CN1965082A - 人源化抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了特异性结合AF-20的新型人源化和嵌合抗体、人源化抗体片段、所述抗体的多肽序列及其衍生物,以及它们的制备方法。这些人源化和嵌合抗体、抗体片段和多肽序列可用于治疗表达AF-20的癌症,以及诊断目的,如表达AF-20的肿瘤或癌细胞的体内成像。
Description
发明领域
本发明的实施方式涉及能与腺癌细胞抗原AF-20结合的人源化和嵌合抗体、片段、多肽或其衍生物,AF-20抗原与癌细胞特别是肝癌细胞、结肠和肺的腺癌细胞相关。
相关领域描述
癌症是美国社会的第二大死因。尽管发展到现在,美国人口中每100,000人的癌症发病率自1950年以来从未下降,事实上还有小幅上升。因此,仍然迫切需要有效的癌症治疗方法,以及需要诊断、评价和监测癌症病例的新方法。
尤其需要靶向转移的预防和/或治疗方法。癌症最具破坏性的方面之一是恶变瘤细胞倾向于从原发灶播散并转移至远端器官。尽管外科手术治疗原发瘤和侵入疗法(aggressive therapy)取得进展,但大多数的癌症患者死于转移性疾病。动物实验表明循环系统中约0.01%来自实体瘤的癌细胞成功形成转移集落(Fidler,1993)。肿瘤相关抗原的特异性单克隆抗体(以下简写为“moAb”)为治疗癌症和靶向转移提供了很大的希望。
肝细胞癌-肝细胞癌(以下简写为“HCC”)是世界上癌症相关死亡的主要原因之一。肝癌中80%以上为HCC。世界不同地区HCC的发病率显著不同,亚洲和非洲发病率至少是美国的十倍。许多因素被鉴定是该病病因学中的潜在重要原因。慢性肝病如慢性乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染或肝硬化使个体更易患HCC。世界上许多区域,特别是亚洲和非洲的HBV和HCV高感染率,可能使HCC成为最常见的人类恶性肿瘤之一。存在于某些食物如树木坚果和花生中的黄曲霉毒素,也被认为使个体更易患HCC。男性中肝癌的发病率比女性高2-4倍,因此激素因子在HCC病因学上也许具有其重要性。
HCC预后差,通常3-6个月即死亡。被诊断为HCC的患者中只有约6%存活5年。可手术治疗局部HCC,例如部分肝切除术或全肝切除术和肝移植,若无法切除则用消融疗法如射频消融、冷冻手术或经皮乙醇注射或经肝动脉输注的化疗或化学栓塞。仅有10-20%的HCC手术能够成功切除全部癌组织。可用全身化疗或放疗治疗晚期HCC,但效果有限且少有成功。
HCC的症状一般在病程晚期变明显,这使治疗更加困难。诊断测试包括甲胎蛋白(AFP)血液测试。高AFP测试仅能表明肝癌的可能性,却不能确诊。50-75%原发肝癌患者具有高水平AFP。其它条件下,尤其是肝硬化、慢性肝炎感染和其它数种癌症也产生高水平AFP。除AFP血液测试外,数种检测酶、胆红素和蛋白水平的其它测试可鉴定可能的肝功能障碍。诊断性生成像如肝扫描、计算机辅助X线断层摄影术(CT)扫描、超声波或磁共振成像(MRI)可鉴定潜在的肝脏肿瘤和活检部位。上述方法单独应用无法诊断肝癌。肝活检仍旧是精确诊断HCC的最佳途径。这个过程通常非常安全,但由于一些肿瘤与多根血管相连,仍有小于0.5%的病例可发生致命的大出血。
肺癌-在美国,肺癌是癌症死亡的第一大原因,在世界范围内也是癌症死亡的主要原因之一。感染个体的5年生存率(约13%)在过去25年中未显著改变。经过数年的急剧升高,该病发生率似乎略有下降。吸烟在男性中引发约90%,在女性中引发约80%的肺癌病例。吸烟的时间越长数量越多,罹患肺癌的危险越大。全部吸烟者中约10-12%最终会发生肺癌。
原发性肺癌主要分为两类:非小细胞癌和小细胞癌。与小细胞癌相比,非小细胞癌更常见且预后更好。非小细胞肺癌主要分为三种类型:鳞状细胞癌(也称表皮状癌)、腺癌和大细胞癌。腺癌是最常见的肺癌类型,占总数的30-35%。
原发性肺癌的预后差。确诊后,小细胞癌患者中1%以下能够存活5年。相反,非小细胞癌患者的预后取决于癌症分期,尤其是存在或不存在远端转移。远端转移与五年生存率小于5%相关。肝脏是上述转移的常见位置。
目前通过手术切除、放疗和化疗的联合来治疗小细胞癌。尽管采用这些侵入性疗法,但该疾病的预后极差。治疗非小细胞肺癌的选择包括手术摘除癌变灶。不幸的是,此种外科手术仅可能在该疾病最早期阶段应用,即使手术,五年生存率也近似为25%-40%。虽然可施用放疗以治疗较晚期的非小细胞癌,但放疗预后很差。化疗对非小细胞癌作用有限但能显著延长转移性非小细胞癌的生存期。
胸部X射线、肺部CT扫描、支气管镜和活检等有利于诊断和检测肺癌。
结直肠癌-结肠和直肠癌是第二大癌症死因,大约占美国癌症死亡的20%。5年存活率约为63%;远端转移与存活率大大降低(小于10%)相关。确诊患有结直肠癌的病人中大约60%会发生肝转移,治疗金牌标准仍然是切除肝脏。尽管有手术治疗,大多数肝切除病人会复发且约50%复发在肝脏内。几乎所有结直肠癌均为腺癌。
诊断的延误显著影响结直肠癌的预后。若检测得早,结直肠癌经常能成功治疗。因此,例如,肿瘤局限于肠壁内的病人通常在手术切除后很有机会治愈(5年生存率大于95%)。然而肿瘤发展至浆膜层和肠脂中时,切除后5年存活率则降至80%。淋巴结转移使5年存活率降至40%,远端转移(如肝、肺、骨、脑)使5年存活率降至10%以下。由于结直肠癌的症状在疾病早期常常不明显且不特异,故常常延误了检测。结果是,当作出阳性诊断结论的时候,癌症已经良好地建立以至于难以治愈或不可能治愈。通常结直肠癌对化疗的反应差。尽管可能减轻痛苦,但化疗不能延长确诊为结直肠癌的患者生命,尤其当肿瘤广泛播散时。
美国预防服务特种部队(USPSTF)强烈推荐医生对50岁以上男女性进行结直肠癌筛查。USPSTF有证据表明定期的排泄物中便血检测(FOBT)降低了结直肠癌的死亡率,且单独使用乙状结肠镜或与FOBT联用能降低死亡率。然而,常用的结直肠癌筛查测试可产生假阳性结果,假阴性结果可延误对疾病的检测。例如,FOBT检测到便血需要结肠恶变发展到出血阶段。乙状结肠镜则要求结直肠癌变可见,且诊断会因其它病变如痔疮、息肉和直肠炎而变得复杂。结肠镜具有相似缺点。
肿瘤相关抗原的特异性单克隆抗体(“moAb”)为癌症的研究、诊断、监测和治疗提供了光明前景。然而,明显的实际问题阻碍了将其广泛用于人和其它哺乳动物体内。
一个主要问题是非人源的单克隆抗体通常具有免疫原性,从而限制其有效性,在某些情况下,引起危险的过敏反应。大多数moAb为鼠源,注射入人体后通常具有免疫原性。对此类外源moAb的免疫应答包括产生特异性高亲和力抗体与moAb结合并实现moAb的消除,从而通过提高moAb体内清除率并抑制moAb与靶向的肿瘤相关抗原的结合能力显著降低moAb的有效性。
已知可降低非人抗体免疫原性的许多方法,包括:
·如Cabilly等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984);Boulianne G.L.等,Nature 312;643-646(1984);Neuberger,M.S.等,Nature 314:268-270(1985)所述,将非人源抗体的重链和轻链可变区连接在人抗体的恒定区上产生嵌合抗体;
·如Winter,美国专利号5,225,539;Jones,P.T.等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann,L.等,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen,M.等,Science239:1534-1536(1988)所述,用人抗体的相应片段取代非人互补决定区(CDR)或CDR序列(也称作CDR嫁接)产生嵌合抗体。也可如Queen等,美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762、6,180,370;Carter等,美国专利号6,054,297、6,407,213和6,639,055,Adair,美国专利号6,632,927以及Winter,美国专利号6,548,640所述,包括用非人抗体的相似位点的残基取代人抗体的一些FR残基以保持抗原结合能力。
·选择性取代非人抗体可变区的残基(也称作镶面或表面再造)产生人源化抗体,例如Pedersen等,美国专利号5,639,641,Studnicka等,美国专利号5,766,886和5,821,123,以及Carr等,美国专利申请号10/300215所述。
