の高いアミノ酸配列を含むデータがいくつか得られ た。 得られたデータのアミノ酸配列について G e n B a n k/E S Tデ —夕ベースの検索を行い、 既知または未知物質のいずれであるかを判定 した結果、 相同性は高いが未知の塩基配列を含む 1種のデータ （H 3 0 4 5 5 ：胸部由来） を得ることができた。 得られた E S Tクローンの塩 基配列を用い、 再度 E S Tデータベースを検索した結果、 同一の塩基配 列を含むことが認められた 9種のデータ （登録番号： AA558494： 生殖細 胞由来、 AA582499： 腎臓由来、 AI420986：前立腺由来、 AA742449：生殖 細胞由来、 AA954657：腎臓由来、 AA908360：卵巣由来、 AI264145：腎臓 由来、 AA089855：心臓由来、 AA456055： メラノサイト、 妊娠子宮、 胎児 心臓由来） を得ることができた。 これらはすべて同一の新規コレクチン の塩基配列の一部を示すクローンであった。
[実施例 2 ： ヒト肝臓由来 c DNAライブラリーの P C Rによるスク リーニングと塩基配列の決定]
上記の 1 0種のクローンの塩基配列よりコンセンサス配列を作製し (配列番号 1 5) 、 新規ヒトコレクチンの c DNAの 5 ' 上流領域をク ローニングするため、 実施例 1で得られたコンセンサス配列を基に上流 方向への 2種類のプライマ一 CAP1 (5'-agattttattgtatagciigg-3' (配列 番号 1 6) 、 CAP 2 (5' -ctgggtaataattacataatg-3' (配列番号 1 7 ) と、 ヒト肝臓由来 c DNAライブラリーのベクタ一領域の一部分のプライマ ― λ TriplEx-Fl (5' -aagc tccgagatc tggacgag-3' (配列番号 1 8 ) ) 、 λ TriplEx- F2 (5' -ctcgggaagcgcgccat tgtg-3' (配列番号 1 9) ) を PE App lied Biosystems社製 3 9 2 A D N AZ R N Aシンセサイザ一により 合成し、 以下のように P CRによるスクリ一ニングを行った （第 4図） 。
P CRによるスクリ一ニングのテンプレートとしてヒト肝臓由来 c D NAライブラリ一 （クローンテック社製） を用い、 第一回 P CRを行つ た。反応混液は、総液量 50 Uこて、 LA PCR Buffer II (Mg2 +不含）、 2. 5 mM Mg C 12、 それぞれ 2 Ο Ο μΜの dATP、 d CTP、 d GTPおよび d TTP (以上、 すべて宝酒造社製） を l / L、 ヒト肝臓 由来 c DNAライブラリー （クローンテック社製） 、 0. 5 zMATripl Ex-Flプライマー、 ならびに 0. 5 M CAP1プライマ一を含むものとし た。 P C Rは熱変性 9 5 °Cにて 20秒、ァニ一リング 6 0 °Cにて 2 0秒、 伸長反応 7 2°Cにて 9 0秒を 3 5サイクル、 また繰り返し反応前に熱変 性 9 5°Cにて 5分、 最後に伸長反応 72 °Cにて 5分を含むプログラムで 行った。 第 1回 P CR終了後、 第 2回 P CRを行った。 第 1回 P CR産 物 l Lを铸型とし、 プライマ一は λ TriplEx-Πプライマーおよび CAP2プ ライマーを用い、 第 1回 P CRと同様の反応組成、 プログラム （但し、 サイクル数は 2 5サイクル） で行った。 以上の P CRは PE Applied Bios ystenis社製 GeneAmp PCR System9700により行った。 得られた P CR産 物をァガロースゲル電気泳動により確認後、 バンドをゲルより切り出し、 一 8 0°C、 1 0分間で凍結し、 1 5 0 0 0 r pmにて 1 0分間遠心分離 後、 上清をエタノール沈澱することにより精製した。
精製した DN A断片は、 Novagen 社製 pT7Blue Vector に組み込み、 このベクターをコンビテントセル XL1- Blue 細胞に形質転換した。 形質 転換体を LB培地 （100 g/mLアンピシリン） で培養し、 アルカリ SD S 法によりプラスミドを抽出し、 PE Applied Biosys tems社製 BigDye Term inator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kitおよび ABI PRISM 37 7シーケンサで塩基配列の決定を行った。 プライマーは M13 Universalプ ライマー （5' - cgacgttgtaaaacgacggccagt- 3' (配列番号 2 0 ) ) および M 13 Reverseプライマー（5'-caggaaacagc tgac- 3' (配列番号 2 1) ) (両 プライマ一ともに CAP1プライマーと同様にして合成した） を用いた。 こ の結果得られた塩基配列は CAP2プライマーの 3 ' 末端側から N末端側に 5 7 5塩基長い配列であることが明らかとなった （第 4図に示す CL- L2 - 1 0RFのアミノ酸番号 6 8〜 2 7 1、 または CL - L2- 2 0RFのアミノ酸番号 4 2〜 2 4 5に相当する領域） 。 伹し、 実施例 1で得られた E S Tのコン センサス配列の 5 ' 末端領域の塩基配列と若干の相違が認められた。
[実施例 3 ：新規ヒトコレクチンのヒト腎臓由来キャップサイト c D N Aライブラリーからの P C Rによるスクリーニングと塩基配列の決 定]
実施例 2で得られた塩基配列よりさらに転写開始点を含む 5， 末端領 域のクローニングを行うため、 実施例 2で得られた塩基配列をもとに上 流方向への 2種類のプライマ一 CAP3 (5' -ggtcctatgtcaccggaatc-3' (配 列番号 2 2) ) 、 CAP 4 (5'-ttccatgacgacccacactgc-3' (配列番号 2 3) ) を PE Applied Biosys t ems社製 392A DNA/RNAシンセサイザ一により合成 し、 以下のようにキャップサイ ト c DNAを用いて、 P CRによるスク リ一ニングを行った （第 4図） 。
Cap Site cDNA、 Human Kidney (NIPPON GENE 社製） により、 添付の 1 RC2プライマー （5' - caagg cgccacagcgtatg - 3' (配列番号 2 4) ) およ び CAP3プライマ一を用いて第 1回 P CRを行った。 反応混液は、 総液量 5 0 こて、 LA PCR Buffer II (Mg2 +不含）、 2. 5mM Mg C 1 2、 それぞれ 2 0 0 /Mの dATP、 d CTP、 d GTPおよび dTTP (以 上 宝酒造社製） を 1 L、 Cap Site cDNA Human Kidney, 0. 1RC2 プライマー （以上 NIPPON GENE 社製 ）、 ならびに 0. 5 M CAP3プラ イマ一を含むものとした。 P C Rは、 熱変性 9 5 :にて 2 0秒、 ァニー リング 6 0°Cにて 2 0秒、 伸長反応 7 2°Cにて 6 0秒を 3 5サイクル、 また繰り返し反応前に熱変性 9 5°Cにて 5分、 最後に伸長反応 7 2°Cに て 1 0分を含むプログラムで行った。 第 1回 P C R終了後、 第 2回 P C Rを行った。 第 1回 P CR産物 1 Lを铸型とし、 プライマ一は添付の 2R C2プライマ一 （5'- gtacgccacagcgtatgatgc- 3' (配列番号 2 5) ) および CAP4プライマーを用い、第 1回 P C Rと同様の反応組成、プログラム（伹 し、 サイクル数は 2 5サイクル） で行った。 以上の P CRは PE Applied Biosystems社製 GeneAmp PCR System9700により行った。 得られた P C R 産物をァガロースゲル電気泳動により確認後、 バンドをゲルより切り出 し、 一 8 0°C、 1 0分間凍結し、 1 5 0 0 0 r pm、 1 0分、 遠心分 離後、 上清をエタノール沈澱することにより精製した。
