JP2524939B2

JP2524939B2 - エンハンサ−及びその用途

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Publication number: JP2524939B2
Application number: JP4187477A
Authority: JP
Inventors: 鈎一郎小田; 進中田; 琢磨中島; 岳史中村; 潮角田
Original assignee: Nichirei Corp
Current assignee: Nichirei Corp
Priority date: 1991-12-03
Filing date: 1992-06-22
Publication date: 1996-08-14
Anticipated expiration: 2011-08-14
Also published as: EP0546333B1; DE69224360T2; DE69224360D1; EP0546333A1; JPH06181767A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、無血清あるいは低血清
で効率良く遺伝子を発現させる、フィブロネクチン（以
下、ＦＮと略称することもある）遺伝子に対しエンハン
サー活性を持つＤＮＡ及びその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】任意の遺伝子産物の生産には、大腸菌
等のバクテリアを用いる方法と、酵母等の真菌類を用
いる方法、動物（細胞）を用いる方法が考えられる。
このうち、との方法には、（ａ）遺伝子産物が細胞
（菌体）外に分泌されない場合がある、（ｂ）動物由来
遺伝子の立体構造が異常となる場合がある、（ｃ）動物
由来遺伝子産物が、本来有する修飾糖鎖を付加されな
い、等の欠点がある。従って、一般的に動物由来遺伝子
産物（以下、物質という）の生産にはの方法が選択さ
れる。

【０００３】の方法は、動物個体を用いる方法と、培
養細胞を用いる方法に大別される。動物個体を用いる方
法は、生産しようとする遺伝子産物の宿主（生産個体）
への影響や、個体差間の管理が困難である場合が多い。
従って、現時点では、培養細胞を用いる方法が選択され
ることが多い。

【０００４】物質生産等を目的とする動物細胞（以下、
細胞と言う）の培養には、一般的に高濃度（５〜２０
％）の動物血清（以下、血清と言う）を含む培地が用い
られている。このような培地に添加される血清は、高価
である上に品質がロット間で安定しないために利用者が
細胞に合わせて品質のチェックをしなければならない。
このために培地に要する血清の調達コストが細胞培養コ
ストの多くの割合を占めている。また、培養細胞で発現
する遺伝子産物やその代謝物（以下、両産物を総称して
物質と言う）を取得しようとする場合、培地に含まれる
血清成分は目的物質の純化を困難にし、精製コストを引
上げる主因となっている。

【０００５】従って、培養細胞を用いて物質生産を行な
う場合、生産コストを低く抑えるためには血清不含培地
若しくは血清濃度の極めて低い培地（以下、低血清培地
と言う）を用いるのがもっとも有効である。しかし、血
清不含培地に順応しない細胞や低血清培地では細胞の増
殖活性の低下に伴って発現しなくなる遺伝子が多く、実
用には多くの問題が伴っている。

【０００６】一方、細胞外マトリックスの構成成分であ
るフィブロネクチン（以下、ＦＮと略す）は、休止期
（低血清培地で維持したり、細胞密度が上昇して接触障
害が起こり増殖を停止した状態）の正常型接着性培養細
胞で極めて強く発現し、増殖開始とともに発現が抑制さ
れるが、これはＦＮ遺伝子の転写制御領域（以下、ＦＮ
プロモーターと言う）の活性の調節に依存している（Ha
raら、Gene 70、 97 (1988)) 。従って、ＦＮプロモータ
ーの下流にクローン化した遺伝子をつないで細胞に導入
すれば、低血清培地中で高レベルに該遺伝子産物を生産
する細胞株（形質転換株）を樹立することができると考
えられる。

【０００７】ＦＮプロモーターについては、既にラット
やヒトをはじめとする数種の動物細胞からクローン化さ
れ、ＤＮＡの一次構造（ヌクレオチド配列）も報告され
ている（Patel ら、The EMBO Journal６巻９号、2565
頁、1987年) 。

【０００８】しかしこれらの解析は完全とは言えず、例
えばＦＮプロモーター発現に必要なエンハンサーは未知
のまま残されていた。さらに、物質生産への応用を前提
としたＦＮプロモーターの研究に関する報告は、小田が
１９８８年の細胞工学（細胞工学別冊４、３頁）に可能
性として示唆したものを除いて他には見られない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、無血清及び低血清培地中で動物細胞による高レベル
の物質生産を行うことのできるエンハンサー活性を有す
るＤＮＡ及びその用途を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは無血清ある
いは低血清下で作動するエンハンサーのクローニングに
ついて鋭意研究した結果、ＦＮ遺伝子に対してエンハン
サー活性を持つＤＮＡを得、これとプロモーターとを用
いると効率良く構造遺伝子を発現させることができるこ
とを見出し、さらに研究した結果、本発明を完成した。

【００１１】すなわち、本発明は、(1) フィブロネクチ
ン遺伝子に対してエンハンサー活性を持ち、配列表の配
列番号１ないし２７又は３４で示される塩基配列を有す
るＤＮＡ、(2) プロモーター及び構造遺伝子に上記(1)
記載のエンハンサー活性を有するＤＮＡが接続された組
換えベクター、(3) 上記(2) 記載の組換えベクターを保
持する動物細胞形質転換体を培養することを特徴とする
遺伝子産物の製造法である。

【００１２】本発明のＦＮ遺伝子に対してエンハンサー
活性を持つＤＮＡを以下において、本発明のエンハンサ
ーＤＮＡと略称することもある。

【００１３】また、ここで、エンハンサーとは、以下の
ような特徴を持つ、ＤＮＡ上の塩基配列を指す。 (1) エンハンサーは、同一ＤＮＡ上にある最も近いプロ
モーターの転写効率を増大させる活性を持つ。 (2) エンハンサーは、その働きの対象となる遺伝子とか
なり距離が離れていても（数千塩基程度まで）機能す
る。 (3) エンハンサーは決まった位置にある必要はない。つ
まり遺伝子の５’側に位置する必要はなく、転写領域内
あるいはその下流にあってもよい。 (4) ある種のエンハンサー配列は、特定の細胞を好んだ
り、そこでだけ働いたりする（組織特異性）。以上のような特徴によって、エンハンサーとプロモータ
ーを区別することが出来る。

【００１４】本発明のＦＮエンハンサーＤＮＡの、ＦＮ
遺伝子に対するエンハンサー活性とは、ＦＮプロモータ
ーの上流にエンハンサーＤＮＡをつなぐと、その結果、
ＦＮプロモーターの転写効率が増大する、つまりＦＮプ
ロモーターの支配下にある構造遺伝子の発現が増大す
る、ということを意味する。さらに、そうした転写効率
の増大は、休止期の状態にある細胞（上記参照）で著し
く、逆に細胞増殖の開始とともに転写は急速に抑制され
る。このことも本発明のエンハンサーＤＮＡの重要な性
質である。

【００１５】本発明のエンハンサーＤＮＡは、例えば、
ラットＦＮプロモーターの塩基配列（Patel ら、The EM
BO Journal、 6(9)、 2565) を基にポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）法によりプローブを調製し、これを用いてラ
ットＦＮプロモーター領域及びエンハンサー領域をクロ
ーニングし、この遺伝子を制限酵素消化してＦＮをコー
ドしている構造遺伝子の一部を含むその上流部分２千塩
基対（以下、kbp と言う) のＤＮＡを得、これを再びプ
ラスミドＤＮＡ上にサブクローニングし、この２ｋｂｐ
ＤＮＡの下流に、レポーター遺伝子としてのクロラムフ
ェニコールアセチル転移酵素（ＣＡＴ）遺伝子を連結し
たプラスミドＤＮＡを構築し、該ＤＮＡをトランスフェ
クトした動物細胞のＣＡＴの活性を測定することによ
り、ＦＮ遺伝子上流部分２ｋｂｐＤＮＡに無血清あるい
は低血清下で作動するエンハンサーを得ることができ
る。

【００１６】さらに詳しくは、たとえばPatel らの方法
により得ることが出来る。すなわち、cDNAをプローブと
して用いてＥＭＢＬ３型ラムダファージベクターに組込
まれたラットゲノム遺伝子ライブラリー(Tamkun, J. W.
ら Proc. Natl. Acad. Sci.USA、 81、 5140 (1984)) を
スクリーニングし、プローブと反応するファージクロー
ンよりＦＮゲノム遺伝子の３’側２５kbを有するＤＮＡ
を抽出する。さらに、得られたＦＮゲノム遺伝子ＤＮＡ
の５’側部分をプローブとして用いて同様のスクリーニ
ングを繰り返し、一連の一部重複するＦＮゲノム遺伝子
ＤＮＡを得る。これらのＤＮＡのＦＮ遺伝子上の位置は
cDNAをプローブとして用いてサザンブロッティングを行
ない決定する。このうち、ＦＮcDNA５’末端部分のプロ
ーブと反応するＤＮＡについて、制限酵素切断とＤＮＡ
塩基配列の解析並びにＲＮase プロテクション試験等を
行ない、ＦＮ遺伝子の転写始点並びにプロモーターの一
部を決定することができる。

【００１７】こうして得られたプロモーターの一部をプ
ローブとして用いてＥＭＢＬ３型λファージベクターに
組込まれたラット繊維芽細胞株３Ｙ１（Kimuraら、Int.
J.Cancer、 15、 694 (1975)) 遺伝子ライブラリーをス
クリーニングする。プローブと反応するファージクロー
ンよりＤＮＡを抽出し、組込まれているラット遺伝子部
分の制限酵素地図を作製し、構造遺伝子上流のＤＮＡ断
片、例えば2.0kb 断片を例えばプラスミドpBluescriptI
I ＫＳに再クローニングすることができる。

【００１８】クローニングしたＤＮＡの塩基配列を決定
し、例えばcDNAの塩基配列と比較することにより遺伝子
上の翻訳開始コドンの位置を知ることができる。

【００１９】また、ラットmRNAを用いて、例えばＳ１マ
ッピング法(Berk, A. J. and Sharp, P. A. Cell 2、 72
1 (1977)) を行なえば該遺伝子の転写開始点を知ること
ができる。

【００２０】このようにして得られた本発明のエンハン
サーＤＮＡの一例としては、図４に示した−１０８１〜
−１９０８の塩基配列の中に存在するエンハンサー領域
を含むものが挙げられる。

【００２１】プロモーターとしては、例えば、The EMBO
Journal, 6, 2563-2572 (1987) の第２５６８〜２５６
９頁の第５図に記載の塩基配列中の”ＴＡＴＡＡ”、”
ＧＧＧＣＧＧ”、”ＣＣＡＡＴ”の配列を含むＤＮＡが
挙げられる。

