DE3640042A1

DE3640042A1 - Neue calcitoninderivate

Info

Publication number: DE3640042A1
Application number: DE19863640042
Authority: DE
Inventors: Francois Dr Cardinaux; Janos Dr Pless; Robert Helmut Dr Buck
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1985-12-04
Filing date: 1986-11-24
Publication date: 1987-06-11

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Calcitoninderivate, ihre Herstellung, pharmazeutische Präparate, welche sie enthalten, sowie ihre Verwendung als Arzneimittel.

Insbesondere betrifft die Erfindung neue Polypeptide der Formel I worin R für H oder R′CO
R′CO für den Acylrest einer Carbonsäure,
Y₁ für den am α-C-Atom einer α-Aminosäure befindlichen Rest,
Y₂ für den am α-C-Atom einer α-Aminosäure befindlichen Rest, Y₃ für Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, gegebenenfalls durch Methyl oder Methoxy substituiertes Benzyl oder CH₃CONH-CH₂-,
n für 1 bis 4
A₆ für Thr oder D-Thr
p für 3 bis 5
A₈ für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L-α-Aminosäure
A₉ für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L- oder D-α-Aminosäure, und
Z für den Polypeptidrest, der sich in den Stellungen 10 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Derivates oder Analogons davon mit hypocalcämischer Wirkung befindet, stehen,
wobei die 1 bis 4 Y₁-Reste in der Formel I unabhängig voneinander die gleichen oder verschiedenartige Bedeutungen haben können und mit Ausnahme des Aminoacylrestes A₈ alle Aminosäurereste in der Formel I die L- oder D-Konfiguration haben können,
mit der Massgabe, dass falls Y₂ für CH₂SH steht und n 4 bedeutet, der N-terminale Aminoacylrest nicht H-Cys sein darf,
sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.

Unter Z in der Formel I sind solche Peptidreste zu verstehen, welche in den verschiedenen bekannten Calcitoninen, z. B. in Human-, Salm-, Aal-, Huhn-, Rind-, Schaf-, Ratte- oder Schwein-Calcitonin, sowie in den Derivaten und Analoga dieser Calcitonine mit ähnlicher Wirkung, in den Stellungen 10 bis 31 vorkommen. Unter Derivaten und Analoga dieser Calcitonine sind besonders natürliche Calcitonine, worin ein oder mehrere Aminosäurereste durch einen oder mehrere andere Aminosäurereste oder die S-S-Brücke durch eine Alkylen-Brücke ersetzt sind, oder worin ein oder mehrere Aminosäurereste weggelassen wurden, zu verstehen. Diese Peptidreste Z sind normalerweise aus 22 Aminosäuren zusammengesetzt, können jedoch bei Weglassen eines oder mehrerer Aminosäurereste (des-Aminoacylderivate) auch entsprechend weniger Aminosäurereste enthalten.

Z steht bevorzugt für
a)Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr- Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala
b)Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr
c)Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, worin Z die unter b) oder c) angegebenen Bedeutungen hat, ganz besonders solche, worin Z die Bedeutung c) hat.

R′CO ist vorzugsweise der Acylrest einer aliphatischen, cyclo- aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure,

R′ steht bevorzugt
a′) für gesättigtes oder ungesättigtes, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 17 C-Atomen, besonders für gesättigtes Alkyl mit 3 bis 9 C-Atomen,
b′) für Cycloalkyl mit 5 bis 7 C-Atomen oder für Cycloalkylalkyl, worin die Cycloalkylgruppe 5 bis 7 C-Atome und der Alkylrest 1 oder 2 C-Atome enthält,
c′) für Adamantyl, Adamantylmethyl oder Adamantyläthyl, oder
d′) für Phenyl, Benzyl oder Phenäthyl.

In den oben erwähnten Bedeutungen für R′ können die Alkyl-, Cycloalkyl- oder Phenylreste durch übliche Substituenten substituiert sein, z. B. durch Halogen, NO₂, OH, Alkoxy u. s. w.

Der Rest R′CO kann z. B. der α-Desaminorest einer natürlichen α-Aminosäure sein. Für R′ sind besonders die Bedeutungen a′), b′) und c′) bevorzugt.

Y₁ und Y₂ als sich am α-C-Atom einer α-Aminosäure befindlichen Reste stehen besonders für die am α-C-Atom einer natürlichen α-Aminosäure gebundenen Reste, jedoch kommen auch Reste anderer α-Aminosäuren, z. B. des 3-Cyclohexylalanins oder der α-Aminoisobuttersäure, in Betracht.

Falls n in der Formel I 4 bedeutet, steht,
a) der N-terminale Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem zweiten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Ser, Gly oder Ala
b) der zweite Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem dritten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Asn oder Ser
c) der dritte Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem vierten Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Leu, Asn, Ser, Phe, D-Leu oder den Rest des Cyclohexylalanins
d) der vierte Aminoacylrest (übereinstimmend mit dem fünften Aminosäurerest in der Sequenz der natürlichen Calcitonine) bevorzugt für Ser oder Ala.

Falls n in der Formel I für 3 steht, haben der N-terminale, der zweite und der dritte Aminoacylrest die gleichen bevorzugten Bedeutungen wie oben für den Fall, das n = 4 unter b) bzw. c), bzw. d) angegeben.