精製した DN A断片は、 Novagen 社製 pT7Blue Vector に組み込み、 このべクタ—をコンビテントセル XL卜 Blue 細胞に形質転換した。 形質 転換体を L B培地 （ 1 0 0 xg/ml アンピシリン） で培養し、 アル力リ S D S法によりプラスミドを抽出し、 PE Applied Biosystems社製 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready React ion kitおよび ABI PRIS M 377シーケンサで塩基配列の決定を行った。 プライマ一は M13 Universa 1プライマー （5'- cgacgttgtaaaacgacggccagt- 3' (配列番号 2 0 ) ) およ び M13 Reverseプライマ一 （5' -caggaaacagctatgac- 3' (配列番号 2 1 ) ) を用いた。 この結果得られた 2種類の塩基配列は、 実施例 2で得られた 塩基配列から N末端側に 4 9 2塩基長い配列 （配列番号 1 ) と実施例 2 で得られた塩基配列かち N末端側に 2 7 4塩基長い配列 （配列番号 3) であることが明らかとなった。
以上のことから、 ここで得られた C L— L 2は 8 1 3塩基の OR F (転 写解読枠） を有し （配列番号 1 ) 、 配列番号 2に示される 2 7 1のアミ ノ酸をコードしている c DNA (CL— L 2— 1 ) 、 並びに 7 3 5塩基 の ORF (転写解読枠） を有し （配列番号 3) 、 配列番号 4に示される 245のアミノ酸をコードしている c DNA (CL-L 2 - 2) の 2種 類が得られた。
[実施例 4 ：相同性検索]
次いで、 G e n B a n kデータベースで DNAおよびアミノ酸につい ての相同性の検索を行った結果、 得られたアミノ酸配列は、 従来見出さ れているコレクチンのいずれとも異なる新規夕ンパク質の配列であるこ とが明らかとなった。
従来報告されている 3種のコレクチン （MB P、 S P— Aおよび S P 一 D) と本発明者が最近単離したヒト肝臓由来コレクチン CL一 L 1 (特 開平 1 1一 2 0 6 3 7 7号参照） のアミノ酸配列と、 本発明の新規コレ クチンのコレクチン構造部分のアミノ酸配列を比較し、 その結果を第 5 および 6図に示す。 第 2および 3図と同様に、 相同性を有するアミノ酸 残基部分に囲みを付した。 このアラインメントにより、 得られた新規夕 ンパク質は既知コレクチンタンパク質と相同性を有し、 コレクチンファ ミリーに属していることが示される。
また、 配列番号 4に示すアミノ酸配列の第 1 8〜6 5番目のアミノ酸 が欠失した配列番号 5に示す塩基配列の第 14 1〜7 3 1番目によって コードされる変異体 （配列番号 6) 、 配列番号 4に示すアミノ酸配列の 第 1 8〜4 1番目のアミノ酸が欠失した配列番号 7に示す塩基配列の第 1 4 1〜 8 0 3番目によってコードされる変異体 （配列番号 8) および 配列番号 4に示すアミノ酸配列の第 42〜6 5番目のアミノ酸が欠失し た配列番号 9に示す塩基配列の第 1 4 1〜 8 0 3番目によってコードさ れる変異体 （配列番号 1 0) が得られた。
[実施例 5 ：新規マウスコレクチンの c DNAの取得]
h CL-L 2と同様の方法により、 マウス肝臓 c DN Aライブラリ一 のスクリーニングを行うことにより mCL _L 2遺伝子を得ることがで きた。 得られた mC L— L 2の c DNAクローンは 8 1 3塩基の〇 R F (転写解読枠） を有し （配列番号 1 2) 、 配列番号 1 3に示される 2 7 1のアミノ酸をコードしていることが確認できた。
[実施例 6 ：新規コレクチンのヒトの組織における発現分布解析] 新規コレクチンの種々の組織での発現を調べるため、 RT— P C R法 により解析を行った。 得られた新規コレクチンの c DN A配列のネック 領域から糖鎖認識領域を増幅できるような 2種類のプライマー RTF1 (5' - agat tccggtgacataggacc-3' (配歹 !J番号 2 6) ) 、 RTR1 (5 -tggtctgggctc tgtcccigc~3' (配列番号 2 7) ) と各組織での新規コレクチンの発現量 を比較するため /3-ァクチン遺伝子の一部分を増幅できる 2種類のプライ マ一ヒト β -ァクチン ·センスプフイマ一 (5' -caagagatggccacggctgct-3 ' (配列番号 2 8) ) 、 ヒト ]3 -ァクチン ·アンチセンスプライマ一 （5' - tccttctgcatcctgtcggca-3' (配列番号 2 9) ) (全てのプライマ一は CAP 1プライマーと同様にして合成した） を用い、 RT— P CRを行った。 種々のヒト由来組織の RN A ( ( 1) 脳、 (2) 心臓、 （3) 腎臓、 (4) 肝臓、 （5) 肺、 （6) 気管、 （7) 骨髄、 （8) 結腸、 （9) 小腸、 （ 1 0) 脾臓、 （1 1) 胃、 （ 1 2) 胸腺、 （ 1 3) 乳腺、 （ 1 4) 前立腺、 （ 1 5) 骨格筋、 （ 1 6) 精巣、 （1 7) 子宮、 （ 1 8) 小脳、 （ 1 9) 胎児脳、 （2 0) 胎児肝臓、 （2 1 ) 脊髄、 （2 2) 胎 盤、 （2 3) 副腎、 （24) 塍臓、 （2 5) 唾液腺、 （2 6) 甲状腺） をテンプレートとし、 MA LA PCR KIT (AMV) VER1.1 (宝酒造社製） を 用いて RT— P C Rを実施した。 まず以下の反応組成で逆転写反応を行 つた。
5 mM Mg C l 2、 I X RNA P CR Buffer, 1 mM d NTP