【００２２】構造遺伝子としては、種（Ｓｐｅｃｉｅ
ｓ）の由来に限定されるものではなく、動物細胞で発現
されるものであればいずれでもよい。

【００２３】該構造遺伝子の一例としては、例えば、tr
ansposable element Tn9由来のクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする遺伝
子、ヒト由来のγ型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）を
コードする遺伝子、ヒト由来のNerve Growth Factor 2
(NGF-2) （ヨーロッパ特許出願公開第386,752A1 号公報
参照）をコードする遺伝子等が挙げられる。

【００２４】本発明のエンハンサーＤＮＡ、プロモータ
ー領域及び構造遺伝子を接続するベクターとしては、例
えばpCD ベクター、cDM8ベクター(Aruffo, A and Seed,
B.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 84、 8573 (1987))、
レトロウイルスベクター(Cone, R. D. and Mulligan,
R. C.、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 81、 6349 (198
4))等動物細胞用のものを含め、pBR、 pUC等いかなるプ
ラスミドであっても用いることができる。

【００２５】上記の本発明のエンハンサーＤＮＡ、プロ
モーター領域及び構造遺伝子をベクターに接続すること
は、以下のような手順で行なうことができる。

【００２６】まず、ベクターを適当な制限酵素で処理し
て外来ＤＮＡを挿入できる形にする。一方、エンハンサ
ーＤＮＡ、プロモーター領域及び構造遺伝子（これらは
同一ＤＮＡ上で連続している状態で利用可能であるとす
る）を適当な供給源から切り出してきて、その両末端を
必要に応じて加工する。その後、処理済のベクター及び
エンハンサーＤＮＡ、プロモーター領域及び構造遺伝子
のＤＮＡ断片とを混合して、リガーゼで処理して接続す
る。

【００２７】このようにして得られた組換えベクターを
動物細胞に導入し、形質転換体とする。

【００２８】該宿主としての動物細胞の例としては、例
えば、ラット繊維芽細胞由来の３Ｙ１細胞、マウス繊維
芽細胞由来の３Ｔ３細胞、ヒト繊維芽細胞由来のＷＩ３
８細胞、ヒト肝腫瘍細胞由来のＨＵＨ７細胞、ハムスタ
ー肺癌細胞由来のＨｍＬｕ１細胞等が挙げられる。中で
も、ラット３Ｙ１細胞が特に好ましい。

【００２９】組換えベクターを動物細胞に導入するに
は、例えば燐酸カルシウム法（Wigler, M ら、Cell、 16、
777 (1979))、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata, M.
A. ら、Nucleic Acid Res.、 12、 5707 (1984)) 、電気穿
孔（エレクトロポレーション）法（石崎ら、細胞工学、
５巻５５７ページ、１９８６年）、マイクロインジェク
ション法等の方法を用いて行なうことができる。

【００３０】上記の方法で得られた動物細胞形質転換体
は、それ自体公知の方法で培養することができる。培地
としては、例えばＭＥＭ培地（Science、 122、 501 (195
2))、ＤＭＥＭ培地（Virology、 8、 396 (1959))、RPMI1
640培地（The Journal of the American Medical Assoc
iation、 199、 519 (1967)) 、199 培地（Proceedingof
the Society for the Biological Medicine、 73、 1 (19
50))等が挙げられる。培地のｐＨは約６〜８であるのが
好ましい。培養は通常、約３０〜４０℃で約１５〜９６
時間行ない、必要に応じて通気や攪拌を加えることもで
きる。また、血清を含む培地で培養した形質転換体を途
中で血清を含まないあるいは低血清条件下に移して培養
しても良い。

【００３１】該培養においては、血清を全く含まない培
地又は０．１〜２０％のウシ血清を含む培地を使用す
る。通常の培養においては血清濃度１０％（細胞によっ
ては５％）で十分である。その条件で適当な細胞数にま
で増やし、その後、無血清あるいは低血清（約０．１〜
２％）の新しい培地に替えて、細胞を維持することによ
り、目的とする遺伝子産物を大量に得ることができる。
培地は３日おきくらいに新しいものに交換するのが好ま
しい。該血清としては例えば仔牛血清、牛胎児血清等が
挙げられ、なかでも牛胎児血清が好ましい。

【００３２】これらの方法により、任意の構造遺伝子を
本発明のエンハンサーＤＮＡ及びプロモーターを用い
て、無血清あるいは低血清条件下で効率良く発現させる
ことが可能となる。

【００３３】後述の実施例１(3) で得られた、本発明の
エンハンサーＤＮＡ及びプロモーターが接続された組換
えベクターｐＦ１９００Ｌを、大腸菌に保持させた形質
転換体Ｅ．ｃｏｌｉＡＧ１／ｐＦ１９００Ｌは、平成
３年９月３日より財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託
番号ＩＦＯ１５２２０として寄託され、また、本形質
転換体は平成３年９月９日より通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に微工研条寄第３５５２
号として寄託されている。

【００３４】

【実施例】以下、本発明を実施例により、より具体的に
説明するが、本発明の実施例はこれらに限られるもので
はない。

【００３５】実施例１ (1) ラットＦＮプロモーター及びエンハンサーの単離ラット繊維芽細胞株３Ｙ１クローンb 1-6 （以下、３Ｙ
１と略す）よりＥＭＢＬ３型λファージベクター（スト
ラタジーン社製；以下、Ｓｔｇと言う）を用いてゲノミ
ックＤＮＡライブラリーを作製した。また、Patel らの
決定したＦＮの５’側（隣接）領域の-1067 ヌクレオチ
ド（以下、ｎｔ）から−５２９ｎｔ（ただし、ＦＮ伝達
ＲＮＡ（以下、mRNAと略す）転写開始点を＋１ｎｔ、そ
の１ヌクレオチド上流を−１ｎｔとする）に相当するＤ
ＮＡ断片を３Ｙ１ゲノミックＤＮＡを鋳型としてポリメ
ラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲ）法で調製した。

【００３６】前記ＤＮＡ断片の５’側末端を（γ−
³²Ｐ）ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
放射線標識しＤＮＡプローブとした。これを用いて前記
ゲノミックＤＮＡライブラリー１５０万クローンをスク
リーニングし、ＦＮプロモーターを含む２クローン＃９
０８と＃９１６を得た。サザンブロッティングによる解
析の結果、＃９０８は約１０キロ塩基対（以下、kbp と
言う）、＃９１６は約5.7kbpのＦＮの５’側（隣接）領
域を含むSalI断片を有することが分かった（図１）。

【００３７】次に、＃９０８からＦＮの５’側（隣接）
領域を含む２．１ｋｂｐのＰｓｔＩ断片、２．３ｋｂｐ
のｓａｌＩ−ＮｈｅＩ断片をプラスミドｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（Ｓｔｇ）にサブクローニング
し、それぞれｐｒＦＮｐｐ２．１並びにｐｒＦＮｓｎ
２．３を得た（図２、３）。ｐｒＦＮｐｐ２．１の塩基
配列を決定したところ、得られたＦＮの５’側（隣接）
領域は未報告の−１９０８ヌクレオチドから−１０８１
ヌクレオチドまでを含むことが分かった（図４。ただ
し、−１０８０ヌクレオチドから＋２４６０ヌクレオチ
ドまでの塩基配列はＰａｔｅｌらが報告済み［Ｔｈｅ
ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、６（９）、２５６５（１
９８７）］）。−１０８０ヌクレオチド以下の塩基配列
又は制限酵素地図はＰａｔｅｌらの報告と一致した。

【００３８】（２）ＦＮプロモーター及びエンハンサー
の機能領域の検討ＦＮプロモーター及びエンハンサーの機能領域を３Ｙ１
におけるクロラムフェニコール・アセチルトランスフェ
ラーゼ（以下、ＣＡＴと言う）の一過性発現活性の解析
（ＣＡＴアッセイ）によって検討した。すなわち、種々
の欠失や塩基置換変異を与えたＦＮ５’側隣接領域（プ
ロモーター及びエンハンサーを含む）をＣＡＴ遺伝子の
上流に挿入したプラスミド（ｐＦＣＡＴ）を作製し（図
６、７、８参照）、３Ｙ１にトランスフェクト後、４８
時間目に細胞抽出液中のＣＡＴ活性を測定し相互に比較
した。

【００３９】（２）−１ｐＦＣＡＴの作出まず、ＦＮプロモーター及びエンハンサーをＣＡＴ遺伝
子の上流に挿入するためにプラスミドｐＳＶ２ＣＡＴ−
ＢＸとｐＳＶ２ＣＡＴ−ＸＢを作出した（図５参照）。
これらのプラスミドは、Ｇｏｒｍａｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、２
（９）、１０４４（１９８２））らが報告したｐＳＶ２
ＣＡＴのＡｃｃＩ切断部位（以下、サイトと言う）とＮ
ｄｅＩサイトをそれぞれＢｇｌＩＩサイトとＸｈｏＩ
サイトに置換したもの（ｐＳＶ２ＣＡＴ−ＢＸ）又は
ＸｈｏＩサイトとＢｇｌＩＩサイトに置換したもの
（ｐＳＶ２ＣＡＴ−ＸＢ）である。以下、これらのプラ
スミドをベースに種々の欠失、あるいは塩基置換変異を
有するＦＮ５’側隣接領域をＣＡＴ遺伝子上流に挿入
し、２６種のｐＦＣＡＴを構築した（図６、７、８参
照。作出した各プラスミドには便宜のため１〜２６の番
号を付記した）。なお、図６、７、８中１〜２６で示さ
れる各ＤＮＡ領域の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番
号１〜２６に示す。なお、これらの塩基配列は、図６、
７、８に示された塩基番号および図４に示された全塩基
配列から知ることができるものである。なお、−１９０
９ｎｔ〜−２０５０ｎｔの塩基配列は決定されていない
ので、この部分を含むものについては、−１９０８ｎｔ
以降の部分のみの塩基配列が示されている。さらに、図
６、７、８のそれぞれの上部に記載されている−２３９
ｎｔ〜−２３０ｎｔ、−５４ｎｔ〜−４４ｎｔおよび−
１０５ｎｔ〜−９５ｎｔの両端に図４に示されているこ
れらの領域の両端の１塩基ずつを加えた塩基配列をそれ
ぞれ配列番号２８、２９および３０で示す。さらに、図
８中のプラスミド２０、２２および２１中に具体的に示
されている−２３９ｎｔ〜−２３０ｎｔ、−５４ｎｔ〜
−４４ｎｔおよび−１０５ｎｔ〜−９５ｎｔの両端に図
４に示されているこれらの領域の両端の１塩基ずつを加
えた塩基配列をそれぞれ配列番号３１、３２および３３
で示す。以下に、構築したｐＦＣＡＴの作出法を説明す
る。

【００４０】ｐＦ１９００ＣＡＴ、ｐＦ２０２ＣＡＴ
（図６；１，７参照）ｐｒＦＮｐｐ２．１をＢａｍＨＩ又はＳａｕ３ＡＩと
ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、それぞれ２．１ｋｂｐと３
５１ｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮの５’側隣接領域の−１９
０８ｎｔ又は−２０２ｎｔから＋１３６ｎｔまでを含
む）をｐＳＶ２ＣＡＴ−ＸＢのＨｉｎｄＩＩＩサイト
とＢｇｌＩＩサイトの間に挿入し、ｐＦ１９００ＣＡ
ＴとｐＦ２０２ＣＡＴを作出した。

