FI95273B - Menetelmä kipua lievittävien peptidien, niiden amidien ja suolojen valmistamiseksi - Google Patents

Description

95273 5

Menetelmä kipua lievittävien peptidien, niiden amidien ja suolojen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee peptidejä, niiden valmistusta ja niiden käyttöä.

Käsite interleukiini-1 (IL-1) kuvaa kahta aktivoitujen mak-10 rofagien ja muiden solutyyppien tuottamaa monivaikutteista tulehdusproteiinia. 2 geeniä koodittaa IL-l:n 2 muotoa, IL-la:aa ja IL-lB:aa, joiden aminohapposekvensseillä on vain 26-% homologia. Tästä huolimatta IL-la:11a ja IL-IB:11a on esitetty olevan samanlaiset biologiset aktiivisuudet muuta-15 maa poikkeusta lukuunottamatta. Tosiasiassa molemmat molekyylit tuntuvat vaikuttavan samoihin reseptoreihin. On paljon näyttöä siitä, että molemmilla on osuutta verisolujen kasvutekijänä ja tulehdussairausjoukon patologiassa. IL-l:llä on myös syövän vastaista aktiivisuutta.

20

Koska IL-1 vapauttaa prostaglandiineja, jotka herkistävät kipureseptoreita ihmisessä ja koe-eläimissä, testattiin IL-la:n ja IL-lB:n kivulle herkistävä aktiivisuus. Havaittiin, että IL-IB on äärimmäisen voimakas kivulle herkistävä aine, 25 jonka aktiivisuus on noin 3000 kertaa niin voimakas kuin IL-: la:n. Edelleen on löydetty joukko peptidejä, jotka vastavai- kuttavat hyvin tehokkaasti IL-lB:n ja muiden tulehdusta aiheuttavien aineiden kivulle herkistävää vaikutusta. Tämän vuoksi näitä peptidejä voidaan käyttää kipua lievittävinä.

30 ; : Tämän mukaisesti tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän kipua lievittävän yhdisteen valmistamiseksi, joka on (a) kaavan I mukainen peptidi: 2 95273

O

II

X—N—CH-CH—C—Y

I I

5 CH2 CH, I

\ / CHj jossa X on H2N- [CHj] 4-CH (NH2) -C(=0) - tai 10 H2N-C(=NH) -NH- [CH2]3-CH(NH2) -C (=0) - , ja Y on hydroksiryhmä tai aminohappotähde; edellyttäen, että (i) proliinitähde on D-Pro, kun X on L-Lys tai L-Arg; ja (ii) kaavan (I) mukainen peptidi ei ole L-Arg-D-Pro-L-Pro, Arg-D-Pro-L-Lys, D-Lys-D-Pro-D-Arg, D-Lys-L-Pro, L-Arg-D, L- 15 Pro, L-Lys-D-Pro-Val, D-Lys-L-Pro-L-Val tai D-Lys-D-Pro-D-Val; (b) seuraavan kaavan II mukainen peptidi:

20 H2N - CH - CO - N-CH-CO-NH-CH-COOH

I I I I

(CH2)4 ch2 ^ch2 choh

NH2 ^^CHj ch3 II

25 (c) edellä (a)- tai (b)-kohdassa määritellyn mukaisen peptidin C-terminaalinen amidi; tai 30 (d) missä tahansa kohdassa (a)-(c) määritellyn mainitun peptidin tai amidin farmaseuttisesti hyväksyttävä suola.

Menetelmä käsittää mainitun peptidin kemiallisen synteesin, mahdollisesti C-terminaalisena amidina, mukana olevien ami-35 nohappojen kondensoinnin siinä järjestyksessä, missä ne ovat peptidissä, käyttäen konventionaalista kiinteäfaasi- tai liuosmenetelmää, ja haluttaessa saadun yhdisteen muuttamisen farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolakseen.

Il 3 95273

Artikkelissa D.B. Richards ja J.M. Lipton: Peptides 5 (1984), s. 815-817, esitetään tripeptidi Lys-Pro-Val:n kuumetta alentava vaikutus kuumeisissa kaneissa. Jotkin muut kaavan I mukaiset peptidit ovat tunnettuja, mutta jotkin 5 ovat uusia.

Kaikki kaavan I mukaisen kiraalisen peptidin rakenneosina olevat aminohappotähteet voivat olla joko D- tai L-optista isomeeriä. D-isomeeri on erityisen edullinen keskellä olevan 10 proliinitähteen kohdalla. Käytettäessä aminohappojen nimeämiseksi käytettävää 3-kirjainjärjestelmää, jossa symbolit merkitsevät, ellei toisin ole ilmoitettu, kiraalisen aminohapon konfiguraatiota L, voi X olla Lys, D-Lys, Arg tai D-Arg. Tosiasiassa kaavan I mukainen peptidi voi olla raseemi-15 sena seoksena tai optisesti puhtaassa muodossa. Edullisesti X on Lys tai D-Lys.

Kun Y on hydroksiryhmä, on kaavan I mukainen peptidi dipep-tidi. Tripeptidit ovat kuitenkin edullisia. Y on tyypilli-20 sesti α-aminohappotähde. Erityisemmin Y on yleensä luonnollisesti esiintyvä aminohappotähde. Y on edullisesti neutraali aminohappotähde. Alifaattinen aminohappotähde on edullisempi kuin aromaattinen aminohappotähde, ja neutraali aminohappotähde on edullisempi kuin hapan aminohappotähde. Eri-25 tyisesti Y voi olla treoniini tai valiinitähde.

Y voi olla myös glysiinistä peräisin oleva tähde. Y voi olla alaniini- tai seriinitähde tai edullisesti leusiini- tai isoleusiinitähde. Y voi sopivasti olla myös hapan aminohap-30 potähde. Tällöin Y on tyypillisesti asparagiinihappo tai as-: paragiini.

Erityisen edullisia kaavan I mukaisia peptidejä ovat Lys-D-Pro-Thr, D-Lys-Pro-Thr, D-Arg-Pro-Vai, Arg-D-Pro-Val, D-Arg-35 D-Pro-Val, D-Arg-Pro-Thr, Arg-D-Pro-Thr ja D-Arg-D-Pro-Thr. Dipeptidi voi olla Lys-D-Pro tai Arg-D-Pro.

4 95273

Kaavan I ja II mukaiset peptidit valmistetaan kondensoimalla rakenneosina olevat aminohapot järjestyksessä, jossa ne ovat kaavassa I tai II. Peptidi voidaan saada C-päädyssään vapaan karboksin tai amidi (-CONH2)-ryhmän sisältävänä. Voidaan 5 käyttää kiintofaasi- tai liuosmenetelmiä. Saatava peptidi voidaan haluttaessa muuttaa farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Kiintofaasisynteesissä kaavan I mukainen aminohapposekvenssi 10 valmistetaan jaksottain C-terminaalisesta aminohaposta, joka on sitoutunut ei-liukoiseen hartsiin. Kun haluttu peptidi on valmistettu, se lohkaistaan hartsista. Käytettäessä liuos-faasisynteesiä peptidi voidaan jälleen valmistaa C-terminaalisesta aminohaposta. Tämän hapon karboksiryhmä pysyy koko 15 synteesin ajan suojattuna sopivalla suojaryhmällä, joka poistetaan synteesin lopussa.