·将抗体或抗体片段与自身抗原序列连接使非人抗体或抗体片段免疫原性更低,如Jordan等,美国专利号6,652,863所述。
产生嵌合或人源化抗体方法的数量表明了开发合适候选抗体中遇到的困难。经常发现获得的抗体对靶向的肿瘤相关抗原的亲和力或特异性太低,仍引起不良免疫应答,难以表达可应用量的抗体或抗体具有其它不良特性。
另一个主要关注点涉及抗体靶向的肿瘤相关抗原。疗效依赖于抗原对肿瘤的特异性、抗原在肿瘤生长中的作用和其在肿瘤细胞中的表达。肿瘤相关抗原可能在正常组织中广泛表达,因此治疗需要更高的有效剂量,增加了不良副作用的风险。也可能仅有小部分肿瘤、任一肿瘤的小部分细胞或两者可表达该抗原。该抗原可能仅由肿瘤细胞分泌而不在肿瘤细胞表面表达,使得细胞毒治疗的靶向更加困难(若非不可能)。结合于细胞表面表达的抗原可能不导致细胞毒剂内化到细胞中或不导致所需的抑制功能。
尽管存在这些障碍,在多次尝试之后,少数几个单克隆抗体已获得管理机构批准。批准的基于抗体的治疗包括:
·曲妥珠单抗(贺赛汀),一种结合人表皮生长因子受体2(HER2),从而在过表达HER2的转移性乳腺癌中抑制肿瘤细胞的增殖和迁移的人源化单克隆抗体(moAb)。目前表明可单用或与另一种化疗药紫杉醇联用治疗过表达HER2蛋白的转移性乳腺癌。贺赛汀在临床试验中用于治疗非转移性乳腺癌,也在临床试验中研究它对可能过表达HER-2蛋白的其它类型癌症,包括骨肉瘤、非小细胞肺癌和胰腺癌、唾液腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌以及膀胱癌的治疗。也研究了与细胞毒素如格尔德霉素偶联时的用途。
·阿来组单抗(坎帕斯),一种结合CD52抗原的人源化moAb。目前表明可用于治疗顽固性B-细胞慢性淋巴细胞白血病,正在研究其在治疗其它慢性淋巴细胞性或慢性髓性白血病中的用途。
·吉姆单抗(Mylotarg),一种结合CD33抗原的人源化moAb,CD33是一种在约90%急性髓性白血病(AML)病例中表达的蛋白。Mylotarg与一种细菌毒素卡奇霉素偶联,卡奇霉素诱导DNA链断裂和细胞凋亡。表明其可用于治疗AML。
·利妥昔单抗(利妥昔),一种结合发现在成熟B细胞表面表达的CD20抗原,从而标记细胞并使细胞被人体免疫系统破坏的嵌合moAb。表明可用于治疗复发性或顽固性、低级或滤泡型B-细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)。对B-细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的治疗用途也在研究中。
·替伊莫单抗(Zevalint),鼠moAb,偶联于β-发射型同位素钇-90(90Y),也与CD20结合并在靶细胞和邻近细胞中诱导细胞损伤。表明可与利妥昔联用以治疗NHL。
·托西莫单抗(Bexxar),一种也结合CD20并与另一种放射性同位素碘-131(131I)偶联的鼠moAb。表明用于治疗利妥昔化疗后复发的NHL。
·依决可单抗(Panorex),一种结合上皮细胞粘附分子的鼠moAb。在欧洲批准用于治疗结直肠癌,在美国正在进行治疗结直肠癌和乳腺癌的III期临床试验。
其它处于III期临床试验的治疗性抗体包括:
·西妥昔单抗(艾比特斯),一种结合表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合moAb,正研究用于治疗头颈癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺和前列腺癌。
·贝伐单抗(阿瓦斯丁),一种结合血管内皮生长因子(VEGF)的人源化moAb,被研究用于治疗转移性结直肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。
通过应用诸如嗜菌体展示、细菌或酵母细胞表面展示(如Kieke,美国专利号6,300,065和Wittrup等,美国专利号6,423,538)和其它定向分子进化技术(如Co等,美国专利号5,714,350)等设计用于提高人源化抗体和抗体片段的特性和性能的方法,人源化抗体和抗体片段也可用于产生优化的新疗法。
嵌合和人源化抗体以及抗体片段也用于癌症诊断、分期和治疗监测。体内半衰期延长和免疫原性降低使moAb可能在体内免疫成像中更加实用,应用时将可探测标记如放射性核素或共振成像剂与抗体或抗体片段偶联。此类抗体和抗体片段亦可用于测定肿瘤在开始治疗前是否表达该抗原、确定局部给予抗体的部位和检测治疗后的复发。与其它抗体一样,此类抗体亦可用于免疫组织学和免疫测定。
AF-20肿瘤相关抗原是细胞表面迅速内化的180kDa同型二聚体糖蛋白,在人肝细胞癌(HCC)细胞、以及远端转移如肺腺癌细胞和结直肠癌细胞中大量表达。用肝细胞癌细胞系FOCUS免疫小鼠并在一系列细胞系中筛选有抗体活性的杂交瘤,发现高亲和力鼠单克隆抗体(AF-20 moAb),以此发现AF-20抗原。在与HCC组织相邻的正常肝组织中,以及在除肾上腺外的其它正常组织中未发现AF-20抗原表达。在肾上腺球状带的细胞亚群和小肠肠道内隐细胞(crypt cell)中发现有低水平的AF-20抗原表达(参见Wands等,美国专利号5,703,213;Wilson等,“伴随人肝细胞转化成恶性表型的细胞表面改变”(Cell-surface changes associated with transformation of humanhepatocytes to the malignant phenotype),Proc Natl Acad Sci USA(198885:3140-4);Takahashi等,“两种新型肿瘤相关抗原的体内表达和它们在人肝细胞癌免疫定位中的应用”(In vivo expression of two novel tumor-associated antigens and their use inimmunolocalization of human hepatocellular carcinoma),Hepatology(1989;9:625-34);Moradpour等,“在体外用免疫脂质体特异性靶向人肝细胞癌细胞”(Specific targetingof human hepatocellular carcinoma cells by immunoliposomes in vitro),Hepatology(1995;22:1527-37);Wands等,“对肝细胞癌的免疫方法”(Immunological approachto hepatocellular carcinoma),J Viral Hepat(1997;4增刊2:60-74);Mohr等,“在体外用新型基于单克隆抗体的基因递送系统将靶基因转移到肝细胞癌细胞”(Targetedgene transfer to hepatocellular carcinoma cells in vitro using a novel monoclonalantibody-based gene delivery system)Hepatology(1999;29:82-9);Yoon等,“用双功能Fab-抗体偶联物将重组腺病毒载体靶向HCC细胞”(Targeting a recombinantadenovirus vector to HCC cells using a bifunctional Fab-antibody conjugate)BiochemBiophys Res Commun.(2000;272:497-504);Palumbo等,“人天冬氨酰(天冬酰胺酰)β-羟化酶单克隆抗体:胰腺癌的潜在生物标记”(Human aspartyl(asparaginyl)beta-hydroxylase monoclonal antibodies:potential biomarkers for pancreatic carcinoma),Pancreas(2002;25:39-44);Yoon等,“用AF-20单克隆抗体与假单胞菌外毒素的嵌合免疫毒素治疗肝细胞癌的靶向癌症治疗”(Targeted cancer therapy using chimericimmunotoxin of AF-20 monoclonal antibody with Pseudomonas exotoxin forhepatocellular carcinoma)(未发表的摘要,2002年6月);将各自的公开内容纳入本文作为参考。