【００４１】ｐＦＣ１０７９ＣＡＴ（図６，２参照）ｐｒＦＮｓｎ２．３をＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑末端とし、ＢａｍＨＩリンカーを
付加した。次に、ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで切断し、
１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮの５’側隣接領域の−
１０７９ｎｔから＋１３６ｎｔまでを含む）をＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＰｓｔＩアダプター（５’ＡＧＣＴＴＧＣＡ
３’）を用いてｐＳＶ２ＣＡＴ−ＸＢのＨｉｎｄＩＩ
ＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの間に挿入し、ｐＦ１０
７９ＣＡＴを作出した。

【００４２】ｐＦ８８２ＣＡＴ、ｐＦ５６４ＣＡＴ、ｐ
Ｆ４１４ＣＡＴ、ｐＦ１６６ＣＡＴ（図６；３、５、
６、８参照）ｐｒＦＮｐｐ２．１をＳｔｕＩ、ＳｍａＩ、ＤｒａＩ又
はＲｓａＩで切断し、ＢｇｌＩＩリンカーを付加し
た。次に、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、
それぞれ１ｋｂｐ、７１０ｂｐ、５６０ｂｐ並び３１０
ｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮの５’側隣接領域の−８８２ヌ
クレオチド、−５６４ヌクレオチド、−４１４ヌクレオ
チド又は−１６６ヌクレオチドから＋１３６ヌクレオチ
ドまでを含む）をｐＳＶ２ＣＡＴ−ＸＢのＨｉｎｄＩ
ＩＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの間に挿入し、ｐＦ８
８２ＣＡＴ、ｐＦ５６４ＣＡＴ、ｐＦ４１４ＣＡＴ並び
にｐＦ１６６ＣＡＴを作出した。

【００４３】ｐＦ７４６ＣＡＴ、ｐＦ１２３ＣＡＴ（図
６；４，１０参照）ｐｒＦＮｐｐ２．１をＡｐａＬＩ又はＥａｇＩで切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、Ｂｇ
ｌＩＩリンカーを付加した（ＥａｇＩサイトはリンカ
ーを付加したことにより修復された）。次に、Ｂｇｌ
ＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、それぞれ９００ｂｐ又
は２７０ｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮの５’側隣接領域の−
７４６ｎｔ又は−１２３ｎｔから＋１３６ｎｔまでを含
む）をｐＳＶ２ＣＡＴ−ＸＢのＨｉｎｄＩＩＩサイト
とＢｇｌＩＩサイトの間に挿入しｐＦ７４６ＣＡＴと
ｐＦ１２３ＣＡＴを作出した。

【００４４】ｐＦ１５４ＣＡＴ（図６；９参照）ｐｒＦＮｐｐ２．１をＡａｔＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で切断し、３００ｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮの５’側隣接
領域の−１５４ｎｔから＋１３６ｎｔまでを含む）をＳ
ａｕ３ＡＩ−ＡａｔＩＩアダプター（５’ＧＡＴＣＡ
ＣＧＴ３’）を用いてｐＳＶ２ＣＡＴ−ＸＢのＨｉｎｄ
ＩＩＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの間に挿入しｐＦ
１５４ＣＡＴを作出した。

【００４５】ｐＦΔａ８８２ＣＡＴ、ｐＦΔａ７４６Ｃ
ＡＴ、ｐＦΔａ５６４ＣＡＴ、ｐＦΔａ４１４ＣＡＴ、
ｐＦΔａ１２３ＣＡＴ（図７；１１、１２、１３、１
４、１６参照）ｐｒＦＮｓｎ２．３をＥｃｏＲＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑末端とし、ＢｇｌＩＩリンカーを
付加した。次に、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し、
１ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮエンハンサーの−１９０８
ｎｔから−１０７５ｎｔまでを含む）をｐＳＶ２ＣＡＴ
−ＢＸのＢｇｌＩＩサイトとＸｈｏＩサイトの間に挿
入し、ｐＳＶ２ＣＡＴ−ＦＮａを作出した。次に、ｐＦ
８８２ＣＡＴ、ｐＦ７４６ＣＡＴ、ｐＦ５６４ＣＡＴ、
ｐＦ４１４ＣＡＴ及びｐＦ１２３ＣＡＴからそれぞれＦ
Ｎプロモーター及びエンハンサーを含むＢｇｌＩＩ−
ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離してｐＳＶ２ＣＡＴ−Ｆ
ＮａのＨｉｎｄＩＩＩサイトとＢｇｌＩＩサイトの
間に挿入し、ｐＦΔａ８８２ＣＡＴ、ｐＦΔａ７４６Ｃ
ＡＴ、ｐＦΔａ５６４ＣＡＴ、ｐＦΔａ４１４ＣＡＴ及
びｐＦΔａ１２３ＣＡＴを作出した。

【００４６】ｐＦΔａ１５４ＣＡＴ（図７；１５参照）ｐｒＦＮｐｐ２．１をＡａｔＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で切断し、３００ｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮの５’側隣接
領域の−１５４ｎｔから＋１３６ｎｔまでを含む）をＳ
ａｕ３ＡＩ−ＡａｔＩＩアダプター（５’ＧＡＴＣＡ
ＣＧＴ３’）を用いて前項で作出したｐＳＶ２ＣＡＴ−
ＦＮａのＨｉｎｄＩＩＩサイトとＢｇｌＩＩサイト
の間に挿入し、ｐＦΔａ１５４ＣＡＴを作出した。

【００４７】ｐＦΔｂ７４６ＣＡＴ、ｐＦΔｂ５６４Ｃ
ＡＴ（図７；１７、１８参照）ｐｒＦＮｓｎ２．３をＳｔｕＩで切断後、ＢｇｌＩＩ
リンカーを付加した。次に、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで
切断し、１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮエンハンサー
の−１９０８ｎｔから−８８２ｎｔまでを含む）をｐＳ
Ｖ２ＣＡＴ−ＢＸのＢｇｌＩＩサイトとＸｈｏＩサ
イトの間に挿入し、ｐＳＶ２ＣＡＴ−ＦＮｂを作出し
た。次に、ｐＦ７４６ＣＡＴ又はｐＦ５６４ＣＡＴから
それぞれＦＮプロモーター及びエンハンサーを含むＢｇ
ｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を単離してｐＳＶ２Ｃ
ＡＴ−ＦＮｂのＨｉｎｄＩＩＩサイトとＢｇｌＩＩ
サイトの間に挿入しｐＦΔｂ７４６ＣＡＴとｐＦΔｂ５
６４ＣＡＴを作出した。

【００４８】ｐＦΔｃ５６４ＣＡＴ（図７；１９参照）ｐｒＦＮｓｎ２．３をＡｐａＬＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑末端とし、ＢｇｌＩＩリンカーを
付加した。次に、ＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで切断し
１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（ＦＮエンハンサーの−９０
８ヌクレオチドから−７４２ヌクレオチドを含む）をｐ
ＳＶ２ＣＡＴ−ＢＸのＢｇｌＩＩサイトとＸｈｏＩ
サイトの間に挿入し、ｐＳＶ２ＣＡＴ−ＦＮｃを作出し
た。次に、ｐＦ５６４ＣＡＴからＦＮプロモーター及び
エンハンサーを含むＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
を単離してｐＳＶ２ＣＡＴ−ＦＮｃのＨｉｎｄＩＩＩサ
イトとＢｇｌＩＩサイトの間に挿入し、ｐＦΔｃ５６
４ＣＡＴを作出した。

【００４９】ｐＦｇＧＧＣＡＴ、ｐＦｇｇＧＣＡＴ、ｐ
ＦｇＧｇＣＡＴＡ、ｐＦｇｇｇＣＡＴ（図８；２０、２
１、２２、２３参照）ＦＮプロモーター及びエンハンサーの機能をより強化す
る目的で、該ＤＮＡ塩基配列に含まれる３カ所のＧリッ
チな領域（ＦＮ５’側隣接領域の−２３９〜−２２９ｎ
ｔ、−１０５〜−９５ｎｔ及び−５４〜−４４ｎｔに存
在するＧのみで、又は中央付近にＣを１塩基挟んでＧが
１０塩基並んだ領域。これらをＧ１０領域と称する）に
塩基置換変異を導入し、本項及び次項のｐＦＣＡＴｓを
作出した。ｐＦ５６４ＣＡＴをＢｇｌＩＩとＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し、ＦＮプロモーターを含む７２０ｂｐ
のＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１９ファージベクターのＢａ
ｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入して
Ｍ１３Ｆ５６４ファージを得、これを大腸菌ＣＪ２３６
株に感染して単鎖ファージＤＮＡを調製した。該単鎖フ
ァージＤＮＡを鋳型とし、合成ＤＮＡプライマーと宝酒
造社の部位特異的変異導入システム”Ｍｕｔａｎ−Ｋ”
を用いて、Ｋｕｎｋｅｌらの方法によりＦＮ５’側隣接
領域の−２３６〜−２３３ｎｔ（ａ）、−９８〜−９５
ｎｔ（ｂ）、または−５４〜−５１ｎｔ（ｃ）にある３
カ所のＧＧＧＧ配列をそれぞれＡＴＣＣ、ＡＴＣＣ、Ｃ
ＴＴＡに置換した。この塩基置換変異の導入により、そ
れぞれのＧ１０領域は破壊された。塩基置換変異ファー
ジのうち、（ａ）のみを置換したものをＭ１３ＦｇＧ
Ｇ、（ａ）と（ｂ）を置換したものをＭ１３ｇｇＧ、
（ａ）と（ｃ）を置換したものをＭ１３ＦｇＧｇ、
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の３カ所を置換したものを
Ｍ１３Ｆｇｇｇとした。下線部分のｇは置換変異を、Ｇ
は野生型の配列を表し、最初のｇは（ａ）の位置、二番
目のｇは（ｂ）の位置、三番目のｇは（ｃ）の位置を示
した。Ｍ１３ＦｇＧＧ、Ｍ１３ＦｇｇＧ、Ｍ１３ＦｇＧ
ｇ並びにＭ１３Ｆｇｇｇより、ｐＦ４１４ＣＡＴと同様
の方法で、それぞれｐＦｇＧＧＣＡＴ、ｐＦｇｇＧＣＡ
Ｔ、ｐＦｇＧｇＣＡＴ並びにｐＦｇｇｇＣＡＴを構築し
た。

