DK156957B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af crf eller crf-analoge peptidforbindelser og peptidmellemprodukter til gennemfoerelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 156957 B

Den fore!iggende opfindelse angâr en analogifremgangsmâde til fremsti11ing af hidtil ukendte CRF eller CRF-analoge peptid-forbindelser samt peptidmellemprodukter til brug som udgangs-materiale ved fremgangsmâden.

5

Eksperimentelle og kliniske iagttagelser har underst0ttet den opfattelse, at hypothalamus spiller en afg0rende rol-le med hensyn til reguleringen af adenohypofysielle cortico= trope cellers sekretionsfunktioner. For mere end 25 âr siden 10 demonstrerede Guillemin, Rosenberg og Saffran og Schally uafhængigt af hinanden tilstedeværelsen af faktorer i hypo= thalamus, som ville for0ge omfanget af ACTH-sekretion fra hypofysekirtlen, der er inkuberet in vitro eller opbevares i en organkultur. Ingen af de indtil dato karakteriserede sekretagoger opfylder de kriterier, der forventes af en fysiologisk corticotropinfrig0rende faktor, CRF. F0lgelig har rensning af en stor CRF været fors0gt. Udgangsmateriale for rensningen var en tidlig sidefraktion af de 490.000 hy= pothalame fragmenter fra fâr, der oprindeligt blev ekstra-

OQ

heret pa laboratoriet for neuroendocrinologi ved The Salk Institute, sâledes som beskrevet af Burgus et al. i Hypo= thalamus and Endocringe Functions (F. Labrie et al. eds.)

Plénum, New York, 1976, side 355. Ingen af de tidligere rensningsfors0g syntes at hâve f0rt til denne CRF med h0j 25 molekylvægt i en renhed pâ mere end ca. 1%

Sauvagin er et amideret generelt lignende 40-rest peptid, som blev isoleret fra huden af den sydamerikanske fr0 Phyllomedusa sauvagei, og det blev karakteriseret af ο Π

Erspamer et al. og blev beskrevet i Regulatory Peptides,

Vol. 2 (1981), side 1-13.

Sauvagin har formlen: 3 5 pGlu-Gly-Pro-Pro-Ile-Ser-Ile-Asp-Leu-Ser-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Lys-Met-Ile-Glu-Ile-Glu-Lys-Gln-Glu-Lys-Glu-Lys-Gln-Gln-Ala-Ala-Asn-Asn-Arg-Leu-Leu-Leu-Asp-Thr-Ile-NH2.

2

DK 156957 B

Sauvagin er blevet omtalt som havende en biologisk virkning i henseende til sænkning af blodtrykket hos pattedyr og til sti-mulering af sekretionen af ACTH og β-endorphin.

5 Det har nu vist sig muligt at syntetisere den i henseende til virkning og struktur lignende forbindelse CRF og dermed analo-ge forbindelser.

CRF er nu blevet isoleret, renset og karakteriseret som 10 værende et hentetracontapeptid med formlen: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-

Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-

Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NE^.

15

Det kan alternativt omtales som amunin. Syntesen af 41-rest-peptidet er blevet fuldf0rt, og sâvel det isolerede CRF som det syntetiske CRF har vist sig at stimulere ACTH-og β-endorphin-aktiviteter in vitro og in vivo. Syntetisk CRF 20 har vist sig i væsentlig grad at sænke blodtrykket i et udstrakt tidsrum. Som résultat heraf er CRF blevet gjort tilgængeligt i hovedsagelig ren form (dvs. i det væsentlige uden indhold af tilbageblivende mængder af en râ, biologisk ekstrakt eller af beslægtede syntetiske kopier), og en ren-25 hed pâ mindst ca. 93% eller h0jere er praktisk opnâelig og anvendelig til klinisk afpr0vning.

Med 41-rest-peptidet CRF analoge forbindelser, der har den nedenfor anf0rte formlen, har i det mindste hovedsageligt 30 den samme biologiske aktivitet:

Rj-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-R^-Leu-Leu-Arg-G1u-Val -Leu-G1u-R2i-Thr-Lys-A1a-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-G1n-Ala-R32-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-AIa-NH2 » hvori Rx er Ser-Gln-Glu 35 eller Ac, R13 er His eller Tyr, R21 er Met, Ile eller Nie, og R32 er His eller Tyr.

DK 156957 B

3 CRF er blevet isoleret fra fârs hypothalame ekstrakter, renset og karakteriseret, Den benyttede nomenklatur til definering af peptiderne er den, sorti er angivet af Schroder & Lubke, "The Peptides", Academie Press (1965), hvori 5 aminogruppen i overensstemmelse med konventionel fremstil- ling forekommer til venstre, og carboxylgruppen forekom-mer til h0jre. Nâr aminosyreresten har isomere former, er det L-formen af aminosyren, der er taie om, med mindre andet direkte er anf0rt.