AF-20 moAb展示了作为免疫靶向剂和免疫成像剂的可能。在裸鼠模型中,125I放射标记的AF-20 moAb已成功用于体内放射成像以定位生长为皮下瘤的乙肝病毒相关的肝细胞癌细胞系(FOCUS)。核成像研究显示了肿瘤组织的清晰图像,证明AF-20 moAb作为可能的免疫靶向剂或免疫成像剂的良好特异性和灵敏度。
发现AF-20 moAb能够被HCC细胞迅速内化,这使其成为将细胞毒剂或基因治疗靶向递送到表达AF-20抗原的肿瘤细胞上的良好候选物。不能在所结合的肿瘤细胞内内化的肿瘤相关抗原的抗体因不能到达细胞内作用位点而通常不可用于所述靶向递送。一项研究中(Yoon 2002,同上),发现与假单胞菌外毒素偶联的AF-20 moAb具有体外抗HCC细胞和体内抗裸小鼠HCC移植瘤的强效活性。另一方法中(Moradpour,同上),AF-20 moAb与含羧基荧光素的脂质体共价偶联。AF-20免疫脂质体与表达AF-20抗原的HCC及其它人癌细胞系结合,在37℃迅速内化。AF-20偶联的脂质体与这些细胞系的作用比未偶联的脂质体强5-200倍,而偶联不相关抗体的对照脂质体与未偶联抗体之间未观察到差异。动力学分析显示AF-20免疫脂质体与靶细胞快速联合,在60分钟后达到饱和状态。
AF-20 moAb也已用于开发实验性靶向基因递送系统。在一个此类方法中,通过将AF-20 moAb与抗-六邻体抗体Fab片段交联产生由双功能Fab-抗体偶联物(2Hx-2-AF-20)组成的特异性腺病毒基因递送系统。发现偶联复合物在37℃快速内化,在AF-20抗原阳性HCC细胞中发现报告基因表达水平提高,但在AF-20抗原阴性对照细胞则未发现提高。另一方法中,AF-20 moAb与DNA结合的阳离子两亲体,胆甾醇-精胺偶联,用于将基因递送到肝细胞癌(HCC)细胞中。用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的抗小鼠IgG抗体进行荧光显微镜检测确认了AF-20-胆甾醇-精胺的结合与内化。在AF-20抗原阳性的肿瘤细胞中,转染与AF-20-胆甾醇-精胺复合的荧光素酶或β-半乳糖苷酶报告基因导致基因的高水平表达。
如上讨论所述,迫切需要癌症治疗,特别是肝细胞癌、肺腺癌和结直肠癌的治疗。鼠单克隆抗体AF-20 moAb,展现了用于将靶向治疗递送至肿瘤及其转移灶的前景,但是必须降低其免疫原性,或优选无免疫原性以有效治疗。因此,需要保持了对AF-20抗原的亲和力和特异性的衍生自AF-20 moAb的嵌合和人源化抗体。
本文对与已知组合物、方法和系统相关的缺点和有害特性的描述不旨在限制本发明范围以排除它们。事实上,本发明实施方式可包括一种或多种已知组合物、方法和系统或其部分,而不受其缺点和有害特性的限制。
实施方式概述
本发明实施方式由惊人地发现和开发了保持对AF-20的良好亲和力的嵌合和人源化抗体所实现,并为至少三种主要毁灭性癌症提供重要的新治疗方法。
本发明的一个实施方式包括能够识别与肝细胞癌、肺腺癌、结直肠癌和其它癌症相关的AF-20抗原的嵌合和人源化抗体及其片段(“AF-20抗体”)。本发明的一个优选的实施方式涉及本文所述嵌合抗体和人源化抗体,包括VR、FR和CDR多肽的序列和编码它们的多核苷酸。
本发明的另一实施方式包括本文所述非人AF-20抗体和人源化AF-20抗体的VR,FR和CDR多肽(“VR、FR和CDR”)和编码它们的多核苷酸,以及这些多核苷酸和多肽在产生能够识别AF-20抗原的新型抗体和多肽组合物中的用途。
本发明另一实施方式提供了编码AF-20抗体多肽,VR、FR和CDR的多核苷酸。也提供了包含操作性连接于启动子序列的编码AF-20抗体以及VR、FR和CDR的多核苷酸的各种表达载体。类似地,本发明另一实施方式考虑了用表达AF-20抗体,VR、FR和CDR的表达载体转化的宿主细胞。
本发明的实施方式也涉及AF-20抗体在诊断、评估和治疗表达AF-20抗原的肝细胞癌、肺腺癌、结直肠癌及其它癌症中的应用。本发明另一实施方式涉及用此类抗体作为细胞毒剂如化疗药、肽或放射性核素,或免疫应答促进剂如细胞因子,或前药,或基因治疗的靶向递送系统。
本发明另一实施方式涉及将人源化AF-20抗体及其VR、FR以及CDR用于定向分子进化技术如嗜菌体展示或者细菌或酵母表面展示技术,以产生具有增强亲和力、特异性、稳定性和其它所需特性的多肽。
根据以下描述和所附权利要求书,可明显看出本发明的其它目的、特征和属性。
附图简要说明
图1显示NYR-1002的VH链及其中鉴定的四个FR和三个CDR的DNA和氨基酸序列。
图2显示NYR-1002的可变轻链及其中鉴定的的四个FR和三个CDR的DNA和氨基酸序列。
图3显示抗体重链表达载体。
图4显示抗体轻链表达载体。
图5显示在NYR-1002的重链和轻链可变区中鉴定的潜在人T细胞表位。
图6显示在NYR-1002 VH区变体中产生的氨基酸改变和潜在表位。
图7显示在NYR-1002 VK区变体中产生的氨基酸改变和潜在表位。
图8显示主要(primary)NYDIVK1的DNA和氨基酸序列;
图9显示主要NYR-1002 VK变体NYDIVK1的DNA和氨基酸序列;
图10显示产生的修饰抗体和1升培养物上清中经蛋白A纯化的抗体产量;
图11显示人T细胞实验中20名供者对NYDIVH2/NYDIVK2抗体和NYR-1002鼠抗体的反应;
发明详述
通常,当用于说明书、实施例和权利要求时,以下词语或短语具有所示定义:
术语“AF-20”或“AF-20抗原”指美国专利号5,703,213(将其公开全文内容纳入本文作为参考)所述腺癌细胞抗原,它能够与1988年4月12日依照布达佩斯条约保存于美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)的杂交瘤细胞(ATCC保藏号为HB 9687)所产生的鼠抗体结合。
术语“AF-20 moAb”、“AF-20抗体”或“AF-20单克隆抗体”指能够结合AF-20抗原的非人抗体或其片段。这些术语具体包括美国专利号5,703,213所述及要求权利并由1988年4月12日依照布达佩斯条约保存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的保藏号为HB 9687的杂交瘤细胞系所产生的鼠抗体。
本文所用“ATCC”应指位于美国,维吉尼亚州20110-2209,马纳萨斯市,大学大街(University Boulevard)10801的美国典型培养物保藏中心。“NYR-1002”指ATCC编号HB9687的杂交瘤细胞系所产生的鼠抗体。
术语“恒定区”或“CR”指抗体的恒定结构域,它不直接参与抗体抗原的结合,但参与多种效应器功能,如参与抗体依赖的细胞毒作用。
现在,脊椎动物抗体的一般结构已经明了(Edelman,G.M.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,190:5(1971))。抗体由分子量约为23,000道尔顿的两条相同的轻多肽链(“轻链”),和分子量为53,000-70,000道尔顿的两条相同的重多肽链(“重链”)组成。四条链由二硫键连接成“Y”构型,其中轻链在“Y”构型开口处与重链相扣。“Y”构型的“分支”部分称为Fab区;“Y”构型的主干部分称为Fc区。氨基酸序列起源于位于“Y”构型顶部的N末端,终止于各链底部的C末端。N末端具有对引发该抗体的抗原有特异性的可变区,长约100个氨基酸,轻链与重链以及抗体与抗体之间的变化很小。
各链的可变区与恒定区连接,恒定区延续(extend)该链的其余长度,在特定类型的抗体中,恒定区并不因为抗体特异性不同(即引发它的抗原)而变化。已知五种主要的恒定区决定免疫球蛋白分子的种类(IgG、IgM、IgA、IgD和IgE对应γ、μ、α、δ和ε重链恒定区)。恒定区或种类决定抗体后续的效应器功能,包括补体的激活(Kabat等,《免疫学和免疫化学的结构概念》(Structural Concepts in Immunology andImmunochemistry),第2版,第413-436页,Holt,Rinehart,Winston(1976)),及其它细胞反应(Andrews,D.W.等,《临床免疫学》(Clinical Immunobiology),第1-18页,W.B.Sanders(1980);Kohl,S等,Immunology,48卷:187期(1983));而可变区则决定与其反应的抗原。轻链分为κ或λ。各重链种类可与κ或λ轻链制备(在一起)。轻链和重链互相共价结合,当免疫球蛋白由杂交瘤或者B细胞产生时,两条重链的“尾”部由共价二硫键连接而互相结合。