Falls n in der Formel I für 2 steht, haben der N-terminale und der zweite Aminoacylrest bevorzugt die gleichen bevorzugten Bedeutungen wie oben für den Fall, dass n = 4 unter c) bzw. d) angegeben.

Falls n in der Formel I für 1 steht, steht der N-terminale Aminoacylrest bevorzugt für Ser oder Ala.

A₆ steht bevorzugt für Thr steht bevorzugt für Cys, ein wie oben für Y₂ angegebenes Derivat des Cysteins oder einen neutralen lipophilen α-Aminoacylrest, besonders für Ala oder einen anderen neutralen lipophilen α-Aminoacylrest, ganz besonders für Ala

A₈ steht bevorzugt für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen α-Aminosäure, besonders für Val oder Gly

A₉ steht ebenfalls bevorzugt für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen α-Aminosäure, besonders für Leu oder Phe

In den Verbindungen der Formel I steht n bevorzugt für 2, wobei R H oder R′CO bedeutet oder ganz besonders steht n für 1 und R für R′CO.

Alle Aminosäurereste haben vorzugsweise die L-Konfiguration.

Eine Gruppe von Verbindungen hat die nachstehende Formel worin X′ für Gly oder Ser wobei der letzte Rest über das endständige S-Atom an der benachbarten CH₂-Gruppe in der Formel Ip gebunden ist
und
Z′ für den aus 24 Aminosäuren zusammengesetzten Polypeptidrest, der sich in den Stellungen 8 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Derivates oder Analogons davon mit Calcitonin-ähnlicher Wirkung befindet,
stehen, wobei alle Aminosäurereste, inklusive diese in den Stellungen 1 und 7, die L-Konfiguration aufweisen.

In dieser Gruppe steht X′ vorzugsweise für Ser, Z′ für Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-
Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr.

Eine zweite Gruppe von Verbindungen entspricht der Formel Iq worin X″ für NH oder eine Bindung, jedoch falls m′ = 0 nur für eine Bindung,
Y₁″ für den am α-C-Atom einer natürlichen Aminosäure befindlichen Rest,
Y₂″ für den am α-C-Atom einer natürlichen α-Aminosäure befindlichen Rest, Y₃′ für Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen,
m′ für 0 oder 1,
n′ für 0 bis 3,
p′ für 3 bis 5, und
Z″ für den aus 24 Aminosäuren zusammengesetzten Polypeptidrest, der sich in den Stellungen 8 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Derivates oder Analogons davon mit Calcitonin-ähnlicher Wirkung befindet,
stehen,
wobei die 1 bis 4 Y₁″-Reste in der Formel I unabhängig voneinander die gleichen oder verschiedenartige Bedeutungen haben können und alle Aminosäuren in der Formel I die L- oder D-Konfiguration haben können.

Bevorzugt sind die Verbindungen der Formel Iq, worin
a) Z″ = Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr- Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala
b) Z″ = Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr
c) Z″ = Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr

In der Formel Iq steht der Rest bevorzugt für worin n″ für 0 bis 2 steht
oder worin n″ für 0 oder 1 steht, und
die Reste Y₁″ bevorzugt für CH₂OH, (CH₃)₂-CH-CH₂ oder CH₂-CONH₂ stehen.

Die Verbindungen der Formel I können als Salze oder Komplexe vorliegen. Als Säureadditionssalze kommen solche mit organischen Säuren, polymeren Säuren oder anorganischen Säuren in Frage. Solche Säureadditionssalze sind z. B. die Hydrochloride und Acetate. Unter Komplexen sind solche Verbindungen zu verstehen, die bei Zusatz anorganischer Salze oder Hydroxide (z. B. Ca- oder Zn-Salze) und/oder beim Zusatz polymerer organischer Stoffe entstehen.

Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der obigen Formel. Sie können nach für die Synthese von Polypeptiden dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden. Beispielsweise können die Polypeptide der obigen Formel hergestellt werden, indem man
a) mindestens eine Schutzgruppe, die in einem geschützten Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Sequenz vorhanden ist, entfernt,
oder
b) zwei Peptideinheiten, von denen jede mindestens eine Aminosäure oder Derivat davon, wie für die Formel I beschriiben, in geschützter oder ungeschützter Form enthält, durch eine Amidbindung miteinander verknüpft, wobei die Peptidbindung in der Weise erfolgen soll, dass die in der Formel I enthaltene Aminosäuresequenz hergestellt wird und anschliessend gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird, oder
c) eine Verbindung der Formel I, worin R für Wasserstoff steht, in geschützter oder ungeschützter Form, mit einer Säure der Formel R′COOH oder einem reaktiven Derivat einer solchen Säure, umsetzt und gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausführt, oder
d) zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin Y₂ für oder CH₂-S-S-CH₂-CH₂-COOH steht, entweder
eine Verbindung der Formel II in geschützter oder ungeschützter Form, umsetzt mit einer Verbindung der Formel III worin R₁ eine Gruppe ist, welche die Ausbildung einer S-S-Brücke mit dem S-Atom der CH₂SH-Gruppe im Polypeptid der Formel II erleichtert,
R₂ Wasserstoff oder eine Amino-Schutgruppe und
R₃ OH oder eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe bedeuten
oder
eine Verbindung der Formel IV in geschützter oder ungeschützter Form, worin R₁ oben erwähnte Bedeutung hat, mit einer Verbindung der Formel V umsetzt
und anschliessend gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird.

