JP2004057199A - 新規タンパク質およびそのｄｎａ - Google Patents

新規タンパク質およびそのｄｎａ Download PDF

Info

Publication number
JP2004057199A
JP2004057199A JP2002367432A JP2002367432A JP2004057199A JP 2004057199 A JP2004057199 A JP 2004057199A JP 2002367432 A JP2002367432 A JP 2002367432A JP 2002367432 A JP2002367432 A JP 2002367432A JP 2004057199 A JP2004057199 A JP 2004057199A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
salt
seq
present
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2002367432A
Other languages
English (en)
Inventor
Atsushi Nakanishi
中西　淳
Yoji Sagiya
鷺谷　洋司
Yumiko Uno
宇野　裕美子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Priority to JP2002367432A priority Critical patent/JP2004057199A/ja
Publication of JP2004057199A publication Critical patent/JP2004057199A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

【課題】新規グルコーストランスポータタンパク質、新規小胞グルタミン酸トランスポータタンパク質および新規電位依存性Ｋ＋チャネルタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質の活性または該タンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物などの提供。
【解決手段】本発明のタンパク質は、例えば糖尿病、高脂血症または動脈硬化などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物は、例えば上記疾患などの予防・治療剤として使用することができる。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規グルコーストランスポータタンパク質、新規小胞グルタミン酸トランスポータタンパク質ならびに新規電位依存性Ｋ＋チャネルタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法で得られる化合物などを提供する。
【０００２】
【従来の技術】
グルコース、フルクトースまたはガラクトースが細胞内外を移行するには、細胞膜上に糖輸送担体と呼ばれる膜蛋白が必要である。グルコース、フルクトースまたはガラクトースの輸送担体は、グルコーストランスポータ（ＧＬＵＴ）とＮａ＋／グルコーストランスポータ（ＳＧＬＴ）に大別される。ＧＬＵＴは、濃度勾配に従って輸送を行う促進拡散型の輸送体であり、８種類のアイソフォームが存在し、分子量約５万の細胞膜を１２回貫通する共通構造を有している。ＳＧＬＴは、Ｎａ＋イオン輸送と共役することでグルコースを濃度勾配に逆らって輸送する能動輸送担体であり、分子量７．５万の細胞膜を１４回貫通する共通構造を有している。
ＧＬＵＴは組織や器官によって発現している種類が異なっている。例えば、脂肪細胞ではＧＬＵＴ４とＧＬＵＴ１が発現している。膵β細胞、肝細胞では、ＧＬＵＴ２が主に発現していると考えられている。ＧＬＵＴ２はグルコースに対する低い親和性と高い最大輸送能を特徴とする。膵β細胞では、血糖値に応じてグルコースを取り込み、グルコキナーゼと共にグルコース濃度依存性のインスリン分泌作用を示すためのグルコースセンサーとして機能していると考えられている。肝細胞では、細胞内外のグルコース濃度勾配に従って、食後高血糖時には血中グルコースを細胞内に取り込み、空腹時にはグリコーゲン分解、あるいは糖新生によって細胞内で作られたグルコースを血中に放出する糖輸送担体として機能している。ＧＬＵＴ４やＧＬＵＴ１は通常、細胞膜下の小胞に存在し、インスリンの刺激によって小胞が細胞膜に融合し糖の取り込みを促進する。インスリン刺激がなくなると、これら輸送体は小胞に取り込まれて細胞内に戻る。この一連のサイクルによって血中糖濃度の調節に寄与している。小腸絨毛上皮、精子などに発現するＧＬＵＴ５はグルコースに親和性は無く、フルクトースに高い親和性を有しており、食事による腸管からのフルクトースの取り込みに関わっている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、第２６７巻、１４５２３頁、１９９２年）。
グルタミン酸は哺乳動物中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であり、脳神経系の情報伝達、可塑性、形成および種々の病態における神経細胞死に関与していることが示唆されている。グルタミン酸は主に脳内で生合成され、Ｎａ＋／Ｋ＋依存性グルタミン酸トランスポータによって細胞外から細胞内に取り込まれる。細胞内のグルタミン酸は、シナプス小胞上にある特異的輸送体によって小胞内に取り込まれ、刺激によって小胞から遊離される。近年、Ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｎａ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＢＮＰＩ）が、グルタミン酸をシナプス小胞に運搬する特異的輸送体であることが明らかとなり　（Ｎａｔｕｒｅ、４０７巻、１８９−１９４頁、２０００年；Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９巻、９５７−９６０頁、２０００年）、小胞グルタミン酸トランスポータ１（ＶＧＬＵＴ１）とも呼ばれるようになった。また、ＢＮＰＩと相同性の高いＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｎａ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＤＮＰＩ）も、同様の機能を有することが明らかとなり、ＤＮＰＩはＶＧＬＵＴ２とも呼ばれるようになった（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７６巻、４３４００−４３４０６頁、２００１年）。
Ｋ＋イオンを選択的に透過させる膜蛋白であるＫ＋チャネルは、原核生物からヒトまで普遍的に存在し、非常に多くのファミリーからなる。生体内では、広範な組織に分布しており、細胞の静止膜電位形成、再分極、活動電位発生頻度の調節など重要な生理機能に密接に関わっている。
Ｋ＋チャネルの構造は多様であり、６回膜貫通型、２回膜貫通型、１回膜貫通型などに加えて、これらの基本構造が２個連結した連結型のチャネル分子も存在する。
電位差依存性Ｋ＋チャネル（Ｋｖ）は、６回膜貫通型に属し、α、β、γの３種類のサブユニットが存在する。この中で、αサブユニットは６回膜貫通型の構造を有し、第５膜貫通領域と第６膜貫通領域の間にポア領域が存在する。４つのαサブユニットが会合し、Ｋ＋イオン選択的チャネルを形成している。βサブユニットは、細胞質内に存在しており、αサブユニットの制御分子であると考えられている。γサブユニットは、αサブユニットと相同性を有しており、６回膜貫通型の構造を有する。γサブユニットのみではＫｖとしての機能を持たないが、αサブユニットと共にｈｅｔｅｒｏｍｕｌｔｉｍｅｒを形成することにより、αサブユニットに対し調節的な役割を担っていると考えられている。（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｓｃｉ　１８巻、４７４−４８３頁、１９９９年）。
【非特許文献１】
Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．、第２６５巻、１３２７６頁、１９９０年
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
現在使用されているインスリン分泌促進薬（ＳＵ剤）は、膵ベータ細胞のＫＡＴＰチャネルを閉鎖することにより、血糖値に関わらず強制的にインスリンを分泌させる。従って、血糖コントロールが難しく低血糖を起こしたり、過剰なインスリン分泌により肥満を誘発したりする副作用があると考えられている。また、平均して１０年で薬が効かなくなるＳＵ剤の二次無効と呼ばれる現象が起きるが、膵ベータ細胞に疲弊を起こすのが原因とも考えられている。ＧＬＵＴ機能を賦活化することにより、膵β細胞への糖取り込みを促進し、血糖値依存性のインスリン分泌を亢進することが期待できる。また、ＧＬＵＴ機能の賦活化薬には，現在使用されているインスリン分泌促進薬（ＳＵ剤）の上記副作用は起きないものと期待される。
また、糖の体内への吸収を抑制することによる血糖低下薬の開発も行われている。現在、食後過血糖を抑制する薬剤としてα−グルコシダーゼ阻害薬が市販されている。これは多糖類からグルコースへの変換を遅らせることで薬効を示すが、最終的に体内に取り込まれるグルコースの量は抑制できないため、長期的血糖低下作用は弱い。腎臓における糖の再吸収や腸管における糖の吸収を特異的に阻害する薬剤は優れた血糖低下薬になることが期待される。
小胞グルタミン酸トランスポータ（ＶＧＬＵＴ）はグルタミン酸のシナプス小胞への運搬において重要な役割を果たしていると考えられているが、その詳細なメカニズムや疾患との関連についてはよく分かっていない。グルタミン酸は主要な興奮性神経伝達物質であり、ＶＧＬＵＴが種々の中枢神経系疾患、特に学習・記憶に関連する疾患に大きく関与する可能性が示唆される。また、グルタミン酸代謝に関わるその他の種々の疾患にも関与する可能性がある。ＶＧＬＵＴの特定の機能を解明することにより、グルタミン酸が関与する中枢神経系疾患などの治療薬開発につながる。
Ｋｖには非常に多数の分子種が存在し、それらの発現部位も多様である。また、ひとつの細胞が複数のＫｖを発現していることが多い。個々のＫｖが開口することによるＫ＋イオン電流の特徴はかなり明確になってきたが、複数のＫｖが働いたときのシグナルの性質や、各Ｋｖ間の相互の調節作用に関する知見は少ない。Ｋｖは細胞にとって重要な機能を多数担っていると考えられるが、その特定の機能と各分子種との関係を明らかにすることが、Ｋｖが関与する種々の疾患の治療薬開発につながる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規グルコーストランスポータ蛋白質を見出した。該タンパク質は、アミノ酸レベルでＧＬＵＴ５（非特許文献１　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．、第２６５巻、１３２７６頁、１９９０年）と５９％、塩基レベルで６０％の相同性を示し、１２回膜貫通型の構造を有しており、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の促進拡散型の輸送体として機能し得るものである。該タンパク質を抑制する方法としては、例えば、リガンドと該タンパク質との結合を阻害したり、該タンパク質による神経伝達物質作動性チャネル活性を阻害したり、該タンパク質の転写を抑制して発現レベルを低下させることが考えられる。該タンパク質を賦活化する方法としては、例えば該タンパク質のプロモーターの活性化、ｍＲＮＡの安定化による発現レベルの亢進などが考えられる。また、該タンパク質を細胞内から膜表面に移行させ、細胞膜上で機能する該タンパク質数を増やすことも考えられる。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規小胞グルタミン酸トランスポータタンパク質を見出した。該タンパク質を抑制する方法としては、例えばグルタミン酸の輸送阻害、該タンパク質の転写抑制による発現レベルの低下などが考えられ、該タンパク質を賦活化する方法としては、例えばグルタミン酸の輸送促進、該タンパク質のプロモーターの活性化、ｍＲＮＡの安定化による発現レベルの亢進などが考えられる。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、新規電位差依存性Ｋ＋チャネルタンパク質を見出した。該タンパク質を調節する方法としては、例えばＫ＋イオンの透過阻害または促進、該タンパク質遺伝子の転写抑制による発現レベル低下、該タンパク質遺伝子のプロモーターの活性化、ｍＲＮＡの安定化による発現レベルの亢進などが考えられる。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）　配列番号：１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）　配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（３）　配列番号：２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（４）　上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（５）　上記（１）記載のタンパク質または上記（４）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（６）　ＤＮＡである上記（５）記載のポリヌクレオチド、
（７）　配列番号：２、配列番号：１４または配列番号：２４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（８）　上記（５）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（９）　上記（８）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１０）　上記（９）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質または上記（４）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（１１）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１２）　上記（５）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１３）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１４）　上記（１３）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１５）　上記（１３）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１６）　上記（５）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
（１７）　上記（１６）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１８）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１９）　上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２０）　上記（１８）記載のスクリーニング方法または上記（１９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質もしくは上記（４）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２１）　上記（２０）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２２）　上記（５）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２３）　上記（５）記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２４）　上記（２２）記載のスクリーニング方法または上記（２３）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
（２５）　上記（２４）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２６）　糖尿病、高脂血症または動脈硬化の予防・治療剤である上記（１１）、（１２）、（１４）、（１７）、（２１）または（２５）記載の医薬、
（２７）　哺乳動物に対して、上記（２０）または（２４）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、高脂血症または動脈硬化の予防・治療方法、
（２８）　糖尿病、高脂血症または動脈硬化の予防・治療剤を製造するための上記（２０）または（２４）記載の化合物またはその塩の使用、
（２９）　配列番号：２８または配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（３０）　配列番号：２８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（３１）　配列番号：４６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（３２）　上記（２９）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（３３）　上記（２９）記載のタンパク質または上記（３２）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（３４）　ＤＮＡである上記（３３）記載のポリヌクレオチド、
（３５）　配列番号：２９、配列番号：４５、配列番号：４７または配列番号：５８で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（３６）　上記（３３）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（３７）　上記（３６）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（３８）　上記（３７）記載の形質転換体を培養し、上記（２９）記載のタンパク質または上記（３２）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（２９）記載のタンパク質もしくは上記（３２）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（３９）　上記（２９）記載のタンパク質もしくは上記（３２）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（４０）　上記（３３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（４１）　上記（２９）記載のタンパク質もしくは上記（３２）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（４２）　上記（４１）記載の抗体を含有してなる医薬、
（４３）　上記（４１）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（４４）　上記（３３）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
（４５）　上記（４４）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（４６）　上記（２９）記載のタンパク質もしくは上記（３２）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（２９）記載のタンパク質もしくは上記（３２）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（４７）　上記（２９）記載のタンパク質もしくは上記（３２）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記（２９）記載のタンパク質もしくは上記（３２）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（４８）　上記（４６）記載のスクリーニング方法または上記（４７）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（２９）記載のタンパク質もしくは上記（３２）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩、
（４９）　上記（４８）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（５０）　上記（３３）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（２９）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（５１）　上記（３３）記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記（２９）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（５２）　上記（５０）記載のスクリーニング方法または上記（５１）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（２９）記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、
（５３）　上記（５２）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（５４）　中枢神経系疾患、内分泌疾患または糖尿病の予防・治療剤である上記（３９）、（４０）、（４２）、（４５）、（４９）または（５３）記載の医薬、
（５５）　哺乳動物に対して、上記（４８）または（５２）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢神経系疾患、内分泌疾患または糖尿病の予防・治療方法、
（５６）　中枢神経系疾患、内分泌疾患または糖尿病の予防・治療剤を製造するための上記（４８）または（５２）記載の化合物またはその塩の使用、
（５７）　配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（５８）　配列番号：６２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（５９）　上記（５７）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（６０）　上記（５７）記載のタンパク質または上記（５９）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（６１）　ＤＮＡである上記（６０）記載のポリヌクレオチド、
（６２）　配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（６３）　上記（６０）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（６４）　上記（６３）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（６５）　上記（６４）記載の形質転換体を培養し、上記（５７）記載のタンパク質または上記（５９）記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記（５７）記載のタンパク質もしくは上記（５９）記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（６６）　上記（５７）記載のタンパク質もしくは上記（５９）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（６７）　上記（６０）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（６８）　上記（５７）記載のタンパク質もしくは上記（５９）記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（６９）　上記（６８）記載の抗体を含有してなる医薬、