【００５０】ｐＦΔｇＧＣＡＴ、ｐＦΔＧｇＣＡＴ、ｐ
ＦΔｇｇＣＡＴ（図８；２４、２５、２６参照）前項で構築したＭ１３ｇｇＧ、Ｍ１３ｇＧｇ並びにＭ１
３ｇｇｇより、ｐＦ１２３ＣＡＴと同様の方法で、それ
ぞれｐＦΔｇＧＣＡＴ、ｐＦΔＧｇＣＡＴ並びにｐＦΔ
ｇｇＣＡＴを構築した。下線部のΔは前項の（ａ）の配
列が欠如していることを示した。

【００５１】（２）−２ＣＡＴアッセイ３Ｙ１細胞における発現（図９参照）前項で作出した２６種類のｐＦＣＡＴ及び実験対照用Ｃ
ＡＴ発現プラスミドｐｔｋＣＡＴ（ＨａｙａｓｈｉらＧ
ｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１、８１８）
とｐＳＶ２ＣＡＴを用い、増殖中と低血清（ウシ血清
０．５％）培地中で休止中の３Ｙ１でＣＡＴアッセイを
行なった（図９、Ａ参照）。このときのＤＮＡトランス
フェクションは、以下の条件で行なった。増殖中の３Ｙ
１；直径９ｃｍのシャーレに約５×１０５の細胞をま
き、翌日１枚あたり２０μｇのＤＮＡを燐酸カルシウム
共沈法（Ｃｈｅｎら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣ
ｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、７（８）、２７４
５）で４．５時間から６時間投与した。休止中の３Ｙ
１；直径９ｃｍのシャーレ当たり約１×１０６の細胞を
まき、２日後に増殖中の場合と同様の条件でトランスフ
ェクトした。いずれの場合もトランスフェクションの後
４８時間から５０時間目に細胞を収穫し、０．２５Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）中で凍結融解を３回行な
って細胞抽出液を調製した。

【００５２】ＣＡＴアッセイは、Ｇｏｒｍａｎらの方法
に従って行なった。その結果は図９、Ｂに示す通りであ
るが、以下のことが分かった。なお、各ｐＦＣＡＴは図
６、７、８に示した番号で表現する。（イ）全体からＦＮエンハンサー及びプロモーターは、
休止中の３Ｙ１でより強い発現活性を持つ。（ロ）全体からＦＮエンハンサー及びプロモーターは、
ｔｋプロモーターやＳＶ２プロモーターより強い発現活
性を持つ。（ハ）１と２、３〜６と１１〜１４の比較から、ＦＮエ
ンハンサーの−１９０８ｎｔから−１０７９ｎｔまでの
間には発現を促進する領域が含まれる。なお、図４から
知ることができる、この領域の塩基配列を配列番号２７
に示す。（ニ）１と１８、２〜４と５の比較から、ＦＮエンハン
サーの−８８２ｎｔから−５６４ｎｔまでの間には発現
を抑制する領域が含まれる。なお、図４から知ることが
できる、この領域の塩基配列を配列番号３４に示す。（ホ）６、１４と９、１５または１０、１６の比較か
ら、ＦＮエンハンサーの−４１４ｎｔから−１５４ｎｔ
の間に（イ）で示した−１９０８ｎｔから−１０７９ｎ
ｔにある発現促進領域の機能に必要な領域が存在する。
なお、図４から知ることができる、−４１４ｎｔから−
１５４ｎｔの塩基配列を配列番号３５に示す。

【００５３】トランスフォームした３Ｙ１細胞（Ｘｈｏ
Ｃ１４細胞）における発現（図１０参照）アデノウィルスＥ１遺伝子で３Ｙ１をトランスフォーム
した細胞株ＸｈｏＣ１４では、フィブロネクチンの発現
が正常型３Ｙ１細胞に比べて極めて低い。ＸｈｏＣ細胞
で前項同様にＣＡＴアッセイを行って解析したところ、
１〜１９までのｐＦＣＡＴｓの発現は３Ｙ１細胞での発
現に比べて１／１０程度と低かった（トランスフェクシ
ョンの条件、及びＣＡＴアッセイの方法は、前項の増殖
中の３Ｙ１と同様に行った）。一方、Ｇ１０領域に塩基
置換変異を導入した２０〜２６（図８参照）をＸｈｏＣ
細胞にトランスフェクトし、ＣＡＴアッセイを行なって
ｐＦ４１４ＣＡＴ（＝ｐＦＧＧＧＣＡＴ）、またはｐＦ
１２３ＣＡＴ（＝ｐＦΔＧＧＣＡＴ）と発現レベルを比
較したところ、図１０に示す結果を得た。これにより、
以下のことがわかった。（ヘ）ＦＮプロモーター及びエンハンサーに含まれる３
箇所のＧリッチな領域（Ｇ１０領域）は、トランスフォ
ームした細胞株（ＸｈｏＣ）において、発現に対して抑
制的に働く。（ト）従って、３箇所のＧ１０領域を例えば塩基置換等
の変異を導入することで破壊すれば、ＦＮエンハンサー
及びプロモーターは、トランスフォームした細胞株にお
いても強い発現活性を回復する。

【００５４】（３）形質導入ベクターｐＦ１９００Ｌ、
ｐＦΔｂ５６４Ｌ，ｐＦ１９００Ｌｎｅｏ並びにｐＦ
Δｂ５６４Ｌｎｅｏの構築前項の結果に基づき、形質導入ベクターｐＦ１９００
Ｌ、ｐＦΔｂ５６４Ｌ、ｐＦ１９００Ｌｎｅｏ及びｐＦ
Δｂ５６４Ｌｎｅｏを構築した（図１１、１２参照）。
ｐＦ１９００ＬとｐＦΔｂ５６４ＬはそれぞれｐＦ１９
００ＣＡＴとｐＦΔｂ５６４ＣＡＴのＣＡＴ遺伝子部分
をＦＮの＋１９８ｎｔから＋３１２ｎｔの断片（ＦＮ分
泌シグナルの部分）と交換したプラスミドである。新た
に挿入したＦＮ分泌シグナルの部分は、５’側にＨｉｎ
ｄＩＩＩサイトと３’側にＢｇｌＩＩサイトを持
ち、これらの制限酵素によって切り出すことができる。
また、これらのサイトはそれぞれの任意構造遺伝子のク
ローニングサイトとなる。ただし、ＢｇｌＩＩサイト
にクローニングするときは、ＦＮ分泌シグナルのアミノ
酸コードにコドンフレームを合わせなければならない。

【００５５】pF1900LneoとpFΔb564Lneoは、pSV2neo の
NdelサイトにBamHI リンカーを付加してBamHI で切断
し、SV2 プロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む
ＤＮＡ断片をそれぞれpF1900L とpFΔb564L のBamHI サ
イトに挿入して作出した。これらのプラスミドは細胞に
導入後、安定形質転換株をG418耐性株として単離するこ
とができる。

【００５６】上記プラスミドｐＦ１９００Ｌを、Maniat
is, T. Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982). Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring H
arbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory) の
方法に従って大腸菌ＤＨ１に導入し、形質転換体E. col
i AG1/pF1900L (IFO 15220、 FERM BP-3552) を作製し
た。

【００５７】図実施例２（４）形質導入ベクターｐＦ１９００Ｍの構築前項で構築した形質導入ベクターとは別に、ＦＮ分泌シ
グナルを予め持たないベクターｐＦ１９００Ｍを構築し
た（図１９、２０参照）。まず、ｐｒＦＮｐｐ２．１の
ＦＮエンハンサー及びプロモーター３’側に隣接するマ
ルチクローニングサイトをＡｐａＩで切断した。Ｂｇｌ
ＩＩＩリンカーを挿入後、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩ
で切断してＦＮエンハンサー及びプロモーターを含むＤ
ＮＡ断片を単離した。次にｐＳＶ２β−ｇｌｏｂｉｎを
ＮｄｅＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理してＢ
ｇｌＩＩリンカーを挿入後、ＢｇｌＩＩで切断してＳＶ
４０のスプライシング／ポリアデニレーション・シグナ
ル、並びにｐＢＲ３２２の複製開始点とアンピシリン耐
性遺伝子領域を含むＤＮＡ断片を単離した。それぞれ単
離したＤＮＡ断片を接続し、ＦＮエンハンサー及びプロ
モーターの３’側にＳＶ４０のスプライシング／ポリア
デニレーション・シグナルを配置したプラスミドを選択
して、ｐＦ１９００Ｍとした。

【００５８】(5) ｐＦ１９００Ｍを用いた遺伝子産物の
産生構築した形質発現ベクターｐＦ１９００Ｍの遺伝子産物
産生能を調べる目的で、該ベクターを用いてラット３Ｙ
１細胞にヒト・インターフェロン・ガンマ（以下、Ｈｕ
ＩＦＮ−γと表記する）の遺伝子を導入し、ＨｕＩＦＮ
−γ発現細胞Ｉ株（Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６）を
樹立した。該細胞株を用いて血清無添加培地、又は低血
清濃度培地におけるＨｕＩＦＮ−γの産生レベル、ｍＲ
ＮＡの発現レベル、導入した遺伝子の細胞ゲノムにおけ
る存在状態、及び産生されたＨｕＩＦＮ−γタンパク質
について解析した。

【００５９】解析結果から次の５点を明らかにした。こ
れらの結果から、形質導入ベクターｐＦ１９００Ｍを用
いて構造遺伝子を導入、保持せしめた動物細胞形質転換
体を培養し、遺伝子産物を製造することが有用であるこ
とを示した。 (i) ｐＦ１９００Ｍを用いて構造遺伝子を導入、保持せ
しめた動物細胞形質転換体の、低血清培地中での簡便な
単層培養による遺伝子産物の産生量が、従来の動物細胞
形質転換体を培養して得られる遺伝子産物の産生量を上
回る。 (ii)ｐＦ１９００Ｍを用いて構造遺伝子を導入、保持せ
しめた動物細胞形質転換体の遺伝子産物産生量は、該細
胞が増殖を停止することによって増加する。 (iii) ｐＦ１９００Ｍを用いて構造遺伝子を導入、保持
せしめた動物細胞形質転換体の遺伝子産物産生量は、Ｆ
Ｎエンハンサー・プロモーターによる構造遺伝子ｍＲＮ
Ａの発現活性に依存する。 (iv)ｐＦ１９００Ｍを用いて構造遺伝子を導入した動物
細胞形質転換体では、導入した遺伝子が３〜６コピー程
度保持される。 (v) ｐＦ１９００Ｍを用いて構造遺伝子を導入、保持せ
しめた動物細胞形質転換体によって産生された遺伝子産
物は、糖鎖修飾等の点において天然型の遺伝子産物と類
似している。