Es handelt sich hierbei um in der Peptidchemie an sich bekannte Verfahren. Sie können z. B. analog zu den in den Beispielen beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.

Falls die Herstellung der Ausgangsprodukte nicht spezifisch beschrieben ist, sind diese Verbindungen bekannt oder können nach üblichen Methoden hergestellt und gereinigt werden. Die Endprodukte der Formel I können ebenfalls in üblicher Weise gereinigt werden, so dass sie weniger als 5% Polypeptid- Nebenprodukte enthalten. Die für die Verfahren a) und b) als Ausgangsprodukte verwendeten Polypeptide können ebenfalls auf an sich bekannte Weise in Lösung oder nach dem Solid Phase- Verfahren hergestellt werden.

Die Herstellung von Peptideinheiten, welche als Y₂-Rest eine -CH₂-S-S-CH₂-CH₂-COOH oder CH₂-S-S-CH-CH₂(NH₂)-COOH-Gruppe enthalten, erfolgt analog zu dem oben erwähnten Verfahren d).

Bei diesem Verfahren d) werden Verbindungen der Formel III bzw. IV verwendet, worin R₁ für solche an sich bekannte Reste steht, welche mit Merkaptanen unter Ausbildung einer S-S-Bindung reagieren. R₁ steht besonders für S-Alkyl, -S-COOAlkyl, oder
S-SO₃-. In diesen Resten steht Alkyl besonders für niederes Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen. Die Einführung dieser Reste in die Verbindungen mit freien SH-Gruppen geschieht analog zu in der Schwefelchemie bekannten Methoden.

In den nachfolgenden Beispielen erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden und sind die [α]-Werte unkorrigiert. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: Acm = Acetamidomethyl Boc = tert. Butyloxycarbonyl
Bu^t = tert. Butyl DCM = Dichloromethan
DMF = Dimethylformamid
Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Scm = Methoxycarbonylsulfenyl
Trt = Trityl
Asu = α-Aminosuberinsäure
Cys(Me) = S-Methylcystein

Alle Peptide werden als Polyacetatepolyhydrate erhalten mit einem Peptidgehalt von 70 bis 90%.

Die HPLC-Analyse ergibt, dass die Polypeptide weniger als 5% an anderen Peptiden enthalten.

Der in den nachfolgenden Beispielen angeführte Faktor "F" gibt den Peptidgehalt in den erhaltenen Produkten an (F = 1 kommt mit einem 100%-igen Peptidgehalt überein). Die Differenz zu 100% [(1-F)×100] besteht aus Essigsäure und Wasser.

Beispiel 1 a) Fmoc-Leu-Ser(Bu^t)-Thr(Bu^t)-Cys(SBu^t)-Val-Leu-OCH₂- phenyl-(p)OCH₂-co(polystyrol-1%-divinylbenzol)

1 g p-Hydroxymethyl-phenoxymethyl-co(polystyrol-1%-dinylbenzol) wird in Dimethylformamid/Methylenchlorid 1 : 4 (v/v) quellengelassen, abgenutscht und mit einer Lösung von 0,74 g Fmoc-Leucin und 0,19 g 1-Hydroxybenzotriazol in 5 ml des oben erwähnten Lösungsmittelgemisches versetzt. Unter Rühren werden noch 0,43 g Dicyclohexylcarbodiimid und 85 mg 4-Dimethylaminopyridin, je in 5 ml desselben Lösungsmittelgemisches hinzugefügt. Man rührt 16 Stunden bei 20°, nutscht ab und wäscht mit dem Lösungsmittelgemisch, dann mit Dimethylformamid. Man erhält Fmoc-Leu-OCH₂-phenyl-(p)-OCH₂- co(polystyrol-1%-divinylbenzol). Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe durch Behandlung (10 Minuten) mit Piperidin/Dimethylformamid (1 : 4, v/v), Waschen mit Dimethylformamid, gibt man nacheinander die folgenden Reagenzien zu, je in 5 ml Dimethylformamid: 0,71 g Fmoc-Valin, 0,28 g 1-Hydroxybenzotriazol und 0,32 ml Diisopropylcarbodiimid und rührt 3/4 Stunden. Dieselben Reaktionen (Abspaltung der Fmoc-Gruppe, Kupplung der nächsten Fmoc-Aminosäure) werden in der Reihenfolge: Fmoc-Cys(SBu^t)-OH (0,9 g), Fmoc-Thr(Bu^t)- OH (0,83 g), Fmoc-Ser(Bu^t)-OH (0,8 g) und Fmoc-Leu-OH (0,74 g) durchgeführt. Nach jeder Kupplung wird mit einem Ninhydrin-Test kontrolliert, dass die Kupplung vollständig war.
Man erhält die Titelverbindung.