术语“可变区”或“VR”指抗体中各对轻链和重链中直接参与抗原抗体结合的结构域。各重链在一端都有一可变结构域(VH)后随许多恒定结构域。各轻链在一端有一可变结构域(VL)并在另一端有一恒定结构域;轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域排成一线(align),轻链的可变结构域与重链的可变结构域排成一线。
术语“互补决定区”、“高变区”或“CDR”指在抗体的轻链或重链可变区中发现的一个或多个高变或互补决定区(CDR)(参见Kabat等编,《引起免疫学兴趣的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest),国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health),Bethesda,Md.,(1987))。这些术语包括Kabat等所定义的高变区(《引起免疫学兴趣的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest),Kabat等,美国卫生和人类服务部(US Dept.of Health and Human Services),1983)或抗体三维结构中的高变环(Chothia和Lesk,J Mol.Biol.196 901-917(1987))。构架区将各链中的CDR安排得非常近,与其它链的CDR一起形成抗原结合位点。
术语“构架区”或“FR”指抗体轻链或重链可变区内的一个或多个构架区(参见Kabat等编,《引起免疫学兴趣的蛋白序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest),国立卫生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,Md.,(1987))。这些术语包括在抗体轻链和重链可变区内的CDR之间插入的氨基酸序列区。
依照标准序列定义(参见Kabat等编,《引起免疫学兴趣的蛋白序列》(Sequencesof Proteins of Immunological Interest),国立卫生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,Md.,(1987))和结构定义(如Chothia和Lesk,J.Mot.Biol.196:901-217(1987)来确定CDR和FR的残基。当两种方法导致CDR的鉴定略有差别时,优选结构定义,但认为由序列定义法鉴定的残基是用于决定将哪一构架残基输入共有序列的重要FR残基。
整个说明书中参照了Kabat等,《引起免疫学兴趣的蛋白序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest),国立卫生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,Md.(1987)和(1991)的编号方案。在这些概要(compendium)中,Kabat为各类亚类抗体列举了许多氨基酸序列,列举了在该亚类中各残基位置上最常见的氨基酸。Kabat采用为所列序列中各氨基酸指定残基编号的方法,这个指定残基编号的方法已在业内成为标准。在以下说明书中介绍Kabat编号方案。
为本发明目的,给不包括在Kabat概要中的候选抗体氨基酸序列指定残基编号,可按照以下步骤进行。通常,候选序列与Kabat中任一免疫球蛋白序列或任一共有序列比对。可手工或利用通常接受的计算机程序进行比对。用大多数Fab序列中常见的氨基酸残基有利于比对。例如,轻链和重链一般各含有两个残基编号相同的半胱氨酸;在VL结构域中两个半胱氨酸残基一般是23和88号残基,在VH结构域中两个半胱氨酸残基一般是22和92号。
构架残基通常(但并非总是)有近似数量的残基,然而CDR大小不同。例如,当来自候选序列的CDR比所比对的Kabat中的序列长时,一般在残基编号后加后缀以表示插入额外的残基。候选序列(例如)与Kabat序列比对残基34和36,但两者之间没有残基与残基35比对,则号码35不指定给残基。
术语“抗体”以其最广的含义使用,具体涵盖单一的单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)和具有多表位特异性的抗体组合物。术语“抗体”也包括基本保持了所述抗体的结合特性和其它性质的明显的变体、衍生物、类似物、片段、模拟物。
本文所用术语“单克隆抗体”(moAb)指获自一群基本均一的抗体的抗体,即组成群体的单个抗体完全相同,除了可能存在少数天然突变。单克隆抗体高度特异,抗某抗原的一个表位区。而且,与一般包括抗不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂不同,各moAb抗抗原上的单个决定簇。除了特异性之外,单克隆抗体的优势在于它们可通过杂交瘤培养合成,不被其它免疫球蛋白污染。
修饰语“单克隆”表示获自基本均一抗体群体的抗体的特征,并不解释为需要任何特殊方法生产的抗体。例如,可通过首先由Kohler等,Nature,256卷:495期(1975)所述杂交瘤方法或重组DNA方法(参见例如,美国专利号4,816,567,Cabilly等)制备按照本发明使用的单克隆抗体。“单克隆抗体”也包括(例如)用Clackson等,Nature,352期:第624-628页(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222期:第581-597页(1991)所述技术分离自噬菌体抗体文库的、含有抗原识别和结合位点的抗体片段的克隆(Fv克隆)。
本文所用“抗体片段”及其所有语法变体定义为包含抗原结合位点的完整抗体的一部分或该完整抗体的可变区,其中该部分不含该完整抗体Fc区的恒定重链结构域(如CH2、CH3、和CH4,取决于抗体的同种型)。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2和Fv片段;双抗体;作为具有由相邻氨基酸残基的一个连续序列组成的初级结构的多肽的任何抗体片段(本文称为“单链抗体片段”或“单链多肽”),包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子;(2)仅包含一个轻链可变区的单链多肽,或其包含轻链可变区的三个CDR但不连接重链部分的片段;和(3)仅包含一个重链可变区的单链多肽,或其包含重链可变区的三个CDR但不连接轻链部分的片段。本发明抗体片段还包括从上述抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一条或多条重链的抗体片段中,重链可含有以下的任一序列:
·在完整抗体的非Fc区发现的一个或多个恒定区序列(如IgG同种型中的CH1),和/或
·在完整抗体中发现的任一绞链区序列,和/或
·融合于或位于重链绞链区或恒定区序列的亮氨酸拉链序列。合适的亮氨酸拉链序列包括Kostelney等,J.Immunol.,148期:第1547-1553页(1992)所述的jun和fos亮氨酸拉链和如以下实施例所述的GCN4亮氨酸拉链。
术语“嵌合抗体”指包含至少连接于另一蛋白的另一部分(优选人抗体恒定区)的结合AF-20的非人抗体可变区的多肽。
在“人源化”抗体中术语“人源化”指包含修饰的人抗体可变区的多肽,其中可变区的一部分,优选大大少于完整人抗体可变区的部分,被来自非人物种的相应序列取代;修饰的可变区至少连接于另一蛋白的另一部分,优选人抗体恒定区。术语“人源化抗体”包括一些或全部CDR残基和/或可能是一些FR残基被来自能够结合AF-20抗原的啮齿动物或其它非人抗体中类似位点的残基取代的人抗体。术语“人源化抗体”也包括免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段,所述免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段能够与AF-20抗原结合且包含基本具有人免疫球蛋白氨基酸序列的FR区和基本具有非人源免疫球蛋白氨基酸序列的CDR。