Mixture, 1 \ / L RNaseインヒビ夕一、 RNA 2 gを含み、 全量 40 Lになるように RNase不含の蒸留水で調節した。 同時に逆転写酵素 を含まない反応組成も調整して、 ネガティブコントロールとした。 上記 反応液を 0. 2mL チューブに入れ、 PE Applied Biosys tems社製 Gen eAmp PCR System9700で 4 2°Cで 3 0分間、 9 9°Cで 5分間、 5°Cで 5分 間の 1サイクルで逆転写反応を行った。 得られた逆転写反応産物の 1 0 zLを用いて、 以下の反応組成で LA P CRをそれぞれ 2 8サイクルと 3 5サイクルで行った。 2. 5 mM Mg C l 2、 l X LA P CR Buf fer (Mg2 +不含） 、 2 U TaKaRa LA Taq 0. 2 fiM RTF 1プラ イマ一、 0. 2 M R T R 1プライマ一を加え、 全量 5 0 Lになる ように滅菌蒸留水で調節した。 P CRは、 熱変性 9 5 °Cにて 2 0秒、 ァ ニーリング 6 0°Cにて 2 0秒、 伸長反応 7 2°Cにて 6 0秒を 2 8サイク ルおよび 3 5サイクル、 また繰り返し反応前に熱変性 9 5°Cにて 5分、 最後に伸長反応 7 2°Cにて 1 0分を含むプログラムで行った。 反応生成 物を 1. 5 %ァガロースゲル電気永動により分離し、 ェチジゥムブロマ イド溶液 （0. 1 gZmL) で染色を行い、 トランスイルミネーター で泳動パターンを確認し、 発現組織を同定した。 各組織での発現量を比 較するために、 各組織での i3—ァクチン遺伝子の一部分を増幅させる R T一 P C Rを行い、 R NAの補正を行った。 方法は上記同様、 逆転写反 応、 P C Rを行い、 判定を行った。 この結果を第 7図に示すが、 本発明 の新規コレクチンは、 2 8サイクルの P C Rでは腎臓 （レーン 3) での 発現が強く、 その他肝臓 （レーン 4) 、 小腸 （レーン 9) 、 胸腺 （レー ン 1 2) 、 胎児肝臓 （レーン 2 0) 、 脊髄 (レーン 2 1 ) 、 副腎 （レー ン 2 3) 、 滕臓 （レーン 2 4) での発現が確認できた。 また 3 5サイク ルの P C Rでは新規コレクチンの発現に強弱は認められるが、 試した全 ての組織においてュビキタスな発現が確認できた。
[実施例 7 ：新規コレクチンの遺伝学的解析] 得られた新規コレクチンの DN A配列 （h CL— L 2— 1 (配列番号 1) および mCL— L 2 (配列番号： 1 2) ) に基づき、 既知のコレク チンとの遺伝的位置付けを明らかにするために解析を行い、 遺伝的系統 樹を作製した。
解析の対象としたコレクチンは、 第 8図に示す各種コレクチンファミリ 一の蛋白質 （図中、 CL— L l， CL一 P 1は本発明者らが最近単離に 成功した） であり、 G e n B a n kデータベースからそれぞれのァミノ 酸配列を検索して得られたデータをもとにレクチンドメインを含む領域 を用いて c lust alw法でマルチプル · ァライメントを作成し、 それらをも とに N— J法 (neighbor-j oiningfe) を用い、 P yl ip vers ion 3.57c p ackageプログラムを用いて遺伝的系統樹を作成した。
その結果、 S P— D、 ゥシ CL一 43、 およびゥシコングルチニンで 一つのクラスターを形成し、 さらに MB Pおよび S P _ Aでそれぞれ 別々にクラスターを形成しているが、 本発明の新規コレクチン遺伝子は これらのクラスタ一には属せず、 C L一 L 1と同様のクラスタ一に属し ており CL_L 1のホモログであると推測された。
[実施例 8 ：新規コレクチン （CL一 L 2— 1および CL— L 2— 2) のヒトの組織における発現分布解析]
C L - L 2 - 1 (配列番号 1) および CL一 L 2 - 2 (配列番号 3 ) の種々の組織での発現を調べるため、 R T— P C R法により解析を行つ た。 得られた CL— L 2 - 1の全長の翻訳領域を増幅できるプライマー (RTF2(5'-atgagggggaatctggccctggtg-3' (配列番号 3 0))、 RTR2(5'-cat gitclcctigtcaaactcac-3' (配列番号 3 1 ) )) 、 得られた CL一 L 2— 2の全長の翻訳領域を増幅できるプライマ一 （RTF3(5'-atgtggtgggtgcct ccgagtc- 3' (配列番号 3 2))、 RTR2 (配列番号 3 1) ) 、 および各組織で の新規コレクチンの発現量を比較するため) S-ァクチン遺伝子の一部分 を増幅できる実施例 6で使用した 2種類のヒト ] 3-ァクチンプライマー
(全てのプライマーは CAP1プライマ一と同様にして合成した） を用い、 実施例 6と同様の方法で R T— P C Rを行った。
この結果を第 9図に示すが、 本発明の C L— L 2— 1 (配列番号 1 ) は、 2 8サイクルの P CRでは腎臓 （レーン 3) 、 肝臓 （レーン 4) 、 小腸 （レーン 9) 、 胸腺 （レーン 1 2) 、 胎児肝臓 （レーン 2 0) 、 脊 髄 （レーン 2 1 ) 、 副腎 （レーン 2 3) 、 塍臓 （レーン 2 4) での発現 が強く、 また 3 5サイクルの P CRでは C L— L 2— 1 (配列番号 1 ) の発現に強弱は認められるが、 試した全ての組織においてュビキタスな 発現が確認できた。 また C L一 L 2— 2 (配列番号 3) は、 2 8サイク ルの P C Rでは、 腎臓 (レーン 3 ) での発現が強く、 また 3 5サイクル の P CRでは C L— L 2— 2 (配列番号 3) の発現は腎臓 （レ一ン 3) の他、発現レベルは低いが、 前立腺（レーン 14) 、精巣（レーン 1 6) 、 脊髄 （レーン 2 1) 、 胎盤 (レーン 2 2) での発現が確認された。
また、 第 9図に示したように、 CL一 L 2— 1および C L— L 2— 2 の RT- PCR産物に数本の増幅断片が確認された。 これらのバンドをゲルよ り切り出し、 実施例 2と同様の方法、 すなわち— 8 0 °C, 10 min. 凍結 し、 15,000 rpm, 10 min. 遠心分離後、 上清をエタノール沈澱すること により精製した。 精製した DNA 断片は、 Novagen 社製 pT7Blue Vector に組み込み、 このベクターをコンビテントセル XL卜 Blue 細胞に形質転 換した。 形質転換体を LB 培地 （100^g/ml アンピシリン） で培養し、 アルカリ SDS 法によりプラスミドを抽出し、 PE Applied Biosystems社 製 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kitおよ び ABI PRISM 377シーケンサで塩基配列の決定を行った。 プライマ一は M 13 Universalプライマ一 (5' -cgacgt tgtaaaacgacggccagt-3' (配歹 D番号 2 0) ) および M13 Reverseフライマー (b -caggaaacagctatgac-3' (配 列番号 2 1) ) を用いた。