（７０）　上記（６８）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（７１）　上記（６０）記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
（７２）　上記（７１）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（７３）　上記（５７）記載のタンパク質もしくは上記（５９）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（５７）記載のタンパク質もしくは上記（５９）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（７４）　上記（５７）記載のタンパク質もしくは上記（５９）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記（５７）記載のタンパク質もしくは上記（５９）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（７５）　上記（７３）記載のスクリーニング方法または上記（７４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（５７）記載のタンパク質もしくは上記（５９）記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩、
（７６）　上記（７５）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（７７）　上記（６０）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（５７）記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（７８）　上記（６０）記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記（５７）記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（７９）　上記（７７）記載のスクリーニング方法または上記（７８）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（５７）記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩、
（８０）　上記（７９）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（８１）　中枢神経系疾患または消化器疾患の予防・治療剤である上記（６６）、（６７）、（６９）、（７２）、（７６）または（８０）記載の医薬、
（８２）　哺乳動物に対して、上記（７５）または（７９）記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢神経系疾患または消化器疾患の予防・治療方法、
（８３）　中枢神経系疾患または消化器疾患の予防・治療剤を製造するための上記（７５）または（７９）記載の化合物またはその塩の使用などを提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
配列番号：１、配列番号：２３、配列番号：２８、配列番号：４６または配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトやその他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【０００７】
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送の活性の測定は、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７５巻、４６０７−４６１２頁、２０００年に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、グルタミン酸の輸送などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、グルタミン酸の輸送が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
グルタミン酸の輸送の活性の測定は、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、Ｎａｔｕｒｅ、４０７巻、１８９−１９４頁、２０００年、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７６巻、４３４００−４３４０６頁、２００１年などに記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、特に好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、Ｋ＋イオンの透過などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、Ｋ＋イオンの透過が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
Ｋ＋イオンの透過の活性の測定は、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　６巻、３３７−３５０頁、１９９９年に記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
【０００８】
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば（１）▲１▼配列番号：１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、▲４▼配列番号：１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲５▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、
（２）▲１▼配列番号：２８または配列番号：４６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：２８または配列番号：４６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：２８または配列番号：４６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、▲４▼配列番号：２８または配列番号：４６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲５▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、
（３）▲１▼配列番号：６２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：６２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：６２で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、▲４▼配列番号：６２で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜２００個程度、好ましくは１〜１５０個程度、好ましくは１〜１００個程度、さらに好ましくは１〜３０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲５▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、とくに限定されない。
【０００９】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド表記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
【００１０】
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。例えば、本発明のタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１５個以上、好ましくは２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
本発明の部分ペプチドとしては、例えば配列番号：１で表されるアミノ酸配列において第４６〜７８番目、第２１９〜２８３番目または第４６４〜５１２番目のアミノ酸配列を含有するペプチド（配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において第５５〜８７番目、第２２８〜２９２番目または第４７３〜５２１番目のアミノ酸配列を含有するペプチド）などが、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列において第２００〜２３４番目、第３３６〜３４７番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列において第２１３〜２４７番目、第３４９〜３６０番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列において第１９２〜２２０番目、第２７４〜２８８、第３４４〜３６０番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。
【００１１】
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。本発明の抗体を調製する目的には、例えば配列番号：１で表されるアミノ酸配列において第４６〜７８番目、第２１９〜２８３番目、第４６４〜５１２番目のアミノ酸配列を含有するペプチド（配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において第５５〜８７番目、第２２８〜２９２番目、第４７３〜５２１番目のアミノ酸配列を含有するペプチド）などが、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列において第２００〜２３４番目、第３３６〜３４７番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列において第２１３〜２４７番目、第３４９〜３６０番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列において第１９２〜２２０番目、第２７４〜２８８、第３４４〜３６０番目のアミノ酸配列を含有するペプチドなどがあげられる。
【００１２】
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、または有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはそれらの塩は、前述したヒトやその他の温血動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１３】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそれらのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対応する酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１４】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００１５】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１６】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１７】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護、保護基の脱離および反応に関与する官能基の活性化などは公知の手段から、また用いられる保護基は公知の基からそれぞれ適宜選択、適用される。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００１８】
本発明で用いられる部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼Ｍ．　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ　および　Ｍ．Ａ．　Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６６年）
▲２▼ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ），　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６５年）
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、　丸善（株）　（１９７５年）
▲４▼矢島治明　および榊原俊平、生化学実験講座　１、　タンパク質の化学ＩＶ、　２０５、（１９７７年）
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００１９】
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２または配列番号：１４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２または配列番号：１４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（２）配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（３）配列番号：２９または配列番号：４５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２９または配列番号：４５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（４）配列番号：４７または配列番号：５８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４７または配列番号：５８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（５）配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
【００２０】
配列番号：２または配列番号：１４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２または配列番号：１４で表される塩基配列と６５％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２４で表される塩基配列と６５％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２９または配列番号：４５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２９または配列番号：４５で表される塩基配列と６５％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：４７または配列番号：５８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４７または配列番号：５８で表される塩基配列と例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約８５％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２または配列番号：１４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２９または配列番号：４５で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４７または配列番号：５８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００２１】
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、配列番号：１４、配列番号：２４、配列番号：２９、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：５８、配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２、配列番号：１４、配列番号：２４、配列番号：２９、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：５８、配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：１４、配列番号：２４、配列番号：２９、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：５８、配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００２２】
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を含有する合成ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによる選別があげられる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ．　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ（宝酒造）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造）等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ　ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ　ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。
本発明のタンパク質をコードする、クローン化されたＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する、例えばｃＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００２３】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２４】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００２５】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），６０巻，１６０　（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９　（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７　（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９　（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０　（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５　（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７　（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
【００２６】
昆虫細胞としては、例えば、ウィルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウィルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，　Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ　Ｖｉｖｏ），１３，　２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２　（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）、６９巻、２１１０　（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ）、１７巻、１０７　（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。
【００２７】
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１６８巻、１１１　（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９４巻、１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ）、７５巻、１９２９　（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６、４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行うことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、５２巻、４５６　（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００２８】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，　Ｋ．　Ｌ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），７７巻，４５０５　（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，　Ｇ．　Ａ．　ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，　Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），　１９５，　７８８　（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１　（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６　（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９　（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００２９】
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３０】
このようにして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより測定することができる。
【００３１】
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５　（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
【００３２】
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３３】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うことができる。
【００３４】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００３５】
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のＤＮＡの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。