b) Fmoc-Leu-Ser-Thr-Cys(SBu^t)-Val-Leu-OH

1,2 g Fmoc-Leu-Ser(Bu^t)-Thr(Bu^t)-Cys(SBu^t)-Val-Leu-OCH₂- phenyl-OCH₂-co(polystyrol-1%-divinylbenzol) (ca. 0,4 mmol Peptid/g) werden in 10 ml Trifluoressigsäure (Methylenchlorid 1 : 1 (v/v) 1 Stunde gerührt. Man filtriert, wäscht mit Trifluoressigsäure/ Methylenchlorid 1 : 1, dann mit Methylenchlorid, engt im Vakuum ein und fällt mit 25 ml Aether. Der Niederschlag wird mit Aether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält die Titelverbindung.

c) Fmoc-Leu-Ser-Thr-Cys(SBu^t)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser- Gln-Glu(OBu^t)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

Man löst 1,0 g des Endproduktes der Stufe b in 15 ml Dimethylformamid, gibt 2,3 g H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBu^t)-Leu- His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH₂, 0,33 g 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin und 0,31 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt 16 Stunden bei 25°. Man filtriert, dampft das Filtrat zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform, Aceton und erhält die Titelverbindung.

d) H-Leu-Ser-Thr-Cys(SBu^t)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu (OBu^t)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-Ser- Gly-Thr-Pro-NH₂, acetat

0,8 g des geschützten Peptids der Stufe c) werden in 8 ml Piperidin/ Dimethylformamid 1 : 4 (v/v) gelöst und während 10 Minuten gerührt. Nach Abdampfen im Hochvacuum bei 25° wird der Rückstand in 4 ml Dimethylformamid gelöst. Man gibt 50 µl Eisessig zu und giesst die Lösung in 80 ml Aether. Das ausgefallene Produkt wird abgenutscht, mit Aether gewaschen und im Vacuum bei 20° getrocknet. Man erhält die Titelverbindung.

e) H-Leu-Ser-Thr-Cys(H)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBu^t)- Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH₂-acetat

0,46 g des Peptids der Stufe d) werden in 2,5 ml Trifluoraethanol gelöst und unter Argon mit 0,69 ml Tributylphosphin versetzt. Man rührt 30 Minuten bei 20°, giesst, immer unter Argon, in 50 ml Aethylacetat, zentrifugiert. Der Niederschlag wird im Aethylacetat aufgeschlämmt und nochmals zentrifugiert. Der feuchte Rückstand (Titelverbindung) wird sofort bei der nächsten Reaktion eingesetzt.

f) Boc-Cys(Scm)-OH, Dicyclohexylammonium-Salz

Eine auf -5 abgekühlte Lösung von 1,39gg Boc-Cys(Trt)-OH inee15 ml Chloroform/Methanol 2 : 1 (v/v) wird mit 0,5 ml Methoxycarbonylsulfenylchlorid und 0,31 ml Diaethylamin versetzt und 1 Stunde bei derselben Temperatur gerührt. Man gibt noch 0,33 ml Diathylamin zu und rührt weitere 5 Minuten bei 0°, verdünnt mit 50 ml Chloroform, wäscht mit 10%iger Phosphorsäure, Wasser und trocknet über Magnesiumsulfat. Nach Eindampfen des Lösungsmittel wird das gelbe Oel in 3 ml Aether gelöst und mit 0,6 ml Dicyclohexylamin bei +4° versetzt. Die kristallinische Masse wird abgenutscht, mit Aether gewaschen und am Hochvakuum bei 30° getrocknet. Man erhält die Titelverbindung.
Smp. 142-143°C. [α] = -31 (c = 1 in Dimethylformamid).aa

Unter Argon wird das Peptid der Stufe e) in 6 ml Trifluoraethanol gelöst und mit einer Lösung von 0,16 g Boc/Cys(Scm)-OH.dicyclo- hexylammonium-Salz in 65 ml Trifluoraethanol versetzt. Man rührt 2 Stunden unter Argon, engt im Vacuum auf ca. 7 ml und giesst in 50 ml Aether. Der Niederschlag wird abgenutscht, mit Aether gewaschen und im Vacuum bei 25° getrocknet.
Man erhält die Titelverbindung.

Man löst 3,0 g des geschützten Peptids der Stufe g) unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 20° stehen und dampft zur Trockene ein.

Das Produkt wird durch "reversed-phase" Chromatographie (Gradient von Acetonitril in Wasser/Trifluoressigsäure) gereinigt. Die die erwartete Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Man filtriert über einem basischen Ionenaustauscher in der Acetat-Form und lyophilisiert das Filtrat. Man erhält die Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat.[α] = -42 (in 95% Essigsäure, c = 0,3) F = 0,86aa

Beispiel 2 a) Boc-Cys(Acm)-Val-Leu-OMe

Man löst 28,1 g HCl.H-Val-Leu-OMe, 29,2 g Boc-Cys(Acm)-OH, 13,6 g 1-Hydroxybenzotriazol in 200 ml Methylenchlorid, kühlt auf 5°, gibt 21,0 g Dicyclohexylcarbodiimid und 10,1 ml N-Methylmorpholin zu und rührt 2 Stunden, indem man die Temperatur auf 20° steigen lässt. Nach Filtration vom Unlöslichen wird das Filtrat zur Trockene abgedampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit 10%iger Phosphorsäure, Wasser, 1N NaHCO₃ und Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Abdampfen des Filtrats erhält man die Titelverbindung.