10 CRF og CRF-analoge forbindelser fresmtillet ifelge opfindelser angives med folgende formel: R1-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-R13-Leu-Leu-Arg-Glu-Va' -Leu-Glu-R2i-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-R32-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2, hvori Rj er Ser-Gln-Gli 15 eller Ac, Rj3 er His eller Tyr, R21 er Met, Ile eller Nie, o< R32 er His eller Tyr.

Fremgangsmâden ifolge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anferte.

20

Opfindelsen angàr endvidere peptidmellemprodukter med formlen:

Xl-Ser(X2)-Gln(X4)-Glu(X5)-Pro-Pro-Ile-Ser(X2)-Leu-Asp(X5)-Leu-Thr(X2)-Phe-R13(X8)-Leu-Leu-Arg(X3)-Glu(X5)-Val-Leu-Glu-25 (X5)-R2i-Thr(X2)-Lys(X6)-Ala-Asp(X5)-GTn(X4)-Leu-Ala-Gln(X4)-Gln(X4)-Ala-R32(Xe)-Ser(X2)-Asn(X4)-Arg(x3)-LyS(xS)-Leu-Leu-Asp(X5)-Ile-Ala-(X7 ), son) er ejendommel ige ved, at X* er hy-drogen eller βη α-aminobeskyttelsesgruppe, X2 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for den alkoholiske hydroxylgruppe i 30 en Ser- eller Thr-rest, X3 er hydrogen eller en beskyttelses- 4

DK 156957 B

gruppe for guanidinogruppen i Arg, er hydrogen eller en be-skyttelsesgruppe for amidogruppen i Gin eller Asn, X5 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for carboxylgruppen i Asp eller Glu, X6 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for si-5 dekædeaminogruppen i Lys, X7 er valgt blandt NH2, -NH-BHA-harpiksbærer og -NH-MBHA-harpiksbærer, og X8 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for imidazolnitrogenet i His eller for den phénoliske hydroxylgruppe i Tyr, forudsat at ikke aile symbolerne X1 til X8 stâr for hydrogen eller NH2· 10

De α-aminobeskyttelsesgrupper, der kommer i betragtning som χΐ, er de, der vides at være anvendelige inden for den kendte trinsvise syntese af polypeptider. Til klasserne af a-aminobe-skyttelsesgrupper, der dækkes af χΐ, herer (1) beskyttelses-15 grupper af acyltypen, sâsom formyl, acrylyl(Acr), benzoyl(Bz) og acetyl(Ac), der fortrinsvis kun anvendes ved N-afslutnin-gen; (2) beskyttelsesgrupper af den aromatiske urethantype, sâsom benzyloxycarbonyl (Z) og substitueret Z, sâsom N-chlor-benzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, p-brombenzyloxy-20 carbonyl og p-methoxybenzyloxycarbonyl; (3) alifatiske ure- thanbeskyttelsesgrupper, sâsom t-butyloxycarbonyl (BOC), di-isopropylmethoxycarbonyl, isopropyloxycarbony, ethoxycarbonyl og allyloxycarbonyl; (4) beskyttelsesgrupper af cykloalkyl- urethantypen, sâsom cyklopentyloxycarbonyl, adamantyloxycar-25 bonyl og cyklohexyloxycarbonyl; og (5) beskyttelsesgrupper af thiourethantypen, sâsom phenylthiocarbonyl. Den foretrukne a-aminobeskyttelsesgruppe er BOC.

X2 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for hydroxy1gruppen 30 i Thr og Ser og er fortrinsvis valgt blandt acetyl(Ac), ben-zoyl(Bz), tert.-butyl, triphenylmethyl (trityl), tetrahydropy-ranyl, benzylether (Bzl) og 2,6-dichlorbenzyl (DCB). Den mest foretrukne beskyttelsesgruppe er Bzl. X2 kan være hydrogen, hvilket betyder, at der ikke findes nogen beskyttelsesgruppe 35 pâ hydroxyIgruppen.

X3 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for guanidinogruppen i Arg og er fortrinsvis valgt blandt nitro, p-toluensulfo- 5

DK 156957 B

nyl (Tos), Z, admantoloxycarbonyl og BOC eller er hydrogen.

Tos er den mest foretrukne.

4 X er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for amidogrup-5 pen i Asn eller Gin og er fortrinsvis xanthyl(Xan).

5 X er hydrogen eller en esterdannende beskyttelsesgruppe for β- eller α-carboxylgruppen i Asp eller Glu og er fortrinsvis valgt blandt benzyl, 2,6-dichlorbenzyl, methyl, 10 ethyl og t-butylester. OBzl er den mest foretrukne.

g X er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for Lys"s side-kædeaminosubstituent. Eksempler pâ passende sidekædeamino= beskyttelsesgrupper er Z, 2-chlorbenzyloxycarbonyl(2-Cl-15 Z), Tos, t-amyloxycarbonyl(Aoc), BOC og aromatiske eller alifatiske beskyttelsesgrupper af urethantypen soin oven-for anf0rt.