【００６０】以下に解析の具体的方法と結果を示す。(5) −１ＨｕＩＦＮ−γｃＤＮＡのｐＦ１９００Ｍ
ＦＮエンハンサー及びプロモーター下流への挿入（ｐＦ
１９００γの作出）ｐＦ１９００ＭをＥｃｏＲＶで切断し、ＢｇｌIIリンカ
ーを挿入後、ＢｇｌIIで切断してベクター断片とした。
次に、大阪大学バイオサイエンス研究所分子生物学研究
部・部長長田重一博士の好意により分与されたＨｕＩ
ＦＮ−γｃＤＮＡを、ｍＲＮＡ転写開始部位から５０番
目と８９２番目の塩基部位に存在するＳａｕ３ＡＩサイ
ト（Gray et al., Nature (London) 295, 503-508 (198
2)) で切断して単離し、ｐＦ１９００Ｍベクター断片と
接続した。ＨｕＩＦＮ−γｃＤＮＡの５’末端側が、Ｆ
Ｎプロモーターの３’末端側に隣接するプラスミドを選
択し、ＨｕＩＦＮ−γ発現プラスミドｐＦ１９００γと
した。

【００６１】(5) −２ＨｕＩＦＮ−γ産生細胞株Ｉ
６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６の樹立直径８ｃｍのシャーレに約５ｘ１０⁵ の３Ｙ１細胞をま
いて１夜培養した。この３Ｙ１細胞に、前項で作出した
ｐＦ１９００γ ２０μｇと薬剤耐性遺伝子発現プラス
ミドｐＳＶ２ｎｅｏ２μｇをリン酸カルシウム共沈法
（Chen, et al., Molecular and Cellular Biology, 7,
2745-2752 (1987))で４時間投与した。投与後、３Ｙ１
細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコの
修飾イーグル培地（以下、１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭと表
記）で４８時間培養し、新しいシャーレ４枚にまき換え
た。まき換え後およそ２週間、Ｇ４１８（geneticin)３
００μｇ／ｍｌを含む１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地で培
養した。出現した細胞のコロニーをクローニング・カッ
プを用いて単離し、Ｇ４１８（geneticin)３００μｇ／
ｍｌを含む１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地で培養した。お
よそ４週間継代培養後、培地をＧ４１８（geneticin)を
含まない１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭに換え、さらに１回継
代し、Ｉ細胞株とした。

【００６２】得られた各Ｉ細胞株について培養上清を回
収し、含まれるＨｕＩＦＮ−γの濃度をメンゴ（mengo)
ウイルスに対する抗ウイルス・アッセイで調べた。すな
わち、９６−ウェル培養プレートに、ヒトＦＬ細胞を５
ｘ１０⁴ 細胞／ウェルでまき込み、５％ＦＣＳ−ＤＭＥ
Ｍ培地１００μｌと段階希釈した標準ＨｕＩＦＮ−γ標
品、または回収したＩ細胞株培養上清４５μｌを投与し
て２４時間培養した。各ウェルに１ｘ１０⁵ のメンゴ・
ウイルスを加えてさらに２４時間培養後、上清を捨てて
ウェル内に残存する細胞をクリスタルバイオレットで染
色した。ＦＬ細胞の抗ウイルス活性の獲得に必要な標準
ＨｕＩＦＮ−γ標品濃度と、同等の活性を有するＩ細胞
株培養上清の希釈率から、該上清中のＨｕＩＦＮ−γ濃
度を算出した。Ｉ細胞各株のうち、最も培養上清へのＨ
ｕＩＦＮ−γ分泌産生量の多かったＩ６、Ｉ７、Ｉ２５
及びＩ２６細胞株を選択して以下の検討に供した。

【００６３】（５）−３培養方法の、Ｉ細胞株による
ＨｕＩＦＮ−γ産生に及ぼす影響１６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細胞を直径５ｃｍのシャ
ーレに２ｘ１０５個まき（１ｘ１０４細胞／ｃｍ２），
１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地４ｍｌで３日間培養後、同
組成の培地４ｍｌに交換してさらに２日培養した。ＰＢ
Ｓ−でシャーレに付着した細胞を２回洗浄し、ＦＣＳ無
添加のＤＭＥＭ培地（０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）４ｍｌ
で３日培養後、再度０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ４ｍｌに交換
して５日培養した。この間に各細胞株について、細胞数
と培養上清中のＨｕＩＦＮ−γ濃度（抗ウイルス活性力
価）を測定した。結果を図２１に示した。黒点と実線の
曲線で細胞数を表し、灰色の棒グラフで培養上清中のＨ
ｕＩＦＮ−γ濃度を表した。黒矢印は１０％ＦＣＳ−Ｄ
ＭＥＭ培地に交換したことを、白矢印は０％ＦＣＳ−Ｄ
ＭＥＭ培地に交換したことを示す。いずれの細胞株もま
き込み後ほぼ５日間に１〜１．２ｘ１０６細胞／ディッ
シュ（５〜６ｘ１０４細胞／ｃｍ２）でコンフルーエン
トに達し、０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換後５日間で
８ｘ１０５細胞／ディッシュ（４ｘ１０４細胞／ｃｍ
２）まで減少した。その後３日間はほとんど減少しなか
った。培養上清中のＨｕＩＦＮ−γ濃度は、細胞密度が
コンフルーエントに達した後、Ｉ６とＩ７株では１日で
約５ｘ１０４単位／ｍｌに上昇した。特にＩ７株では細
胞数減少後に、２日間で最高濃度の４ｘ１０５単位／
ｍｌを示した。Ｉ６とＩ７株で一細胞当たりのＨｕＩＦ
Ｎ−γ産生量は、増殖中の３日目から５日目までの平均
がそれぞれ０．０３単位／細胞／日と０．０５単位／細
胞／日、増殖を停止した５日目から８日目までの平均が
それぞれ０．０６単位／細胞／日と０．１２単位／細胞
／日（ただし、培地中のＨｕＩＦＮ−γは経時的に分解
せず、培養上清中に蓄積するものとして２４時間に蓄積
した量を用い、細胞数は２４時間毎の推定細胞数を用い
た）であった。

【００６４】以上の結果から、（ａ）少なくともＩ６と
Ｉ７株では、増殖停止後に細胞当たりのＨｕＩＦＮ−γ
産生能力が倍加することが判明した。この結果は、ＦＮ
プロモーターの活性が増殖停止（休止）中の３Ｙ１細胞
で、増殖中に比べて約２〜５倍上昇することを示したＣ
ＡＴアッセイの結果（図９、Ｂ）と一致する。

【００６５】（Ｂ）培地中のＦＣＳ濃度がＨｕＩＦＮ−
γ産生に及ぼす影響Ｉ７細胞を直径８ｃｍのシャーレに５ｘ１０５細胞／デ
ィッシュ（１ｘ１０４細胞／ｃｍ２）でまき、１０％Ｆ
ＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌで３日間、培地を交換して
さらに３日間、合計６日間培養し、コンフルーエント
（細胞密度６ｘ１０４細胞／ｃｍ２）にした。６日目を
サンプリング開始日（Ｄａｙ０）とし、各シャーレの培
養上清を１００μｌづつ収穫し、４℃に保存した。次に
これらのシャーレを２群に分け、ＰＢＳ−で２回洗浄
後、１群には１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを、
他の１群には０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍえて１０
日間培養した。この間培地交換は行わず、Ｄａｙ１、
２、３、４、６、８、１０にそれぞれ１００μｌづつ培
養上清を収穫して４℃に保存した。収穫したサンプル中
のＨｕＩＦＮ−γ濃度（抗ウイルス活性力価）を測定
し、図２２Ａに示した。

【００６６】Ｄａｙ０に、３日間１０％ＦＣＳ−ＤＭＥ
Ｍ培地１０ｍｌで培養した上清中のＨｕＩＦＮ−γ濃度
は、１ｘ１０⁵ 単位／ｍｌを示した（黒棒グラフ）。１
０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを与えた１群の上清
中のＨｕＩＦＮ−γ濃度はＤａｙ１に１ｘ１０⁵ 単位／
ｍｌを示し、Ｄａｙ２以降は５ｘ１０⁵ 単位／ｍｌを示
した（黒棒グラフ）。Ｄａｙ２以後ＨｕＩＦＮ−γ濃度
が変化しなかった原因は、ＨｕＩＦＮ−γの産生・分泌
と、器質等への吸着・分解が平衡状態に達したためと推
定した。

【００６７】一方、０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌ
を与えた１群は、Ｄａｙ１で１ｘ１０⁴ 単位／ｍｌ、Ｄ
ａｙ２で１ｘ１０⁵ 単位／ｍｌのＨｕＩＦＮ−γ濃度を
示した。Ｄａｙ３以降は５ｘ１０⁵ 単位／ｍｌを示して
Ｄａｙ１０まで変化しなかった（白棒グラフ）。

【００６８】光学顕微鏡観察では、どちらの培地を用い
た場合でも、Ｄａｙ１０でＤａｙ０に比べて細胞密度の
低下を認めたが、細胞が萎縮したり、まとまって剥離し
た形跡を認めなかった。

【００６９】これらの結果は、ｐＦ１９００ＭのＦＮエ
ンハンサー及びプロモーターによるＨｕＩＦＮ−γの発
現が、（ｂ）細胞培養用の培地に含まれるＦＣＳ濃度に
ほとんど依存しないこと、（ｃ）細胞密度がコンフルー
エントとなって増殖を停止した状態で、上昇することを
示した。

【００７０】（ｃ）２日毎に培地交換を行った場合のＨ
ｕＩＦＮ−γの産生濃度変化Ｉ７細胞を直径８ｃｍのシャーレに５ｘ１０５細胞／デ
ィッシュ（１ｘ１０４細胞／ｃｍ２）でまき、１０％Ｆ
ＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌで３日間、培地を交換して
さらに３日間、合計６日間培養し、コンフルーエント
（細胞密度６ｘ１０４細胞／ｃｍ２）にした。６日目を
サンプリング開始日（Ｄａｙ０）とし、各シャーレの培
養上清を１００μｌづつ収穫し、４℃に保存した。次に
これらのシャーレを３群に分け、ＰＢＳ−で２回洗浄
後、１群には１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを、
他の１群には０．５％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌ
を、残りの１群には０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌ
を与えて１０日間培養した。この間、２日毎にそれぞれ
同一組成の培地１０ｍｌに交換した。培地交換時には、
交換前の培養上清をそれぞれ１００μｌづつ収穫して４
℃に保存した。収穫したサンプル中のＨｕＩＦＮ−γ濃
度（抗ウイルス活性力価）を測定し、図２２Ｂに示し
た。

【００７１】Ｄａｙ０には、３日間１０％ＦＣＳ−ＤＭ
ＥＭ培地１０ｍｌで培養した上清中のＨｕＩＦＮ−γ濃
度、１ｘ１０⁵ 単位／ｍｌを示した（黒棒グラフ）。１
０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地（黒棒グラフ）または０．５
％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地（灰色棒グラフ）１０ｍｌを与
えた群の上清では、Ｄａｙ１０まで毎回、１ｘ１０⁵単
位／ｍｌのＨｕＩＦＮ−γ濃度を示した。０％ＦＣＳ−
ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを与えた群では、６日目まで１ｘ
１０⁵ 単位／ｍｌのＨｕＩＦＮ−γ濃度を示したが、
８、１０日目では１ｘ１０⁵ 単位／ｍｌに低下した（白
棒グラフ）。