具体的には、配列番号：２、配列番号：１４、配列番号：２４、配列番号：２９、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：５８、配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係については、目的核酸が対象領域とハイブリダイズすることができる場合は、その目的核酸は、当該対象領域のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００３６】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば　Ｊ．　Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ　Ｔｅｃｈ　Ｊａｐａｎ，　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．２４７，　１９９２；　Ｖｏｌ．　８，　ｐｐ．３９５，　１９９２；　Ｓ．　Ｔ．　Ｃｒｏｏｋｅ　ｅｔ　ａｌ．　ｅｄ．，　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　１９９３　などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００３７】
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
また、配列番号：１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を「本発明のタンパク質Ａ」、配列番号：２８または配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を「本発明のタンパク質Ｂ」、配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を「本発明のタンパク質Ｃ」と略称することもある。
【００３８】
〔１〕本発明のタンパク質が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明のタンパク質Ａは、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送活性などを有し、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送に寄与している。
したがって、本発明のタンパク質ＡをコードするＤＮＡに異常があったり、欠損している場合あるいは本発明のタンパク質の発現量が減少している場合には、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの種々の疾患が発症する。
したがって、本発明のタンパク質ＡおよびそれをコードするＤＮＡは、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの疾患の予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として使用することができる。好ましくは、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの予防・治療剤である。
例えば、生体内において本発明Ａのタンパク質が減少あるいは欠損しているために、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送が十分あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡをその患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質Ａを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質Ａを発現させた後に、その細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のタンパク質Ａをその患者に投与することなどによって、その患者における本発明のタンパク質の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のタンパク質Ｂは、グルタミン酸の輸送活性などを有し、グルタミン酸の輸送に寄与するとともに、グルタミン酸代謝などに重要な役割を果たしている。
したがって、本発明のタンパク質ＢおよびそれをコードするＤＮＡは、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として使用することができる。好ましくは、中枢神経系疾患、内分泌疾患、糖尿病などの予防・治療剤である。
例えば、生体内において本発明Ｂのタンパク質が減少あるいは欠損しているために、グルタミン酸の輸送が十分あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡをその患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質Ｂを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質Ｂを発現させた後に、その細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のタンパク質Ｂをその患者に投与することなどによって、その患者における本発明のタンパク質Ｂの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のタンパク質Ｃは、Ｋ＋イオンの透過活性などを有し、Ｋ＋イオンの透過に寄与するとともに、細胞の膜電位発生に重要な役割を果たしている。
したがって、本発明のタンパク質ＣおよびそれをコードするＤＮＡは、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として使用することができる。好ましくは、中枢神経系疾患、消化器疾患などの予防・治療剤である。
例えば、生体内において本発明Ｃのタンパク質が減少あるいは欠損しているために、Ｋ＋イオンの透過活性が十分あるいは正常に発揮されない患者がいる場合に、（イ）本発明のＤＮＡをその患者に投与し、生体内で本発明のタンパク質Ｃを発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のＤＮＡを挿入し、本発明のタンパク質Ｃを発現させた後に、その細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明のタンパク質Ｃをその患者に投与することなどによって、その患者における本発明のタンパク質Ｃの役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）を上記の予防・治療剤として使用する場合は、本発明のＤＮＡを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の温血動物に投与することができる。本発明のＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のタンパク質を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００３９】
本発明のタンパク質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のタンパク質等を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のＤＮＡが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【００４０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
本発明のタンパク質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある。例えば、糖尿病の治療目的で本発明のタンパク質Ａを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質Ａを約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質Ａの１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病の治療目的で本発明のタンパク質Ａを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
例えば、アルツハイマー病の治療目的で本発明のタンパク質Ｂを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質を約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で本発明のタンパク質Ｂを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
例えば、消化器疾患の治療目的で本発明のタンパク質Ｃを経口投与する場合、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき該タンパク質を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該タンパク質の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、消化器疾患の治療目的で本発明のタンパク質Ｃを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該タンパク質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４１】
〔２〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（１）本発明のタンパク質Ａを用いることを特徴とする本発明のタンパク質Ａの活性（例えば、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送など）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（２）（ｉ）本発明のタンパク質Ａを産生する能力を有する細胞の糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送と（ｉｉ）本発明のタンパク質Ａを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物の糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送の比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ）と（ｉｉ）の場合において、糖取り込み活性を３Ｈで標識したグルコースまたは２−ｄｅｏｘｙ−ｇｌｕｃｏｓｅなどのグルコース類縁体の細胞内への蓄積を放射活性で測定し、グルコースの促進拡散型の輸送活性の指標として比較することを特徴とするものである。
本発明のタンパク質Ａの糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送活性などは、公知の方法、例えば、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７５巻、４６０７−４６１２頁、２０００年に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、本発明のタンパク質Ａの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記（ｉｉ）の場合における糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、本発明のタンパク質Ａの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。本発明は、（１’）本発明のタンパク質Ｂを用いることを特徴とする本発明のタンパク質Ｂの活性（例えば、グルタミン酸の輸送など）を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（２’）（ｉ’）本発明のタンパク質Ｂを産生する能力を有する細胞のグルタミン酸の輸送と（ｉｉ’）本発明のタンパク質Ｂを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物のグルタミン酸の輸送の比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ’）と（ｉｉ’）の場合において、グルタミン酸の輸送を、放射標識した基質もしくは蛍光色素で測定し、グルタミン酸の輸送を指標として比較することを特徴とするものである。
本発明のタンパク質Ｂのグルタミン酸の輸送活性などは、公知の方法、例えば、Ｎａｔｕｒｅ、４０７巻、１８９−１９４頁、２０００年、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７６巻、４３４００−４３４０６頁、２００１年などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。
例えば、上記（ｉｉ’）の場合におけるグルタミン酸の輸送を、上記（ｉ’）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を、本発明のタンパク質Ｂの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｉｉ’）の場合におけるグルタミン酸の輸送を、上記（ｉ’）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を、本発明のタンパク質Ｂの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明は、（１’’）本発明のタンパク質Ｃを用いることを特徴とする本発明のタンパク質Ｃの活性（例えば、Ｋ＋イオンの透過など）を調節する化合物またはその塩（以下、それぞれ調節剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（２’’）（ｉ’’）本発明のタンパク質Ｃを産生する能力を有する細胞のＫ＋イオンの透過と（ｉｉ’’）本発明のタンパク質Ｃを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物のＫ＋イオンの透過の比較を行うことを特徴とする調節剤のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉ’’）と（ｉｉ’’）の場合において、Ｋ＋イオンの透過に伴う膜電位の変化を蛍光色素で測定し、Ｋ＋イオンの透過の指標として比較することを特徴とするものである。
本発明のタンパク質ＣのＫ＋イオンの透過活性などは、公知の方法、例えば、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ　６巻、３３７−３５０頁、１９９９年に記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。
例えば、上記（ｉｉ’’）の場合におけるＫ＋イオンの透過を、上記（ｉ’’）の場合に比べて、約２０％、好ましくは３０％、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質Ｃの活性を調節（促進または阻害）する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｉｉ’’）の場合におけるＫ＋イオンの透過を、上記（ｉ’’）の場合に比べて、約２０％、好ましくは３０％、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質Ｃの活性を調節（促進または阻害）する化合物またはその塩として選択することができる。
【００４２】
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を小胞体膜、ゴルジ膜、細胞膜などの膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
【００４３】
また、本発明のタンパク質遺伝子のプロモーター下流に分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入し、上記の各種細胞に発現させ、該細胞に上記試験化合物を接触させた場合における酵素活性を促進または阻害する化合物またはその塩を探索することにより、本発明のタンパク質の発現を促進または阻害（本発明のタンパク質の活性を促進または阻害）する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。
【００４４】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（３）本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（４）（ｉｉｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｉｖ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合における、本発明のタンパク質遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の発現を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を小胞体膜、ゴルジ膜、細胞膜などの膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明のタンパク質遺伝子発現量は、自体公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやＲｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ解析システム（ＡＢＩ社製、ＴａｑＭａｎ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における本発明のタンパク質遺伝子の発現量を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
本発明は、（５）本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の発現を促進または阻害する化合物またはその塩（以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、
（６）（ｖ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ｖｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、例えば、本発明の抗体を用いて（ｖ）と（ｖｉ）の場合における、本発明のタンパク質の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量）を測定（例、本発明のタンパク質の発現を検出、本発明のタンパク質の発現量を定量等）して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明のタンパク質の発現を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を小胞体膜、ゴルジ膜、細胞膜などの膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。
本発明のタンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ｖｉ）の場合における本発明のタンパク質の発現量を、上記（ｖ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
【００４５】
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
（ｉ）本発明のタンパク質Ａの活性を促進する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明のタンパク質Ａの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、および（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ａの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。好ましくは、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの予防・治療剤である。
（ｉ）本発明のタンパク質Ａの活性を阻害する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明のタンパク質Ａの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、および（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ａの発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。好ましくは、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの予防・治療剤である。
（ｉ）本発明のタンパク質Ｂの活性を促進する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明のタンパク質Ｂの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、および（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ｂの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。好ましくは、中枢神経系疾患、内分泌疾患、糖尿病などの予防・治療剤である。
（ｉ）本発明のタンパク質Ｂの活性を阻害する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明のタンパク質Ｂの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、および（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ｂの発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。好ましくは、中枢神経系疾患、内分泌疾患、糖尿病などの予防・治療剤である。
（ｉ）本発明のタンパク質Ｃの活性を調節（例、促進）する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明のタンパク質Ｃの遺伝子の発現を調節（例、促進）する化合物またはその塩、および（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ｃの発現を調節（例、促進）する化合物またはその塩は、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。好ましくは、中枢神経系疾患、消化器疾患などの予防・治療剤である。
（ｉ）本発明のタンパク質Ｃの活性を調節（例、阻害）する化合物またはその塩、（ｉｉ）本発明のタンパク質Ｃの遺伝子の発現を調節（例、阻害）する化合物またはその塩、および（ｉｉｉ）本発明のタンパク質Ｃの発現を調節（例、阻害）する化合物またはその塩は、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。好ましくは、中枢神経系疾患、消化器疾患などの予防・治療剤である。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある。例えば、糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質Ａの活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、糖尿病治療の目的で本発明のタンパク質Ａの活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
例えば、アルツハイマー病治療の目的で本発明のタンパク質Ｂの活性を促進する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、アルツハイマー病治療の目的で本発明のタンパク質Ｂの活性を促進する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