通常,人源化抗体主要包含至少一个,优选两个可变区(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv),其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的区域,所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体也最好包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,一般是人免疫球蛋白的至少一部分。通常,抗体含有轻链以及至少重链的可变区。该抗体也可包括重链的CH1、绞链、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可选自任一类免疫球蛋白,包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE和任何同种型,包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常恒定区是需要人源化抗体具有细胞毒活性的互补固定恒定区,种类一般为IgG,优选IgG1。当不需要此类细胞毒活性时,恒定区可以是IgG2种类。人源化抗体可包含来自不止一个种类或同种型的序列,本领域普通技术人员能够做到选择特定恒定区以优化所需效应器功能。人源化抗体的FR和CDR区无需与亲本序列精确对应,例如,可通过取代、插入或缺失一个或多个残基来诱变输入CDR或共有FR,从而使该位点上的CDR或FR残基既不对应于共有序列也不对应于输入抗体。然而此类突变不会广泛,也不会显著影响抗体与其结合靶点结合。
术语“人源化抗体”也包括通过将抗AF-20抗体的可变区或一个或多个CDR与任何异源蛋白进行剪接产生的杂交和重组的抗体和多肽,不管异源蛋白的起源种属、蛋白种类、免疫球蛋白种类或亚类名称,只要杂交和重组的抗体和多肽具有所需的生物学活性。
术语“人源化抗体”还包括用以下方法使其对人无免疫原性,或相对于天然抗体免疫原性降低的抗体和多肽,该方法包括:测定抗体或多肽的至少一部分氨基酸序列(优选非人源部分如非人抗体的VH或VK区),在所述氨基酸序列中鉴定一个或多个对人T细胞的潜在表位,修饰这一个或多个表位的氨基酸序列以消除至少一个鉴定的T细胞表位以消除或降低该蛋白或其部分暴露于人体免疫系统时的免疫原性。在产生人源化抗体时,优选约75%,更优选约90%,最优选大于约95%的人源化抗体残基对应于亲本FR和CDR序列的相应部分。
短语“T细胞表位”指合理有效地结合于II类MHC分子或者在以前或其它研究中显示具有通过递呈在II类MHC分子上而刺激T细胞的能力的特定肽序列。然而应理解,并非所有此类多肽序列会被递送至正确的II类MHC细胞部分以供II类MHC结合,或适当地从较大细胞蛋白中释放以供后续II类MHC结合。也可理解,即便这些多肽被II类MHC分子递呈于抗原递呈细胞的表面,也会引发T细胞反应,原因包括缺少合适的T细胞特异性和免疫系统对特定多肽序列缺少耐受性。
术语“双功能抗体”指一条臂对于一个抗原位点如肿瘤相关抗原具有特异性,而另一条臂识别不同靶点,如作为或结合于对携带抗原的肿瘤细胞具有致死性的物质的半抗原的抗体。或者,双功能抗体可以是其中各臂对治疗性或生物学修饰的细胞的肿瘤相关抗原的不同表位具有特异性的抗体。在任何情况下,杂交抗体具有双重特异性,优选具有对所选半抗原特异的一个或多个结合位点或对靶抗原例如与肿瘤、感染微生物或其它疾病相关的抗原特异的一个或多个结合位点。
生物双功能抗体,如本领域技术人员所参考的欧洲专利申请EPA 0105360所描述。此类杂交或双功能抗体可由(如注释)生物学方法如细胞融合技术,或化学方法,特别是利用交联剂或二硫桥键形成剂衍生而来,可由这些抗体和/或其片段组成。获得此类杂交抗体的方法公开于(例如)1983年10月27日公开的国际公开号WO83/03679,1987年4月8日公开的欧洲专利申请EPA 0217577,将这些公开文本以全文纳入本文作为参考。尤其优选的双功能抗体是用生物方法从“多聚体”或“四聚体”制备的抗体或用交联剂如双(马来酰亚氨基)甲酯(“BMME”)或其它本领域技术人员熟悉的交联剂合成的抗体。
术语“偶联”指通过多种方式如共价键合、非共价键合、离子键结合或非离子键结合将一个分子与另一分子直接或间接偶联。共价键合包括用各种接头如硫醚接头或硫酯接头键合。直接偶联包括一个分子连接于另一感兴趣的分子。间接偶联包括一个分子连接于用作桥接的另一不感兴趣的分子,该分子进而直接或间接连接于感兴趣的分子。
术语“细胞毒剂”指对细胞有害的任何物质。例子包括抗代谢剂如甲氨蝶呤、氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(decarbazine);烷化剂如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、丝裂霉素C、洛莫司汀(CCNU)、1-甲基亚硝基脲、环磷酰胺、氮芥、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C、顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂和卡铂(铂尔定);蒽环类抗生素包括道诺霉素,多柔比星(阿霉素),地托比星,洋红霉素,黄胆素,表柔比星,米托蒽醌和比生群;抗生素包括d放线菌素(放线菌素D)、博来霉素、卡奇霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC);和抗有丝分裂剂如长春花属生物碱、长春新碱和长春碱。其它细胞毒剂包括紫杉醇(泰素)、蓖麻毒蛋白、假单胞菌外毒素、吉西他滨、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、依托泊甙、替尼泊苷(tenoposide)、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、mytotane(O,P′-(DDD))、干扰素和这些细胞毒剂的混合物。
在尤其优选的实施方式中,细胞毒剂包括美国申请序列号10/153,334、10/198,070、10/198,069和10/294,891所公开的NTP肽中的一种或多种,将各自公开内容以全文纳入本文作为参考。这些NTP肽、NTP肽片段等可偶联于本文所述的人源化抗体,以促进肿瘤细胞坏死。
本文所用“寡核苷酸”指用已知方法(如磷酸三酯、磷酸酯或亚磷酰胺化学,用如1988年5月4日公开的EP 266,032所述的固相技术,或通过如Froehler等,Nucl.Acids Res.,14:5399-2407(1986)所述的脱氧核苷H-膦酸中间体)化学合成的长度短的单链或双链脱氧核苷酸。然后在聚丙烯酰胺凝胶上纯化。
本文所用的“聚合酶链反应”或“PCR”技术通常指如1987年7月28日出版的美国专利号4,683,195所述扩增少量特定的核酸、RNA和/或DNA的方法。通常,需要获得感兴趣末端或更长区域的序列信息,以便设计寡核苷酸引物;该引物与待扩增模板的反义链的序列相同或相似。两种引物的5′末端核苷酸可与扩增链的末端一致。可用PCR从总基因组DNA和从总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等扩增特定RNA序列、特定DNA序列。通常参见Mullis等,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.,51:263(1987);Erlich编,《PCR技术》(PCR Technology),(StocktonPress,N.Y.,1989)。本文所用的PCR被认为是用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应方法之一,但不是唯一一种,包括用已知核酸(DNA或RNA)作为引物并用核酸聚合酶扩增或产生核酸的特异性片段或者扩增或产生与特定核酸互补的核酸的特异性片段。
本文所用“治疗”指治疗性治疗和预防性措施。需要治疗的人包括已患有疾病的人和倾向于患病的人或准备预防疾病的人。
本文所述实施方式的特征涉及能够结合于腺癌细胞抗原AF-20的人源化和嵌合抗体、片段、多肽或其衍生物,AF-20与癌细胞,尤其是肝癌细胞,以及结肠和肺的腺癌细胞相关。更具体说,实施方式涉及衍生自杂交瘤细胞系ATCC编号HB 9687产生的鼠单克隆抗体或特异性结合AF-20的其它非人抗体的人源化和嵌合抗体、片段、多肽或其衍生物。本文所述实施方式也涉及表达本发明的人源化和嵌合抗体、片段、多肽或其衍生物的核酸序列,产生这些对AF-20特异的人源化和嵌合抗体、片段、多肽和衍生物的方法,用这些人源化和嵌合抗体、片段、多肽和衍生物产生对AF-20特异的其它多肽、变体和衍生物的方法,能够分泌这些人源化和嵌合抗体的连续杂交瘤细胞系,含有这些人源化或嵌合抗体或片段或其衍生物的药物组合物和诊断组合物,以及将其用于治疗或诊断癌症的方法。