Kumpaa hyvänsä, kiintofaasi- tai liuostekniikkaa sovellettaessa kaikissa järjestelmään lisätyissä aminohapoissa on 20 tyypillisesti suojattu aminoryhmä ja aktivoitu karboksiryhmä. Aminoryhmä voi olla fluoren-9-yylimetoksikarbonyyli (Fmoc)- tai t-butoksikarbonyyli(Boc)-ryhmällä suojattu. Karboksiryhmä voi olla aktivoitu pentafluorifenyyli- tai 1-okso-2-hydroksidihydrobentsotriatsiiniesterinä. Kaikki kon-25 densointivaiheet voidaan suorittaa disykloheksyylikarbodi- imidin tai 1-hydroksibentsotriatsolin läsnäollessa. Lysiinin sivuketjun aminoryhmä ja treoniinin sivuketjun hydroksiryhmä voivat olla suojattuja, butyylieettereinään (seriinin ja treoniinin tapauksessa), butyyliestereinä (asparagiinihapon 30 tapauksessa), butyylioksikarbonyylijohdannaisena (lysiini) . ja 4,4'-dimetoksibentshydryyliryhmänä (asparagiini). a-ami- nosuojaryhmä poistetaan kunkin synteesivaiheen jälkeen.

Kaikki sivuketjujen suojaryhmät poistetaan yleensä synteesin lopussa.

35

Voidaan valmistaa peptidejä, joissa on joko C-terminaalinen karboksi- tai C-terminaalinen amidiryhmä. Kiintofaasipepti-

II

5 95273 disynteesissä tämä voi määräytyä sen mukaan, miten C-terminaalinen aminohappo on kytketty hartsikantajaan ja/tai kuinka lopullinen peptidi lohkaistaan hartsikäntajasta. Tyypillisesti hartsi on styreeni- ja/tai divinyylibentseenipo-5 lymeeri. C-terminaalinen aminohappo voi olla kytkeytynyt hartsiin esterisidoksella, joka voidaan lohkaista vahvalla hapolla, kuten HBrillä trifluorietikkahapossa tai HF:llä, jolloin saadaan C-terminaalisen karboksiryhmän sisältävä peptidi. Ammonolyysillä voidaan saada vastaava amidi.

10

Vaihtoehtoinen menetelmä peptidiamidin saamiseksi kiintofaa-sisynteesillä on järjestää hartsiin kytkettävän peptidin C-terminaalisen aminohapon kytkeminen hartsiin peptidiamino-bentshydryylisidoksella. Tämä voidaan muodostaa liittämällä 15 disykloheksyylikarbodi-imidillä, ja lohkaista HF:llä, tyypillisesti kylmässä. Liuosfaasisynteesin tapauksessa se, onko läsnä C-terminaalinen karboksi- vai amidiryhmä, riippuu siitä, kuinka C-terminaalisen aminohapon karboksiryhmä on liitetty, ja synteesin lopussa vapautetaan suojaryhmästään.

20 C-terminaalisen karboksiryhmän sisältävä peptidi voidaan muuttaa C-terminaalisen amidiryhmän sisältäväksi ja päinvastoin.

Saatava peptidi voi olla muutettu farmaseuttisesti hyväksyt-. 25 täväksi suolaksi. Se voi olla muutettu happoadditiosuolaksi • orgaanisella tai epäorgaanisella hapolla. Sopiviin happoihin kuuluvat etikka-, meripihka- ja suolahappo. Vaihtoehtoisesti peptidi voi olla muutettu karboksyylihapposuolaksi, kuten ammoniumsuolaksi tai alkalimetallisuolaksi, kuten natrium-30 tai kaliumsuolaksi.

«

Kaavan I mukaiset peptidit ja niiden amidit ja suolat ovat kipua lievittäviä. Kipua voidaan sen vuoksi hoitaa ihmisillä tai eläimillä antamalla vaikuttava määrä kaavan I mukaista 35 peptidiä tai sen C-terminaalista amidia tai farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa. Kipua voidaan sen vuoksi lievittää.

6 95273

Tripeptidi Lys-Pro-Thr muodostaa osan IL-lE:n sekvenssistä. Sekä se että sen D-Pro-rasemaatti, joka on keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistettu edullinen tripeptidi, ovat vaikutukseltaan IL-lE:n kivulle herkistävälle vaikutukselle 5 vastakkaisia. Kaikki muotoa L olevat yhdisteet on kuitenkin myös havaittu agonistisesti vaikuttaviksi määrätyillä kon-sentraatioilla; rotilla annokset a 50 μg/150 g rottaa saavat aikaan herkistymistä kivulle. D-Pro-yhdisteellä ei ollut tätä agonistivaikutusta ja se on sen vuoksi edullinen kaik-10 kiin L-yhdisteisiin verrattuna vaikkakin sen aktiivisuus kivun lievittäjänä on vähäisempi kuin L-yhdisteellä. Rottien ED50-arvo on laskettu Lys-Pro-Thr:lie arvoksi 25 μg/150 g rotta ja Lys-D-Pro-Thr:lie arvoksi 85 μg/150 g rotta. Edelleen on havaittu, että tripeptidit Lys-Pro-Val ja Lys-D-Pro-15 Vai ovat tehokkaampia IL-IS:n aiheuttaman kivulle herkistä-misen antagonisteja kuin Lys-D-Pro-Thr.

Lisätodisteita C-terminaalisen valiinitähteen omaavien tri-peptidien tehokkaammasta antagonistiaktiivisuudesta verrat-20 tuna tripeptideihin, joissa on C-terminaalinen treoniinitäh-de, on saatu siitä tosiseikasta, että sekä Lys-Pro-Val että Lys-D-Pro-Val ovat vaikutukseltaan vastakkaisia PGE2:n aiheuttamalle kivulle herkistykselle. Lys-Pro-Thr:11a tai Lys-D-Pro-Thr: 11a ei ole tällaista vaikutusta. Lys-Pro-Val ja sen 25 D-Pro-rasemaatti antagonisoivat tosiasiassa PGE2:n aikaansaa-‘ maa kivulle herkistymistä suuremmilla annostasoilla, kuin millä ne antagonisoivat IL-lS:n aikaansaamaa kivulle herkistymistä. ED50-arvot Lys-Pro-Val:lie on suunnilleen 170 ng/-150 g rotta ja Lys-D-Pro-Val:lie suunnilleen 140 μg/150 g 30 rotta PGE2:n aikaansaaman kivun herkistyksen antagonisoimi-. sessa. IL-IS:n aiheuttamassa kivulle herkistyksessä pätevät ED50-arvo 70 μg/150 g rotta (Lys-Pro-Val) ja 40 μg/150 g rotta (Lys-D-Pro-Val).