b) H-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH

Man löst 20,8 g Boc-Cys(Acm)-Val-Leu-OMe in 120 ml Trifluoressigsäure. Nach 40 Minuten wird zur Trockene abgedampft, der Rückstand in Methanol gelöst und die Lösung über einen schwach basischen Ionenaustauscherharz filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene abgedampft. Der Rückstand wird in Tetrahydrofuran gelöst, mit 8,8 g Boc-Thr-OH und 5,4 g 1-Hydroxybenzotriazol und nach Abkühlen auf 0° mit 8,4 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Man rührt 2 Stunden bei 20°, filtriert vom Unlöslichen, dampft zur Trockene ab, löst den Rückstand in Essigester, wäscht mit 10%iger Phosphorsäure, Wasser, 1N NaHCO₃ und Wasser, trocknet über Na₂SO₄ und dampft ab. Das Produkt, gelöst in 150 ml Trifluoressigsäure, wird 40 Minuten stehen gelassen, das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, der Rückstand in Aether zerrieben, dann getrocknet. Das Produkt wird in 200 ml Methanol gelöst und mit 45 ml 1N Natronlauge behandelt. Nach einer Stunde werden 100 ml Wasser zugegeben, der Methanol im Vakuum entfernt, und die wässrige Lösung über einen schwach sauren Ionenaustauscher filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene abgedampft.

c) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH₂

Man löst 17 g Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe in 200 ml Hydrazinhydrat, rührt 2 Stunden bei 20°, dampft zur Trockene im Hochvakuum bei 25° ab, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, trocknet und erhält die Titelverbindung.

d) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-OH

Man löst 13,6 g Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH₂ in 150 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20,, gibt 40mml einer wasserfreien Lösung von HCl (2N)eein Dioxan zu, gefolgt von 3,6 ml tert.-Butylnitrit. Nach 10 Minuten bei -20 gibt man noch 16mml Triaethylamin und 13,0gg H-Thr-Cys(Acm)-ooVal-Leu-OH zu und rührt 16 Stunden bei 25°. Man filtriert vom Unlöslichen ab, dampft das Filtrat zur Trockene ein, suspendiert wiederholt in 1N Essigsäure und in Wasser, filtriert das Produkt ab, trocknet im Vakuum und erhält die Titelverbindung.

e) Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser- Gln-Glu(OBu^t)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn- Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

Man löst 1,0 g des Endproduktes der Stufe d) in 15 ml Dimethylformamid, gibt 2,3 g H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBu^t)-Leu- His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH₂, 0,33 g 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin und 0,31 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt 16 Stunden bei 25°. Man filtriert, dampft das Filtrat zur Trockene ein, wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform, Aceton und erhält die Titelverbindung.

Die Endverbindung der Stufe e) wird in 100 ml Chloroform/Methanol 1 : 1 gelöst. Bei 0° gibt man 0,18 ml Methoxycarbonylsulfenylchlorid zu und rührt 1 1/2 Stunde bei dieser Temperatur. Dann gibt man 0,20 ml Diäthylamin zu. Nach 5 Minuten bei 0° fügt man 0,3 Boc-Cystein hinzu und rührt noch 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Lösung wird eingeengt, und das Produkt mit Diäthyläther ausgefällt, abgenutscht und getrocknet. Man erhält die Titelverbindung, die bei der nächsten Reaktion eingesetzt wird.

Man löst 3,0 g des geschützten Peptids der Stufe f) unter Stickstoffatmosphäre in 100 ml Trifluoressigsäure, lässt 15 Minuten bei 20° stehen und dampft zur Trockene ein.

Das Produkt wird durch "reversed-phase" Chromatographie (Gradient von Acetonitril in Wasser/Trifluoressigsäure) gereinigt. Die die erwartete Substanz enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Man filtriert über einem basischen Ionenaustauscher in der Acetat-Form und lyophilisiert das Filtrat. Man erhält die Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat.
[α] = -62 (in 50% Essigsäure, c = 0,19) F = 0,80.aa

Beispiel 3: N^a-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln- Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ a) N^α-Isocaproyl-Ser(Bu^t)-Thr(Bu^t)-Ala-Val-Leu-OCH₂- phenyl-(p)OCH₂-co-(polystyrol-1%-divinylbenzol)

Von Fmoc-Leu-OCH₂-phenyl-(p)OCH₂-co(polystyrol-1%-divinylbenzol) (1,56 g entsprechend 0,7 mMol) spaltet man die N^α-Fmoc-Gruppe ab durch Behandeln mit Piperidin (20% v/v) in DMF während 10 Minuten. Man wäscht gut mit DMF und fügt dazu, in je 5 ml DMF gelöst, 0,71 g Fmoc-Val-OH, 0,28 g 1-Hydroxybenzotriazol und 0,32 ml Diisopropyl- carbodiimid. Nach 45 Minuten nutscht man ab und wäscht das Peptidharz gut mit DMF. Man wiederholt die Abspaltung der N^α-Fmoc-Gruppe und die Ankupplung mit der in der Sequenz folgenden Aminosäure in der Reihenfolge:
Fmoc-Ala-OH (0,65 g) Fmoc-Thr(Bu^t)-OH (0,83 g) und Fmoc-Ser(Bu^t)- OH (0,80 g). Im letzten Reaktionszyklus (Abspalten der Fmoc-Schutzgruppe, Acylierung mit geschützter Aminosäure) ersetzt man das Aminosäurederivat durch Isocapronsäure (0,41 g), erhöht die Mengen von 1-Hydroxybenzotriazol auf 0,53 g und von Diisopropylcarbodiimid auf 0,54 g und kuppelt während 15 Stunden. Man wäscht das geschützte Peptidharz gut mit DMF und Methylenchlorid, trocknet im Vakuum bei 40°C während 15 Stunden und erhält das geschützte Peptidharz als farbloses Pulver.