本文所述的各种实施方式起源于从能够结合AF-20的鼠AF-20抗体产生嵌合和人源化抗体。令人惊讶的是,证明嵌合抗体chNYR-1002和人源化抗体huNYR-1002能够结合AF-20抗原。
本发明的一个实施方式提供了AF-20抗体的嵌合衍生物chNYR-1002,将NYR-1002的鼠可变区VH和VK分别连接在人IgG1或K恒定区上。其它实施方式包括NYR-1002的其它嵌合衍生物,它们具有用于连接NYR-1002的鼠可变区VH和VK的不同人恒定区如IgG2或λ恒定区。
另一实施方式提供了chNYR-1002嵌合抗体的人源化衍生物huNYR-1002,其中鉴定到潜在的人T细胞表位(在chNYR-1002 VH和Vk区的氨基酸序列中),修饰推定的T细胞表位的氨基酸序列以清除经鉴定能消除或降低抗体免疫原性的一个或多个T细胞表位。本文实施方式也包括NYR-1002的其它人源化衍生物,其中用不同的人恒定区如IgG2或λ恒定区连接huNYR-1002中所含的NYR-002人源化可变区VH和VK。
又一实施方式提供了在NYR-1002的VH和VK区中鉴定的CDR的氨基酸和相应核酸序列:轻链的CDR1(SEQ ID No.)、CDR2(SEQ ID No.)和CDR3(SEQ ID No.)以及重链的CDR1(SEQ ID No.)、CDR2(SEQ ID No.)和CDR3(SEQ ID No.)。然而,可改变这些CDR的氨基酸序列。优选通过高达10%、更优选高达20%、更优选高达30%、更优选高达40%的氨基酸取代、插入和/或缺失而改变各CDR的氨基酸序列,只要得到的包含氨基酸序列的人源化抗体维持其结合靶点的结合特异性。因此,各CDR可包括一个、两个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。优选地,各CDR的氨基酸序列与本发明公开的特定CDR基本同源。本领域技术人员将理解,所列的特定氨基酸序列包括所有这些修饰,只要基本保持该序列的活性和效用。
本文提供的多核苷酸和多肽序列可用于(例如)通过取代人抗体可变区的CDR区产生其它人源化抗体。这些序列也可用于(例如)通过取代人抗体可变区的CDR区产生其它人源化可变区,其中人可变区与NYR-1002的鼠可变区具有显著同源性。这些序列也可用于产生能够结合AF-20抗原的多肽。本文提供的多核苷酸和多肽序列也可用于鉴定与人或人源化抗体基本同源的CDR,如这种抗体的文库或库中所含的CDR。本文实施方式还包括人源化抗体的一个或多个初始CDR被本文所述CDR取代的人源化抗体和抗体片段。本文实施方式也包括含有一个或多个本发明CDR的双特异性抗体、抗体片段和多肽。
本文所述实施方式还包括与本文所列人源化抗体、抗体片段、多肽、可变区和CDR基本同源的变体和等效物。它们可含有(例如)保守取代突变(即用相似氨基酸取代一个或多个氨基酸)。例如,保守取代指用相同大类的另一氨基酸取代某一氨基酸,例如,用另一酸性氨基酸取代一酸性氨基酸,用另一碱性氨基酸取代一碱性氨基酸,或用另一中性氨基酸取代一中性氨基酸。保守氨基酸取代所指的内容是本领域熟知的。
本文所用术语“基本同源”涉及主题氨基酸序列(寡肽或多肽或蛋白质)与相关的参比氨基酸序列的相似性。该术语一般定义为至少约75%“一致”—即在“比对”序列时主题和参比序列之间相同氨基酸残基的位置是平行的(即在将最小数量的“空”碱基插入主题和/或参比序列时,以最大程度增加序列之间一致的现有碱基的数量)。“空”碱基不是主题和参比序列的一部分;同时,插入主题序列的最小数量的“空”碱基可能与插入参比序列的最小数量不同。此定义中,参比序列被认为与主题序列“相关”,其中两种氨基酸序列均组成作为具有结合AF-20的能力的AF-20抗体、抗体片段或多肽的蛋白或蛋白部分。包含这些AF-20抗体、抗体片段或多肽的蛋白可各自独立地为抗体、抗体片段、多肽或双功能或多功能蛋白,如融合蛋白、双特异性和多特异性抗体、单链抗体、或其多聚体等。
本发明又一方面提供了huNYR-1002的人源化VH和VK区的氨基酸和相应核酸序列。这些序列可用于产生其它人源化抗体,例如取代人抗体的相应可变区。这些序列也可用于鉴定与人或人源化抗体基本同源的可变区,如这种抗体的文库或库中所含的可变区。这些序列也可用于产生能够结合AF-20抗原的抗体片段和多肽。实施方式还包括人源化抗体中的一个或多个初始可变区被本文所述可变区取代的人源化抗体和抗体片段。本文实施方式也包括含有一个或多个本文所述人源化可变区的双特异性抗体、抗体片段和多肽。
本发明实施方式也包括将本文所述人源化抗体、抗体片段、CDR和人源化可变区用于定向分子进化技术,如噬菌体展示技术以及细菌和酵母细胞表面展示技术。可用噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature 348:552(1990))从可变区基因或编码人源化抗体或抗体片段的基因体外产生新型人抗体和抗体片段。根据此技术,将抗体可变区基因在阅读框中克隆到丝状噬菌体如M13或fd的主要或次要壳蛋白基因中,在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒含有该噬菌体基因组的单链DNA拷贝,根据抗体的功能特征选择也导致选择到编码具有这些特征的抗体的基因。因此,该噬菌体模拟了一些B细胞特征。
可以各种形式进行噬菌体展示;综述参见例如Johnson等,Current Opinion inStructural Biology 3:564(1993)。可变基因节段可用于噬菌体展示。Clackson等,(Nature 352:624(1991))从衍生自免疫小鼠脾的可变区基因的小随机组合文库中分离了各种不同的抗唑酮抗体。在天然免疫应答中,抗体基因高速率积累突变(体细胞高突变)。引入的一些改变会产生更高亲和力,展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞优选在随后的抗原刺激期间复制和分化。可用将小随机突变引入抗体基因的技术模拟此天然过程。在此方法中,可改进人源化抗体的亲和力、特异性、免疫原性或其它特征,发现了能够结合AF-20抗原的新型人源化抗体、抗体片段和多肽。
另一实施方式包括衍生自结合AF-20的其它非人单克隆抗体的嵌合和人源化抗体和抗体片段。本领域熟知产生抗所需抗原的单克隆抗体的方法。美国专利号5,703,213描述了一种通过用FOCUS HCC细胞免疫小鼠产生抗AF-20抗原的鼠单克隆抗体的方法。此方法可应用于从小鼠和其它非人宿主动物产生其它AF-20抗体。
本领域熟知产生非人抗体的其它方法,可采用这些方法用FOCUS HCC细胞或AF-20抗原本身进行免疫(当且如果分离时)。可用Kohler等,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法生产单克隆抗体,或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)生产单克隆抗体。在杂交瘤方法中,通过多点皮下注射(sc)或腹膜内注射(ip)抗原和佐剂,如单磷酰基脂质A(MPL)/海藻糖二氰基梅菌酸酯(dicrynomycolate)(TDM)(RibiImmunochem.Research,Inc.,Hamilton,Mont.),多位点免疫小鼠或其它合适宿主动物,如仓鼠或猕猴。两周后,对动物进行加强免疫,7-14天后,动物放血,测定血清的抗抗原滴度。对动物进行加强免疫,直到达到滴度平台。收获动物的血清,用常规免疫球蛋白纯化方法,如蛋白质A-凝胶层析、羟基磷灰石层析、凝胶过滤、透析或抗原亲和层析从血清中分离多克隆抗体。
用上述方法引出产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者,可体外免疫淋巴细胞。然后,可用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞(Goding,《单克隆抗体:原理和实践》(Monoclonal Antibodies:Principles,and Practice),59-103页(Academic Press,1986))。