例えば、消化器疾患治療の目的で本発明のタンパク質Ｃの活性を調節（例、促進）する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、消化器疾患治療の目的で本発明のタンパク質Ｃの活性を調節（例、促進）する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００４７】
〔３〕本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
【００４８】
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による本発明のタンパク質の検出を行うこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２　、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
【００４９】
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
【００５１】
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江　寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江　寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．　７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ａ））、　同書　Ｖｏｌ．　７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｂ））、　同書　Ｖｏｌ．　７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｃ））、　同書　Ｖｏｌ．　８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ））、　同書　Ｖｏｌ．　１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ　Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質Ａの濃度の減少が検出された場合、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することができる。また、本発明のタンパク質Ａの濃度の上昇が検出された場合、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することが出来る。
本発明のタンパク質Ｂの濃度の減少が検出された場合、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することができる。また、本発明のタンパク質Ｂの濃度の上昇が検出された場合、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することが出来る。
本発明のタンパク質Ｃの濃度の減少が検出された場合、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することができる。また、本発明のタンパク質Ｃの濃度の上昇が検出された場合、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）の可能性が高いと診断することが出来る。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
【００５２】
〔４〕遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたはその他の温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（ゲノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ），第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ），第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のタンパク質Ａの遺伝子の発現増加が検出された場合、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することが出来る。また、該遺伝子の発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のタンパク質Ｂの遺伝子の発現増加が検出された場合、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することが出来る。また、該遺伝子の発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することができる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより本発明のタンパク質Ｃの遺伝子の発現増加が検出された場合、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することが出来る。また、該遺伝子の発現低下が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異が検出された場合は、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの可能性が高いと診断することができる。
【００５３】
〔５〕アンチセンスポリヌクレオチド含有医薬
本発明のタンパク質ＡをコードするＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質Ａまたは上記ＤＮＡの機能（例、糖（例、グルコース、フルクトース、ガラクトースなど）の輸送など）を抑制することができるので、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤として使用することができる。好ましくは、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの予防・治療剤である。
本発明のタンパク質ＢをコードするＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質Ｂまたは上記ＤＮＡの機能（例、グルタミン酸の輸送など）を抑制することができるので、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤として使用することができる。好ましくは、中枢神経系疾患、内分泌疾患、糖尿病などの予防・治療剤である。
本発明のタンパク質ＣをコードするＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質Ｃまたは上記ＤＮＡの機能（例、Ｋ＋イオンの透過活性など）を調節することができるので、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤として使用することができる。好ましくは、中枢神経系疾患、消化器疾患などの予防・治療剤である。上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、糖尿病の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを特定の消化器に投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５４】
さらに、本発明は、
▲１▼本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡ、
▲２▼前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、
▲３▼本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、
▲４▼前記リボザイムを含有してなる医薬、
▲５▼前記リボザイムをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含有する発現ベクターなども提供する。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写されるＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができ、生体内における本発明のタンパク質ＡまたはそれをコードするＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などとして使用することができる。好ましくは、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの予防・治療剤である。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写されるＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができ、生体内における本発明のタンパク質ＢまたはそれをコードするＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などとして使用することができる。好ましくは、中枢神経系疾患、内分泌疾患、糖尿病などの予防・治療剤である。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写されるＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができ、生体内における本発明のタンパク質ＣまたはそれをコードするＤＮＡの機能を調節することができるので、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などとして使用することができる。好ましくは、中枢神経系疾患、消化器疾患などの予防・治療剤である。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，　４１１巻，　４９４頁，　２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　７巻，　２２１頁，　２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部を本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。また、前記▲５▼の発現ベクターは、公知の遺伝子治療法などと同様に用い、上記予防・治療剤として使用する。
【００５５】
〔６〕本発明のＤＮＡを有する動物の作製
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【００５６】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【００５７】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【００５８】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流　に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【００５９】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【００６０】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質またはその機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析する、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質との関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６１】
〔７〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６２】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００６３】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知　ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００６４】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ　ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．　Ｊ．　Ｅｖａｎｓ及びＭ．　Ｈ．　Ｋａｕｆｍａｎ，　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．　Ｒ．　Ｍａｒｔｉｎ　プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．）第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．　Ｃ．　Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ　ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６５】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【００６６】
〔７ａ〕本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
【００６７】
例えば、糖尿病に対して治療効果を有する化合物のスクリーニングをする場合、本発明のタンパク質ＡをコードするＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に糖負荷処置を行ない、糖負荷処置前または処置後に試験化合物を投与し、該動物の血糖値、尿量、尿糖および体重変化などを経時的に測定する。
例えば、アルツハイマー病に対して予防・治療効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のタンパク質ＢをコードするＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の脳内アミロイドβタンパク質濃度の測定、老人班の観察、脳内異常リン酸化タウタンパク質濃度の測定、神経変性の観察、動物の学習能力に与える影響の変化の観察などを行う。
例えば、過敏性腸症候群に対して予防・治療効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のタンパク質ＣをコードするＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の拘束ストレスに対する排便量変化を経時的に測定する。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して予防・治療効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【００６８】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の糖尿病の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の糖尿病の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００６９】
〔７ｂ〕本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
【００７０】
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
【００７１】
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質ＡをコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質Ａの発現を促進し、該タンパク質の活性・機能を促進することができるので、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として有用である。好ましくは、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの予防・治療剤である。
本発明のタンパク質ＢをコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質Ｂの発現を促進し、該タンパク質の活性・機能を促進することができるので、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として有用である。好ましくは、中枢神経系疾患、内分泌疾患、糖尿病などの予防・治療剤である。
本発明のタンパク質ＣをコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質Ｃの発現を促進し、該タンパク質の活性・機能を促進することができるので、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として有用である。好ましくは、中枢神経系疾患、消化器疾患などの予防・治療剤である。
本発明のタンパク質ＡをコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質Ａの発現を阻害し、該タンパク質の活性・機能を阻害することができるので、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として有用である。好ましくは、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの予防・治療剤である。
本発明のタンパク質ＢをコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質Ｂの発現を阻害し、該タンパク質の活性・機能を阻害することができるので、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として有用である。好ましくは、中枢神経系疾患、内分泌疾患、糖尿病などの予防・治療剤である。
本発明のタンパク質ＣをコードするＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質Ｃの発現を阻害し、該タンパク質の活性・機能を阻害することができるので、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの医薬として有用である。好ましくは、中枢神経系疾患、消化器疾患などの予防・治療剤である。
【００７２】
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の糖尿病患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の糖尿病の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７３】
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の糖尿病の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）の糖尿病の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡのプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【００７４】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ　　　　　：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ　　　　：相補的デオキシリボ核酸
Ａ　　　　　　：アデニン
Ｔ　　　　　　：チミン
Ｇ　　　　　　：グアニン
Ｃ　　　　　　：シトシン
ＲＮＡ　　　　　：リボ核酸
ｍＲＮＡ　　　　：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ　　　　：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ　　　　：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ　　　　：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ　　　　：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ　　　　　：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ　　　　：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ　　　　　：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ　　　　　　：グリシン
Ａｌａ　　　　　　　　　：アラニン
Ｖａｌ　　　　　　　　　：バリン
Ｌｅｕ　　　　　　　　　：ロイシン
Ｉｌｅ　　　　　　　　　：イソロイシン
Ｓｅｒ　　　　　　　　　：セリン
Ｔｈｒ　　　　　　　　　：スレオニン
Ｃｙｓ　　　　　　　　　　：システイン
Ｍｅｔ　　　　　　　　　：メチオニン
Ｇｌｕ　　　　　　　　　：グルタミン酸
Ａｓｐ　　　　　　　　　：アスパラギン酸
Ｌｙｓ　　　　　　　　　：リジン
Ａｒｇ　　　　　　　　　：アルギニン
Ｈｉｓ　　　　　　　　　：ヒスチジン
Ｐｈｅ　　　　　　　　　：フェニルアラニン
Ｔｙｒ　　　　　　　　　：チロシン
Ｔｒｐ　　　　　　　　　：トリプトファン
Ｐｒｏ　　　　　　　　　：プロリン
Ａｓｎ　　　　　　　　　：アスパラギン
Ｇｌｎ　　　　　　　　　：グルタミン
ｐＧｌｕ　　　　：ピログルタミン酸
【００７５】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Figure 2004057199
【００７６】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
実施例１で取得したヒトＴＣＨ０９９タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴＣＨ０９９タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
実施例１で用いられたプライマーＡ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
実施例１で用いられたプライマーＢ１６の塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例１で用いられたプライマーＢ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例１で用いられたプライマーＳＰ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
実施例１および実施例１２で用いられたプライマーＴ７の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例１および実施例１２で用いられたプライマーＡ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例１および実施例１２で用いられたプライマーＡ４の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例１および実施例１２で用いられたプライマーＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例１および実施例１２で用いられたプライマーＢ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例１および実施例１２で用いられたプライマーＲ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例１および実施例１２で用いられたプライマーＢ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例１で取得したヒトＴＣＨ０９９全長遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例２で用いられたプライマーＢ８の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例２で用いられたプライマーＢ９の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例２で用いられたプライマーＢ１１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例２で用いられたプライマーＢ１２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例２で用いられたプライマーＡＰ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例２で用いられたプライマーＡＰ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例２で取得したセット２によるＲＡＣＥ産物の塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