35 Mikään tämän keksinnön mukaisista tripeptideistä ei ole antagonisti dibutryylisyklisen adenosiinimonofosfaatin (DbcAMP) aikaansaamalle kivulle herkistämiselle. Tällainen 11 7 95273 kaiken vaikutuksen puute on hyvin voimakkaasti morfiinin vaikutukselle vastakkainen, joka on DbcAMP:n aikaansaaman kivulleherkistyksen tehokas antagonisti. Tämä on siksi eräs merkki siitä, etteivät kaavan I mukaiset peptidit ole toi-5 minnaltaan morfiinityyppisiä.

Peptidien Lys-Pro-Thr ja Lys-D-Pro-Th eräs etu on, että toisin kuin sekä steroidiset että ei-steroidiset (aspiriini-tyyppiset) kipua lievittävät lääkkeet, kuten edellä mainit-10 tiin, ne eivät inhiboi prostaglandiinituotantoa, millä on vatsassa suojaavaa vaikutusta. Steroidiset ja ei-steroidiset (aspiriinityyppiset) lääkkeet aiheuttavat ruoansulatuskanavan vaurioita, mikä rajoittaa niiden käyttökelpoisuutta, erityisesti hoitamaan niveltulehduksen oireita, joista IL-IS 15 voi osaltaan olla vastuussa. Tätä ruoansulatuskanavan vaurio-ongelmaa voidaan sen vuoksi helpottaa käyttämällä kaavan I mukaisia peptidejä ja niiden suoloja.

Erään keksijöistä, Stephen Poolen, vastaavan US-hakemuksen 20 käsittelyn yhteydessä antaman selvityksen biologisten tietojen mukaan peptideillä, joilla joko keskimmäinen proliini-tähde tai N-terminaalin X-tähde on D-isomeerimuodossa, on poikkeuksetta kiitettävää kipua lievittävää aktiivisuutta. Patenttivaatimuksen ehdossa (i) on esitetty nämä edulliset 25 suoritusmuodot.

Kaavan I mukainen peptidi ja sen C-terminaalinen amidi ja suolat voidaan antaa oraalisesti pai parenteraalisesti, esimerkiksi ihonalaisesti, laskimonsisäisesti, lihaksen sisään, 30 vatsaontelon sisäisesti, intranasaalisti tai poskeen. Yhdistettä annetaan ihmiselle tai eläimelle tyypillisesti määrä 0,2 - 2 mg/kg annoksessa joko oraalisesti tai parenteraalisesti .

Kaavan I mukainen peptidi tai sen C-terminaalinen amidi tai 35 suola formuloidaan käyttöä varten yleensä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai laimennusaineen kanssa. Voidaan 8 95273 käyttää tavanomaisia väliaineita, lisäaineita ja laimennus-aineita. Nämä riippuvat yleensä antoreitistä.

Seuraavat esimerkit 1-19 kuvaavat keksintöä. Esitetään 5 myös vertailuesimerkki, joka osoittaa, että IL-IS on voimakas kivulle herkistävä aine. Kuvissa, joihin esimerkeissä ja vertaavassa esimerkissä viitataan:

Kuvassa 1 esitetään HPLC(High Performance Liquid Chromato-10 graphy)-tulos puhdistetusta peptidistä Lys-D-Pro-Thr (esimerkki 3) ;

Kuvassa 2 esitetään HPLC-tulos puhdistetusta KPV:stä (esimerkki 4) ; 15

Kuvassa 3 esitetään HPLC-tulos puhdistetusta K(D)PV:stä (esimerkki 5);

Kuvassa 4 esitetään IL-lfi:n kivulle herkistävä vaikutus ja 20 sen kesto esikäsiteltäessä indometasiinilla (vertailuesimerkki) ;

Kuvassa 5 esitetään kolmen peptidin vaikutus IL-l£:n aikaansaaman kivulle herkistykseen (esimerkki 6); 25 * Kuvassa 6 esitetään IL-lam ja IL-lS:n kivulle herkistävät vasteet ja peptidin K(D)PT vaikutus näihin vasteisiin (esimerkki 7) ; 30 Kuvassa 7 esitetään K(D)PT:n vaikutus PGE2:n, karrageenanin ja IL-lS:n aikaansaamaan kivulle herkistykseen (esimerkki 8) ;

Kuvassa 8 esitetään esimerkin 16 peptidin HPLC-tulos; ja • · • · 9 95273

Kuvassa 9 esitetään esimerkin 17 peptidin HLPOtulos. Esimerkki 1: Lvs-Pro-Thr:n valmistus

Tripeptidi Lys-Pro-Thr syntetisoitiin käyttäen kiintofaasi-5 peptidisynteesin Fmoc-polyamidimenetelmää (Dryland ia Sheppard, Peptide Synthesis 8 "A system for solid phase synthesis under low pressure continuous flow conditions" J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1, s. 125, 1986). Kiintofaasikantaja oli polydimetyyliakryyliamidipolymeeri, joka koostui 3 monomee-10 ristä dimetyyliakryyliamidi (perusrungon monomeeri), his-ak-ryloyylietyleenidiamiinista (ristiliittäjä) ia akryloyyli-sarkosamiinimetyyliesteristä (funktionalisointiagenssi). Peptidin lohkaisemisen sallivalla tavalla hartsiin liittämiseen käytettiin happolabiilia 4 -hydroksimetyy1ifenoksietikkahap-15 poiohdannaista.

Kaikki aminohappo johdannaiset lisättiin etukäteen valmistettuina symmetrisinä anhydridiiohdannaisinaan. Tilapäinen Na-aminoryhmän suojaus suoritettiin Fmoc-ryhmällä. Tämän i'yhmän 20 toistuvat lohkaisut suoritettiin 20-% piperidiiniä N,N-dime-tyylif oi-mamidissa käyttäen. Sivuketjufunktionaalisuudet oli suojattu butyyl ies terinä (freoniini) ja butyylioksikarbonyy-lijohdannaisena (lysiini).

25 Synteesin loppuunsaattamisen jälkeen saatu peptidi lohkais-. tiin hai'tsikantajasta 95-% trifluorietikkahapolla (TFA), jo hon oli sekoitettu 5 % sieppaajaa. Peptidi puhdistettiin HPLC:llä. Puhtaus määritettiin aminohappoanalyysillä ja Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry:llä (FAB-MS): 30 aminohappoanalyysi laskettu saatu : 1 1,00 Lys 1 0,95 Pro 1 0,98 Thr 35 FAB-MS: positiivinen ionispektri antoi M+H~" m/z 345 (molekyy-lipaino on 344,415 (344)).