この結果得られた塩基配列は、実施例 2で得られた CL一 L 2— 2 (配 列番号 3) の変異体である C L _ L 2— 2 V 1、 CL— L 2 _ 2 v 2お よび CL一 L 2— 2 V 3と同様のものであった。 また、 配列番号 2に示 す CL— L 2— 1には mRN Aのオルターナティブスプライシングによ り 3種のタンパク質が存在していた。 それらを C L— L 2— 1 V 1 (配 列番号 3 6、 3 7) 、 CL-L 2 - l v 2 (配列番号 3 8、 3 9) およ び CL— L 2— 1 ν 3 (配列番号 40、 4 1) と称す。 C L— L 2— 1 V 1は、 配列番号 2に示す C L— L 2 _ 1のアミノ酸番号 44〜 9 1間 が欠失 （配列番号 1に示す C L一 L 2— 1の塩基番号 3 94〜 5 3 7間 が欠失） したものであり、 そのアミノ酸配列は配列番号 3 6に示す塩基 配列の第 2 6 5〜9 3 3番目 （配列番号 5 9) によってコードされる。 CL— L 2 _ l v 2は、 配列番号 2に示す C L— L 2— 1のアミノ酸番 号 44〜6 7間が欠失 （配列番号 1に示す CL一 L 2— 1の塩基番号 3 94〜46 5間が欠失） したものであり、 そのアミノ酸配列は配列番号 3 8に示す塩基配列の第 2 6 5〜 1 0 0 5番目 （配列番号 6 0 ) によつ てコ一ドされる。 CL一 L 2— 1 ν 3は、 配列番号 2に示す C L一 L 2 一 1のアミノ酸番号 6 8〜 9 1間が欠失 （配列番号 1に示す C L - L 2 — 1の塩基番号 46 6〜 5 3 7間が欠失） したものであり、 そのアミノ 酸配列は配列番号 40に示す塩基配列の第 2 6 5〜 1 0 0 5番目 （配列 番号 6 1 ) によってコードされる。 また実施例 4と同様の方法にて mC L-L 2— 2遺伝子を得ることができた。
[実施例 9 ：新規コレクチンの発現べクタ一 pcDNA3.1/Myc-His (+) A-CL -L2-1, 2の構築]
C L - L 2 - 1 (配列番号 1) の翻訳領域を、 CL-L2- 1Fプライマ一 （5 -gggaagct tcgatcaggatgagggggaatctggccctggig-3' (配歹 'J番号： 3 3) ) と d_L2 - 1Rプライマー (5' -gggctcgagcatgt tctcct tgtcaaactcac-3' (配 列番号： 3 4) ) を用いて、 また新規コレクチン （配列番号 3) の翻訳 領域を CL - L2- 2Fフライマー (¾ -gggaagct t ccagcacaatgtggtgggtgcciccga gtc- 3'配列番号： 3 5) ) と CL- L2- 1Rプライマ一 （配列番号： 34) を 用いて、 ヒト腎臓由来 cDNAライブラリ一を铸型として、 P CR (夕カラ 社製： Takara Thermal Cycler MP) により増幅させた。 得られた CL— L 2 - 1 c DNAを pT7Blue T- Vector (Novagen社製） にライゲ一ション し、 大腸菌 XLI-Blueにトランスフオメーシヨンを行った。 得られたクロ ーンから C L一 L 2— l c DNAを含むプラスミドを精製し、 シークェ ンサ一により塩基配列を確認後、 誤りのないプラスミドを制限酵素 Hind IIIと Xho Iで消化して、 同様の酵素で消化し精製した pcDNA3.1/Myc-His (+)Aベクタ一 （インビトロジェン社製） にライゲーシヨンを行った。 ラ ィゲーションしたプラスミドは、 大腸菌 XLI_Blueにトランスフオメーシ ヨン後、 得られたクローンを培養し、 プラスミドを精製して、 発現べク 夕一 pcDNA3.1/Myc- His (+)A- CL - L2- 1, 2とした。 尚、 この際に CL— L 2 一 1と C L— L 2— 2の変異体（配列番号 5、 配列番号 7、 配列番号 9、 配列番号 3 6、 配列番号 3 8および配列番号 40) についても同様に発 現べクタ—を作製した。
[実施例 1 0 ：新規コレクチンの安定発現細胞株の作成]
実施例 9により得られた発現べクタ一 pcDNA3.1/Myc-His (+) A-CL-L2-1 と pEGFP- Fベクタ一 （クロ一ンテック社製） を LIPOFECTAMINE 2000 (LF20 00) Reagent (GIBCOBRL社製） を用いて CH0細胞にコトランスフエクトし、 一過性発現をさせた。 まず、 LF2000 Reagent溶液 0.5 ml (LF2000 Reagen t 30 1、 utrient Mixture F-12 Ham ( Ham' s F- 12培地 ） （シグマ社 製） ） を準備し、 5分間室温でインキュベートした後、 ベクタ一溶液 0.5 ml (pcDNA3.1/Myc-Hi s (!) A-CL-L2-1 , 2： 7.5 ig, pEGFP- Fベクタ一 2.5 fig. Ham' s F- 12培地） と混和し、 2 0分間インキュベートした。その後、 25cm2フラスコで 5 ml Ham' s F- 12培地 （5%FCS含む） で高密度にまで培 養した CH0細胞に添加した。 4時間、 37°C、 5%C02下で培養を行った後、 新しい培地と交換し、 さらに続けて 20時間、 37°C、 5%C02下で培養を行 つた。 次に、 培地を Ham's F- 12培地 （5%FCS、 0.4 mg/ml Geneticin (GI BCOBRL社製）含む） に交換し、 さらに、 10日間培養を行った。 途中一度培 地交換を行った。
この 10日間の薬剤セレクションにより、 形質転換細胞のみが生存し増 殖したが、 形質転換されなかった細胞は死滅した。 得られた形質転換細 胞から高発現な細胞を得るために GFPの蛍光をマーカーにしてセルソ一 夕一 （Becton Dickinson 社製） によりソーティングを行った。 形質転換 した 25cm2フラスコの細胞を 5 ml PBS (-)で 2回洗浄した後、 EDTA solutio n 0.02% (ナカライテスク社製） 0.3 ml で細胞をはがし、 10 ml PBS (-） に懸濁した後、 200 X g、 7分間、 4°Cで遠心後、 上清を除去し、 0.5 mlの 2% FCS/PBS (-)に懸濁し、 ソ一ティングサンプルとした。 サンプルはセ ルストレーナ一キャップ付き 5 ml チューブ （Becton Dickinson 社製） を通した後にセルソ一夕一にかけた。 同様に処理した形質転換していな レ «10細胞をコントロールとして蛍光強度が 10 倍以上高いものをセレク シヨンした。 これらの細胞はあらかじめ Ham s F - 12培地 （5%FCS、 0.4 m g/ml Geneticin含む） を lOO^ ずつ入れておいた 96穴細胞培養用プレー トに 1穴あたり 1細胞ずつ分取した。 37°C、 5%C02下で培養を行い、 1週間 培養後、 さらに、 100^ 1 ずつ培養液を加え、 さらに 1週間培養を行った。 Geneticinによる薬剤セレクションにより増殖してきたクローンを 2分割 して、 12穴および 24穴細胞培養用プレート継代した。 このとき、 1穴に 2 細胞以上から増殖してきているようなクローンは除外し、 12穴および 24 穴細胞培養用プレートには 9： 1の細胞比で細胞を播いた。 