Nâr Met er til stede, kan svovlatomet om 0nsket beskyttes 20 med oxygen. Nâr His er til stede, kan imidazolnitrogenet beskyttes med Tos eller 2,4-dinitrophenyl(DNP). Nâr Tyr er til stede, kan hydroxylgruppen beskyttes med DCB.

Valget af en sidekædeaminobeskyttelsesgruppe er ikke kri-25 tisk, men den skal være en sâdan, som ikke fjernes under afbeskyttelse af α-aminogrupperne under syntesen. a-amino= beskyttelsesgruppen og sidekædeaminobeskyttelsesgruppen kan derfor ikke være den samme.

30 X7 vælges blandt NH2, -NH-BHA-harpiksbærer og -NH-MBHA-har-piksbærer, der benyttes ved fastfasesyntese med henblik pà binding til en fast harpiksbærer, sâledes som repræsenteret ved formlerne: J 5 -0-CH2-benzyl-polyamid-harpiksbærer, -NH-benzhydrylamin (BHA)-harpiksbærer, og -NH-paramethylbenzhydrylamin (MBHA)-harpiksbærer.

6

DK 156957 B

χ8 vælges blandt hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for imi-dazolnîtrogenet i His eller en beskyttelsesgruppe for den phénol iske hydroxy1gruppe i Tyr.

5 Polyamidpolymeren stâr kommercielt til râdighed og er om-talt i detaljer i Bioorganic Chemistry, 8, 251-370 (1979), hvor en foretrukken version deraf er omtalt i fig. 6. An-vendelse af BHA- eller MBHA-harpiks foretrækkes, og spalt-ning f0rer til CRF-amidet eller CRF-analog-amidet.

10 I formlen for mellemproduktet er mindst en af grupperne i ^ ο λ ζ A p X , X , X , X , X , X og X en beskyttelsesgruppe, Afhængigt af de pâgældende aminosyrer, der vælges til R-grupperne, kan disse ogsâ hâve en beskyttelsesgruppe tilknyttet, sâ- ledes som anf0rt i det foregâende og som almindelig kendt pâ omrâdet og nævnt i det foregâende. Ved udvælgelsen af en bestemt sidekædebeskyttelsesgruppe til anvendelse ved syntesen af peptiderne, bliver f01gende regler fulgt: (a) beskyttelsesgruppen skal være stabil over for reagenset 9 Ω og under de reaktionsbetingelser, der vælges til fjernelse af α-aminobeskyttelsesgruppen pâ hvert trin i syntesen, (b) beskyttelsesgruppen skal bevare sine beskyttende egen-skaber og ikke blive fraspaltet under koblingsbetingelser og (c) sidekædebeskyttelsesgruppen skal kunne fjernes efter 25 afslutning af syntesen omfattende den 0nskede aminosyre-sekvens under reaktionsbetingelser, der ikke vil ændre:-peptidkæden,

Udgangspeptiderne freinstilles fortrinsvis under anvendelse af β Λ fastfasesyntese, sâsom den af Merrifield beskrevne, J. Am.

Chem. Soc., 85, side 2149 (1964), selv om andre ækvivalen-te kendte kemiske synteser ogsâ kan anvendes som ovenfor 35

DK 156957 B

7

nævnt. Fastfasesyntese starter ud fra den C-afsluttede ende af peptidet ved kobling af en beskyttet a-aminosyre til en passende harpiks som generelt anf0rt i U.S.A. pa-tentskrift nr. 4.244.946, hvis indhold medtages heri ved 5 henvisningen dertil. Et sâdant udgangsmateriale for CRF

kan fremstilles ved at knytte α-aminobeskyttet Ala til en BHA-harpiks.

Ala beskyttet med BOC, der er koblet til BHA-harpiksen, under anvendelse af methylenchlorid og dimethylformamid 10 (DMF). Efter koblingen af BOC-Ala til harpiksbæreren, fjernes α-aminobeskyttelsesgruppen, sâsom ved anvendelse af trifluoreddikesyre(TFA) i methylenchlorid, TFA alene eller med HCl i dioxan. Fortrinsvis anvendes 50 vægt% TFA i methylenchlorid sammen med 0,5 vægt% 1,2-ethandithiol.

15 Afbeskyttelsen udf0res ved en temperatur mellem 0°C og stuetemperatur. André standardspaltningsreagenser og stand-ardbetingelser til fjernelse af specifikke a-aminobeskyt-telsesgrupper kan benyttes, sâledes som beskrevet i Schroder & Lubke, "The Peptides", 1 side 72-75 (Academie Press 1965).

20 Efter fjernelse af Ala's α-aminobeskyttelsesgruppe, kob- les de resterende a-amino- og sidekædebeskyttede amino-syrer trinvis i den 0nskede orden til opnâelse af den oven-for definerede mellemproduktforbindelse. Som et alternativ til tilf0jelse af hver aminosyrer separat i syntesen, kan 25 nogle af dem kobles indbyrdes forud for tilsætning til fast= fasereaktoren. Udvælgelsen af et passende koblingsreagens h0rer til kendt teknik, der beherskes af fagmanden pâ om-râdet. Særlig egnet som koblingsreagens er N,N'-dicyklo= hexylcarodiimid (DCCI).