配列番号：２１にコードされる部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例２で取得したヒトＴＣＨ０９９Ｖのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するヒトＴＣＨ０９９Ｖタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例３、実施例１４および実施例２３で用いられたプライマーＡ１３の塩基配列を示す。
〔配列番号：２６〕
実施例３、実施例１４および実施例２３で用いられたプライマーＢ１８の塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
実施例３、実施例１４および実施例２３で用いられたＴａｑＭａｎプローブＴ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例４で取得した５８９アミノ酸のヒトＴＣＨ１７７タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２９〕
配列番号：２８で表されるアミノ酸配列を含有するヒトＴＣＨ１７７タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例５、実施例２０および実施例２３で用いられたプライマーＴＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
実施例５、実施例２０および実施例２３で用いられたプライマーＴＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
実施例５、実施例２０および実施例２３で用いられたＴａｑＭａｎプローブＴ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
実施例４で用いられたプライマーＡ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
実施例４で用いられたプライマーＢ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
実施例４で用いられたプライマーＡ４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
実施例４で用いられたプライマーＳＰ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
実施例４および実施例１８で用いられたプライマーＴ７の塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
実施例４および実施例１８で用いられたプライマーＡ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３９〕
実施例４および実施例１８で用いられたプライマーＢ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
実施例４および実施例１８で用いられたプライマーＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
実施例４および実施例１８で用いられたプライマーＲ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
実施例４で用いられたプライマーＲ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
実施例４で用いられたプライマー５−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
実施例４で用いられたプライマー３−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
実施例４で取得したヒトＴＣＨ１７７全長遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
実施例６で取得した６０１アミノ酸のマウスＴＣＨ１７７タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４７〕
配列番号：４６で表されるアミノ酸配列を有するマウスＴＣＨ１７７タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
実施例６で用いられたプライマーｍＯＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：４９〕
実施例６で用いられたプライマーｍＯＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
実施例６で用いられたプライマーｍＯＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
実施例６で用いられたプライマーｍＯＲ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５２〕
実施例６および実施例１６で用いられたプライマーｍＡ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５３〕
実施例６および実施例１６で用いられたプライマーｍＢ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
実施例６で用いられたプライマーｍＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
実施例６で用いられたプライマーｍＦ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
実施例６で用いられたプライマーｍＲ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
実施例６で用いられたプライマーｍＲ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
実施例６で取得したマウスＴＣＨ１７７全長遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
実施例７および実施例１５で用いられたプライマーｍＴＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
実施例７および実施例１５で用いられたプライマーｍＴＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
実施例７および実施例１５で用いられたＴａｑＭａｎプローブｍＴ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６２〕
実施例８で取得したヒトＴＣＨ１３６タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６３〕
配列番号：６２で表されるアミノ酸配列を有するＴＣＨ１３６タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６４〕
実施例８で用いられたプライマーＳＰ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：６５〕
実施例８で用いられたプライマーＴ７の塩基配列を示す。
〔配列番号：６６〕
実施例８で用いられたプライマーＡ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６７〕
実施例８および実施例９で用いられたプライマーＡ２塩基配列を示す。
〔配列番号：６８〕
実施例８で用いられたプライマーＢ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６９〕
実施例８で用いられたプライマーＦ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：７０〕
実施例８で用いられたプライマーＦ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：７１〕
実施例８で用いられたプライマーＦ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：７２〕
実施例８で用いられたプライマーＦ４の塩基配列を示す。
〔配列番号：７３〕
実施例８で用いられたプライマーＦ５の塩基配列を示す。
〔配列番号：７４〕
実施例８で用いられたプライマーＦ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：７５〕
実施例８で用いられたプライマーＦ７の塩基配列を示す。
〔配列番号：７６〕
実施例８で用いられたプライマーＲ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：７７〕
実施例８で用いられたプライマーＲ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：７８〕
実施例８で用いられたプライマーＲ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：７９〕
実施例８で用いられたプライマーＲ４の塩基配列を示す。
〔配列番号：８０〕
実施例８で用いられたプライマーＲ５の塩基配列を示す。
〔配列番号：８１〕
実施例８で用いられたプライマーＲ６の塩基配列を示す。
〔配列番号：８２〕
実施例８で用いられたプライマーＲ７の塩基配列を示す。
〔配列番号：８３〕
実施例８で取得したヒトＴＣＨ１３６全長遺伝子を含むｃＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：８４〕
実施例９および実施例２３で用いられたプライマーＴＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：８５〕
実施例９および実施例２３で用いられたプライマーＴＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：８６〕
実施例９および実施例２３で用いられたＴａｑＭａｎプローブＴ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：８７〕
実施例９で用いられたプライマーＢ３の塩基配列を示す。
〔配列番号：８８〕
実施例１０で用いられたプライマーｍ０９９Ａ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：８９〕
実施例１０で用いられたプライマーｍ０９９Ｂ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：９０〕
実施例１０で同定したマウスＴＣＨ０９９遺伝子ｃＤＮＡの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：９１〕
実施例１１で用いられたプライマーｍ０９９Ａ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：９２〕
実施例１１で用いられたプライマーｍ０９９Ｂ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：９３〕
実施例１１で用いられたＴａｑＭａｎプローブｍ０９９Ｔ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：９４〕
実施例１２で用いられたプライマーＡ１４ｄの塩基配列を示す。
〔配列番号：９５〕
実施例１２で用いられたプライマーＢ１９Ｓの塩基配列を示す。
〔配列番号：９６〕
実施例１２で用いられたプライマーＢＧＨ　ＲＶの塩基配列を示す。
〔配列番号：９７〕
実施例１６で同定したラットＴＣＨ１７７遺伝子ｃＤＮＡの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：９８〕
実施例１７で用いられたプライマーｒＴＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：９９〕
実施例１７で用いられたプライマーｒＴＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：１００〕
実施例１７で用いられたＴａｑＭａｎプローブｒＴ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０１〕
実施例１８で用いられたプライマーＯＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０２〕
実施例１８で用いられたプライマーＯＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０３〕
実施例２１で用いられたプライマーｍＡ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０４〕
実施例２１で用いられたプライマーｍＢ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０５〕
実施例２１で同定したマウスＴＣＨ１３６遺伝子ｃＤＮＡの部分配列の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０６〕
実施例２２で用いられたプライマーｍＴＦの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０７〕
実施例２２で用いられたプライマーｍＴＲの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０８〕
実施例２２で用いられたＴａｑＭａｎプローブｍＴ１の塩基配列を示す。
【００７７】
後述の実施例１で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ０９９は、２００２年１月２５日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７８６３として、２００２年１月１０日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ　１６７４４として寄託されている。
後述の実施例４で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ１７７は、２００２年２月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７８７３として、２００１年１２月１１日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ
１６７３７として寄託されている。
後述の実施例６で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＴＣＨ１７７は、２００２年５月２７日から茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−８０５８として、２００２年５月１４日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７９９として寄託されている。
後述の実施例８で得られた形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲ−ＴＣＨ１３６は、２００１年１２月１９日から日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７８３３として、２００１年１１月２７日から大阪府大阪市淀川区十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ　１６７３５として寄託されている。
【実施例】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。なお、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
実施例１
ヒトＴＣＨ０９９遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
２種のプライマーＤＮＡ、プライマーＡ６（配列番号：３）およびプライマーＢ１６（配列番号：４）を用いて、ヒト小腸Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）に対して、まず、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（クロンテック社製）により、以下の条件（１）〜（５）で一次ＰＣＲを行った。
（１）９４℃３分間
（２）９４℃５秒間−７２℃３分間を５サイクル
（３）９４℃５秒間−７０℃３分間を５サイクル
（４）９４℃５秒間−６８℃３分間を５サイクル
（５）７０℃１０分間
さらに、この一次ＰＣＲの産物を鋳型として、プライマーＡ６（配列番号：３）とプライマーＢ６（配列番号：５）を用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）により以下の条件（６）〜（１０）でｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。
（６）９４℃２分間
（７）９４℃５秒間−７２℃４分間を５サイクル
（８）９４℃５秒間−７０℃４分間を５サイクル
（９）９４℃５秒間−６８℃４分間を２５サイクル
（１０）７２℃１０分間
得られた増幅産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてクローニングし、プラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ０９９を得た。
これをプライマーＤＮＡ〔プライマーＳＰ６（配列番号：６）、プライマーＴ７（配列番号：７）、プライマーＡ２（配列番号：８）、プライマーＡ４（配列番号：９）、プライマーＦ１（配列番号：１０）、プライマーＢ１（配列番号：１１）、プライマーＲ１（配列番号：１２）、プライマーＢ３（配列番号：１３）〕およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、取得したプラスミドは１６５２個の塩基配列を有していた（配列番号：１４）。該ｃＤＮＡ断片には５１２個のアミノ酸配列（配列番号：１）がコードされており（配列番号：２）、該アミノ酸配列を含有するタンパク質を、ヒトＴＣＨ０９９タンパク質と命名した。
該ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ０９９と命名した。
Ｂｌａｓｔ　Ｐ〔ヌクレイック　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）第２５巻、３３８９頁、１９９７年〕を用いてＯＷＬに対してホモロジー検索を行ったところ、該ｃＤＮＡはグルコーストランスポータファミリーに属する新規遺伝子であることが判明した（図１）。ヒトで報告されているグルコーストランスポータであるＧＬＵＴ５（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．、第２６５巻、１３２７６頁、１９９０年）とアミノ酸レベルで５９％の相同性を示し、該タンパク質は１２回膜貫通型の構造を有すると推測された。
【００７８】
実施例２
ヒトＴＣＨ０９９遺伝子ｃＤＮＡの５’末端の取得
ヒト小腸Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）に対して、表１の一次用プライマーとプライマーＡＰ１（配列番号：１９）を用いて、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（クロンテック社製）により、以下の条件（１）〜（５）で一次ＲＡＣＥ反応を行った。
【表１】
Figure 2004057199
（１）９４℃３分間
（２）９４℃５秒間−７２℃１分間を５サイクル
（３）９４℃５秒間−７０℃１分間を５サイクル
（４）９４℃５秒間−６８℃１分間を２５サイクル
（５）７０℃１０分間
さらに、この一次ＲＡＣＥ反応産物を鋳型として、表１の二次用プライマーとプライマーＡＰ２（配列番号：２０）を用いる以外は、一次ＲＡＣＥ反応と同様に二次ＲＡＣＥ反応を行った。二次ＲＡＣＥ反応産物をゲル電気泳動後、主要バンドを精製し、塩基配列を決定した。その結果、セット１、セット４、セット５から得られた産物は配列番号：１４の５’末端を含むものであったが、セット２、セット３から得られた産物はいずれも配列番号：１４とは別の、同一のエクソンに由来するものであった。セット２より得られた配列を配列番号：２１に、ここにコードされる部分ペプチドのアミノ酸配列を配列番号：２２に示す。配列番号：２１の３’側は配列番号：１４と共通していることから、実施例１で得られたｃＤＮＡとは異なる５’末端を有するバリアントが存在するものと考えられた。このバリアントには、５２１個のアミノ酸配列（配列番号：２３）がコードされ（配列番号：２４）、該アミノ酸配列を含有するタンパク質を、ヒトＴＣＨ０９９Ｖタンパク質と命名した（図１）。
配列番号：１４および配列番号：２１で表される塩基配列をＢｌａｓｔ　Ｎ〔ヌクレイック　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）、第２５巻、３３８９頁、１９９７年〕を用いて公知ゲノムデータベース（ｈｔｇｓ）に対してホモロジー検索を行ったところ、配列番号：１４および配列番号：２１は共に一番染色体上にあり、配列番号：１４の第一エクソンと第二エクソンの間に配列番号：２１の第一エクソンが位置することが分かった。
【００７９】
実施例３
ヒトＴＣＨ０９９遺伝子産物の組織分布の解析
ヒトＴＣＨ０９９の配列から設計した、２種のプライマーＤＮＡ、プライマーＡ１３（配列番号：２４）およびプライマーＢ１８（配列番号：２５）と、ＴａｑＭａｎプローブＴ１（配列番号：２６）を用いて、ヒトの各組織のｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ０９９の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。
反応は、ＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。測定に用いたヒトの各組織のｃＤＮＡを〔表２〕に示す。
【表２】
Figure 2004057199
結果を図２に示す。
ヒトＴＣＨ０９９遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は、Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩおよびＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩＩにおいては、胸腺、末梢血白血球でわずかな発現が見られ、小腸で若干の発現が見られ、前立腺、精巣、卵巣で強い発現が見られた。
Ｈｕｍａｎ　ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌにおいては、十二指腸から直腸まですべての部位で発現が見られた（十二指腸および空腸で特に強い発現が見られた）。また、肝臓、食道、胃でもわずかな発現が見られた。
【００８０】
実施例４
ヒトＴＣＨ１７７遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