37°C、 5 C02 下で培養を行い、 12穴のプレートの細胞が高密度にまで達した時、 その 培養上清の 200 1 を Immobilon- Pメンプレン （ミリポア社製） に Bio- Dot Microf iltration Apparatus (BIO-RAD社製）を用いてドットブロットし、 抗 myc 抗体 (Invitorogen社製) ¾0.05%T een 20/TBS buffer (宝酒造社 製） で 5000倍希釈した溶液に室温で 1時間インキュベートした後、 100ml の 0.05%Tween 20/TBS bufferでメンブレンを室温で 20分間 X3回洗浄し、 さらに抗マウス IgG-HRP (ケミコン社製） を 0.05%Tween 20/TBS buffer で 5000倍希釈した溶液に室温で ί時間ィンキュベートした後、 lOOmlの 0.0 5%Tween 20/TBS bufferでメンブレンを室温で 20分間 X 3回洗浄し、 TMB Membrane Peroxidase substrate system (フナコシ社製） を用いて検出し た。 発色の強かったクローンを確認した後、 それぞれ対応する 24穴のプ レートの細胞を安定発現細胞株 （CH0/CL- L2- 1) とした。
[実施例 1 1 ：新規コレクチンの糖結合特性の解析]
実施例 1 0で作製した新規コレクチンの安定発現細胞株 （CH0/CL- L2 - 1) の培養上清 1Lを VIVAP0RE10 (フナコシ社製） を用いて 50mlに濃縮した 後、 Ni- NTA ァガロース （キアゲン社製） を 200 1加え、 一晩、 4°Cで浸 透しながらインキュベーションすることにより新規コレクチンを Ni - NTA ァガロースに結合させた。 Ni-NTA ァガロースを Poly- Prep Chromatogr aphy Columns (バイオラッド社製） に充填し、 5mlの 50mM NaH2P04、 300mM NaCK 20mM イミダゾール、 0.05 % Tween20 (pH8.0)で 3回洗浄した後、 20 0 1の 50mM NaH2P04 , 300mM NaCK 250mM イミダゾ一ル、 0.05%Tween20 (ρΗδ.0) で 5回溶出することにより精製した。 精製した新規コレクチン を定量し、 糖特異性の解析に使用した。
すなわち、 精製した新規コレクチン （l^g) を、 結合特性を調べる糖 鎖プローブの種類分 Immobilon- Pメンブレン （ミリポア社製） に Bio- Dot Microfiltration Apparatus (BIO- RAD社製） を用いてドットブロットし た後、 各ドットを 1 cm画に切り取り、 ブロックェ一ス （大日本製薬社製） に浸けて、 室温で 1時間インキュベートした。 次にメンブレンを 0.05%Tw een20、 5mM CaCl2、 TBS buf f erで 3回洗浄し、 5mM CaCl2、 TBS bufferで 1 g/mlに希釈した各種糖鎖プローブ （第 1 0図） 溶液中で室温で 1時間ィ ンキュペートした後、 再度 0.05%Tween20、 5mM CaCl2、 TBS bufferで 3回 洗浄した。 次に 0.05%Tween20、 5mM CaCl2、 TBS bufferで 1000倍希釈し た StrepUbvidin- biotinylated HRP (アマシャム社製） 溶液中に室温で 3 0分間インキュベートし、 0.05%Tween20、 5mM CaCl2、 TBS bufferで 3回 洗净した後、 TMB Membrane Peroxidase substrate system (フナコシ社 製）を用いて検出した。 第 1 0図に示した様に新規コレクチンはマンノ一 ス、 フコース、 N—ァセチルガラクトサミン、 N—ァセチルノイラミン酸、 マンノース- 6-リン酸と結合する活性を有していた。
本発明の CL一 L 2 sタンパク質は、 コレクチン構造を有しているこ とから、 それらに特有の効果を示す物質と考えられ、 基礎免疫の機能の 解明、 細菌感染症等を始めとする各種疾患等の発症機構の解明、 さらに その診断、 予防および治療法、 並びにそれらのための試薬や医薬の開発 に利用できるものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸 2 7 1個か ら成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 2に示すァ ミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付 加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタン パク質、 あるいはこれらの誘導体またはび断片。
2 . 配列番号 4 5 (配列番号 1の塩基番号 2 6 5〜 1 0 7 7に相当） に示す塩基配列、 配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸 配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列も しくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下 でハイプリダイズし、 かつ配列番号 2のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示す アミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコ —ドする塩基配列。
3 . 配列番号 4のアミノ酸番号 1〜 2 4 5に示すアミノ酸 2 4 5個か ら成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 4のァミノ 酸番号 1〜 2 4 5に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番 号 4のアミノ酸番号 1〜 2 4 5に示すアミノ酸配列を有するタンパク質 と伺等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体または断片。
4 . 配列番号 4 6 (配列番号 3の塩基番号 1 4 1〜 8 7 5に相当） に 示す塩基配列、 配列番号 4のアミノ酸番号 1〜2 4 5に示すアミノ酸配 列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列もし くはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で ハイプリダイズし、 かつ配列番号 4のアミノ酸番号 1〜 2 4 5に示すァ ミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコー ドする塩基配列。
5. 配列番号 47 (配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜2 7 1に相当） に示すアミノ酸 1 5 9個から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 ま たは、 配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番 号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜2 7 1に示すアミノ酸配列を有するタンパ ク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体または 断片。