95273 10

Puhtaus oli > 80 %. Puhdistus > 95 %:iin suoritettiin kään-teisfaasi-HPLC:llä Hypersil (tavaramerkki) WP 300 butyyliko-lonnia (150 x 4,6 mm) käyttäen. Puskurit olivat: A = 0,25 % TFA ia B = 0,25 % TFA/CHaCN. Detektio suoritettiin UV:llä 5 aallonpituudella 225 mm, ia preparatiivinen määrä oli 0,5 mg.

Esimerkki 2: Lvs-D-Pro-Thr:n valmistus (1)

Tripeptidi Lys-D-Pro-Thr syntetisoitiin ia puhdistettiin esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti. Puhtaus määi-itet-10 tiin aminohappoanalyysillä, FAB-MS:llä ia HPLCillä: aminohappoanalyysi laskettu saatu 1 1,03 Lys 1 1,05 Pro 15 1 0,91 Thr FAB-MS: positiivinen ionispektri M+H- m/s 345 (molekyylipaino on 344,415 (344)) 20 HPLC: kolonni: uBondapak Che 3,8 mm x 30 cm liuotin: lineaai'inen gx-adientti 5 - 95 % B 20 min aikana; A = 0,1 % TFÄ/Hr-0 ia B = 0. 1% TFA/CHeCN; virtausnopeus 1,5 crrv! min 1 detektio: UV allonpituudella 230 nm.

25

Puhtaus oli > 8 0 %. Tämä nostettiin > 9 5 %: iin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.

Esimerkki 3: Lvs-D-Pro-Thr:n valmistus (2) 30 Tripeptidi Lys-B-Pro-Thr valmistettiin myös kiintofaasisyn-teesillä Boc-aminosuoiar-yhmää käyttäen. Lähtöainehax't.si oli : Boc-Thr- (bentsyyli (Bsl) ) -ö-hartsi . Suorittaen suo jarylimän poiston 20-% TFA/DCM:llä (DCM = dikloorimetaani), minkä jälkeen neutralisoitiin 10-% trietyylamiinilla Boc-D-Pro liitet-35 tiin DCC:tä (DCC=disykloheksyylikarbodi-imidi)/DCM käyttäen. Onnistunut liittyminen varmistettiin Kaiser-kokeella. Boc-D-Pro-tähteen suojaryhmänpoiston ia neutralisoinnin jälkeen lo-pullinen tähde liitettiin Boc-Lys-(bentsyylioksikarbonyyli- « 11 11 95273 (Z))-johdannaisena, jolloin saatiin peptidihartsi.

Peptidihartsi lohkaistiin HF:llä 0 °C:ssa 45 min ajan, jolloin saatiin raakapeptidi. Lohkaisun aikana käytettiin 5 anisolia sieppaajana. Raakapeptidi puhdistettiin "Kieselgel 60"-silikageelillä käyttäen butanoli:pyridiini:etikkahappo:-H20 (B:P:A:W)-liikkuvaa faasia suhteessa 90:90:18:72. Liuottimen tyhjiössä poistamisen jälkeen näyte lyofilisoitiin vedestä, jolloin saatiin puhdas peptidi.

10 aminohappoanalyysi laskettu saatu 1 1,04 Lys 1 0,95 Pro 1 0,89 Thr 15 ohutlevykromatografia: 1. B:P:A:W suhteessa 60:20:6:24 antoi yhden pisteen, ninhyd-riinipositiivinen, Rf 0,21 2. B:A:W suhteessa 3:1:1 antoi yhden pisteen, ninhydriinipo-20 sitiivinen, 0,24.

HPLC: Saatu tulos esitetään kuvassa 1, jossa I merkitsee liuotinrintamaa. HPLC-moodi: Gilson, kolonni: Vydac C,18. Liuottimet: A 0,05 M NaH2P04 ja B 60 % CH3CN A:ssa.

25 Gradientti: lineaarinen 0 - 100 % B 40 minuutissa, piirturi: 2 mm/min. Detektori: 210 mm AUFS.

Esimerkki 4: Lvs-Pro-Val:n valmistus

Tripeptidi Lys-Pro-Val (KPV) syntetisoitiin ja puhdistettiin 30 esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Puhtaus määritettiin amino-happoanalyysillä ja HPLC:llä: aminohappoanalyysi

Lys Pro Vai 35 laskettu: 1,00 1,00 1,00 saatu: 0,87 1,15 0,98

HPLC

12 95273

Puhdistetun tripeptidin HPLC-tulos esitetään kuvassa 2. kolonni: Vydac C„ 4,6 mm x 25 cm

Liuotin: Lineaarinen gradientti 0-30 % B 30 minuutin aikana 5 virtausnopeus: l,5cm3 min'1 A = 0,1 % TFA/HjO B = 0,1 % TFA/CH3CN

Detektio: UV aallonpituudella 230nm.

10 Esimerkki 5: Lys-D-Pro-Val:n valmistus Tämä tripeptidi syntetisoitiin ja puhdistettiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Analyysitulokset ovat seuraavanlaiset: aminohappoanalyys i 15 Lys Pro Vai laskettu: 1,00 1,00 1,00 saatu: 1,25 1,00 0,75

HPLC

20 Puhdistetun tripeptidin HPLC-tulos esitetään kuvassa 3. Kolonni: Vydac C„ 4,6 mm x 25 cm

Liuotin: Lineaarinen gradientti 0 - 30 % B 30 min aikana Virtausnopeus: 1,5 cm3 min'1 A = 0,1 % TFA/H20 25 B = 0,1 % TFA/CHjCN

Detektio: UV aallonpituudella 230 nm.

Vertailuesimerkki: IL-IS:n kivulle herkistävä aktiivisuus IL-IS:n kivulle herkistävä aktiivisuus tutkittiin modifioi-30 dulla Randall-Sellito-rotankäpälänpuristustestillä (Ferreira et ai, Eur. J. Pharmacol. 53, s. 39-48, 1978). IL-Ιβ (ja esimerkissä 7 käytetty IL-la) olivat ihmisen yhdistelmä-DNA-proteiineja, jotka oli ostettu Genzyme Ltd:stä ja kalibroitiin Interim-referenssireagensseja vastaan (nämä ovat tilap-35 äisiä biologisia standardeja laitoksesta National Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, GB: IL-la:lle ti „ 95273 1 yksikkö = 10 pg ja IL-IB:lie 1 yksikkö = 10 pg).

Tutkittiin bilateraalisen kivulle herkistymisen (nociception) kehitystä IL-IB:n ruiskeen antamisen jälkeen rottien yhteen 5 käpälään, ja sen kestoa esikäsiteltäessä indometasiinilla (INDO). IL-IB annettiin joko intraplantaarisesti (ipl, ruiskeen tilavuus = 0,1 ml) tai vatsaontelonsisäisesti (ip>, ruiskeen tilavuus = 0,3 ml). Indometasiinia annettiin ipl, 100 ug 0,1 ml:ssa.