30 De aktiverende reagenser, der anvendes ved fastfasesyntesen af udgangspeptiderne, er velkendte inden for peptidomrâdet. Ek-sempler pè egnede aktiverende reagenser er carbodiimider, sàsc

~ DK 156957 B

8 N, N '-diisopropylcarbodiimid og N-ethyl-N'-(3-dimethylamino= propyl)carbodiimid. André aktiverende reagenser og deres anvendelse til peptidkobling er beskrevet af Schroder &

Lubke, supra, i kapitel III og af Kapoor, J. Phar. Soi., 5 59, side 1-27 (1970) .

Hver beskyttet aminosyre eller aminosyresekvens indf0res i fastfasereaktoren i ca. et firdobbelt overskud, og kob-lingen udf0res i et medium bestâende af dimethylformamid(DMF): CH2C12 (1î1) eller i DMF eller CH2C12 alene. I tilfælde, 10 hvor koblingen udf0res manuelt, mâles koblingsreaktionens udfald pâ hvert trin i syntesen ved hjælp af ninhydrin= reaktionen, sâledes som beskrevet af E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 34, 595 (1970). I tilfælde, hvor ufuldstændig kobling finder sted, gentages koblingsproceduren f0r fjer-15 nelse af α-aminobeskyttelsesgruppen forud for koblingen af den næste aminosyre. Koblingsreaktionerne kan foretages automatisk, sâsom pâ en Beckman 990 automatic synthesizer, idet man anvender et program, sâsom det af Rivier et al. omtalte, Biopolymers, 1978, 17, side 1927-1938.

20 Efter at den 0nskede aminosyresekvens er blevet afsluttet, fjernes det intermediære peptid fra harpiksbæreren ved be-handling med et reagens, sâsom flydende hydrogenfluorid, der ikke alene spalter peptidet fra harpiksen, men ogsâ fraspalter aile tilbageværende sidekædebeskyttelsesgrupper 25 X2, X3# X4, X5/ X6 og X8 samt α-aminobeskyttelsesgruppen xl, til opnàelse af peptidet. Ved anvendelse af hydrogenfluorid til spaltning, medtages anisol og methylenethylsulfid i reak-tionsbeholderen som rensemidler. Nâr Met er til stede i sek-vensen, kan BOC-beskyttelsesgruppen fraspaltes med trifluored-30 dikesyre(TFA)/ethandithiol forud for spaltningen af peptidet fra harpiksen til undgâelse af S-alkylering.

Folgende eksempler viser fremgangsmâden ifelge opfindelsen.

9

DK 156957 B

Eksempel 1.

Syntese af CRF med formlen: 5 H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-N^ og med en molekylvægt pâ 4.666 udf0res pâ trinvis mâde pâ 10 en benzhydrylaminhydrochloridharpiks, sâsom den der fâs fra Bachem, Inc. og har et substitutionsinterval pâ ca.

0,1 til 0,5 mmol/g harpiks. Syntesen foretages pâ et auto-matisk Beckman 990A peptidsynteseapparat. Kobling af BOC-Ala resulterer i substitution af ca. 0,35 mmol Ala pr. g 15 harpiks. Aile opl0sningsmidler, som benyttes, afgasses om-hyggeligt, fortrinsvis ved indblæsning af en indifferent gas, f.eks. hélium eller nitrogen, til sikring af fravær af oxygen, som pâ uheldig mâde kunne oxidere svovlet i Met-resten.

20

Efter afbeskyttelse og neutralisation opbygges peptid-kæden trin for trin pâ harpiksen. Generelt anvendes et eller to mmol BOC-beskyttet aminosyre i methylenchlorid pr. g harpiks plus et ækvivalent 2 molær DCCI i methylen= 25 chlorid i to timer. Nâr BOC-Arg(Tos) kobles, anvendes en blanding af 50% DMF og methylenchlorid. Bzl anvendes som hydroxyl-sidekædebeskyttelsesgruppe for Ser og Thr. P-nitrophenylester(ONp) anvendes til aktivering af carboxyl-enden af Asn eller Gin, og f.eks. kobles BOC-Asn(ONp) nat-30 ten over under anvendelse af ét ækvivalent HOBt i en 50% blanding af DMF og methylenchlorid. Amidogruppen.i Asn eller Gin beskyttes ved hjælp af Xan, nâr DCC-kobling anvendes i 35 i