6. 配列番号 48 (配列番号 1の塩基番号 6 0 1〜 1 0 7 7に相当） に示す塩基配列、 配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜2 7 1に示すアミ ノ酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配 列もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条 件下でハイブリダィズし、 かつ配列番号 2のアミノ酸番号 1 1 3〜2 7 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパ ク質をコードする塩基配列。
7. 請求の範囲第 5項記載のタンパク質の N末端側に （Gly_Xaa-Yaa) n (但し nは 1以上 5 0以下の整数を示し、 Xaaおよび Yaaはアミノ酸残基 を示し、 Xaaと Yaaは同一アミノ酸残基であっても異なるアミノ酸残基で あっても良い） の構造をさらに含むことを特徴とするタンパク質。
8. (Gly- Xaa- Yaa) nが下記群、 すなわち、
Gly-Leu-Lys-Gly-Asp-Ala-Gly-Glo-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly- Arg- Pro- Gly- Arg- Va卜 Gly- Pro-Thr- Gly- Glu- Lys- Gly- Asp- Met- Gly- Asp- Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly-Lys-Ile-Gly-Pro-Ile- Gly - Ser - Lys - Gly - Glu-Lys - Gly - Asp - Ser - Gly - Asp- lie - Gly - Pro - Pro - Gly - Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro- (配列番号 4 9 (配列番号 2 ： アミ ノ酸番号 4 1〜； 1 1 2に相当） ） 、
Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Ala-Pro-Gly-Arg-Pro-Gly- Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gln- Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly-Lys-Ile-Gly-Pro-Ile-Gly-Ser-Lys- Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly- Glu- Pro- Gly- Leu- Pro (配列番号 5 0 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 44〜 1 1 2、 もしくは配列番号 4 ： アミノ酸番号 1 8〜8 6に相当） ） 、 Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly- Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 5 1 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 9 2〜 1 1 2、 もしくは配列番号 4 ：アミノ酸番号 6 6〜8 6に相当） ） 、
Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gln-Lys-Gly-Ser-Val-Gly-Arg-His-Gly- Lys- Ile-Gly- Pro- lie- Gly-Ser-Lys- Gly- Glu- Lys- Gly- Asp- Ser_Gly- Asp - lie- Gly- Pro- Pro- Gly- Pro- Asn- Gly- Glu- Pro- Gly- Leu- Pro (配列番号 5 2 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 6 8〜 1 1 2、 もしくは配列番号 4 ： アミ ノ酸番号 42〜8 6に相当） ） 、
Gly-Asp-Ala-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Lys-Gly-Al -Pro-Gly-Arg-Pro-Gly- Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp- Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 1 1 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 4 1〜 6 7および 9 2〜 1 1 2、 もしくは 配列番号 4.: アミノ酸番号 1 8〜4 1および 6 6〜8 6に相当） ） 、
Gly-Leu-Lys-Gly-Glu-Lys-Gly-Asp-Ser-Gly-Asp-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly- Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 4 3 (配列番号 2 ：ァミノ 酸番号 4 1〜43および 9 2〜： L 1 2に相当） ) 、 または
Gly-Leu-Lys-Gly-Asp-Met-Gly-Asp-Lys-Gly-Gin-Lys-GIy-Ser-Val-GIy- Arg- His- G - Lys- Ile_Gly-Pro- I le- Gly_Ser- Lys- Gly- Glu- Lys- Gly- Asp- Ser - G - Asp - lie - Gly- Pro-Pro - G - Pro - Asn - Gly - Glu - Pro - Gly - Leu -： Pro (配列番号 42 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 4 1〜43ぉょび6 8〜 1 1 2に相当） ）
Gly- Leu- Lys- Gly-Asp- Ala- Gly-Glu- Lys-GIy- Asp- Lys- Gly- Ala- Pro- Gly - Arg-Pro-Gly-Arg-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-GIy-Glu-Lys-Gly-Asp- Ser-Gly-Asp-I le-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Asn-Gly-Glu-Pro-Gly-Leu-Pro (配列番号 44 (配列番号 2 ： アミノ酸番号 4 1〜6 7ぉょび9 2〜 1 1 2に相当） ）