【００７２】光学顕微鏡観察で、１０％または０．５％
ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地を与えた群では、Ｄａｙ１０でＤ
ａｙ０に比べてわずかに細胞密度の低下を認めたのみで
あったが、０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地を与えた群ではＤ
ａｙ６以降、死んで萎縮したり、まとまって剥離した細
胞を認めた。

【００７３】これらの結果は、（ｄ）ＨｕＩＦＮ−γの
産生濃度は、２日毎の培地交換で最高レベルの５ｘ１０
⁵ 単位／ｍｌを維持できること、（ｅ）ＨｕＩＦＮ−γ
の産生レベルは培地中のＦＣＳ濃度に依存しないこと、
（ｆ）ＤＭＥＭを基礎培地を用いて２日毎の培地交換を
行う場合は、細胞の維持のために０．５％程度のＦＣＳ
を培地に添加すべきであることを示した。

【００７４】本項（(5) −３）の結果は、Ｉ７細胞の低
血清培地中での簡便な単層培養によるＨｕＩＦＮ−γの
産生量が、従来の動物細胞形質転換体を培養して得られ
るヒト型インターフェロンの産生量（E. Sano et al.,
in Biotechnology of Mammalian Cells (M. Umeda, et
al. ed.)pp.149-162, Japan Scientific Societies Pre
ss, Tokyo (1987), R. Fukunaga, et al., Proceedings
of the National Academy of Science USA, 81, 5086-
5090 (1984))を上回ることを示した。

【００７５】(5) −４Ｉ細胞株におけるＨｕＩＦＮ−
γｍＲＮＡの発現状態Ｉ細胞株におけるＨｕＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現状態
を、ノザンブロット・ハイブリダイゼーション法で解析
した。まず、３Ｙ１、Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細
胞株から全ＲＮＡを酸グアニジウムフェノールクロロホ
ルム（ＡＧＰＣ）法（P. Chomczynski and N. Sacchi,
Analytical Biochemistry, 162, 156-159(1987)) で抽
出した。具体的方法を以下に示す。

【００７６】３Ｙ１、Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細
胞を直径８０ｍｍのプラスチックシャーレ各３０枚に３
ｘ１０⁶ 細胞／ディッシュ（コンフルーエント）の密度
まで培養した。これらのシャーレをそれぞれ１５枚づつ
ａとｂの２グループに分けてＰＢＳ^- で２回洗浄後、ａ
グループのシャーレはＲＮＡの調製に供し、ｂグループ
のシャーレには０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地１０ｍｌを与
えてさらに４８時間培養し、細胞増殖を完全に停止させ
てＲＮＡの調製に供した。ＲＮＡの調製は以下の方法
（ＡＧＰＣ法）で行った。

【００７７】冷ＰＢＳ^- で２回洗浄した細胞（シャーレ
に付着した状態）をラバーポリスマンで剥離し、１５枚
（１グループ）毎にＦａｌｃｏｎ＃２０７０チューブに
採取後１２００ｘｇで５分間遠心してＰＢＳ^- を吸引除
去した。得られた細胞の沈殿に、１ｍｌの変性溶液（４
Ｍグアニジウムチオシアネート−２５ｍＭクエン酸ナト
リウム、ｐＨ７−0.1 Ｍβ−メルカプトエタノール−
０．５％Ｎ−ラウロイルザルコシン（Ｓａｒｋｏｓｙ
ｌ））を加え、１８ゲージの注射針と１ｍｌ容のディス
ポーザブル注射筒（テルモ社製）で粘性を失うまで吸入
・吐出を繰り返し、ホモゲナイズした。ホモジェネート
に０．１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ４と１ｍｌの
水飽和フェノール、０．２ｍｌのクロロホルムを加えて
ボルテックス・ミキサーで激しく混合した。混合液を氷
中で１５分間インキュベートし、１．５ｍｌ用の微量遠
心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）２本に分注して12000
x g で４℃、１５分遠心した。分離した水層を新しい微
量遠心管に写し、２倍量のイソプロパノールを加えて−
２０℃で１時間、ＲＮＡを沈殿させた。12000 x g で４
℃、１５分間遠心分離して上清を捨て、沈殿を３００μ
ｌの変性溶液に溶解後、２分間遠心分離して不溶物を除
去した。上清を新しい微量遠心管に写し、等量のイソプ
ロパノールを加えてＲＮＡを−２０℃で一夜沈殿させ、
12000 x g で４℃、１５分遠心分離した。上清を捨て、
沈殿を７５％エタノールでリンスし、２分間真空乾燥し
て２５μｌのＴＥに溶解し、ＲＮＡ溶液とした。ＲＮＡ
濃度は、ＲＮＡ溶液３μｌをＴＥで６００μｌに希釈
（１／２００倍希釈）して２６０ｎｍで吸光度（Ｏ．
Ｄ．２６０）を測定し、その値（λ）から次の式を用い
て算出した。（ＲＮＡ濃度μｇ／μｌ）＝λｘ４０ｘ２００÷１００
０（ただし、ＲＮＡは１Ｏ．Ｄ．２６０単位＝４０μｇ／
ｍｌ）

【００７８】次に抽出したＲＮＡをノザンブロット・ハ
イブリダイゼーション法によって解析した。具体的な方
法を以下に示す。

【００７９】３Ｙ１、Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細
胞株から抽出したＲＮＡそれぞれ２０μｇ当量に水を加
えて4.5 μｌとし、１０ｘＭＯＰＳ泳動緩衝液（２００
ｍＭ３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸ナト
リウム（ＭＯＰＳ）、ｐＨ７−８０ｍＭ酢酸ナトリウム
−１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２μｌ、１２．３
Ｍホルムアルデヒド３．５μｌ、及びホルムアミド１０
μｌを加えて十分混和後、６５℃で１５分間加熱変性せ
しめた。変性したＲＮＡ溶液に６ｘサンプル緩衝液（６
ｘホルムアルデヒドローディング緩衝液（１ｍＭＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８．０−０．２５％ブロムフェノールブルー
（ＢＰＢ）−０．２５％キシレンシアノール−５０％グ
リセロール））５μｌを加え、アガロース／ホルマリン
／ゲル（１．２％アガロース−２．２Ｍホルムアルデヒ
ド−２０ｍＭＭＯＰＳ、ｐＨ７−８ｍＭ酢酸ナトリウ
ム−１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に１ｘＭＯＰＳ泳
動緩衝液中で、電解強度（Ｅｄ）＝４Ｖ／ｃｍを負荷し
て４時間（ブロムフェノールブルーの泳動開始位置から
の移動距離（Ｍ_BPB ）＝１１ｃｍ）電気泳動分離した。
分離したＲＮＡは、ナイロンメンブレン（Hybond N+ 、
アマシャム社製）に、吸引転写装置（VacuGene (Pharma
cia-LKB 社製）を用いて、吸引圧（ＶＰ）＝４０ｍｍＨ
₂ Ｏで転写し、ノザンブロットとした。

【００８０】ノザンブロットをハイブリダイゼーション
反応液（５０％ホルムアミド−５ｘＳＳＣ−５ｘデンハ
ルツ溶液−０．５％ＳＤＳ−０．２ｍｇ／ｍｌ加熱変性
ｈｓＤＮＡ）中で４２℃、４時間インキュベートした
後、ランダム・プライマー法で³²Ｐ標識したＨｕＩＦＮ
−γｃＤＮＡプローブ（１ｘ１０⁹ ｃｐｍ／μｇ）また
はラットβ−アクチンｃＤＮＡプローブ（１ｘ１０⁹ ｃ
ｐｍ／μｇ）を５ｘ１０⁵ ｃｐｍ／ｍｌとなるように加
え、さらに４２℃、１８時間インキュベートした。ノザ
ンブロットに過剰に付着したハイブリダイゼーション反
応液は、２ｘＳＳＣ中に室温で１０分間２回洗浄後、２
ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで４２℃、２０分２回、０．
２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで４２℃、２０分間１回洗
浄して除去した。洗浄後のノザンブロットをサランラッ
プ（登録商標）で包み、バイオ・イメージアナライザー
ＢＡＳ２０００システム（富士写真フィルム（株）社
製）でプローブが特異的にハイブリダイズしたＲＮＡ分
子の量、及び鎖長を解析した。

【００８１】ノザンブロット上に検出されたＨｕＩＦＮ
−γ（ＩＦＮ−γ）ｍＲＮＡとラットβ−アクチン（β
−Ａｃｔｉｎ）ｍＲＮＡのバンドを図２３ＡとＢにそれ
ぞれ示した。ブロット上部に各レーンのＲＮＡサンプル
を抽出した細胞名とグループ名を示した。ブロット左側
にはＲＮＡサンプルに含まれる２８Ｓと１８Ｓのリボゾ
ームＲＮＡの移動位置を、右側にはバンドの検出に用い
たプローブ名を示した。図２３Ｂで、全ての細胞株間ま
たはグループ間で、ラットβ−アクチンｍＲＮＡのバン
ドの濃度差が小さいことを示し、各レーンに泳動したＲ
ＮＡサンプルの量がほぼ均一であることを証明した。Ｈ
ｕＩＦＮ−γｍＲＮＡのバンド（図２３Ａ）の濃度差は
該遺伝子の発現レベルを反映している。

【００８２】図２３Ａに示すようにＨｕＩＦＮ−γｍＲ
ＮＡは親細胞３Ｙ１を除く全ての細胞株で単一のバンド
として検出された。バンドの移動位置は１８Ｓリボゾー
ムＲＮＡのバンドの低分子量側に接しており、Ｇｒａｙ
らが報告したヒト・リンパ球のＩＦＮ−γｍＲＮＡの移
動位置（Ｐ．Ｗ・Ｇｒａｙ，ｅｔａｌ，Ｎａｔｕｒ
ｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），２９５，５０３−５０８（１９８
２））とほぼ一致した。Ｉ６、Ｉ７及びＩ２６株におい
ては細胞密度がコンフルーエント（３ｘ１０６細胞／デ
ィッシュ）に達した時（ａグループ）のＨｕＩＦＮ−γ
ｍＲＮＡ発現レベルはほとんど同じであった。また、こ
れらの細胞株では、０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地で４８時
間培養して細胞増殖を完全に停止させた時（ｂグルー
プ）のＨｕＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現レベルはそれぞれお
よそ１．５，５及び３倍に上昇した。Ｉ２５株における
ＨｕＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現レベルはａ、ｂグループ共
に低く、Ｉ７株のａグループに比べてそれぞれ０．２、
０．３倍であった。