10

Kivulle herkistymistä arvioitiin käyttämällä rottien (Wistar-rottia, koiraita, paino 135 - 170 g) takakäpäliin vakio 2,7-kPa painetta, joka lopetettiin, kun eläimillä ilmeni ominainen palelemisreaktio (reaktioaika). Kivulle herkistyminen 15 kvantisoitiin reaktioajan muutoksena (Δ reaktioaika, s), joka saatiin vähentämällä 1, 2, 3 tai 4 h kivulle herkistävän aineen annon jälkeen mitattu arvo ennen ruisketta mitatusta kontrollireaktioajasta (0-hetki). Kokeen suorittaja ei ollut tietoinen ryhmän saamasta käsittelystä.

20

Tulokset esitetään kuvassa 4. Panelissa A, Il-IB on annettu ipl. Määritettiin IL-lB:n kivulle herkistävä vaikutus ruiskutetuissa käpälissä (täytetyt, symbolit ia ehjät linjat) ja vastapuolisissä käpälissä (avoimet symbolit, ja katkoviivat).

25

Paneleissa B ja C, tulokset on esitetty "aloinä käyrien alla" esitettyinä mielivaltaisina yksikköinä ja laskettuina tiedoista, jotka saatiin mittaamalla kivulle herkistyminen ajan-hetkillä 0, 1, 2, 3 ja 4 h nosiseptisen stimuloinnin jälkeen 30 (Ferreira et ai, 1978). Pystysuorat pylväät, ovat. keskiarvojen standardipoikkeamia (s.e.m.) 5 rotan ryhmillä saaduista tuloksista.

Paneleissa B ja C esitetään IL-lB:n 0,05 U:n kivulle herkis-35 tävä vaikutus annettuna ipl (B) ja ip (C) ja 30 min etukäteen annetun indometasiiniesikäsittelyn vaikutus. Esikäsittely heikentää merkittävästi kipuherkistysvastetta vain käsitellyissä käpälissä (I). Vastakkaisissa käpälissä (CL) ei ollut 14 95273 vaikutusta, minkä mukaan IL-IS aiheuttaa kivulle herkistämistä vapauttamalla prostaglandiinityyppisiä aineita kipuär-sykkeitä johtavien hermojen läheisyydessä.

5 Esimerkki 6: 3 tripeptidin vaikutus IL-lB:n aiheuttamaan kivulle herkistymiseen 3 tripeptidin vaikutus IL-IS:n aiheuttamaan kivulle herkistymiseen tutkittiin rottaryhmillä. 3 tripeptidiä olivat Lys-Pro-Thr (KPT), Lys-D-Pro-Thr (K(D)PT) ja peptidi Lys-Asp-Asp 10 (KDD), joka ei kuulu keksinnön suoja-alaan. Tulokset esitetään kuvassa 5.

Kuvassa 5 panelissa A esitetään ihonalaisesti (se) annetun KTP-, K(D)PT- ja KDD-esikäsittelyn merkityksen 30 min myö-15 hemmin ip-ruiskeena annetun IL-lS:n kivuherkistysvasteisiin. Panelissa B esitetään K(D)PT:n annoksesta riippuvan antagonismin 30 min myöhemmin vatsaontelonsisäisesti annettua IL-16:n (0,05 U/150 g) kivunherkistysvastetta kohtaan. Jokainen symboli tai histogrammi edustaa keskimääräistä vas-20 tetta 5 eläimen käsittelyryhmässä. Pystysuorat pylväät ovat s.e.m.:iä.

Esimerkki 7: Peptidin K(D)PT vaikutus IL-la:n ia IL-IS:n aikaansaamaan kivulle herkistymiseen 25 IL-la:n ja IL-lE:n kivulleherkistysvasteet arvioitiin rotilla. Määritettiin K(D)PT:n vaikutus näihin vasteisiin. Tulokset esitetään kuvassa 6. Arvot ovat keskiarvoja ± s.e.m 5 eläimen käsittelyryhmässä. K(D)PT (200 μg/150 g rotan painot) annettiin se, 30 min ennen IL-l:n ip-ruisketta.

30

Kuvassa 6 osoitetaan, että IL-lS:n vastapuolinen kivulle herkistävä vaikutus pystyttiin voittamaan kasvattamalla IL-1β:η annosta, mikä on sopusoinnussa kompetitiivisen anta-gonian kanssa. Kuvasta 6 nähdään myös, että IL-Ιβ oli kivul-35 le herkistävänä aineena noin 3000 kertaa voimakkaampi kuin IL-Ια, ja että K(D)PT antagonisoi vain heikosti IL-la:aa, jolta puuttuu sekvenssi Lys-Pro-Thr.

15 95273

Esimerkki 8: Peptidin K(D)PT vaikutus PGEp»;n. karraeeenanin ja IL-IB:n aikaansaamaan kivulle herkistymiseen Peptidin K(D)PT vaikutus PGEa:n, karrageenanin ja IL-lB:n aikaansaamaan kivulle herkistymiseen arvioitiin rotilla. Tu-5 lokset esitetään kuvassa 7. Panelit esittävät tilapäisten kivulleherkistysvasteiden kehittymisen seuraaville aineille: A: PGEr-:lle (100 ng/käpälä), B: karrageenan (100 pg/käpälä) ja C: IL-1B (0,05 U/käpälä). K(D)PT (200 ug/150 g) ruiskutettiin ip 30 min ennen ipl-ruiskeita. Kulein symboli esittää 10 keskivastetta 5 eläimellä käsittelyryhmässä. Pystysuorat, pylväät ovat s.e.m.:iä.

Mitattiin pletismografisesti karrageenan-ruiskeen jälkeen kehittynyt turvotus (Ferx-eira, J. Pharm. Pharmacol., 31, s.

15 648, 1979), 4 h käsittelyn jälkeen. Turvotus ei vähentynyt. K(D)PT:llä esikäsittelemällä (arvoja ei esitetty). 2 h IL-lB:n tai karrageenanin jälkeen annetulla K(D)PT:llä ei ollut vaikutusta indusoituun kivulle herkistymiseen, kun taas sen-taalisesti vaikuttavat kipua lievittävät, aineet, esimerkiksi 20 morfiini ja dipyroni, ja perif ei'isest.i vaikuttava kipua lievittävä BW 443C pystyvät antagonisoimaan jatkuvaa kivulle herkistymistä. Esitettynä yhdessä havainnon kanssa, että K(D)PT:llä ei ollut vaikutusta PGKv· :n aikaansaamaan kivulle herkistymiseen, nämä tulokset osoittavat, että K(D)PT:n kipua 25 lievittävä vaikutus ei ollut, sentx-aalinen eikä nonspesifinen.