b) N^α-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH

N^α-Isocaproyl-Ser(Bu^t)-Thr(Bu^t)-Ala-Val-Leu-OCH₂-phenyl- (p)OCH₂-co (polystyrol-1%-divinylbenzol) (1,0 g) rührt man in einem Gemisch von Trifluoressigsäure (5 ml) und Methylenchlorid (5 ml). Man filtriert, wäscht mit demselben Gemisch (5 ml), dann mit Methylenchlorid, engt im Vakuum stark ein und fällt durch Zugabe von Aether vollständig aus. Man wäscht den Niederschlag gut mit Aether, trocknet im Vakuum über festem Kaliumhydroxid und erhält die Titelverbindung als farbloses, amorphes Pulver.

c) N^α-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu (OBu^t)-Leu-His-Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH₂

Zu einer Lösung von N^α-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH(0,165 g) in DMF (7 ml) fügt man H-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser-Gln-Glu(OBu^t)-Leu-His- Lys(Boc)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ hydrochlorid (0,59 g), 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (0,017 g), Dicyclohexylcarbodiimid (0,065 g) und soviel N-Aethyl- N,N-diisopropylamin, bis eine Probe des Reaktionsgemisches auf angefeuchtetem pH-Papier eine Reaktion von pH ca. 6 anzeigt. Nach 16 Stunden fällt man durch Zugabe von Aether aus, trocknet und erhält die Titelverbindung.

d) N^α-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln- Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly- Thr-Pro-NH₂

Man löst 0,50 g des teilgeschützten Peptids der Stufe c) in einem Gemisch von Trifluoressigsäure (50% v/v) und Methylenchlorid. Nach 1 Stunde gibt man dazu 50 ml Aether, welcher 0,6 mMol HCl enthält. Man filtriert, wäscht mit Aether und trocknet im Vakuum. Das Produkt wird durch "reversed-phase"-Chromatographie in einem Gradient Acetonitril in H₃PO₄ (2%) gereinigt. Die die reine Substanz enthaltenden, vereinigten Fraktionen filtriert man über einen basischen Ionenaustauscher in der Acetat-Form. Man lyophilisiert und erhält die Titelverbindung als Polyacetat, Polyhydrat.
[α] = -32,2 (c = 0,3 in AcOH 95%) F = 0,87aa

Analog zu den Beispielen 1, 2 und 3 wurden die nachfolgenden Verbindungen hergestellt.

a) der Formel

A-Leu-Ser-Thr-A₇-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu- Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-Ser-Gly-Thr-ProNH₂

b) der Formel

A-Thr-A₇-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu- Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-Ser-Gly-Thr-ProNH₂

c) der Formel

H-Leu-Ser-A₆-Ala-A₈-A₉-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu- Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr- Gly-Ser-Gly-Thr-ProNH₂

Beispiel 43:

Analog zum Beispiel 2 wurde die Titelverbindung hergestellt.
[α] = -44° (c = 0,11 in AcOH 95%) F = 0,75

Beispiel 44: N^α-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser- Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly- Ala-Gly-Thr-Pro-NH₂

Dieses Peptid wird stufenweise auf einem Polystyrolharz als Träger aufgebaut. Die Boc-Gruppe wird als Schutzgruppe für die α-Aminogruppen verwendet und die funktionellen Gruppen in den Seitenketten wie folgt geschützt: Lys(2-Chlorbenzyloxycarbonyl), Ser (Benzyl), Thr (Benzyl), Arg (Tosyl), His (Tosyl), Tyr (4-Chlorbenzyloxycarbonyl), Lys (4-Methylbenzyl), Glu (Benzyl).

Amino-4-methylphenyl-methyl-co(polystyrol-divinylbenzol)-harz (0,7 mmol/g) werden dem nachfolgenden Behandlungszyklus, Stufen 1 bis 7, unterworfen:
1) DCM
2) Trifluoressigsäure (50%) in DCM
3) DCM
4) Diisopropyläthylamin (10%) in DMF
5) DMF
6) vorher hergestelltes symmetrisches Anhydrid (2,8 mmol per g Ausgangsharz) einer Boc-Aminosäure in DMF
7) DMF

Die Volumen der Waschlösungen und Reagenzien betragen 5 bis 20 ml pro Gramm des Ausgangsharzes. Jede Stufe wird so oft wiederholt als notwendig ist, entweder für die vollständige Reaktion des Harzes (Stufen 2, 4, 6) oder für die vollständige Entfernung des vorhergehenden Reagenzes vom Harz (Stufen 1, 3, 5, 7). Nach jedem Zyklus werden Proben des Harzes genommen und auf Vollständigkeit der Reaktion mittels des Ninhydrintestes geprüft.