DK 156957 B

10 stedet for den aktive estermetode. 2-Cl-Z anvendes som be-skyttelsesgruppe for Lys-sidekæden. Tos anvendes til be-skyttelse af guanidinogruppen i Arg og af imidazolgruppen i His, og Glu's eller Asp*s sidekædecarboxylgruppe beskyt-5 tes ved hjælp af OBzl. Ved afslutningen af syntesen opnâs f0lgende peptidmellemprodukt BOC-Ser(Bzl)-Gin(Xan)-Glu(OBzl)-Pro-Pro-Ile-Ser(Bzl)-Leu-Asp(OBzl)-Leu-Thr(Bzl)-Phe-His(Tos)-Leu-Leu-Arg(Tos)-Glu(OBzl)-Val-Leu-Glu(OBzl)-Met-Thr(Bzl)-Lys(2-Cl-Z)-Ala-Asp(OBzl)-Gin(Xan)-Leu-Ala-Gln(Xan)-Gin(Xan)-10 Ala-His (Tos)-Æer (Bzl) -Asn (Xan) -Arg(Tos) -Lys (2-Cl-Z) -Leu-Leu-

Asp (OBzl)-Ile-Ala-harpiksbærer. Xan kan være blevet fjernet delvis eller fuldstændigt ved hjælp af TFA-behandling, der anvendes til afblokering af α-aminobeskyttelsesgruppen.

For at spalte og afbeskytte den resulterende beskyttede 15 peptid-harpiks behandles denne med 1,5 ml anisol, 0,5 ml methylethylsulfid og 15 ml hydrogenfluorid (HF) pr. g pep= tid-harpiks, f0rst ved -20°C i 20 minutter og derpâ ved 0°C i 0,5 time. Efter fjernelse af HF under h0jvakuum, vaskes harpiks-peptidet skiftevis med t0r diethylether og 20 chloroform, og peptiderne ekstraheres derpâ med afgasset 2N vandig eddikesyre og skilles fra harpiksen ved hjælp af filtrering.

Peptidet renses ved hjælp af gelgennemtrængning efterfulgt af semi-præparativ HPLC som beskrevet af Rivier et al. i 25 Peptides: Structure and Biological Function (1979), side 125-128. De kromatografiske fraktioner mâles omhyggeligt ved hjælp af HPLC, og kun de fraktioner, der viste be-tydelig renhed, blev forenet.

Specifik optisk drejning af CRF-peptidet, der blev synte- 30 tiseret og renset pâ den ovenfor anf0rte mâde, blev mâlt 22° o pâ et Perkin Elmer apparat model 141 som [a]D = -77,5 +1,0 (c = 1 i 1% eddikesyre) (uden korrektion for tilstede-

DK 156957 B

11 værelsen af E^O og TFA) og viste en renhed pâ ca. 96%.

Til afg0relse af hvorvidt den n0jagtige sekvens var op-nâet, blev CRF-peptidet hydrolyseret i lukkede, evakuerede r0r indeholdende 4N methansulfonsyre og 0,2% tryptamin i 5 24 timer ved 110°C. Aminosyreanalyser af hydrolysaterne under anvendelse af et Beckman 121 MB aminosyreanalyseap-parat viste f0lgende aminosyremængder:

Asp(4,02) , Thr(1,85) , Ser(2,76) , Glu(7,0), Pro(l,58),

Ala(4,03), Val(0,96), Met(0,95), Ile(l,93), Leu(8,15), 10 Phed/00), Lys(2,00), His(l,95) ogArg(l,98), hvilket bekræftede, at 41-rest-peptidstrukturen var blevet opnâet.

Eksempel 2. Fremstilling af referencestof.

CRF blev ekstraheret, isoleret og renset pâ f01gende mâde.

15 490,000 hypothalame fragmenter fra fâr blev ekstraheret i ethanol-eddikesyre-chloroform, affedtet med en blanding af ethylether og petroleumsether og underkastet gentagne udrystninger med skillesystemet 0,1% eddikesyre: n-butanol: pyridin (11:5:3). De kombinerede vandige faser viser ACTH-20 frig0rehde aktivitet.

Efter dialyse (Spectrapor 3) mod 2N HOAc blev ca. 350.000 fragmentækvivalenter af retentaterne med en vægt pâ 15 g underkastet gelfiltrering pâ "Sephadex" G-50. Hovedmængden af materialet blev kromatograferet ved koldrumstemperaturer 25 i 9 successive forl0b under anvendelse af en 3,1 x 150 cm G-50 s0jle, der blev elueret med 2N HOAc. Zonen udvisende den mest signifikante ACTH-frig0rende aktivitet elueredes omkring 1,3 Ve/VQ.