２種のプライマーＤＮＡ、プライマーＡ３（配列番号：３３）およびプライマーＢ３（配列番号：３４）を用いて、Ｍａｒａｔｈｏｎ−　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ，　ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ（クロンテック社製）に対してＰｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）によりＰＣＲを行い、さらにプライマーＡ４（配列番号：３５）およびプライマーＢ３を用いてｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行い、プラスミドクローンｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ１７７の２クローン＃１、および＃２を得た。これをプライマーＤＮＡ〔プライマーＳＰ６（配列番号：３６）、プライマーＴ７（配列番号：３７）、プライマーＡ１（配列番号：３８）　、プライマーＢ２（配列番号：３９）、プライマーＦ１（配列番号：４０）、プライマーＲ１（配列番号：４１）、プライマーＲ２（配列番号：４２）　、プライマー５−２（配列番号：４３）、プライマー３−２（配列番号：４４）〕およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、取得した２クローンは同一のＤＮＡ断片を含んでおり１８５０個の塩基配列を有していた（配列番号：４５）。該ｃＤＮＡ断片には５８９個のアミノ酸配列（配列番号：２８）がコードされており（配列番号：２９）、該アミノ酸配列を含有するタンパク質をヒトＴＣＨ１７７タンパク質と命名した。
該ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＣＨ１７７と命名した。
Ｂｌａｓｔ　Ｐ［ヌクレイック　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）第２５巻、３３８９頁、１９９７年］を用いてｏｗｌに対してホモロジー検索を行ったところ、該ｃＤＮＡは小胞グルタミン酸トランスポータに属する新規遺伝子であることが判明した（図３）。
ヒトＴＣＨ１７７は、ヒトで報告されている小胞グルタミン酸トランスポータである小胞グルタミン酸トランスポータ１（ＶＧＬＵＴ１）（ＢＮＰＩと称することもある）（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、第６６巻、２２２７頁、１９９６年）
とは塩基レベルで６１％、アミノ酸レベルで７３％の相同性を、小胞グルタミン酸トランスポータ２（ＶＧＬＵＴ２）（Ｊ．　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、第７４巻、２６２２頁、２０００年）とは塩基レベルで６３％、アミノ酸レベルで７２％の相同性をそれぞれ示した。
【００８１】
実施例５
ヒトＴＣＨ１７７遺伝子産物の組織分布の解析
ヒトＴＣＨ１７７の配列から設計した、２種のプライマーＤＮＡ、プライマーＴＦ（配列番号：３０）およびプライマーＴＲ（配列番号：３１）と、ＴａｑＭａｎプローブＴ１（配列番号：３２）を用いて、ヒトの各組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血白血球）のｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　Ｉ、およびＨｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩＩ：クロンテック社製）におけるヒトＴＣＨ１７７の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。反応はＴａｑＭａｎ　Ｇｏｌｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて、最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
結果を図５に示す。ヒトＴＣＨ１７７遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は心臓、脳、胎盤、肺、小腸、末梢白血球で若干の発現が見られ、肝臓、胸腺、大腸でさらに強い発現を示した。
【００８２】
実施例６
マウスＴＣＨ１７７タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
２種のプライマーＤＮＡ、プライマーｍＯＦ（配列番号：４８）およびプライマーｍＯＲ（配列番号：４９）を用いて、マウス脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（ともにクロンテック社製）に対して、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）により、以下の条件（１）〜（３）で一次ＰＣＲを行った。
（１）９４℃２分間
（２）９８℃１０秒間−６８℃３０秒間−７２℃４分間を３０サイクル
（３）７２℃１０分間
さらに、この一次ＰＣＲの産物を鋳型として、プライマーＯＦ１（配列番号：５０）およびプライマーＯＲ１（配列番号：５１）を用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）により以下の条件（４）〜（６）でｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲを行った。
（４）９４℃２分間
（５）９８℃　１０秒間−６５℃　３０秒間−７２℃　４分間を３０サイクル
（６）７２℃１０分間
得られた増幅産物をＺｅｒｏ　Ｂｌｕｎｔ　ＴＯＰＯ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてクローニングし、プラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＴＣＨ１７７を得た。
これをプライマーＤＮＡ〔プライマーＳＰ６（配列番号：３６）、プライマーＴ７（配列番号：３７）、プライマーｍＡ１（配列番号：５２）、プライマーｍＢ１（配列番号：５３）、プライマーｍＦ１（配列番号：５４）、プライマーｍＦ２（配列番号：５５）、プライマーｍＲ１（配列番号：５６）、およびプライマーｍＲ２（配列番号：５７）〕およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、クローンは１８２２個の塩基配列を有していた（配列番号：５８）。該ｃＤＮＡ断片には６０１個のアミノ酸配列（配列番号：４６）がコードされており（配列番号：４７）、該アミノ酸配列を有するタンパク質を、マウスＴＣＨ１７７タンパク質と命名した。
該ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ｍＴＣＨ１７７と命名した。
Ｂｌａｓｔ　Ｐ［ヌクレイック　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）第２５巻、３３８９頁、１９９７年］を用いてｏｗｌに対してホモロジー検索を行ったところ、該ｃＤＮＡは小胞グルタミン酸トランスポータであるヒトＶＧＬＵＴ２と塩基レベルで６３％、アミノ酸レベルで７１％の相同性を示した。マウスＴＣＨ１７７は、ヒトＴＣＨ１７７とは塩基レベルで８６％、アミノ酸レベルで９２％の相同性を示し、ヒトＴＣＨ１７７のマウスホモログであることが判明した（図５）。また、マウスで報告されている小胞グルタミン酸トランスポータであるマウス小胞グルタミン酸トランスポータ２（マウスＶＧＬＵＴ２）（マウスＤＮＰＩと称することもある）（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、第２７６巻、３６７６４頁、２００１年）とは塩基レベルで６５％、アミノ酸レベルで７１％の相同性を示した。
【００８３】
実施例７
マウスＴＣＨ１７７遺伝子産物の組織分布の解析
マウスＴＣＨ１７７の配列から設計した、２種のプライマーＤＮＡ、プライマーｍＴＦ（配列番号：５９）およびプライマーｍＴＲ（配列番号：６０）と、ＴａｑＭａｎプローブｍＴ１（配列番号：６１）を用いて、マウスの各組織（骨髄、目、リンパ節、平滑筋、前立腺、胸腺、胃、子宮、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣、胚（７日）、胚（１１日）、胚（１５日）、胚（１７日））のｃＤＮＡ（Ｍｏｕｓｅ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩおよびＭｏｕｓｅ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩＩ：クロンテック社製）におけるマウスＴＣＨ１７７の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。反応はＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて、最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
結果を図６に示す。マウスＴＣＨ１７７遺伝子産物（ｍＲＮＡ）はＭｏｕｓｅ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩおよびＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩＩにおいては、広範な組織で若干の発現が見られた。
【００８４】
実施例８
ヒトＴＣＨ１３６遺伝子ｃＤＮＡの取得
Ｂｌａｓｔ　Ｎ［ヌクレイック　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）第２５巻、３３８９頁、１９９７年］を用いてＥＳＴデータベース（ｄｂｅｓｔ）に対してホモロジー検索を行ったところ、アクセション番号ＢＦ９６６１２２の配列がヒットした。この配列に対応するクローンＩＭＡＧＥ：４３７５４８０（ヒト海馬ライブラリー由来）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社を通じて入手した。これを、プライマーＤＮＡ〔プライマーＭ１３ＲＶ（配列番号：６４）、プライマーＴ７（配列番号：６５）、プライマーＡ１（配列番号：６６）、プライマーＡ２（配列番号：６７）、プライマーＢ１（配列番号：６８）、プライマーＦ１（配列番号：６９）、プライマーＦ２（配列番号：７０）、プライマーＦ３（配列番号：７１）　、プライマーＦ４（配列番号：７２）、プライマーＦ５（配列番号：７３）、プライマーＦ６（配列番号：７４）、プライマーＦ７（配列番号：７５）、プライマーＲ１（配列番号：７６）、プライマーＲ２（配列番号：７７）、プライマーＲ３（配列番号：７８）、プライマーＲ４（配列番号：７９）、プライマーＲ５（配列番号：８０）、プライマーＲ６（配列番号：８１）、プライマーＲ７（配列番号：８２）〕およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、挿入されているｃＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、該ｃＤＮＡ断片は５１７４個の塩基配列を有していた（配列番号：８３）。該ｃＤＮＡ断片には４３６個のアミノ酸配列（配列番号：６２）がコードされており（配列番号：６３）、該アミノ酸配列を含有するタンパク質を、ヒトＴＣＨ１３６タンパク質と命名した。
該ｃＤＮＡ断片を含むプラスミドを有する形質転換体を、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＲ−ＴＣＨ１３６と命名した。
Ｂｌａｓｔ　Ｐ［ヌクレイック　アシッド　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．）第２５巻、３３８９頁、１９９７年］を用いてＯＷＬに対してホモロジー検索を行ったところ、該ｃＤＮＡは電位依存性Ｋ＋チャネルに属する新規遺伝子であることが判明した（図７）。図中、膜貫通領域をＴＭ１〜６で示した。
ヒトで報告されている電位依存性Ｋ＋チャネルγサブユニットであるＫｖ６．２〔Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ．、第６巻、３３７頁、１９９９年〕とは塩基レベルで４４％、アミノ酸レベルで３７％の相同性を示し、該タンパク質は６回膜貫通型の構造を有すると推測された。
【００８５】
実施例９
ヒトＴＣＨ１３６遺伝子産物の組織分布の解析
ヒトＴＣＨ１３６の配列から設計した、２種のプライマーＤＮＡ、プライマーＴＦ２（配列番号：９４）およびプライマーＴＲ２（配列番号：８５）と、ＴａｑＭａｎプローブＴ２（配列番号：８６）を用いて、ヒトの各組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血白血球）のｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩおよびＨｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩＩ：クロンテック社製）におけるヒトＴＣＨ１３６の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。反応はＴａｑＭａｎ　Ｇｏｌｄ　ＲＴ−ＰＣＲ　ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
ヒトＴＣＨ１３６遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は肺、腎臓、卵巣、小腸で僅かに、また精巣でも若干の発現が見られ、大腸、膵臓、胸腺で強い発現を示した〔図８（Ａ）〕。また、ヒトＴＣＨ１３６の配列から設計した、２種のプライマーＤＮＡ、プライマーＡ２（配列番号：６７）およびプライマーＢ３（配列番号：８７）を用いて、ヒトの各組織（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、大腸、末梢血白血球）のｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩおよびＨｕｍａｎ　ＭＴＣ　ｐａｎｅｌ　ＩＩ：クロンテック社製）に対してＰＣＲを行い、増幅バンドを臭化エチジウムにより染色し、ヒトＴＣＨ１３６の発現を検出した。
結果を図８（Ｂ）に示す。ヒトＴＣＨ１３６遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は、図８（Ａ）で発現が確認された組織に加え、脳、前立腺でも発現を示した。
【００８６】
実施例１０
マウスＴＣＨ０９９遺伝子の部分配列の同定
２種のプライマーＤＮＡ、プライマーｍ０９９Ａ１（配列番号：８８）およびプライマーｍ０９９Ｂ１（配列番号：８９）を用いて、マウス精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）に対して、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（クロンテック社製）により、以下の条件（１）〜（５）でＰＣＲを行った。
（１）９４℃３分間
（２）９４℃５秒間−７２℃１分間を５サイクル
（３）９４℃５秒間−７０℃１分間を５サイクル
（４）９４℃５秒間−６８℃１分間を２５サイクル
（５）７０℃１０分間
得られた増幅産物をゲル電気泳動後、約０．５ｋｂの断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、これをプライマーｍ０９９Ａ１（配列番号：８８）、プライマーｍ０９９Ｂ１（配列番号：８９）およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。
その結果、配列番号：９０で表される４７７個の塩基配列を有するマウスＴＣＨ０９９遺伝子ｃＤＮＡの部分配列を同定した。
【００８７】
実施例１１
（１）正常マウス各組織のｃＤＮＡの調製
７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの各組織〔大脳、小脳、海馬、延髄、脊髄、坐骨神経、皮膚、骨格筋、眼球、心臓、肺、気管、膵臓、腎臓、肝臓、前胃、後胃、十二指腸、空回腸、盲腸、結腸、直腸、脾臓、胸腺、骨髄、卵巣、子宮、前立腺、精巣　（卵巣および子宮は雌から、それ以外は雄から、各１−１０匹分を採取）〕より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）、またはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　に対してＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅａｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを調製した。
（２）マウスＴＣＨ０９９遺伝子産物の組織分布の解析
配列番号：９０の配列から設計した、２種のプライマーＤＮＡ、プライマーｍ０９９Ａ２（配列番号：９１）およびプライマーｍ０９９Ｂ２（配列番号：９２）と、ＴａｑＭａｎプローブｍ０９９Ｔ１（配列番号：９３）を用いて、上記のマウス各組織のｃＤＮＡにおけるマウスＴＣＨ０９９の発現量（コピー数）をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。同じｃＤＮＡについてＴａｑＭａｎｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｒｏｄｅｎｔ　ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｉｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　（ＧＡＰＤＨ）の発現量（コピー数）も測定した。反応はＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
結果を図９に示す。マウスＴＣＨ０９９遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの各組織においては、坐骨神経、腎臓、卵巣、精巣、盲腸などで若干の発現が見られ、十二指腸、空回腸、直腸、膵臓で高い発現が見られた。
【００８８】
実施例１２
ヒトＴＣＨ０９９発現ベクターの構築
ヒトＴＣＨ０９９（配列番号：１）発現ベクターを、以下の方法により作成した。実施例１により得られたプラスミド１００ｎｇを鋳型として、プライマーＡ１４ｄ（配列番号：９４）およびプライマーＢ１９Ｓ（配列番号：９５）を用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）により以下の条件（１）〜（３）でＰＣＲを行った。
（１）９４℃３分間
（２）９８℃１０秒間−６５℃３０秒間−７２℃３分間を２５サイクル
（３）７２℃１０分間
上記ＰＣＲ反応液をゲル電気泳動後、主要バンドを精製した。これにより得られたＰＣＲ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてクローニングした。これにより得られた複数のコロニーからプラスミドを調製し、プライマーＤＮＡ〔プライマーＢＧＨＲＶ（配列番号：９６）、プライマーＴ７（配列番号：７）、プライマーＡ２（配列番号：８）、プライマーＡ４（配列番号：９）、プライマーＦ１（配列番号：１０）、プライマーＢ１（配列番号：１１）、プライマーＲ１（配列番号：１２）、プライマーＢ３（配列番号：１３）〕およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて確認した。このプラスミドを有する形質転換体を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ−ＴＣＨ０９９と命名した。
【００８９】
実施例１３
ヒトＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞株の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＤＮＡ３．１Ｄ（＋）−ＴＣＨ０９９を培養し、この大腸菌体からＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡをＦｕＧＥＮＥ　６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）を用いて添付のプロトコールに従ってＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に導入した。２μｇのプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬との混合液を２４時間前に３　ｘ　１０５個のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径６ｃｍシャーレに添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、トリプシン処理により細胞をはがし、回収した細胞を適宜希釈して１０ｃｍシャーレに播種した。さらに２４時間後、培地に０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加し、その後１０日間０．５−１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含んだ培地中でヒトＴＣＨ０９９発現細胞を選択した。Ｇ４１８含有選択培地中に増殖してくるモノクローナルなヒトＴＣＨ０９９発現細胞のコロニーを１２５個選択した。
【００９０】
実施例１４
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いたヒトＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞株における導入遺伝子発現量の測定
実施例１３で作製したヒトＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞株を９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに培養し、増殖した細胞からＳＶ　９６　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｅｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　に対してＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅａｓｅ　ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを調製した。これについて、実施例３で用いられたプライマーＡ１３（配列番号：２５）およびプライマーＢ１８（配列番号：２６）と、ＴａｑＭａｎプローブＴ１（配列番号：２７）とを用いて、ヒトＴＣＨ０９９の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。反応はＴａｑＭａｎＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて、最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。ヒトＴＣＨ０９９遺伝子高発現細胞株として、クローンＮｏ．３３を選択した。
【００９１】
実施例１５
マウスＴＣＨ１７７遺伝子産物の７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける組織分布の解析
実施例７で用いたプライマーｍＴＦ（配列番号：５９）、プライマーｍＴＲ（配列番号：６０）およびＴａｑＭａｎプローブｍＴ１（配列番号：６１）を用いて、実施例１１で調製したマウス各組織のｃＤＮＡにおけるマウスＴＣＨ１７７の発現量（コピー数）をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。同じｃＤＮＡについてＴａｑＭａｎ　ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｒｏｄｅｎｔ　ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｉｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＧＡＰＤＨ）の発現量（コピー数）も測定した。反応はＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
結果を図１０に示す。
マウスＴＣＨ１７７遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの各組織においては、坐骨神経、海馬、脊髄、延髄、大脳、眼球、卵巣、前立腺、子宮、胸腺で高い発現が見られ、肝臓で最も高い発現が見られた
【００９２】
実施例１６
ラットＴＣＨ１７７遺伝子の部分配列の同定