Die symmetrischen Anhydride der Boc-Aminosäuren werden gerade vor Verwendung hergestellt durch Reaktion der Boc-Aminosäure (2,8 mmol pro g Harz) und DCCI (1,4 mmol pro g Harz) in DCM, welches soviel DMF enthält als notwendig ist für die vollständige Auflösung der Boc-Aminosäure. Das Gemisch wird filtriert, weiteres DMF dem Filtrat zugegeben, das Volumen durch Verdampfen des DCM bei einer Temperatur nicht höher als 15°C verringert und die erhaltene Lösung in der Stufe 6) verwendet.

Der Zyklus der Reaktionen 1) bis 7) wird für alle Aminosäurereste in der Weise wiederholt, dass die Aminosäuresequenz der Formel I erhalten wird, wobei jedoch Boc-Gln-OH und Boc-Arg(Tos)-OH in der Stufe 6) als vorher hergestellte Ester mit 1-Hydroxybenzotriazol in DMF eingesetzt werden.

Im letzten Zyklus, in der Stufe 6), werden Isocapronsäure, Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol (für alle 3,5 mmol pro g des Ausgangsharzes) in DMF dem Harz zugegeben. Nach 15 Stunden wird das Harz gewaschen mit DMF und DCM getrocknet. Zu dem Peptidharz (1 g) gibt man p-Kresol (1 g), Dimethylsulfid (1 ml) und HF (10 ml). Nach einer Stunde bei 0°C werden die flüchtigen Bestandteile bei 0°C abdestilliert. Der Rückstand wird mit Aethylacetat gewaschen, mit mehreren Portionen Essigsäure (10%) in Wasser extrahiert und der wässrige Extrakt lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt wird gereinigte durch "reversed-phase" Chromatographie auf einer Octadecyl-Silicasäule, welche mit einem Gradient von Acetonitril in Phosphorsäure (2%) eluiert wird. Fraktionen, welche die Verbindung in reiner Form enthalten, werden zusammengefügt, durch ein schwach basisches Ionenaustauscherarz in Acetatform filtriert, lyophilisiert und getrocknet. Die Titelverbindung wird als weisses, flockiges Pulver erhalten.
[α] = -34 (c = 0,53 in AcOH 95%). F = 0,93).aa

Die Polypeptidderivate der Formel I und die physiologisch verträglichen Säureadditionssalze bzw. Komplexe dieser Verbindungen weisen im Tierversuch interessante pharmakodynamische Eigenschaften auf. Sie können daher als Arzneimittel verwendet werden. Insbesondere senken sie den Calciumplasmaspiegel und bewirken als Antagonisten des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen. Die hypocalcämische Wirkung der neuen Verbindungen kann in bekannter Weise z. B. gemäss der Methode von M. Azria et al., berichtet beim Calcitonin 1984 Symposium, 24. Oktober, Mailand, und publiziert als "Short Communication" in der "Current Clinical Practice Series" Nr. 42, Excerpta Medica 1986, p. 104, gemessen werden. Bei dieser Methode wird eine Ca²⁺-ion selektive Elektrode verwendet, um kontinuierlich das Gehalt an Calcium-ionen im Blut junger Kaninchen zu messen. Die Verbindungen werden i. v. verabreicht in einer Dosis von 0,1 bis 10 µg/kg, z. B. übereinstimmend mit ca. 1 internationaler Einheit pro kg. Die Messungen werden während 5 Stunden durchgeführt und die "area under the curve" berechnet.

Die Verbindungen können auch in anderen Tests, z. B. im hypocalcämischen Standardtest von M. Kumar et al., J. Endocrinology (1965], 33, p. 469, bei Ratten und in gleicher Dosierung geprüft werden. Eine hypocalcämische Aktivität von 300 bis 6000 internationalen Einheiten pro mg wird in diesem Test für die erfindungsgemäßen Verbindungen gemessen.

Bevorzugt sind die Verbindungen der Beispiele 3, 29 und 36.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind somit indiziert bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des Plasmacalciumspiegels bzw. Beeinflussung des Knochenstoffwechsels erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien infolge Mangels des endogenen Thyreocylcitonins durch Ausfall von Schilddrüsengewebe oder Hyperfunktion der Nebenschilddrüsen. Sie sind ferner indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder Inaktivität, bei malignen Erkrankungen u. s. w.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis- und renal bedingte Osteodystrophie, bei Schmerzen, z. B. Knochenschmerzen zusammenhängend mit Osteoporose, neurodystropischen Krankheiten, Krankheit von Paget, sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw. Phosphat.

Die erfindungsgemässen Verbindungen hemmen auch die Pankreassekretion. Diese Hemmung kann in Tierversuchen z. B. mit der Methode beschrieben in Scand. J. Gastroint 6, 423 (1975) durch S. J. Konturek et al. nachgewiesen werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher z. B. auch bei akuter Pankreatitis und gastro-intestinalen Störungen, wie Geschwüren, Verwendung finden.

Für die oben erwähnten Verwendungen beträgt die Tagesdosis etwa 5 bis 1500 internationale Einheiten, die als Einheitsdosis einmal pro Tag oder gewünschtenfalls jeden zweiten oder dritten Tag in Tagesdosen von ca. 5 bis ca. 1500 internationalen Einheiten verabreicht werden können.