En del af materialet fra denne zone, ca. 130.000 fragment- Ο Λ WVM *1 M V\ i. A «4» In 1 Λ** ί 1 M ^ ul» Μ Μ. X. «N J- Λ Λ μΙν· ·<!· J WN WN £ Irt _ ^ C? /N —% Λ A V ^

DK 156957 B

12

Pr0ven blev indf0rt i Ο,ΟΙΜ ammoniumformiatpuffer, pH 3,2, og elueret med en lineær gradient af den benyttede puffer til 1:5M ammoniumformiat, pH 7,0. ACTH-frig0rende aktivi-tet blev svagt absorberet. Den ACTH-frig0rende fraktion fra 5 SP-"Sephadex" og det resterende af zonen fra "Sephadex"-G-50 blev opl0st i 6M guanidin HCl/HOAc, pH 2,5, opvarmet i 5 minutter til 90°C og derpâ kromatograferet pâ "Biogel" P-10 med 4M guanidin HCl/HOAc, pH 2,5. De ACTH-frig0rende fraktioner blev forenet og renset yderligere ved hjælp af 10 successive h0jtryksvæskekromatografiske (HPLC) trin, der indbefattede: 1) omvendt fase HPLC pâ "Bondapak" CN (Wa= ters and Associates) under anvendelse af en gradient af faldende mængde triethylammoniumphosphat (TEAP) og stigen-den mængde acetonitril, 2) omvendt fase HPLC pâ "Bondapak" 15 C^g (Waters and Associates) med TEAP/acetonitril, og enten 3a) omvendt fase HPLC pâ "Bondapak" CN med gradienter af triethylammoniumformiat og acetonitril eller 3b) omvendt fase HPLC pâ Clg med gradienter af trifluoreddikesyre og acetonitril. Lyofiliserede aktive zoner fra begge HPLC-20 trin 3a eller 3b blev benyttet til sammensætnings- og strukturanalyse, der viste f0lgende sekvens: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2.

25 Eksempel 3. Sammenligningseksempel.

Det syntetiske og det naturlige CRF blev unders0gt med hensyn til deres virkninger pâ sekretionen af ACTH og β-endorphin in vitro, og det syntetiske CEF blev ogsâ under-s0gt in vivo. Den h0je virkningsevne af syntetisk og natur-30 ligt CRF til stimulering af sekretionen af ACTH og 3-endor= phin fra dyrkede rottehypofyseceller blev mâlt. Minimale og halv-maksimale reaktioner blev iagttaget ved henholdsvis

DK 156957 B

13 ca. 10 picomolær og ca. 100 piaDmolær syntetisk CRF. Sek-retionsreaktionerne pâ maksimale (>5nM) koncentrationer af CRF ligger pâ et h0jt niveau. In vivo doser fra 30 ng til 3 yg/kg legemsvægt for0gede hurtigt ACTH-sekretionen og 5 β-endorphin-lignende (β-END-LI) sekretion til det 5-20- dobbelte.

Syntetisk CRF har vistlsig at være en kraftig stimulator for sekretion af ACTH og β-END-LI in vivo i flere rotte-præparater. Plasmamængder af ACTH og β-END-LI for0ges i 10 mindst 5-20 minutter efter den intraven0se administration af CRF til nembutalbed0vede hanrotter og til hvilende han-eller hunrotter med indlagt intraven0s kanyle. Endvidere viser CRF sig at hâve en voldsom virkning pâ blodtrykket i rotter og hunde. Det cartoide middelblodtryk i en urethan-15 bed0vet rotte faldt fra 87 til 72+2 mm Hg og forblev pâ dette niveau i 30 minutter efter en indspr0jtning svaren-de til 3 yg CRF/Kg legemsvægt. Efterf01gende administration af en indspr0jtning svarende til 30 yg CRF/Kg legemsvægt sænkede middelblodtrykket til 42+3 mm Hg i mere end 2 timer.

20 Eksempel 4.

Peptidet [Tyr"^, Nle^]-CRF med formlen: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-Tyr-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2 25 syntetiseres. Afpr0vning i overensstemmelse med den generel-le procedure, der er anf0rt i eksempel 3, viser, at det ligeledes stimulerer sekretionen af ATCH og β-END-LI og forârsager en meget signifikant blodtrykssænkning i et st0rre omfang end CRF. Nærmere betegnet er dets virknings-styrke 35¾ st0rre end virkningsstyrken af CRF.

4

DK 156957 B

14

Eksempel 5.

Peptidet [Acetyl-Pro ]-CRF med formlen: 5 Ac-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn-Arg-Ly s-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-ISH^ syntetiseres. Afpr0vning i overensstemmelse med den generelle procedure, der er anf0rt i eksempel 3, viser, at det ligeledes stimu-1° lerer sekretionen af ACTH og β-END-LI og forârsager en meget signifikant blodtrykssænkning i et st0rre omfang end CRF. Nærmere betegnet er dets virkningsstyrke 22% st0rre end virkningsstyrken af CRF.

15 Eksempel 6.

21 32

Peptidet [Nie , Tyr ]-CRF med formlen: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-2 0 Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-

Gln-Gln-Ala-Tyr-Ser-Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2 syntetiseres. Afpr0vning i overensstemmelse med den generelle procedure, der er anf0rt i eksempel 3, viser, at det ligeledes stimulerer sekretionen af ACTH og 3-END-LI og 25 forârsager en meget signifikant blodtrykssænkning i et st0rre omfang end CRF. Nærmere betegnet er dets virkningsstyrke 40% st0rre end virkningsstyrken af CRF.