Esimex-kki 9: Peptidi K(D)PT:n vaikxitus etikkahapolla ja Ilo-prostilla aikaansaatuun kivulle hex-kistvmiseen Määritettiin peptidi K(D)PT:n vaikxitus etikkahapolla ja Ilo-30 prostilla aikaansaatxiun kivxille hexkistymiseen 5 hiix'en x-yh-millä. Iloprost on prostasykliinin stabiili analogi, ja sillä on kaava: 35 5 \ 16 95273

f oOOH

^CH3

OH OH

10 K(D)PT annettiin se ennen 0,6-% etikkahapon tai Iloprost.in (10 ug/kg) ip-ruiskeita, jotka aiheuttivat vääntelyjä (kiemurtelua). Tämän vasteen %-inhibitio K(D)PT-esikäsit.telyn 15 jälkeen esitetään taulukossa 1:

Taulukko 1 K(D)PT %-inhibitio etikkahapon %-inhibitio Iloprostin mg/kg (0.6-%) vasteeseen (10 ug/kg) vasteeseen 20 0 0 0 0,5 11 0 2 36 27 8 45 33 25 32 41 38

Esimerkki 10: Vertailu peptidin K(D)PT:n ia indometasiinin vaikutuksesta etikkahapon ia Iloprostin aikaansaamaan kivulle herkistymiseen 30 Toistettiin esimerkki 9 joillain hiiriryhmillä, jotka saivat eri annoksia indometasiinia paremminkin kuin peptidiä K(D)PT. Kontrollihiiriryhmä ei sanut indometasiinia eikä K(D)PT;tä. Tulokset esitetään taulukossa 2. Arvot ovat väänt.elehtimisten kokonaismäärä mitattuna 20 min aikana ip-altistuksen jälkeen.

35

Taulukko 2 . _ .

käsittely kont- indometasiini (mg/kg)) K(D)PT (mg/kg) ·, ip-ruiske 1'olli 1,25 5,0 20,0 (o, 5 2,0 8,0 32,0

II

17 95273 etikka- 45,3 34,6 24,3 19,3 38,6 31,6 24,2 25,6 happo 0,6% ±2,8 +4,1 ±5,7 ±2,6 ±2,0 ±2,4 ±2,0 ±1,5 0,1 ml/10 g (-%) 23,6% 46,3% 57,4% 14,7% 30,2% 46,5% 43,4% 7 5 ILOPROST 39,4 36,4 29,2 21,3 34,6 26,0 22,4 23,8 10 pg/kg ±6,1 ±4,3 ±2,7 ±1,3 ±3,7 ±2,4 ±1,1 ±3,1 (-%) 6,5% 26,0% 46,0% 9,6% 34,0% 43,2% 40,0% Täten K(D)PT oli tehokas hiirissä etikkahapon ja Iloprostin 10 ip-ruiskeella indusoitujen vääntelehtimisten vähentämisessä. Annos 8 mg/kg K(D)PT:tä sai aikaan maksimaalisen analgesian (annosten 8 ja 32 mg/kg välillä ei ollut eroa), joka oli luokkaa 45 %, joka anelgesia vastasi indometasiiriin annosten 5 ja 20 mg/kg vaikutusta. Indometasiini sai kuitenkin aikaan 15 hiirissä aikaan ruoansulatuskanavan vaurioita, kun taas peptidi K(D)PT ei. Indometasiinin annoksella 20 mg/kg 100 %:lla hiiristä oli ruoansulatuskanavan syöpymistä. K(E>)PT:n annoksella 32 mg/kg ei havaittu vaurioita.

20 Esimerkki 11: K(D)PT ei ole sentraalisesti vaikuttava morfiij-nityyppinen kipua lievittävä aine

Suoritettiin standardi kuumalevytesti (55 °C). Tulokset esitetään taulukossa 3. Tulokset ovat. keskiarvo s.e.m. reaktio-ajasta, joka saatiin vähentämällä ennen käsittelyä saaduista 25 ajoista arvot, jotka havaittiin 1 h lääkkeen annon jälkeen. Taulukosta käy ilmi, ettei K(D)PT ole morfiinityyppinen.

Taulukko 3 suolaliuos Morfiini (mg/kg) K(D)PT (mg/kg) 30 sc-ruiske 3.0_9.0_ 32,0___ -1,1 3,52 5,55 0,37 s ±0,4 ±1,0 ±0,7 ± 3 5 Esimerkki 12: K(B)PT e.i ole aspirii^ i tyyppinen—Lt. s . syki o-oksveenaasin inhibiittori)

Tutkittiin K(D)PT:n ja indometasiinin vaikutusta PGEs>:n va-·’ pautumiseen ihmisen veren vksitumaisills soluilla (MNC).

18 95273 MNC:t eristettiin hienojakoisista kalvojäänteistä (buffy coat residues) tiheysgradienttisentifugoinnilla (Ficoll-hypaque, Sigma), ja suspendoitiin uudelleen RPMI 1640-viljelyväliai-neeseen (Gibco) + 2 % inaktivoitua naudan sikiön seerumia 5 (Imperial Laboratories). Materiaaleja lisättiin inkubointivä-liaineisiin taulukossa 4 esitetyt määrät. K(D)PT ja indometa-siini lisättiin 45 min ennen IL-lB:a tai endotoksiinia. Tulokset esitetään taulukossa 4. Arvot ovat neliöllisiä keskiarvoja ± s.e.m.. PGEe-konsentraatiot mitattiin radioimmuno-10 määrityksellä (NEN Research Products).

Taulukko 4

Inkubointiväli- PGEt--vapautuminen (ng/ml) MNC:llä (5xlOfc aineeseen lisätyt solua/ml) inkuboitiin 4 h seuraavien 15 materiaalit_aineiden kanssa:__ suolaliuos IL-la IL-IB E.coli endotok-kontrolli (50U/ml) (50U/ml) siini" (25/ _o.9% p/til___mlfJ_ suolakontrolli 0,9±0,1 1,8±0,1 2,7±0,2 3,5±0,2 20 (0,9% p/til) 0,1% til/til dime- 1,0±0,1 1,610,1 2,210,2 3,510,2 tyylisulfoksidia (kontrolli K(D)PT:lle) 25 K(D)PT 1,310,3 2,010,2 2,810,2 4,110,3 (200 g/ml, 0,58 mmol/1 0,012% til/til eta- 1,310,2 2,010,2 2,110,1 3,110,2 30 nolia (kontrolli indometasiinille indometasiini 0,031 0,031 0,031 0,031 (2ug/ml, 5,9ymol/l) 0,0002 0,0007 0,0005 0,0004 35 E.coli 0113:H10:K(-) endotoksiini; 25 pg/ml = 0,18 IU/ml

II

• · 19 95273 K(D)PT:llä ei ollut vaikutusta MNC:n aikaansaamaan PGEs-tuo-tantoon, kun taas voimakkaan aspiriinityyppiseri lääkkeen in-dometasiinin 100 kertaa alhaisemmat annokset katkaisivat näiden solujen PGES-tuoton.

5

Esimerkki 13: Peptidien vaikutus IL-lfi:n aikaansaamaan kivulle herkistymiseen

Tutkittiin tripeptidien Lys-Pro-Val (KPV), Lys-D-Pro-Val (K(D)PV) ja Lys-D-Pro-Thr (K(D)PT) vaikutus IL-lJ3:n aikaan-10 saaman kivulle herkistymisen rotilla. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 5. Käsittely annettiin ip 1 h ennen Il-lB:aa, joka myös annettiin ip. Eläimiä oli 5 käsittelyryh-mää kohden.