【００８３】本項の結果は、(5) −３項で得た結果（Ｉ
細胞によるＨｕＩＦＮ−γの産生量は、細胞の増殖停止
後に上昇する）と一致した。従って、Ｉ細胞によるＨｕ
ＩＦＮ−γの産生量が、ＦＮエンハンサー・プロモータ
ーによるＨｕＩＦＮ−γｍＲＮＡの発現活性に依存する
ことは明白である。

【００８４】(5) −５Ｉ細胞株に導入したｐＦ１９０
０ＭＤＮＡの存在状態Ｉ細胞株に導入したｐＦ１９００ＭＤＮＡの存在状態を
サザンブロット・ハイブリダイゼーション法で解析し
た。まず、３Ｙ１、Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細胞
株から高分子量のゲノムＤＮＡを分離した。具体的方法
を以下に示す。

【００８５】３Ｙ１、Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細
胞を直径８０ｍｍのプラスチックシャーレ各１０枚に３
ｘ１０⁶ 細胞／ディッシュ（コンフルーエント）の密度
まで培養した。培養後の細胞を、シャーレ当たり１０ｍ
ｌのＰＢＳ^- で２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのウシ膵臓プ
ロテイナーゼＫ（Proteinase K、 Sigma 社製）を含む１
０ｍＭ Tris-HCl,pH7.4 -１０ｍＭＥＤＴＡ−１５０
ｍＭ NaCl−０．４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）溶液（プロテイナーゼＫ溶液）１ｍｌ／ディシュで
溶解した。細胞溶解液は、シャーレ２５枚分毎に５０ｍ
ｌ容のスクリューキャップ付きプラスチック遠心管に回
収し、６０℃で１５分間、さらに３７℃でゆっくりと反
転させながら一夜インキュベートした。翌日、１０ｍｇ
／ｍｌのプロテイナーゼＫを含むプロテイナーゼ溶液を
遠心管当たり３ｍｌ加え、６０℃で１５分間、続けて３
７℃でゆっくりと反転させながら２夜インキュベート
し、細胞のタンパク質成分を分解した。インキュベート
後、細胞溶解液に等量の塩飽和フェノール（Salt satur
ated phenol またはss-phenol)：クロロホルム（＝１：
１）で混合液で６回、クロロホルムで２回抽出し、水層
を分離した。抽出の際は、高分子量のＤＮＡが剪断され
ないように注意し、穏やかに液層を混合した。水層に１
／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ７．４と２．５倍容
のエタノールを加えて混合し、ゲノムＤＮＡを析出せし
めた。このＤＮＡをピペットマンのチップの先ですくい
取り、５ｍｌの８０％エタノールでリンスし、５分間自
然乾燥した後、５ｍｌの１０ｍＭ Tris-HCl, ｐＨ7.4
−０．５ｍＭＥＤＴＡ溶液（ＴＥ）に再溶解した。溶
解は３７℃で一夜を要した。溶解後、１０ｍｇ／ｍｌの
リボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）１００μｌを加
え、３７℃で１時間、溶液中のＲＮＡを分解した。次に
塩飽和フェノール：クロロホルム（＝１：１）混合液５
ｍｌを加えて穏やかに抽出し、水層を分離してクロロホ
ルムで再度抽出した。水層を分離し、０．５ｍｌの３Ｍ
酢酸ナトリウムｐＨ７．４と１３ｍｌのエタノールを加
えて混合した。析出したＤＮＡは８０％エタノールでリ
ンスして５分間自然乾燥後、２ｍｌのＴＥに溶解してゲ
ノムＤＮＡ溶液とした。ＤＮＡ濃度は、５０μｌのＤＮ
Ａ溶液をＴＥで１ｍｌに希釈してＯ．Ｄ．２６０を測定
し、その値（Ｙ）から次の式を用いて算出した。（ＤＮＡ濃度μｇ／μｌ）＝Ｙｘ５０ｘ２０÷１０００（ただし、ＤＮＡは１Ｏ．Ｄ．２６０単位＝５０μｇ／
ｍｌ）

【００８６】次に分離した高分子量のゲノムＤＮＡを制
限酵素ＢｇｌIIで切り、ゲノムに導入したｐＦ１９００
ＭＤＮＡの存在状態を、サザンブロット・ハイブリダ
イゼーション法によって解析した。具体的な方法を以下
に示す。

【００８７】各細胞のゲノムＤＮＡ溶液４０μｇ当量を
ＢｇｌII（New England Biolabs 社製）８０単位で完全
に切断し、０．５％のアガロースゲルに、ＴＢＥ緩衝液
中で電解強度（Ｅｄ）＝７．５Ｖ／ｃｍを負荷して４時
間（ブロムフェノールブルーの泳動開始位置からの移動
距離（Ｍ_BPB ）＝１５ｃｍ）電気泳動分離した。分離し
たＤＮＡは、ナイロンメンブレン（Hybond N+,アマシャ
ム社製）に、吸引転写装置VacuGene (Pharmacia-LKB 社
製）を用いて、吸引圧（ＶＰ）＝４０ｍｍＨ₂Ｏで転写
し、サザンブロットとした。

【００８８】サザンブロットハイブリダイゼーション反
応液（５０％ホルムアミド−５ｘＳＳＣ−５ｘデンハル
ツ溶液−０．５％ＳＤＳ−０．２ｍｇ／ｍｌ熱変性ニシ
ン精子ＤＮＡ（ｈｓＤＮＡ）、ただし、ＳＳＣは１５０
ｍＭｎａＣｌ−１５ｍＭクエン酸ナトリウム、デンハル
ツ溶液は０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ４００−０．０２％ポ
リビニルピロリドン−０．０２％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ））中で４２℃、４時間インキュベートした
後、ランダム・プライマー法で３２Ｐ標識したＨｕＩＦ
Ｎ−γｃＤＮＡプローブ（１ｘ１０９ｃｐｍ／μｇ）を
５ｘ１０５ｃｐｍ／ｍｌとなるように加え、さらに４２
℃、１８時間インキュベートした。サザンブロットに過
剰に付着したハイブリダイゼーション反応液は、２ｘＳ
ＳＣ中に室温で１０分間２回洗浄後、２ｘＳＳＣ−０．
１％ＳＤＳで４２℃、２０分２回、０．２ｘＳＳＣ−
０．１％ＳＤＳで４２℃、２０分間１回洗浄して除去し
た。洗浄後のサザンブロットをサランラップ（登録商
標）で包み、バイオ・イメージアナライザーＢＡＳ２０
００システム（富士写真フィルム（株）社製）でＨｕＩ
ＦＮ−γｃＤＮＡプローブが特異的にハイブリダイズし
たゲノムＤＮＡＢｇｌＩＩ断片の数及び鎖長を解析し
た。サザンブロット上のｐＦ１９００ＭＤＮＡの存在状
態を図２４に示した。ブロット上部に各レーンのゲノム
ＤＮＡを抽出した細胞名を、左側に同じゲル中で電気泳
動したＤＮＡ鎖長マーカーの移動位置を示した。ブロッ
ト右側の矢印はＢｇｌＩＩで１カ所切断し、直鎖状に
したｐＦ１９００ＭＤＮＡの移動位置（ｐＦ１９００Ｍ
ＤＮＡの単位鎖長）を示した。

【００８９】親細胞３Ｙ１を除くＩ６、Ｉ７、Ｉ２５及
びＩ２６細胞株でＨｕＩＦＮ−γｃＤＮＡプローブと特
異的にハイブリダイズするバンドがそれぞれ３、６、８
及び７本認められた。また、これらのＩ細胞株では、最
もコピー数の多いバンドがｐＦ１９００ＭＤＮＡの単位
鎖長を示し、Ｉ７株で６コピー、その他のＩ細胞株では
３コピーであった。この結果は、親細胞３Ｙ１に導入さ
れたｐＦ１９００ＭＤＮＡが、ほぼ完全長を維持したま
まで細胞のゲノムＤＮＡに挿入されている可能性を示唆
した。

【００９０】（５）−６Ｉ細胞株によって産生される
ＨｕＩＦＮ−γ蛋白質天然型のＨｕＩＦＮ−γは、分子量約２２ｋｄ〜２５ｋ
ｄを示し（Y.K.Yip,etal.,Proceedings of the Nationa
l Academy of Science USA, 79, 1820-1824(1982）) 、
そのうちｍＲＮＡによってコードされるペプチド部分が
約１７．１ｋｄである（P.W.Gray, et al., Nature(Lon
don), 295, 503-508(1982)）。残りの５ｋｄ〜８ｋｄに
相当するのはアスパラギン残基を介してＮ−グリコシル
結合した糖鎖である。Ｉ細胞によって産生されるＨｕＩ
ＦＮ−γを、天然型のＨｕＩＦＮ−γ（文献に基づくデ
ータ）と比較するために、培養上清から免疫沈降法によ
って分離し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動法によって解析した。以下に具体的な方法を示す。

【００９１】免疫沈降法は、Harlowらの方法( E.Harlo
w, D.Lane (ed.), Antibodies;a laboratory manual, 4
21-470, Cold Spling, Harbor Laboratory Press(198
8)）を一部改変して実施した。細胞株は、対照として親
細胞株３Ｙ１、ＨｕＩＦＮ−γ産生細胞株としてＩ６と
Ｉ７を供した。

【００９２】３Ｙ１、Ｉ６及びＩ７細胞を直径５０ｍｍ
のシャーレに１．２×１０⁶ 細胞／ディッシュ（細胞密
度 6×10⁴ 細胞／cm²;コンフルーエント）まで培養し、
０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地で一夜培養した。培地を捨
て、ＰＢＳでシャーレに付着した細胞を２回洗浄し、メ
チオニン不含の０％ＦＣＳ−ＥＭＥＭ（イーグル最少培
地）を５ｍｌと、７．５μＭ［³⁵Ｓ］−メチオニン（4
1.8 TBq/mmol, New England Nuclear, Code no. NEG-07
2）を５９μｌ（18.6MBq ）投与して１７時間３７℃、
５％ＣＯ₂ で培養した。培養上清各１ｍｌにそれぞれ正
常ラビット血清４μｌを加えて４℃で６時間インキュベ
ートした。次にＳＡＣ(Staphylococcus aureus Cowan
I）のペレット４μｌを加えて十分懸濁し、氷上で４０
分間インキュベート後、１２，０００×ｇで４℃、５分
間遠心して沈殿を除去した。上清に抗ＨｕＩＦＮ−ラビ
ット・ポリクローナル抗体（Hayashibara Biochemical
Laboratories, Inc., Code No. PIF-3）５μｌ（ 7μg
; 850 中和単位）を加えて４℃で３時間インキュベー
トした。プロテインＡ−ビーズ（Affi-Gel protein A,
BioRad, Code no. 153-6153 ）２０μｌを加えて４℃で
４０分間緩やかにロッキング（rocking ）し、１０，０
００×ｇで４℃、１５秒間遠心して上清を除去した。ペ
レットを１ｍｌの冷ＰＢＳ^- で４回洗浄後、０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．８−１％ＳＤＳ−１００ｍ
Ｍ β- メルカプトエタノール４０μｌに懸濁して８５
℃、１０分間インキュベートし、プロテインＡビーズか
ら抗原・抗体複合体を解離させた。１０，０００×ｇで
室温、１５秒間遠心して上清を回収し、ＨｕＩＦＮ−γ
の免疫沈降サンプルとした。