Eksempel 7.

30

Peptidet [Nle21]-CRF med formlen: H-Ser-Gln-Glu-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu-Val-Leu-Glu-Nle-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Ala-Gln-Gln-35 Ala-His-Seï Asn-Arg-Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Ala-NH2 syntetiseres. Afprevning i overensstemmelse med den generelle procedure, der er anfert i eksempel 3, viser, at det ligeledes stimulerer se-

DK 156957 B

15 kretionen af ACTH og (3-END-LI og foràrsager en meget signifi-kant blodtrykssænkning i et mindre amfang end CRF. Nærmere be-tegnet er dets biologiske virkningsstyrke 57¾ af CRF's virk-ni ngsstyrke.

5

Det er af interesse/ at CRF og CRF-analoge udviste en sâ-dan ekstrem sænkning af blodtrykket. Som résultat heraf kan disse peptider være særlig værdifulde til behandling af tilstande med h0jt blodtryk og ogsâ til behandling af 10 patienter, der skal udsættes for visse typer kirurgi.

Eftersom CRF vidtgâende stimulerer hypofyse-adrenalcorti= calaksen, skulle CRF eller CRF-analoge være nyttige til stimulering af denne akses funktioner i nogle patienttyper 15

med lav endogen glucocorticoidproduktion. F.eks. skulle CRF

være nyttig til genoprettelse af hypofyse-adrenalfunktion-en i patienter, der har fâet exogen glucocorticoidbehand-ling, og hvis adrenalcorticalfunktioner forbliver 2 0 undertrykte.

De flest andre regulerende peptider har vist sig at hâve virkninger pâ centralnervesystemet og pâ mave-tarmkanalen. Eftersom sekretion af ACTH og 0-END er en uomgængelig n0d-25 vendighed i et dyrs reaktion pâ stress, er det sandsynligt, at CRF vil hâve signifikante virkninger -pâ hjernen som formidler eller begrænser af legemets stressreaktion. F01-gelig kan CRF ogsâ finde anvendelse til modificering af sindsstemningen og opf0rslen af normale og mentait forstyr-2Q rede personer, Eftersom CRF og CRF-analoge for0ger mæng- der af ACTH, β-END, β-lipotropin og corticosteron, kan dets administration benyttes til fremkaldelse af deres virkninger pâ hjernen og dens omkreds til derved at pâvirke hukommelse, sindsstemning,- smertefornemmelse etc. og mere 35 specielt kvikhed, dépréssion og/eller angst.

DK 156957 B

16

Det antages ogsâ, at relativt store mængder CRF eller nogle af de mere virksomme dermed analoge forbindelser kan fungere pâ en mâde, der svarer til den mâde, hvorpâ GnRH-super= agonister inhiberer forplantningsfunktioner. Disse peptider 5 kan sâledes være i stand til at desensitivisere CRF-mâl-organer og sâledes være værdifulde til behandling af per-soner med Cushing's sygdom og lignende forstyrrelser.

CRF, CRF-analoge eller de ikke-toksiske additionssalte der-10 af, der er kombineret med en farmaceutisk acceptabel bærer til dannelse af et farmaceutisk middel, kan administreres til pattedyr inklusive mennesker enten intraven0st, sub-kutant, intramuskulært, intranasalt, intracerebrospinalt eller oralt. Peptiderne b0r vasre mindst ca. 93% rene og 15 b0r fortrinsvis hâve en renhed pâ mindst ca, 98%. Denne ren-hed betyder, at det tilsigtede peptid udg0r den anf0rte vægt% af aile tilstedeværende lignende peptider og peptid-fragmenter. Deres administration kan af en læge anvendes til sænkning af blodtrykket eller til stimulering af den 20 endogene gluco-corticoidproduktion. Den krævede dosis vil variere med den pâgældende lidelse, der behandles# med al-vorligheden af lidelsen og med varigheden af den 0nskede behandling.

25 sâdanne peptider administreres ofte i form af farmaceutisk acceptable ikke-toksiske salte, sâsom syreadditionssalte eller metalkomplekser, f.eks. med zink, jern, calcium, barium, magnésium, aluminium eller lignende (der betragtes som additionssalte for sâvidt angâr den foreliggende an-30 s0gning). Eksempler pâ sâdanne syreadditionssalte er hy= drochloridet, hydrobromidet, sulfatet, phosphatet, tannatet, pamoatet, oxalatet, fumaratet, gluconatet, alginatet, ma= leatet, acetatet, citratet, benzoatet, succinatet, malatet, ascorbatet, tartratet og lignende. Hvis den aktive bestand-35 dei skal administreres i tabletform, kan tabletten inde- holde et bindemiddel, sâsom tragacanth, majsstivelse eller gélatine, et desintégrerende middel, sâsom alginsyre, og

Claims (8)