実施例６で用いた２種のプライマーＤＮＡ、プライマーｍＡ１（配列番号：５２）およびプライマーｍＢ１（配列番号：５３）を用いて、ラット脳Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）に対して、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（クロンテック社製）により、以下の条件（１）〜（３）でＰＣＲを行った。
（１）９５℃１分間
（２）９５℃３０秒間−６０℃３０秒間−６８℃３分間を３５サイクル
（３）６８℃３分間
得られた増幅産物をゲル電気泳動後、約０．５ｋｂの断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。これをプライマーＤＮＡ、プライマーｍＡ１（配列番号：５２）およびプライマーｍＢ１（配列番号：５３）およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、配列番号：９７で表される５３６個の塩基配列を有するラットＴＣＨ１７７遺伝子ｃＤＮＡの部分配列を同定した。
【００９３】
実施例１７
（１）正常ラット各組織のｃＤＮＡの調製
１２週齢Ｗｉｓｔａｒラット雄の各組織（大脳、小脳、肝臓、腎臓、前立腺、心臓、肺、十二指腸、空回腸、結腸、皮膚、眼球）より、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　に対してＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅａｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを調製した。
（２）ラットＴＣＨ１７７遺伝子産物の組織分布の解析
配列番号：９７の配列から設計した、２種のプライマーＤＮＡ、プライマーｒＴＦ（配列番号：９８）およびプライマーｒＴＲ（配列番号：９９）と、ＴａｑＭａｎプローブｒＴ１（配列番号：１００）を用いて、上記のラット各組織のｃＤＮＡにおけるラットＴＣＨ１７７の発現量（コピー数）をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。同じｃＤＮＡについてＴａｑＭａｎ　ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｒｏｄｅｎｔ　ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｉｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　（ＧＡＰＤＨ）の発現量（コピー数）も測定した。反応はＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
結果を図１１に示す。ラットＴＣＨ１７７遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は１２週齢Ｗｉｓｔａｒラットの各組織においては、腎臓、肺、十二指腸、皮膚で若干の発現が見られ、大脳、肝臓、空回腸、結腸、眼球で高い発現が見られた。
【００９４】
実施例１８
ヒトＴＣＨ１７７発現ベクターの構築
実施例４により得られたプラスミド５０ｎｇを鋳型として、プライマーＯＦ（配列番号：１０１）およびプライマーＯＲ（配列番号：１０２）を用いて、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）により以下の条件（１）〜（３）でＰＣＲを行った。５’末端側プライマーＯＦおよび３’末端側プライマーＯＲは、ベクターへのクローニングのために５’末端側にそれぞれＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトおよびＥｃｏ　ＲＩサイトを付加するように設計した。
（１）９４℃２分間
（２）９８℃１０秒間−５７℃３０秒間−７２℃３．５分間を３０サイクル
（３）７２℃１０分間
上記ＰＣＲ反応液をゲル電気泳動後、主要バンドを精製した。これにより得られたＰＣＲ断片を、制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩおよびＥｃｏＲ　Ｉを用いて、３７℃で１時間保温することにより消化し、この反応液をゲル電気泳動後、精製した。これを、動物細胞発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン社製）のＨｉｎｄ　ＩＩＩサイトおよびＥｃｏＲ　Ｉサイトに、Ｔａｋａｒａ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２　（宝酒造社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション反応液をエタノール沈殿処理後、コンピーテント細胞である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０　（インビトロジェン社製）に形質転換した。これにより得られた複数のコロニーからプラスミドを調製し、プライマーＤＮＡ〔プライマーＢＧＨ　ＲＶ（配列番号：９６）、プライマーＴ７（配列番号：３７）、プライマーＡ１（配列番号：３８）、プライマーＢ２（配列番号：３９）、プライマーＦ１（配列番号：４０）、プライマーＲ１（配列番号：４１）〕およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて確認した。このプラスミドを有する形質転換体を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＣＨ１７７と命名した。
【００９５】
実施例１９
ヒトＴＣＨ１７７発現ＣＨＯ細胞株の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０／ｐＣＤＮＡ３．１（＋）−ＴＣＨ１７７を培養し、この大腸菌体からＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミドＤＮＡをＦｕＧＥＮＥ　６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）を用いて添付のプロトコールに従ってＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞に導入した。２μｇのプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬との混合液を２４時間前に３　ｘ　１０５個のＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞を播種した直径６ｃｍシャーレに添加した。１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭα培地で１日間培養した後、トリプシン処理により細胞をはがし、回収した細胞を適宜希釈して１０ｃｍシャーレに播種した。さらに２４時間後、培地に０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加し、その後１０日間０．５−１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含んだ培地中でヒトＴＣＨ１７７発現細胞を選択した。Ｇ４１８含有選択培地中に増殖してくるモノクローナルなヒトＴＣＨ１７７発現細胞のコロニーを、８０個選択した。
【００９６】
実施例２０
ＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ法を用いたヒトＴＣＨ１７７発現ＣＨＯ細胞株における導入遺伝子発現量の測定
実施例１９で作製したヒトＴＣＨ１７７発現ＣＨＯ細胞株を４８ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅまたは２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに培養し、増殖した細胞からＲＮｅａｓｙ　９６　Ｋｉｔ　（キアゲン社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　に対してＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅａｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを調製した。これについて、実施例５で用いた、プライマーＴＦ（配列番号：３０）、プライマーＴＲ（配列番号：３１）およびＴａｑＭａｎプローブＴ１（配列番号：３２）を用いて、ヒトＴＣＨ１７７の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。反応はＴａｑＭａｎ　ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて、最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。ヒトＴＣＨ１７７遺伝子高発現細胞株として、クローンＮｏ．２４を選択した。
【００９７】
実施例２１
マウスＴＣＨ１３６遺伝子の部分配列の同定
２種のプライマーＤＮＡ、プライマーｍＡ１（配列番号：１０３）およびプライマーｍＢ１（配列番号：１０４）を用いて、マウス精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（クロンテック社製）に対して、Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（クロンテック社製）により、以下の条件（１）〜（３）でＰＣＲを行った。
（１）９５℃１分間
（２）９５℃３０秒間−６８℃３分間を３５サイクル
（３）６８℃３分間
得られた増幅産物をゲル電気泳動後、約１．０ｋｂの断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、プライマーＤＮＡ、プライマーｍＡ１（配列番号：１０３）およびプライマーｍＢ１（配列番号：１０４）およびＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて反応を行い、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列をＤＮＡシークエンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００　ＤＮＡアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。その結果、配列番号：１０５で表される９５０個の塩基配列を有するマウスＴＣＨ１３６遺伝子ｃＤＮＡの部分配列を同定した。
【００９８】
実施例２２
マウスＴＣＨ１３６遺伝子産物の組織分布の解析
配列番号：１０５で表される塩基配列から設計した、２種のプライマーＤＮＡ、プライマーｍＴＦ（配列番号：１０６）およびプライマーｍＴＲ（配列番号：１０７）と、ＴａｑＭａｎプローブｍＴ１（配列番号：１０８）を用いて、実施例１１で調製したマウス各組織のｃＤＮＡにおけるマウスＴＣＨ１３６の発現量（コピー数）をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した。同じｃＤＮＡについてＴａｑＭａｎ　ｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｒｏｄｅｎｔ　ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｉｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　（ＧＡＰＤＨ）の発現量（コピー数）も測定した。反応はＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
結果を図１２に示す。
マウスＴＣＨ１３６遺伝子産物（ｍＲＮＡ）は７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの各組織においては、大脳、子宮、卵巣、精巣などで高い発現が見られた
【００９９】
実施例２３
ヒトＴＣＨ０９９、ヒトＴＣＨ１７７およびヒトＴＣＨ１３６遺伝子の市販正常ヒト細胞における発現解析
（１）正常ヒト細胞ｃＤＮＡの調製
正常ヒト細胞はＣａｍｂｒｅｘ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌ社製品を購入し、製品添付の使用説明書記載の方法に従って培養した。実験に使用した細胞と各々の細胞の培養に用いた培地を表３に示す。
【表３】
Figure 2004057199
各細胞を７５ｃｍ２培養フラスコにサブコンフルエントになるよう培養して、トリプシン−ＥＤＴＡ処理により細胞を回収した。回収した細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）、またはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。調製したｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　に対してＴａｑＭａｎ　Ｒｅｖｅａｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを調製した。
【０１００】
（２）ヒトＴＣＨ０９９、ヒトＴＣＨ１７７およびヒトＴＣＨ１３６遺伝子の市販正常ヒト細胞における発現解析
上記の各ｃＤＮＡにおける発現量（Ｃｔ値）をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより以下のように測定した。ヒトＴＣＨ０９９については、実施例３で用いられたプライマーＡ１３（配列番号：２５）、プライマーＢ１８（配列番号：２６）およびＴａｑＭａｎプローブＴ１（配列番号：２７）を用い、ヒトＴＣＨ１７７については、実施例５で用いたプライマーＴＦ（配列番号：３０）、プライマーＴＲ（配列番号：３１）およびＴａｑＭａｎプローブＴ１（配列番号：３２）を用い、ヒトＴＣＨ１３６については、実施例９で用いたプライマーＴＦ（配列番号：８４）、プライマーＴＲ（配列番号：８５）およびＴａｑＭａｎプローブＴ１（配列番号：８６）を用いた。同じｃＤＮＡについてＴａｑＭａｎ　ＧＡＰＤＨ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｉｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　（ＧＡＰＤＨ）の発現量（Ｃｔ値）も測定した。反応はＴａｑＭａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７９００　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）にて最初５０℃２分間、さらに９５℃１０分間おいた後で、９５℃で１５秒、６０℃で１分を１反応サイクルとして４０サイクル繰り返し、同時に検出を行った。
以上の方法で得た測定値をもとにして、ヒトＴＣＨ０９９遺伝子、ヒトＴＣＨ１７７遺伝子およびヒトＴＣＨ１３６遺伝子のＧＡＰＤＨに対する相対的発現量を次式に従ってそれぞれ算出した。
相対的発現量＝１／２Ａ−Ｂ
上記式において、ＡはヒトＴＣＨ０９９遺伝子、ヒトＴＣＨ１７７遺伝子またはヒトＴＣＨ１３６遺伝子のＣｔ値を、ＢはＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｔ値をそれぞれ表す。
結果を表４に示す。表中、○は発現が見られたことを示す。
【表４】
Figure 2004057199
ヒトＴＣＨ０９９は臍帯静脈内皮細胞、大動脈血管内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、骨格筋細胞、乳腺上皮細胞、および軟骨細胞で若干の発現が見られた。
ヒトＴＣＨ１７７は冠状動脈平滑筋細胞、子宮平滑筋細胞、気管支平滑筋細胞、骨格筋衛星細胞、乳腺上皮細胞、気管支上皮細胞、肺繊維芽細胞、間葉系幹細胞、および骨芽細胞で若干の発現が見られた。
ヒトＴＣＨ１３６は臍帯静脈血管内皮細胞、大動脈血管内皮細胞、冠状動脈血管内皮細胞、子宮平滑筋細胞、骨格筋衛星細胞、肺繊維芽細胞、腎臓近位尿細管上皮細胞、腎臓皮質上皮細胞、および骨芽細胞で若干の発現が見られた。
【０１０１】
実施例２４
ヒトＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞株における２−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］−Ｄｅｏｘｙ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ取り込みの測定
実施例１４で取得したＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞株クローンＮｏ．３３を用いて、２−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］−Ｄｅｏｘｙ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ（以下、２−［３Ｈ］−ＤＯＧと称することもある）取り込みを測定した。
ＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞株クローンＮｏ．３３をＩ型コラーゲンでコートした２４ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり２．５×１０５個播種し、３７℃で２４時間培養した。培地を除き、１ｍＬＫＣｌバッファー〔１２５ｍＭ　ＫＣｌ、１．２ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ　ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、４ｍＭ　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、０．１ｍｇ／ｍＬ　ウシ血清アルブミンおよび１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ　７．２）〕で３回洗浄した。１ｍＬ　ＫＣｌバッファーを入れ３７℃で１時間培養した後、４５０μＬ　ＫＣｌバッファー（１００ｎＭ　インスリンを含む）に置換し、３０分後に１００μＭ　２−［３Ｈ］−ＤＯＧ（パーキンエルマー・ライフサイエンス社製）を５０μＬ加え、３７℃で３０分培養し、１ｍＬ　ＫＣｌバッファーで３回洗浄した。細胞を０．５Ｎ　ＮａＯＨで溶解し、溶解液中に含まれる放射活性をシンチレーションカウンターにより測定することで、細胞に取り込まれた２−［３Ｈ］−ＤＯＧの量を測定した。同様の操作を、ＣＨＯ　ｄｈｆｒ−細胞にベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）を導入した細胞（以下、Ｍｏｃｋと称することもある）においても行い、同様に放射活性を測定した。統計解析にはＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ社製）を用いて、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った。
結果を図１３に示す。
ヒトＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞は、Ｍｏｃｋより多くの２−［３Ｈ］−ＤＯＧを取り込むことが明らかとなった。その差は有意なものであった（ｐ＝０．００６９）。
【０１０２】
【発明の効果】
本発明のタンパク質Ａは、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物は、例えば、糖尿病、高脂血症、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などとして使用することができる。
本発明のタンパク質Ｂは、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を促進または阻害する化合物は、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、内分泌疾患（高プロラクチン血症、バセドウ病、褐色細胞腫、クッシング症候群など）、糖尿病、動脈硬化、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、肝臓疾患（例、肝硬変、肝炎、アルコール性肝臓疾患など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などとして使用することができる。
本発明のタンパク質Ｃは、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの診断マーカー等として有用であり、該タンパク質を用いるスクリーニング法により得られる該タンパク質の活性を調節する化合物は、例えば、中枢神経系疾患（例、アルツハイマー病、パーキンソン症候群、統合失調症、脳血管性痴呆、脳虚血、てんかんなど）、消化器疾患（例、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、胃炎、消化性潰瘍、直腸炎、逆流性食道炎など）、炎症性疾患（例、敗血症、肺炎、脳炎、肝炎、心筋炎など）、呼吸器疾患（例、慢性閉塞性肺疾患、気管支喘息など）、自己免疫疾患（例、重症筋無力症、糸球体腎炎、多発性硬化症、シェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスなど）、アレルギー性疾患（例、花粉症、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシーショック、アトピー性皮膚炎など）、胸腺疾患、免疫不全（例、白血球異常、脾機能不全または胸腺異常にともなう免疫不全など）、膵臓疾患（例、慢性膵炎、膵嚢胞性線維症などの膵機能不全など）、糖尿病、動脈硬化、生殖器疾患（例、不妊症、前立腺肥大症、前立腺炎、精巣神経症、精巣過敏症、卵巣機能不全など）、循環器疾患（例、心不全、不整脈、ＱＴ延長症候群など）、筋肉疾患（例、筋萎縮症など）または癌（例、肺癌、腎臓癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸部癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胸腺腫など）などの予防・治療剤、臓器移植後の拒絶反応抑制剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
【０１０３】
【配列表】
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199
Figure 2004057199

【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＴＣＨ０９９、ヒトＴＣＨ０９９ＶおよびＧＬＵＴ５のアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、ＴＣＨ０９９はヒトＴＣＨ０９９のアミノ酸配列（配列番号：１）を、ＴＣＨ０９９ＶはヒトＴＣＨ０９９Ｖのアミノ酸配列（配列番号：２３）を、ＧＬＵＴ５はＧＬＵＴ５のアミノ酸配列を示す。ＴＭ１〜ＴＭ１２は膜貫通領域を示す。□は、３配列のうち、２配列以上で一致するアミノ酸を示す。
【図２】ヒトＴＣＨ０９９遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。ヒトの各組織ｃＤＮＡにおけるヒトＴＣＨ０９９の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した結果を示す。発現量をｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのコピー数で表す。
【図３】小胞グルタミン酸トランスポータ１（ＶＧＬＵＴ１）、小胞グルタミン酸トランスポータ２（ＶＧＬＵＴ２）およびヒトＴＣＨ１７７のアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、膜貫通領域予測ソフトＳＯＳＵＩ〔Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　（ｆｏｒｍｅｒｌｙ　ＣＡＢＩＯＳ）、第１４巻、３７８頁、１９９８年〕により解析された膜貫通領域をＴＭ１〜ＴＭ７で示す。
【図４】ヒトＴＣＨ１７７遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。発現量をｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのコピー数で表す。