Einer anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verbindungen der Formel I in freier Form oder als pharmazeutisch geeignete Salze oder Komplexe zur Verwendung als hypocalcämische Wirkstoffe, zur Behandlung der Krankheit von Paget, der Osteoporose, zur Behandlung von hiermit verbundenen Knochenschmerzen, von neurodystropischen Störungen oder Pankreatitis.

Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Präparate, welche die erfindungsgemässen Verbindungen enthalten. Diese enthalten die genannten Verbindungen oder ihre pharmakologisch aktzeptablen Salze oder Komplexe z. B. in Mischung mit einem flüssigen oder festen Trägermaterial. Diese Präparate können auf übliche Weise hergestellt werden und sollen z. B. für Injektion oder nasale Verabreichung geeignet sein. Es können auch Depotpräparate verwendet werden.

Claims

1. Neue Polypeptide der Formel I worin R für H oder R′CO
R′CO für den Acylrest einer Carbonsäure,
Y₁ für den am α-C-Atom einer α-Aminosäure befindlichen Rest,
Y₂ für den am α-C-Atom einer α-Aminosäure befindlichen Rest, Y₃ für Alkyl mit 1 bis 4 C-Atomen, gegebenenfalls durch Methyl oder Methoxy substituiertes Benzyl oder CH₃CONH-CH₂-,
n für 1 bis 4
A₆ für Thr oder D-Thr
p für 3 bis 5
A₈ für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L-α-Aminosäure
A₉ für den Aminoacylrest einer neutralen, lipophilen L- oder D-α-Aminosäure, und
Z für den Polypeptidrest, der sich in den Stellungen 10 bis 31 eines natürlichen Calcitonins oder eines Derivates oder Analogons davon mit hypocalcämischer Wirkung befindet,
stehen,
wobei die 1 bis 4 Y₁-Reste in der Formel I unabhängig voneinander die gleichen oder verschiedenartige Bedeutungen haben können und mit Ausnahme des Aminoacylrestes A₈ alle Aminosäurereste in der Formel I die L- oder D-Konfiguration haben können, mit der Massgabe, dass falls Y₂ für CH₂SH steht und n 4 bedeutet, der N-terminale Aminoacylrest nicht H-Cys sein darf, sowie die Salze und Komplexe dieser Verbindungen.

2. Verbindungen der Formel I gemäss Anspruch 1, worin Z für
Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-
Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr
steht.

3. Verbindungen der Formel I gemäss Anspruch 1 oder 2, worin -NH-CH(Y₂)-CO für den Rest einer neutralen lipophilen α-Aminosäure steht.

4. Verbindungen der Formel I gemäss einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin n für 2 und R für H oder R′CO stehen.

5. Verbindungen der Formel I gemäss einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin n für 1 und R für R′CO stehen.

6. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel
N^α-Isocaproyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-
Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂.

7. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel
Adamentanacetyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-
Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂.

8. Eine Verbindung gemäss Anspruch 1 der Formel
Cyclohexylpropionyl-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-
Glu-Leu-His-Hys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-
Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂.

9. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) mindestens eine Schutzgruppe, die in einem geschützten Polypeptid mit der in Formel I angegebenen Sequenz vorhanden ist, entfernt,
oder
b) zwei Peptideinheiten, von denen jede mindestens eine Aminosäure oder Derivat davon, wie für die Formel I beschrieben, in geschützter oder ungeschützter Form enthält, durch eine Amidbindung miteinander verknüpft, wobei die Peptidbindung in der Weise erfolgen soll, dass die in der Formel I enthaltene Aminosäuresequenz hergestellt wird und anschließend gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird, oder
c) eine Verbindung der Formel I, worin R für Wasserstoff steht, in geschützter oder ungeschützter Form, mit einer Säure der Formel R′COOH oder einem reaktiven Derivat einer solchen Säure, umsetzt und gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausführt, oder
d) zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin Y₂ für steht, entweder eine Verbindung der Formel II in geschützter oder ungeschützter Form, umsetzt mit einer Verbindung der Formel III worin R₁ eine Gruppe ist, welche die Ausbildung einer S-S-Brücke mit dem S-Atom der CH₂SH-Gruppe im Polypeptid der Formel II erleichtert,
R₂ Wasserstoff oder eine Amino-Schutgruppe und
R₃ OH oder eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe bedeuten
oder
eine Verbindung der Formel IV in geschützter oder ungeschützter Form, worin R₁ oben erwähnte Bedeutung hat, mit einer Verbindung der Formel V umsetzt
und anschliessend gegebenenfalls die Verfahrensstufe a) ausgeführt wird.
und gewünschtenfalls die so erhaltenen Polypeptide in ihre freie Form, in ihre Salze oder Komplexe überführt.

10. Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 in freier Form oder als pharmakologisch verträgliche Salze oder Komplexe zur Verwendung als hypocalcämische Wirkstoffe oder zur Behandlung der Krankheit von Paget, der Osteoporose, von hiermit verbundenen Schmerzen, von neurodystropischen Störungen, Pankreatitis oder gastro-intestinalen Erkrankungen.

11. Pharmazeutische Präparate, welche eine Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8 in freier Form oder als pharmakologisch verträgliches Salz oder Komplex, zusammen mit einem flüssigen oder festen Träger, enthalten.