20 Patentkrav.

1. Analogifremgangsmâde Ή1 fremsti11 ing af CRF eller CRF-analoge peptidforbindelser med formlen Rl-Pro-Pro-Ile-Ser-Leu-

25 Asp-Leu-Thr-Phe-Ri3-Leu-Leu-Arg-Glu-Va1-Leu-Glu-R21"Thr-Lys- A1a-Asp-Gln-Leu-Ala-G 1n-Gln-Ala-R32"Ser_Asn*Ar9"Lys“Leu"Leu_ Asp-Πe-Ala-NH2# hvori R^ er Ser-Gln-Glu eller Ac, R13 er His eller Tyr, R21 er Met, Ile eller Nie, og R32 er His eller Tyr, kendetegnet ved, at man fra et peptidmel1emprodukt 30 med formlen: Xl-Ser(X2)-Gln(X4)-Glu(x5)-Pro-Pro-Ile-Ser(x2)-Leu-Asp(x5)- Leu-Thr (X2 )-Phe-R13(x8)-Leu-Leu-Arg(X3)-Gl u (X5)-Val-Leu-Glu·. (X5)-R2i-Thr(Xz)-Lys(X6)-Ala-Asp(Xî>)-Gln(X4)-Leu-Ala-Gln(X4)-

35 G1n(X4)-Ala-R32(X8)-Ser(X2)-Asn(X4)-Arg(X3)-Lys(X6)-Leu-Leu-Asp(X5)-Ile-Ala-(X7) eller en passende N-terminalt forkortet DK 156957 B version deraf, hvori χΐ er hydrogen eller en α-aminobeskyttel-sesgruppe, X2 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for den alkoholiske hydroxylgruppe i en Ser- eller Thr-rest, X3 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for guanidinogruppen i Arg,

2. Fremgangsmâde if0lge krav 1, kendetegnet ved, at R-^2 er His. 20

3. Fremgangsmade if0lge krav 1, kendetegnet ved, at er Tyr.

4. Fremgangsmâde if01ge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at R01 er Nie. 25 21

5. Fremgangsmâde if01ge ethvert af kravene 1, 2 og 3, kendetegnet ved, at R2^ er Ile.

5 X4 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for amidogruppen i Gin eller Asn, X® er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for carboxylgruppen i Asp eller Glu, X6 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for sidekædeaminogruppen i Lys, X7 er valgt blandt NH2, -NH-BHA-harpiksbærer og -NH-MBHA-harpiksbaerer, og 10 X® er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for imidazolnitro-genet i His eller for den phenoliske hydroxylgruppe i Tyr, fo-rudsat at ikke aile symbolerne X* til X® stâr for hydrogen eller NH2 / fjerner beskyttelsesgrupper og eventuelt covalent bunden harpiksbærer til opnâelse af polypeptidet samt om on-15 sket omdanner et sâdant resulterende polypeptid til et ikke-toksisk sait deraf.

6. Fremgangsmâde if01ge ethvert af kravene 1 - 5, k e n-30 detegnet ved, at R2^ er Met.

7. Fremgangsmâde if01ge ethvert af kravene 1 - 6, k e n-detegnet ved, at R32 er TYr·

8. Fremgangsmâde if0lge ethvert af kravene 1 - 6, ken detegnet ved, at .at R32 er Ris. DK 156957 B Peptid til anvendelse som udgangsmateriale ved fremgangs-màden ifoige krav 1 med formlen: X1-Ser(χ2)_0Ίη(X4)-Glu(Χ5)-Ργο-Ργο-Πe-Ser(x2)-Leu-Asp(X5)-5 Leu-Thr(X2)-Phe-R^(X8)-Leu-Leu-Arg(X3»-G1u(X5)-Val-Leu-Glu (X5)~R2l_Thr(X2)-Lys(x6)-Ala-Asp(x5)-GTln(X4)-Leu-Ala-Gln(X4)-Gln(X4)_Ala.R32(x8)_Ser(X2)-Asn(X4)-Ar5(X3)-Lys(X6)-Leu-Leu-Asp(x5)_jie_Aia_x7f kendetegnæt ved, at X* er hy-drogen eller en a-aminobeskyttelsesgrujppe, X2 er hydrogen el-10 1er en beskyttelsesgruppe for den alko.holiske hydroxyIgruppe i en Ser- eller Thr-rest, X3 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for guanidinogruppen i Arg, X4 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for amidogruppen i Glas eller Asn, X® er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for carboxylgruppen i Asp 15 eller Glu, X6 er hydrogen eller en besikyttelsesgruppe for si-dekædeaminogruppen i Lys, X? er valgt: blandt NH2, -NH-BHA-harpiksbærer og -NH-MBHA-harpiksbærer, .og X8 er hydrogen eller en beskyttelsesgruppe for imidazolnitrogenet i His eller for den phenoliske hydroxylgruppe i Tyr, forudsat at ikke aile 20 symbolerne X^ til X8 stâr for hydrogen eller NH2. 25 30 35