【図５】マウスＴＣＨ１７７（配列番号：１９）（ｍＴＣＨ１７７）およびヒトＴＣＨ１７７（配列番号：１）（ｈＴＣＨ１７７）のアミノ酸配列の比較を表す図である。
【図６】マウスＴＣＨ１７７遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。発現量をｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのコピー数で表す。
【図７】Ｋｖ６．２およびヒトＴＣＨ１３６のアミノ酸配列の比較を表す図である。図中、膜貫通領域をＴＭ１〜ＴＭ６で、ポア領域をＰでそれぞれ示す。
【図８】（Ａ）ヒトＴＣＨ１３６遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。発現量をｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのコピー数で表す。
（Ｂ）ヒトＴＣＨ１３６の発現を検出した結果を表す。図中、発現が検出された組織を＋で、検出されなかった組織を−で示す。
【図９】マウスＴＣＨ０９９遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの各組織ｃＤＮＡにおけるマウスＴＣＨ０９９の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した結果を示す。発現量は、ｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのマウスＴＣＨ０９９のコピー数を、等量の各組織ｃＤＮＡにおけるｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨのコピー数で割った値で表す。
【図１０】マウスＴＣＨ１７７遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの各組織ｃＤＮＡにおけるマウスＴＣＨ１７７の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した結果を示す。発現量は、ｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのマウスＴＣＨ１７７のコピー数を、等量の各組織ｃＤＮＡにおけるｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨのコピー数で割った値で表す。
【図１１】ラットＴＣＨ１７７遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。１２週齢Ｗｉｓｔａｒラット雄の各組織ｃＤＮＡにおけるラットＴＣＨ１７７の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した結果を示す。発現量は、ｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのラットＴＣＨ１７７のコピー数を、等量の各組織ｃＤＮＡにおけるｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨのコピー数で割った値で表す。
【図１２】マウスＴＣＨ１３６遺伝子産物の各組織における発現量を表す図である。７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの各組織ｃＤＮＡにおけるマウスＴＣＨ１３６の発現量をＴａｑＭａｎ　ＰＣＲにより測定した結果を示す。発現量は、ｃＤＮＡ溶液１μｌ当たりのマウスＴＣＨ１３６のコピー数を、等量の各組織ｃＤＮＡにおけるｒｏｄｅｎｔ　ＧＡＰＤＨのコピー数で割った値で表す。
【図１３】ヒトＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞株における２−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］−Ｄｅｏｘｙ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅの取り込みを測定した結果を表す図である。取り込み量は独立した３ｗｅｌｌのカウント（ＤＰＭ）の平均値および標準偏差により示した。図中、Ｍｏｃｋは、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）を導入した細胞を、ＴＣＨ０９９は、ヒトＴＣＨ０９９発現ＣＨＯ細胞を示す。

Claims (83)

  1. 配列番号：１または配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
  2. 配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
  3. 配列番号：２３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
  4. 請求項１記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
  5. 請求項１記載のタンパク質または請求項４記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
  6. ＤＮＡである請求項５記載のポリヌクレオチド。
  7. 配列番号：２、配列番号：１４または配列番号：２４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
  8. 請求項５記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  9. 請求項８記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
  10. 請求項９記載の形質転換体を培養し、請求項１記載のタンパク質または請求項４記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
  11. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
  12. 請求項５記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  13. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
  14. 請求項１３記載の抗体を含有してなる医薬。
  15. 請求項１３記載の抗体を含有してなる診断薬。
  16. 請求項５記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド。
  17. 請求項１６記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  18. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  19. 請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  20. 請求項１８記載のスクリーニング方法または請求項１９記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項１記載のタンパク質もしくは請求項４記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
  21. 請求項２０記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  22. 請求項５記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  23. 請求項５記載のポリヌクレオチドを含有してなる、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  24. 請求項２２記載のスクリーニング方法または請求項２３記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項１記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩。
  25. 請求項２４記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  26. 糖尿病、高脂血症または動脈硬化の予防・治療剤である請求項１１、請求項１２、請求項１４、請求項１７、請求項２１または請求項２５記載の医薬。
  27. 哺乳動物に対して、請求項２０または請求項２４記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、高脂血症または動脈硬化の予防・治療方法。
  28. 糖尿病、高脂血症または動脈硬化の予防・治療剤を製造するための請求項２０または請求項２４記載の化合物またはその塩の使用。
  29. 配列番号：２８または配列番号：４６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
  30. 配列番号：２８で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
  31. 配列番号：４６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
  32. 請求項２９記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
  33. 請求項２９記載のタンパク質または請求項３２記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
  34. ＤＮＡである請求項３３記載のポリヌクレオチド。
  35. 配列番号：２９、配列番号：４５、配列番号：４７または配列番号：５８で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
  36. 請求項３３記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  37. 請求項３６記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
  38. 請求項３７記載の形質転換体を培養し、請求項２９記載のタンパク質または請求項３２記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項２９記載のタンパク質もしくは請求項３２記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
  39. 請求項２９記載のタンパク質もしくは請求項３２記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
  40. 請求項３３記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  41. 請求項２９記載のタンパク質もしくは請求項３２記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
  42. 請求項４１記載の抗体を含有してなる医薬。
  43. 請求項４１記載の抗体を含有してなる診断薬。
  44. 請求項３３記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド。
  45. 請求項４４記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  46. 請求項２９記載のタンパク質もしくは請求項３２記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、請求項２９記載のタンパク質もしくは請求項３２記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  47. 請求項２９記載のタンパク質もしくは請求項３２記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、請求項２９記載のタンパク質もしくは請求項３２記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  48. 請求項４６記載のスクリーニング方法または請求項４７記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項２９記載のタンパク質もしくは請求項３２記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
  49. 請求項４８記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  50. 請求項３３記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項２９記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  51. 請求項３３記載のポリヌクレオチドを含有してなる、請求項２９記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  52. 請求項５０記載のスクリーニング方法または請求項５１記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項２９記載のタンパク質遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩。
  53. 請求項５２記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  54. 中枢神経系疾患、内分泌疾患または糖尿病の予防・治療剤である請求項３９、請求項４０、請求項４２、請求項４５、請求項４９または請求項５３記載の医薬。
  55. 哺乳動物に対して、請求項４８または請求項５２記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢神経系疾患、内分泌疾患または糖尿病の予防・治療方法。
  56. 中枢神経系疾患、内分泌疾患または糖尿病の予防・治療剤を製造するための請求項４８または請求項５２記載の化合物またはその塩の使用。
  57. 配列番号：６２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
  58. 配列番号：６２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
  59. 請求項５７記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
  60. 請求項５７記載のタンパク質または請求項５９記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
  61. ＤＮＡである請求項６０記載のポリヌクレオチド。
  62. 配列番号：６３または配列番号：８３で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
  63. 請求項６０記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  64. 請求項６３記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
  65. 請求項６４記載の形質転換体を培養し、請求項５７記載のタンパク質または請求項５９記載の部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項５７記載のタンパク質もしくは請求項５９記載の部分ペプチドまたはその塩の製造法。
  66. 請求項５７記載のタンパク質もしくは請求項５９記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬。
  67. 請求項６０記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  68. 請求項５７記載のタンパク質もしくは請求項５９記載の部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
  69. 請求項６８記載の抗体を含有してなる医薬。
  70. 請求項６８記載の抗体を含有してなる診断薬。
  71. 請求項６０記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド。
  72. 請求項７１記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
  73. 請求項５７記載のタンパク質もしくは請求項５９記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、請求項５７記載のタンパク質もしくは請求項５９記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  74. 請求項５７記載のタンパク質もしくは請求項５９記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、請求項５７記載のタンパク質もしくは請求項５９記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  75. 請求項７３記載のスクリーニング方法または請求項７４記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項５７記載のタンパク質もしくは請求項５９記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を調節する化合物またはその塩。
  76. 請求項７５記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  77. 請求項６０記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、請求項５７記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
  78. 請求項６０記載のポリヌクレオチドを含有してなる、請求項５７記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
  79. 請求項７７記載のスクリーニング方法または請求項７８記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、請求項５７記載のタンパク質遺伝子の発現を調節する化合物またはその塩。
  80. 請求項７９記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬。
  81. 中枢神経系疾患または消化器疾患の予防・治療剤である請求項６６、請求項６７、請求項６９、請求項７２、請求項７６または請求項８０記載の医薬。
  82. 哺乳動物に対して、請求項７５または請求項７９記載の化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする中枢神経系疾患または消化器疾患の予防・治療方法。
  83. 中枢神経系疾患または消化器疾患の予防・治療剤を製造するための請求項７５または請求項７９記載の化合物またはその塩の使用。
JP2002367432A 2001-12-21 2002-12-19 新規タンパク質およびそのｄｎａ Withdrawn JP2004057199A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002367432A JP2004057199A (ja) 2001-12-21 2002-12-19 新規タンパク質およびそのｄｎａ

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001389361 2001-12-21
JP2001392577 2001-12-25
JP2001395467 2001-12-26
JP2001394947 2001-12-26
JP2002030010 2002-02-06
JP2002033095 2002-02-08
JP2002165336 2002-06-06
JP2002367432A JP2004057199A (ja) 2001-12-21 2002-12-19 新規タンパク質およびそのｄｎａ

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2004057199A true JP2004057199A (ja) 2004-02-26

Family

ID=31950978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002367432A Withdrawn JP2004057199A (ja) 2001-12-21 2002-12-19 新規タンパク質およびそのｄｎａ

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2004057199A (ja)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2002112772A (ja) 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
WO2004048565A1 (ja) アポトーシス関連蛋白質およびその用途
JP2003245076A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004073182A (ja) インスリン抵抗性改善剤
JP4488720B2 (ja) アポトーシス関連蛋白質およびその用途
JP2003289881A (ja) アルツハイマー病関連遺伝子のスクリーニング方法
EP1457557A1 (en) Novel proteins and dnas thereof
JP4300008B2 (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004057199A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP4404605B2 (ja) 新規なｆｐｒｌ１リガンドおよびその用途
JP2004121245A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2001299364A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004024241A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004198202A (ja) 新規スクリーニング方法
JP2004026692A (ja) Ｍｅｐｅの新規用途
WO2004024760A1 (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004173677A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
US20050208494A1 (en) Novel proteins and dnas thereof
JP2003189878A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004041003A (ja) 新規タンパク質、そのｄｎａおよびその用途
JP2004057169A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004105167A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2000053700A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004081196A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2004261172A (ja) 疾患関連遺伝子の用途

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Withdrawal of application because of no request for examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20060307