を含む配列から選択されることを特徴とする、 請求の範囲第 7項記載の
9. 請求の範囲第 7または 8項記載のタンパク質をコードする塩基配 列。
1 0. 請求の範囲第 7または 8項記載のタンパク質の （Gly-Xaa- Yaa) n の構造の N末端に以下のアミノ酸配列すなわち、
Met-Arg-Gly-Asn-Leu-Ala-Leu-Val-Gly-Val-Leu-I le-Ser-Leu-Ala-Phe- Leu-Ser-Leu-Leu-Pro-Ser-Gly-His-Pro-Gln-Pro-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala- Cys-Ser-Val-Gln-Ile-Leu-Val-Pro (配列番号 5 3 (配列番号 2 ： ァミノ 酸番号 1〜40に相当） )
をさらに含むことを特徴とするタンパク質。
1 1. 請求の範囲第 7または 8項記載のタンパク質の （Gly- Xaa- Yaa) n の構造の N末端に以下のアミノ酸配列すなわち、
Met-Trp-Trp-Val-Pro-Pro-Ser-Pro-Tyr-Gly-Cys-Leu-Pro-Cys-Ala-Leu- Pro (配列番号 54 (配列番号 4 ： アミノ酸番号 1〜 1 7に相当） ） をさらに含むことを特徴とするタンパク質。
1 2. 請求の範囲第 1 0または 1 1項記載のタンパク質をコードする塩 基配列。
1 3. 配列番号 6のアミノ酸番号 1〜 1 9 7に示すアミノ酸 1 9 7個か ら成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 6に示すァ ミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付 加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番号 6のアミノ酸番号 1〜 1 9 7に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタン パク質、 あるいはこれらの誘導体または断片。
1 4 . 配列番号 5 5 (配列番号 5の塩基番号 1 4 1〜 7 3 1に相当） に 示す塩基配列、 配列番号 6のアミノ酸番号 1〜 1 9 7に示すアミノ酸配 列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列もし くはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で ハイブリダィズし、 かつ配列番号 6のアミノ酸番号 1〜 1 9 7に示すァ ミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコー ドする塩基配列。
1 5 . 配列番号 8のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸 2 2 1個か ら成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 8のァミノ 酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ 酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配列番 号 8のアミノ酸番号 1〜2 2 1に示すアミノ酸配列を有するタンパク質 と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体または断片。
1 6 . 配列番号 5 6 (配列番号 7の塩基番号 1 4 1〜 8 0 3に相当） に 示す塩基配列、 配列番号 8のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸配 列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列もし くはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下で ハイプリダイズし、 かつ配列番号 8のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すァ ミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質をコー ドする塩基配列。
1 7 . 配列番号 1 0のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸 2 2 1個 から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 1 0のァ ミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配 列番号 1 0のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸配列を有するタン パク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体また は断片。
1 8 . 配列番号 5 7 (配列番号 9の塩基番号 1 4 1〜 8 0 3に相当） に 示す塩基配列、 配列番号 1 0のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示すアミノ酸 配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列も しくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下 でハイプリダイズし、 かつ配列番号 1 0のアミノ酸番号 1〜 2 2 1に示 すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質を コードする塩基配列。
1 9 . 配列番号 1 3のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸 2 7 1個 から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 1 3のァ ミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配 列番号 1 3のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ酸配列を有するタン パク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体また は断片。
2 0 . 配列番号 5 8 (配列番号 1 2の塩基番号 1 5 7〜 9 6 9に相当） に示す塩基配列、 配列番号 1 3のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に示すアミノ 酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列 もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、 かつ配列番号 1 3のアミノ酸番号 1〜 2 7 1に 示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質 をコードする塩基配列。