Mitattiin delta reaktioaika 3 h ΙΙ-Ιβ-annon jälkeen.

15 Kontrolli oli Il-ΐβ (0,05 U), joka annettiin ip. Kontrolliryhmän tulos oli 23,9 ± 0,5 (= 100 %).

Taulukko 5 HOITO_DELTAREAKTIOAIKA (s)_ 20 PEPTIDI ANNOS ug/150g rotan paino _20_50_100_200 K(D)PT ei tes- 18,7±0,5 12,810,6 6,310,4 tattu (-21,8%) (-46,4%) (-73,6%) 25 KPV 18,8±0,3 11,310,5 7,210,6 3,910,3 (-21,3%) (-52,7%) (-69,9%) (-83,7%) K(D)PV 18,210,4 8,510,6 3,810,7 2,810,6 (-23,9%) (-64,4%) (84,1%) (-88,3%) 30

Esimerkki 14: Peptidien vaikutus PGEr»:n aikaansaamaan kivulle herkistymiseen

Tutkittiin tripeptidi K(D)PT:n vaikutus PG£®:n aikaansaamaan kivulle herkistymiseen rotilla. Tulokset esitetään alla tau- 35 lukossa 6. Käsittely annettiin ip 1 h ennen PGEe-ruisketta käpälään (ipl). Käsittelyryhmää kohden oli 5 eläintä. Delta- reaktioaika mitattiin 3 h PGEs--annon jälkeen. Morfiini (0,6 :* mg/150 g) alensi deltareaktioajän 6,1:een 1 0,8 s (-63,7 %) .

« 20 95273

Kontrolli oli PGE<= (100 mg/käpälä). Kontrolliryhmän tulokset olivat 16,8 ± 0,3 (= 100 %) . NT = ei testattu.

Taulukko 6 5 KÄSITTELY DELTRREAKTIOAIKR (s)_ PEPTIDI_ANNOS ug/150 g rotan paino_ 20 50 100 200 K (D) PT NT NT NT 16,7+0,6 10 (-0,6 %) KPV 14,9±0,4 13,0±0,3 9,9±0,2 7,8±0,6 (-11,3%) (-22,6%) (-41,1%) (-53,6%) 15 K{D)PV 14,0±0,4 13,410,4 9,010,2 6,010,3 (-16,7%) (-20,2%) (-46,4%) (-64,3%)

Esimerkki 15: Peptidien vaikutus DbcAMPzn (kontrolli) aikaansaamaan kivulle herkistvkseen 20 Tutkittiin tripeptidien KPV ja K(D)PV vaikutus DbcAMP:n aikaansaamaan kivulle herkistymiseen rotilla. Tulokset esitetään alla taulukossa 7. Käsittely annettiin ip 1 h ennen DbcAMP-ruiskeen antoa käpälään ( ipl ) . Käsit-telyryhmää kohden oli 5 eläintä. Delt.areaktioajat mitattiin 3 h DbcAMP:n jäl-25 keen. Morfiini (0,6 mg/150 g) alensi deltareaktioajän 6,2: een 10,4 s (-64,0%). Kontrolli oli DbcAMP (100 ug/käpälä). Kontrolliryhmän tulokset olivat 17,2 1 6,4 s (= 100 %)·

Taulukko 7 30 HOITO_PELT ARE AKT IOAI KA_ PEPTIDI_ 200 ug/150 e rotan paino_____ K(D)PT 17,8 1 0,6 (+3,5 %) KPV 15,8 1 0,3 (-8,1 %) 35 K(D)PV 16,0 1 0,2 (-7,0 %)

Esimerkki 16: D-Lvs-Pro-Thr:n valmistus : Tripeptidi D-Lys-Pro-Thr syntetisoitiin ja puhdistettiin esi-

II

21 95273 merkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti. Puhtaus määritettiin aminohappoanalyysillä, FAB-MS:llä ja HPLC:llä: aminohappoanalyysi laskettu saatu 5 1 0,97 Lys 1 1,03 Iiro 1 1,00 Thr FAB-MS: positiivinen ionispektri M+H‘K m/s 345 (molekyylipaino 10 on 344,415 (344)) HPLC: kolonni: Vydac Cj0 4,6 mm x 25 cm liuotin: lineaarinen gradientti 0 - 30 % B 30 min aikana; A = 0,1 % TFA/Hf-0 ja B = 0.1 % TFA/CHsiCN; virtausnopeus = 1,5 cm3 min"1 15 Saatu tulos esitetään kuvassa 8.

Esimerkki 17: Lvs-D-Pro:n valmistus

Dipeptidi Lys-D-Pro syntetisoitiin ja puhdistettiin esimerkin 1 mukaisesti. Puhtaus määritettiin aminohappoanalyysillä ja 20 HPLCrllä.

aminohappoanalyysi laskettu saatu 1 1,04 Lys 1 0,96 Pro 25 HPLC: kolonni: Vydac Ct.a 4,6 mm x 25 cm liuotin: lineaarinen gradientti 0 - 10 % B 30 min aikana; A = 0,1 % TFA/Hj-f-0 ja B = 0,1 % TFA/CH,,CN; virtausnopeus = 1,5 ml min.....3 ; piirturin nopeus = 5 mm min'"'1 30 Saatu tulos esitetään kuvassa 9.

Esimerkki 18: Lvs-D-Pro-Asn:n valmistus

Tripeptidi Lys-D-Pro-Asn syntetisoitiin ja puhdistettiin esimerkissä 1 kuvatun menetelmän mukaisesti. Puhtaus määritet-35 tiin HPLC:llä samoissa olosuhteissa kuin esimerkissä 17, aminohappo analyysi ja FAB-MS.

• 22 95273 aminohappoanalyysi laskettu saatu 1 1,00 Lys 1 0,90 Pro 1 1,03 Asn 5 FAB-MS: positiivinen ionispektri antoi M+H*~ m/z 358 (molekyy-lipaino 357,413).

Esimerkki 19: Peptidien vaikutus etikkahapon aikaansaamaan 10 kivulle herkistymiseen Määritettiin peptidien vaikutus etikkahapon aikaansaamaan kivulle herkistymiseen hiiriryhmissä (LÄCA, koiras, 25 - 35 g, 6 < n < 9), jotka käsiteltiin 1 annoksella jotain peptideistä tai morfiinilla, indometasiinilla tai suolaliuoksella 15 (0,1 ml/10 g). Lääkkeet annettiin vatsaontelonsisäisesti (ip) tai oraalisesti (po) 30 min ennen etikkahapon (0,6-% tila-vuus/tilavuus, 0,1 ml/10 g) ip-ruisket.ta. Lääkekäsit.telystä tietämätön tarkkailija laski vääntymisten (vatsaväänteiden tai- kuristimien) lukumäärän aikavälillä 10 ja 20 min ip-al-20 tist.uksen jälkeen etikkahapolla. Laskettiin mediaaniax'vot ja ne käsittävät taulukoissa 8-11 annetut tiedot. Suluissa esitetyt arvot ovat %-vähenemisiä kontrolliarvoista hiirillä, jotka oli x'uiskutettu suolaliuoskontx-ollilla. x : morfiini 2,5 mg/kg ip; : morfiini 1,25 rng/kg ip.