【００９３】免疫沈降サンプルの一部を、Ｎ−グリカナ
ーゼ（ペプチド-N⁴-（Ｎ−アセチル- β- グルコサミニ
ル）アスパラギンミダーゼ、 Genzyme Co., Code no. 1
472-00,N- グリコシル結合を特異的に切断する酵素）に
より除糖鎖（ F.Maley, et al., Analytical Biochemis
try, 180, 195-204(1989) ）した。

【００９４】免疫沈降サンプル１０μｌを５分間沸騰水
中でボイルし、氷上で冷やしてから７．５％ Nonidet
Ｐ−４０５μｌ、０．２５Ｕ／μｌＮ−グリカナーゼ
１．２μｌ、及び水１３．８μｌを加え、３７℃で一夜
インキュベートした。翌日２×Laemmli's sample buffe
r （２％ＳＤＳ- 10％グリセロール-100mMジチオスレイ
トール (DTT)-60mM Tris・HCl,pH 6.8-0.001 ％ブロムフ
ェノールブルー(BPB)）を３０μｌ加えて１０分間ボイ
ルし、１６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動（濃縮ゲル；4.83％モノ−アクリルアミド- 0.17％ビ
ス−アクリルアミド−125mM Tris・HCl,pH 6.8- 0.1％ S
DS /分離ゲル；15.4％モノ−アクリルアミド− 0.53 ％
ビス−アクリルアミド−375mM Tris-HCl,pH 8.8- 0.1％
SDS /泳動緩衝液；25mM Tris・250mM グリシン−0.1 ％
SDS、pH8.3/泳動条件；100 V、６時間）に供した。対照
には、Ｎ−グリカナーゼで未処理の免疫沈降サンプル１
０μｌに２×Laemmli's sample buffer を１０μｌ加
え、１０分間ボイルして供した。

【００９５】電気泳動終了後、ゲルを蛍光増幅処理液
（EN³HANCE, New England Nuclear,Code no. NEF-981）
に１時間漬け、水洗いした後７０℃で乾燥し、−７０℃
で７２時間、Ｘ線用フィルムに露出した。

【００９６】図２５に結果を示した。各レーンにはａ；
３Ｙ１培養上清、ｂ；Ｉ７培養上清、ｃ；３Ｙ１培養上
清（Ｎ−グリカナーゼ処理）、ｄ；Ｉ７培養上清（Ｎ−
グリカナーゼ処理）、ｅ；Ｉ６培養上清（Ｎ−グリカナ
ーゼ処理）、及びｆ；Ｉ６培養上清（Ｎ−グリカナーゼ
処理）の免疫沈降サンプルをそれぞれ供した。図の左側
には同−ゲル上に分離したマーカー蛋白質の分子量を、
右側には除糖鎖処理しない天然型ＨｕＩＦＮ−γの推定
移動位置（分子量約２２ｋｄ；黒矢印）除糖鎖処理した
天然型ＨｕＩＦＮ−γの推定移動位置（分子量約１７．
１ｋｄ；白矢印）を示した。矢印の位置に存在するバン
ドの蛋白質は、親細胞株３Ｙ１の培養上清免疫沈降サン
プルには認められないことから、明らかにｐＦ１９００
γとしてＩ細胞に導入したＨｕＩＦＮ−γ遺伝子の産物
である。

【００９７】この結果から、Ｉ６及びＩ７細胞株から産
生されるＨｕＩＦＮ−γは、分子量約１７．１ｋｄのポ
リペプチドがＮ−グリコシル結合によって糖鎖修飾を受
けた分子で、約２２ｋｄ〜２５ｋｄを示すことが判明し
た。従って、少なくともＩ６及びＩ７細胞株によって産
生されるＨｕＩＦＮ−γは、天然型に極めて類似してい
ることが明示された。

【００９８】

【発明の効果】本発明によりＦＮ遺伝子に対してエンハ
ンサー活性を持つＤＮＡが同定、分離され、それ及びプ
ロモーターを含む組換えベクターが提供された。本発明
の組換えベクターで形質転換された動物細胞は、無血清
培地又は低血清培地にて構造遺伝子を発現するので、こ
のような形質転換動物細胞を用いて無血清培地又は低血
清培地で所望物質を効率良く生産させることが可能にな
った。従って、本発明により、血清を含まない安価な培
地を用いて物質を生産することが可能になり、また、所
望の生産物から血清を除去する精製工程が不要となり、
所望物質の生産を効率良く安価に行なうことができるよ
うになった。さらに、本発明の製造法では、動物細胞形
質転換体を用いるので、天然の遺伝子産物と同一または
少なくとも類似する糖鎖等の修飾が施された遺伝子産物
を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ラットＦＮ５’側隣接領域の−１０６８ｎｔよ
り−５３１ｎｔまでをプローブとして用い、λ−＃９０
８ｐｈａｇｅとλ−＃９１６ｐｈａｇｅクローンの各種
制限酵素断片に対して行なったサザンブロッティングの
結果を示す図。

【図２】完全なラットＦＮプロモーター及びエンハンサ
ーを含む５’側隣接領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIKS
+ のマルチクローニングサイトに挿入して作製したプラ
スミドｐｒＦＮｐｐ２．１及びｐｒＦＮＳｎ２．３の遺
伝子地図。

【図３】完全なラットＦＮプロモーター及びエンハンサ
ー領域を含むＤＮＡの塩基配列を示す図。

【図４】本発明のラットＦＮプロモーター及びエンハン
サー領域の機能を解析するために用いたプラスミドベク
ターｐＳＶ２ＣＡＴ−ＢＸ及びｐＳＶ₂ −ＸＢの遺伝子
地図。

【図５】完全なまたはそれぞれ異なる種々の領域を欠失
又は置換した２６種類のＦＮプロモーター及びエンハン
サーを示す図。

【図６】３ＹＩ細胞におけるＣＡＴアッセイのタイムテ
ーブルとＦＮエンハンサー及びプロモーターの一過性発
現活性を示す図。

【図７】ＸｈｏＣ細胞におけるＦＮエンハンサー及びプ
ロモーターの一過性発現がエンハンサー領域の塩基置換
によって増強されたことを示す図。

【図８】形質導入ベクターｐＦ１９００Ｌの遺伝子地
図。

【図９】形質導入ベクターｐＦ１９００Ｌｎｅｏの遺伝
子地図。

【図１０】形質導入ベクターｐＦΔｂ５６４Ｌの遺伝子
地図。

【図１１】形質導入ベクターｐＦΔｂ５６４Ｌｎｅｏの
遺伝子地図。

【図１２】Ａ形質導入ベクターｐＦ１９００Ｍの遺伝
子地図Ｂ形質導入ベクターｐＦ１９００Ｍから構築したヒト
・インターフェロン・ガンマ（ＨｕＩＦＮ−γ）発現プ
ラスミドｐＦ１９００γの遺伝子地図

【図１３】Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細胞株の増殖
とＨｕＩＦＮ−γの産生

【図１４】Ｉ７細胞株により産生されたＨｕＩＦＮ−γ
の濃度変化Ａ培地を交換しない場合の濃度変化Ｂ２日毎に培地を交換した場合の濃度変化

【図１５】Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細胞株に発現
するＨｕＩＦＮ−γｍＲＮＡのノザンブロット・ハイブ
リダイゼーション解析ＡＨｕＩＦＮ−γｍＲＮＡのノザンブロットＢ β−アクチンｍＲＮＡのノザンブロット（対照実
験）

【図１６】Ｉ６、Ｉ７、Ｉ２５及びＩ２６細胞株に導入
・保持されたｐＦ１９００γのサザンブロット・ハイブ
リダイゼーション解析

【図１７】Ｉ６及びＩ７細胞株より産生されたＨｕＩＦ
Ｎ−γ蛋白質（免疫沈降法で分離）のＳＤＳ−ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動像

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＡＮＤＣＥＬＬＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ. ９，ＮＯ．４，Ｐ．1498−1506（1989)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】フィブロネクチン遺伝子に対してエンハ
ンサー活性を持ち、配列表の配列番号１ないし２７又は
３４で示される塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項２】無血清あるいは低血清条件下でフィブロ
ネクチン遺伝子の発現量を増大させる作用を有すること
を特徴とする請求項１記載のエンハンサー活性を持つＤ
ＮＡ。
【請求項３】ラット由来のものである請求項１又は２
記載のエンハンサー活性を持つＤＮＡ。
【請求項４】配列表の配列番号１で示される塩基配列
を有するＤＮＡ。
【請求項５】配列表の配列番号２で示される塩基配列
を有するＤＮＡ。
【請求項６】配列表の配列番号３で示される塩基配列
を有するＤＮＡ。
【請求項７】配列表の配列番号４で示される塩基配列
を有するＤＮＡ。
【請求項８】配列表の配列番号５で示される塩基配列
を有するＤＮＡ。
【請求項９】配列表の配列番号６で示される塩基配列
を有するＤＮＡ。
【請求項１０】配列表の配列番号７で示される塩基配
列を有するＤＮＡ。
【請求項１１】配列表の配列番号８で示される塩基配
列を有するＤＮＡ。
【請求項１２】配列表の配列番号９で示される塩基配
列を有するＤＮＡ。
【請求項１３】配列表の配列番号１０で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項１４】配列表の配列番号１１で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項１５】配列表の配列番号１２で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項１６】配列表の配列番号１３で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項１７】配列表の配列番号１４で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項１８】配列表の配列番号１５で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項１９】配列表の配列番号１６で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２０】配列表の配列番号１７で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２１】配列表の配列番号１８で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２２】配列表の配列番号１９で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２３】配列表の配列番号２０で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２４】配列表の配列番号２１で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２５】配列表の配列番号２２で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２６】配列表の配列番号２３で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２７】配列表の配列番号２４で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２８】配列表の配列番号２５で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項２９】配列表の配列番号２６で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項３０】配列表の配列番号２７で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項３１】配列表の配列番号３４で示される塩基
配列を有するＤＮＡ。
【請求項３２】プロモーター及び構造遺伝子に請求項
１ないし３のいずれか１項に記載のエンハンサー活性を
有するＤＮＡが接続された組換えベクター。
【請求項３３】プロモーター及び構造遺伝子に請求項
４ないし３１のいずれか１項記載のＤＮＡを含むＤＮＡ
が接続された組換えベクター。
【請求項３４】請求項３２又は３３記載の組換えベク
ターを保持する動物細胞形質転換体を培養することを特
徴とする遺伝子産物の製造法。