2 1 . 配列番号 3 7のアミノ酸番号 1〜 2 2 3に示すアミノ酸 2 2 3個 から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 3 7のァ ミノ酸番号 1〜 2 2 3に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配 列番号 3 7のアミノ酸番号 1〜2 2 3に示すアミノ酸配列を有するタン パク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体また は断片。
2 2 . 配列番号 5 9 (配列番号 3 6の塩基番号 2 6 5〜 9 3 3に相当） に示す塩基配列、 配列番号 3 7のアミノ酸番号 1〜 2 2 3に示すアミノ 酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列 もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件 下で八イブリダイズし、 かつ配列番号 3 7のアミノ酸番号 1〜 2 2 3に 示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質 をコードする塩基配列。
2 3 . 配列番号 3 9のアミノ酸番号 1〜2 4 7に示すアミノ酸 2 4 7個 から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 3 9のァ ミノ酸番号 1〜 2 4 7に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配 列番号 3 9のアミノ酸番号 1〜 2 4 7に示すアミノ酸配列を有するタン パク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体また は断片。
2 4 . 配列番号 6 0 (配列番号 3 8の塩基番号 2 6 5〜 1 0 0 5に相当） に示す塩基配列、 配列番号 3 9のアミノ酸番号 1〜 2 4 7に示すアミノ 酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列 もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件 下でハイブリダィズし、 かつ配列番号 3 9のアミノ酸番号 1〜247に 示すア口ミ冑ノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質 をコードする塩基配列。
2 5. 配列番号 4 1のアミノ酸番号 1〜 247に示すアミノ酸 247個 から成るアミノ酸配列を有するタンパク質、 または、 配列番号 4 1のァ ミノ酸番号 1〜 247に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のァ ミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ配 列番号 4 1のアミノ酸番号 1〜 247に示すアミノ酸配列を有するタン パク質と同等の性質を有するタンパク質、 あるいはこれらの誘導体また は断片。
26. 配列番号 6 1 (配列番号 40の塩基番号 26 5〜 1 0 0 5に相当） に示す塩基配列、 配列番号 4 1のアミノ酸番号 1〜 247に示すアミノ 酸配列またはその断片をコードする塩基配列、 または、 これら塩基配列 もしくはこれら塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件 下でハイプリダイズし、 かつ配列番号 4 1のアミノ酸番号 1〜 247に 示すアミノ酸配列を有するタンパク質と同等の性質を有するタンパク質 をコードする塩基配列。
2 7. 請求の範囲第 2、 4、 6、 9、 1 2、 14. 1 6、 1 8、 20、
2 2 24または 2 6項に記載の塩基配列を含む とを特徴とするべク
2 8 求の範囲第 2、 4、 6、 9、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 20、 2 2 24または 2 6項に記載の塩基配列を発現可能に保持する形質転 換細胞。
2 9. 請求の範囲第 2、 4、 6、 9、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 2、 24または 2 6項に記載の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、 産生 された h C L - L 2 s夕ンパク質を採取することを特徴とするタンパク 質の製造法。
30. 請求の範囲第 2 0項記載の塩基配列で形質転換した細胞を培養し、 産生された mCL— L 2 sタンパク質を採取することを特徴とするタン パク質の製造法。 .
3 1. 細胞が大腸菌、 動物細胞または昆虫細胞である、 請求の範囲第 2 9または 3 0項に記載の製造法。
3 2. CL -L 2 s遺伝子の発現レベルを変化させたトランスジェニッ ク非ヒ卜動物。
33. mCL-L 2 s遺伝子の機能を欠損させたノックアウトマウス。
34. 請求の範囲第 1、 3、 5、 7、 8、 1 0、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3または 2 5項に記載のタンパク質またはその断片 に対する抗体。
3 5. ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体またはペプチド抗体で ある請求の範囲第 34項記載の抗体。
3 6. 請求の範囲第 34または 3 5項に記載の抗体と CL一 L 2 sタン パク質またはその断片との免疫学的な結合に基づいて、 該タンパク質ま たはその断片を測定する方法。
3 7. 請求の範囲第 1、 3、 5、 7、 8、 1 0、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3または 2 5項に記載のタンパク質の機能を刺激す るァゴニスト。
3 8. 請求の範囲第 1、 3、 5、 7、 8、 1 0、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3または 2 5項に記載のタンパク質の機能を阻害す るアンタゴニスト。
3 9. 請求の範囲第 1、 3、 5、 7、 8、 1 0、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3または 2 5項に記載のタンパク質を用いることを 特徴とする薬物のスクリーニング方法。
40. 請求の範囲第 3 9項に記載のスクリーニング方法によって得られ た薬物。
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