可将这样制备的杂交瘤细胞接种并培养于合适的培养基中,该培养基优选含有抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如,如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT),用于杂交瘤的培养基一般包括次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(HAT培养基),这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是有效融合、支持通过选择的产抗体细胞稳定高水平地产生抗体、对培养基如HAT培养基敏感的细胞。其中,优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系,如获自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA的衍生自MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤的细胞系和获自ATCC的SP-2或X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于人单克隆抗体的生产(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,《单克隆抗体生产技术和应用》(MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,51-63页(Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1987))。
可测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地,用免疫沉淀或体外结合实验,如放射性免疫实验(RIA)或酶联免疫吸附实验(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。可通过(例如)Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。美国专利号5,703,213中描述了一种测定对AF-20抗原的结合特异性的方法。
也可根据对AF-20多肽的结合亲和力来描述或详细说明本发明实施方式的抗体。优选的结合亲和力包括离解常数或Kd小于1μM,更优选小于约100nM,最优选小于约1nM的亲和力。
鉴定到产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,可用有限稀释法亚克隆该克隆,并用标准方法(Goding,《单克隆抗体:原理和实践》(MonoclonalAntibodies:Principles and Practice),59-103页(Academic Press,1986))培养。用于此目的合适培养基包括例如:D-MEM或RPMI-1640培养基。此外,杂交瘤细胞在动物体内可生长为腹水瘤:
可用常规免疫球蛋白纯化方法,如蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基,腹水或血清中适当地分离亚克隆分泌的单克隆抗体。
可用常规方法(例如,采用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离后,可将该DNA置入表达载体中,然后转染到本来不产生免疫球蛋白的宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中,在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文献包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs.,130:151(1992)。也存在产生能够结合AF-20抗原的非人单克隆抗体的其它方法。
然后,如此产生的单克隆抗体和编码这种抗体的DNA可用于按照本发明所述方法或本领域技术人员已知的其它方法产生嵌合抗体、人源化抗体和抗体片段。
一种优选方法是通过测定人T细胞的一个或多个潜在表位的至少一部分抗体氨基酸序列(优选非人抗体中非人来源的那部分如VH或VK区),并修饰所述氨基酸序列以消除至少一个推定的T细胞表位使非人抗体对人无免疫原性或免疫原性较低,从而消除或降低蛋白质或其部分在暴露于人体免疫系统时的免疫原性。按照这些方法,可产生一系列修饰抗体。然后,可筛选得到的修饰抗体的表达水平、免疫原性和对AF-20抗原的亲和力和特异性,并选择最佳候选抗体。
本领域普通技术人员了解从非人抗体产生嵌合抗体和人源化抗体或降低非人抗体免疫原性的其它方法,这些方法包括但不限于:
·通过将非人抗体重链和轻链中的可变区连接在人抗体恒定区上产生嵌合抗体,如Cabilly等,美国专利号4,816,567;Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984);Boulianne,G.L.等,Nature 312;643-646(1984);Neuberger,M.S.等,Nature 314:268-270(1985)所述。
·通过用非人互补决定区(CDR)或CDR序列取代人抗体相应节段产生人源化抗体,如Winter,美国专利号5,225,539,Jones,P.T.等,Nature 321:522-525(1986);Riechmann,L.等,Nature 332:323-327(1988);Verhoeyen,M.等,Science 239:1534-1536(1988)所述。这也可包括用非人抗体中相似位点的残基取代人抗体中的一些FR残基以保持抗原结合(性能),如Queen等,美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762、6,180,370;Carter等,美国专利号6,054,297、6,407,213和6,639,055;Adair,美国专利号6,632,927和Winter,美国专利号6,548,640所述。
·通过选择性取代非人抗体可变区中的残基产生人源化抗体,如Pedersen等,美国专利号5,639,641,Studnicka等,美国专利号5,766,886和5,821,123,Carr等,美国专利申请号10/300215所述。
·将抗体或抗体片段与使非人抗体或抗体片段免疫原性较低的自身抗原序列连接,如Jordan等,美国专利号6,652,863所述。
如上所述,编码感兴趣的单克隆抗体或抗体片段的DNA可分离自其杂交瘤或噬菌体展示克隆,然后经操作产生人源化和/或亲和力成熟的构建物。此外,可用已知技术将氨基酸残基引入抗体片段多肽主链上任何所需位置,如将半胱氨酸置于重链绞链区,从而提供特异性连接聚合物分子的位点。在一个实施方式中,用另一种氨基酸如丝氨酸取代通常形成二硫桥键连接轻链和重链的抗体片段轻链或重链中的天然半胱氨酸残基,以使相反链中的配对半胱氨酸残基具有能特异性连接聚合物分子的游离巯基。
构建所需抗体或抗体片段编码克隆后,该克隆可用于用本领域技术人员已知方法进行该抗体或抗体片段的重组生产。最后,可从宿主细胞培养物中回收抗体或抗体片段产物,并用本领域技术人员已知或本文所述的方法纯化。在采用上述经工程改造缺少半胱氨酸残基的抗体片段的实施方式中,优选的重组生产系统包括本领域技术人员已知和本文所述的细菌表达和产物回收方法。如果产生了全长抗体,可根据本领域已知方法将完整抗体进行酶消化从而由其获得所需抗体片段。
可根据已知方法制备本文实施方式的嵌合和人源化抗体、片段和多肽。实施例中详细列出了一种制备方法。应理解,本领域普通技术人员能够用已知常规方法代替以下所述方法,以实现相同或相似结果。可用以下方法生产本文所述实施方式的人源化抗体:
(a)用常规技术构建表达载体,该表达载体含有(1)操纵子,其具有(2)编码抗体重链的DNA序列,所述抗体重链中保持抗体结合特异性所必需的CDR和此类最小部分的可变结构域构架区衍生自非人抗体,和(3)抗体链的剩余部分,其衍生自人抗体,从而产生本发明载体;
(b)用常规技术构建表达载体,该表达载体含有操纵子,其具有编码互补抗体轻链的DNA序列,所述互补抗体轻链中保持供体抗体结合特异性所必需的CDR和此列最小部分的可变结构域构架区衍生自非人抗体,抗体链的剩余部分衍生自人抗体,从而产生本发明载体;
(c)用常规技术将表达载体转染到宿主细胞中,产生本发明转染的宿主细胞;和
(d)用常规技术培养转染的宿主细胞,产生本发明的改变的抗体。
可用本发明两种载体共转染宿主细胞,第一种载体含有编码轻链衍生的多肽的操纵子,第二种载体含有编码重链衍生的多肽的操纵子。这两种载体含有不同的选择性标记,但除了分别含有抗体重链和轻链编码序列之外,这两种载体优选相同,以如愿实现重链和轻链多肽表达相等。或者,可用一种载体,该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。轻链和重链的编码序列可包括cDNA、基因组DNA或二者。