25

Taulukoista 6-11 voidaan nähdä, että tripeptideillä K(D)PV (esimerkki 5), (D)KPT (esimei'kki 16), KPT (esimerkki 1) ja K(D)PT (esimerkit 2 ja 3), jotka annettiin ip annoksena 2 -100 mg/kg, oli kaikilla annoksesta riippuvaa kipua lievittä-30 vää aktiivisuutta etikkahapon aikaansaamaa kivulle herkistymistä vastaan hiirillä. Tässä kokeessa 30 mg/kg ip kutakin peptidiä oli ilmeisesti suunnilleen yhtä tehokas kuin 1,25 mg/kg-annos morfiinia ip tai 5 mg/kg indometasiinia (ip) (taulukot 8 ja 10). Edelleen 4 tripeptidillä oli kipua lie-35 vittävä aktiivisuus oraalisesti (po) annettaessa (taulukko 11). Myös dipeptidi K(D)P oli tehokas kivun lievittäjä joko annettuna ip (taulukko 9) tai po (taulukko 11).

* 4 23 95273

Taulukko 8 Lääkkeen annos (mg/kg, ip) lääke_2_..IQ_30-100.

5 K(D)PV 19(-33 %) 17(-38 %) 15,5(-45 %) 7(-74 %) D)KPT 20,5(-28 %) 24,5(-11 %) 14(-50 %) 9(-66 %) KPT 19(-33 %) 19(-31 %) 14(-50 %) 8(-70 %) K(D)PT 24(-16 %) 22(-20 %) 15(-46 %) 13,5(-49 %)

Morfiini 8(-72%)1 8(-71%)1 14,5 (-4,8 % )B 8(-71%)1 10

Taulukko 9 Lääkkeen annos (mg/kg, ip) lääke_5_10_20 15 K(D)P 14,5(-45 %) 6(-77 %) K(D)P 11(-58 %) 6(-77 %)

Taulukko 10 Lääkkeen annos (mg/kg, ip) 20 lääke_2.5_5_LQ_

Indometasiini 16,5(-37 %) 10(-61,5 %) 10(-61,5 %)

Taulukko 11 Lääkkeen annos (mg/kg, po) 2 5 lääke_5_LO_20_100_ K(D)PV 13(-52 %) (D)KPT 11(-59 %) KPT 9(-67 %) K(D)PT 8(-70 %) 30 K(D)P 19(-10 %) 13,5(-36 %) 14(-38 %)

Claims (7)

95273

1. Menetelmä kipua lievittävän yhdisteen valmistamiseksi, joka yhdiste on (a) kaavan (I) mukainen peptidi: 5 X-N-CH—CO—Y I I CH, CH, (I) ^ / 10 ch2 jossa X on H2N- (CH2)4-CH(NH2)-C(=0) - tai H2N-C(=NH) -NH- (CH^j-CHOtt^) -C(=0) -, ja Y on hydroksiryhmä tai aminohappotähde, sillä ehdolla, 15 että (i) proliinitähde on D-Pro, kun X on L-Lys tai L-Arg; ja (ii) kaavan (I) mukainen peptidi ei ole L-Arg-D-Pro-L-Pro, Arg-D-Pro-L-Lys, D-Lys-D-Pro-D-Arg, D-Lys-L-Pro, L-Arg-D, L-Pro, L-Lys-D-Pro-L-Val, D-Lys-L-Pro-L-Val tai D-Lys-D-Pro-D-

20 Vai; (b) kaavan II mukainen peptidi: H2N - CH - CO - N-CH-CO-NH-CH-COOH I I I I 25 (CH2)4 CH2 CH2 CHOH I \ / I nh2 ch2 CH3 (II) (c) edellä (a)- tai (b)-kohdassa määritellyn mukaisen pep-30 tidin C-terminaalinen amidi; tai (d) missä tahansa kohdassa (a)-(c) määritellyn mainitun peptidin tai amidin farmaseuttisesti hyväksyttävä suola, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää mainitun yhdisteen kemiallisen syntetisoinnin, mahdollisesti C-terminaalisena 35 amidina, kondensoimalla rakenneosina olevat aminohapot järjestyksessä, jossa ne ovat peptidissä käyttäen konventionaalista kiintofaasi- tai liuosmenetelmää ja haluttaessa saatu yhdiste voidaan muuttaa farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolakseen. II . 40 95273

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (I) mukainen peptidi on L-Lys-D-Pro-L-Thr, D-Lys-L-Pro-L-Thr, D-Arg-L-Pro-L-Vai, L-Arg-D.- Pro-L-Val, D-Arg-D-Pro-L-Val, D-Arg-L-Pro-L-Thr, L-Arg-D-Pro-L-Thr tai D-

5 Arg-D-Pro-L-Thr.

3. H2N-C (= NH) -NH- (CH2) 3-CH (NH2) —C (=0) -N-CH-CO-Y3 I I ch2 CH2 (B) \ / ch2 35 jossa Y3 on treoniini-, väliini-, alaniini-, seriini-, leu-siini-, isoleusiini-, asparagiinihappo- tai asparagiinitäh-de, joka tähde voi olla D-isomeerimuodossa, L-isomeerimuodossa tai D- ja L-isomeerien seos, sillä ehdolla, että pro-40 liinitähde on D-Pro, kun arginiinitähde on L-Arg; (c) L-Lys-D-Pro tai L-Arg-D-Pro. 95273

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan I mukainen peptidi on L-Lys-D-Pro-L-Asn, L-Lys-D-Pro tai L-Arg-D-Pro. 10

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaavan (I) mukainen peptidi on: (a) kaavan (A) mukainen peptidi:

15 H,N- (CH,) 4—CH (NH2) —C (= O) -N-CH-CO-Y3 I I CH2 CH2 (A) \ / ch2 20 jossa Y3 on treoniini-, väliini-, alaniini-, seriini-, leu-siini-, isoleusiini-, asparagiinihappo- tai asparagiinitäh-de, joka tähde voi olla D-isomeerimuodossa, L-isomeerimuo-dossa tai D- ja L-isomeerien seos, edellyttäen, että 25 (i) proliinitähde on D-Pro, kun lysiinitähde on L-Lys; ja (ii) peptidi ei ole L-Lys-D-Pro-L-Val, D-Lys-L-Pro-L-Val tai j D-Lys-D-Pro-D-Vai; (b) kaavan (B) mukainen peptidi:

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi C-terminaalisen amidin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän.suolan formuloinnin hyväksyttävän kantajan tai laimennusaineen kanssa. 5