用于表达本发明的改变抗体的宿主细胞可以是细菌细胞如大肠杆菌,或真核细胞。在尤其优选的本发明实施方式中,可采用为此目的良好定义的哺乳动物细胞,如骨髓瘤细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
构建本发明载体的通常方法、产生本发明宿主细胞所需的转染方法和从所述宿主细胞产生本发明抗体所需的培养方法都包括常规技术。以下实施例提供了其中一种方法。虽然用于产生人源化抗体的细胞系优选为哺乳动物细胞系,但也可采用任何其它合适的细胞系,如细菌细胞系或酵母细胞系。具体说,考虑了可采用大肠杆菌衍生的细菌菌株。
同样,一旦产生了本发明实施方式的人源化抗体,可根据本领域标准方法包括交叉流过滤、硫酸铵沉淀、亲和柱层析、凝胶电泳等将其纯化。
应理解,本文实施方式的人源化抗体的作用方式与相同抗体的非人源化类型相同或基本相似。然而优选地,与相同抗体的非人源化类型相比,人源化抗体用于人中更具有优势。本文实施方式的人源化抗体可用于设计和合成治疗用途与抗体相同的肽或非肽化合物(模拟物)(Saragobi等,Science 253:792-795(1991)),将其全文内容纳入本文作为参考。
本发明实施方式包括也包括能够结合AF-20抗原的人源化抗体片段。抗体片段可提供超过完整抗体的显著优点,因为显然可在细菌细胞表达系统中制备重组抗体片段。比起哺乳动物细胞表达系统,细菌细胞表达系统提供了几项优点,包括产品的研发和生产阶段的时间减少和成本降低。
可用本领域已知和本文所述的方法产生抗体片段。通常,抗体片段衍生自亲本完整抗体。可用常规酶学方法从纯化的抗体制剂产生所需抗体片段,如通过胃蛋白酶切割完整抗体产生F(ab′)2片段,用木瓜蛋白酶短时消化完整抗体产生Fab片段。
某些实施方式也包括采用至少对两种不同抗原有特异性的双特异性和异偶联抗体片段。双特异性和异偶联抗体可制备为全长抗体或抗体片段(如F(ab′)2双特异性抗体片段)。本文也考虑采用二价以上的抗体片段(如三价或更高价的抗体片段)。可用本领域技术人员已知和本文所述的方法制备双特异性抗体、异偶联抗体和多价抗体。
本发明实施方式也包括含有本文所述人源化抗体、抗体片段和多肽的治疗组合物。例如,本文所述人源化抗体、抗体片段和多肽可偶联于具有治疗活性的效应器部分,用于选择性靶向表达AF-20抗原的细胞。这种偶联物利用了结合AF-20抗原后AF-20抗体内化这一优点。本领域已知许多这种效应器部分,包括细胞毒剂、免疫应答修饰剂、寡核苷酸、基因、含有治疗基因的病毒载体、含有基因或细胞毒剂的脂质体、或者前药或酶。
本领域技术人员已知许多细胞毒剂。它们包括化疗药如卡铂、顺铂、紫杉醇、吉西他滨、卡奇霉素、多柔比星、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱和博来霉素。来自植物和细菌的毒性酶如蓖麻毒蛋白、白喉毒素和假单胞菌毒素可偶联于本发明的人源化抗体、抗体片段和多肽,以产生细胞类型特异性杀伤试剂(Youle等,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 77:5483(1980);Gilliland等,Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 77:4539(1980);Krolick等,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 77:5419(1980))。其它细胞毒剂包括细胞毒性核糖核酸酶,如Goldenberg,美国专利号6,653,104所述。
本发明实施方式也涉及用或不用络合物形成剂将发射α或β粒子的放射性核素稳定偶联于抗体、抗体片段或多肽的放射性免疫偶联物。这种放射性核素包括β-发射体如磷-32(32p)、钪-47(47Sc)、铜-67(67Cu)、镓-67(67Ga)、钇-88(88y)、钇-90(90Y)、碘-125(125I)、碘-131(131I)、钐-153(153Sm)、镥-177(177Lu)、铼-186(186Re)或铼-188(188Re),和α-发射体如砹-211(211At)、铅-212(212Pb)、铋-212(212Bi)或-213(213Bi)或者锕-225(225Ac)。
尤其优选的实施方式包括NTP肽或其衍生物与人源化抗体的偶联物,应考虑用于本文实施方式。
可用治疗组合物将免疫应答修饰物引入表达AF-20抗原的肿瘤细胞中,从而直接或间接标记肿瘤细胞使其被患者的免疫系统破坏。也可用治疗组合物将基因序列引入表达AF-20抗原的肿瘤细胞中,从而使该基因在肿瘤细胞中表达。该基因可取代或补充肿瘤细胞中功能受损或不存在的基因,从而通过凋亡或其它机制来诱导细胞死亡,抑制或防止肿瘤细胞增殖或迁移,标记肿瘤细胞使其被患者的免疫系统破坏,或具有相似或其它疗效。该基因可以是肿瘤细胞基因组外源的。此基因可表达细胞毒性蛋白或能够将前药切割成细胞毒性部分的酶。可通过基因递送系统,如病毒载体或脂质体将偶联于本发明治疗组合物的所述基因序列递送到靶细胞中。
相似地,可用治疗组合物将寡核苷酸引入表达AF-20抗原的肿瘤细胞中。这种寡核苷酸可包括抑制靶mRNA在肿瘤细胞中的功能的反义寡核苷酸;抑制肿瘤细胞生存、增殖或迁移所必需的蛋白质表达的小干扰核糖核酸(siRNA);核酶;提高肿瘤细胞对其它抗癌治疗的易感性的物质;和形成三股螺旋的寡核苷酸。
本文实施方式也考虑了含有不同治疗组合物如各具有不同抗体或不同效应器部分的两种或多种不同的抗体偶联物的药物组合物。效应器部分可包括基因或其它寡核苷酸,由于抗体治疗内化将其引入肿瘤细胞时,它们提供有益的治疗效应,如诱导细胞凋亡;取代有功能障碍的基因;表达治疗上有益的蛋白质等。可将基因装入脂质体中或连接于合适的载体如病毒。
在本发明的另一实施方式中,对AF-20的特异性和降低的免疫原性使本文所述嵌合和人源化抗体偶联于可检测标记以检测不同癌症类型如肝细胞癌、肺腺癌和结直肠癌时适合用作诊断剂。这种组合物可用于特征是AF-20表达的癌症的诊断、适当治疗的评估和预后评价(基于AF-20表达水平);它们可用作肿瘤显像剂,或用作放射性免疫导向外科治疗RTM系统(RIGS.RTM.)中的放射性标记的抗体。参见Hinkle等,Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals,4(3):339-358(1991)。
本领域已知可偶联于抗体或多肽的许多可检测标记。可检测标记包括放射性核素如3H、11C、14C、18F、64Cu、76Br、86Y、99mTc、111In、123I、125I或177Lu。检测这些标记的方法包括PET扫描和免疫闪烁扫描。体外实验的可检测标记包括酶,如辣根过氧化物酶;荧光团;生色团;化学发光剂;放射性核素;螯合复合物;染料;胶体金或乳胶颗粒。
本实施方式的诊断组合物也可用于体外实验,以测定人或动物是否患有表达AF-20抗原的癌症。这些测定可用于癌症诊断、分期和治疗评估。这些测定优选用于测定患者或动物是否患有易被能够结合表达AF-20抗原的肿瘤细胞的治疗组合物治疗的癌症。这些测定最优选用于测定是否和如何用本发明治疗组合物治疗患者或动物。
本领域已知进行这些测定的方法。测定类型包括但不限于:用本发明诊断组合物对活检组织进行的免疫组织学测定,将组织或体液样品与本发明诊断组合物接触的免疫测定。
本领域技术人员已知偶联效应器部分或可检测标记的许多方法。将抗体与所需效应器连接是熟知的。参见例如Cheng等,美国专利号5,435,990,将其全部公开内容纳入本文作为参考。而且,用于促进这种连接的双功能接头是本领域熟知和广泛可得的。同时,连接放射性核素的螯合物(螯合剂和螯合物)是本领域熟知和容易得到的。
此治疗和诊断组合物可用于诊断和治疗癌症。这些癌症优选为腺癌,这些癌症最优选为肝细胞癌、肺腺癌和结直肠癌。
治疗组合物还可用于治疗表达AF-20抗原的癌症和其它肿瘤。它们可单独使用或与其它抗癌治疗或抗肿瘤治疗如化疗、免疫疗法、放疗、手术切除或消融疗法联用。
本领域技术人员将能够(用常规实验)测定抗体、抗体片段或多肽对于治疗具体癌症有效而无毒的量。然而,有效剂量通常的范围是0.05-100毫克/千克体重/天,优选约0.5-25毫克/千克体重/天。
可根据上述治疗方法将本文所述嵌合或人源化抗体、抗体片段或多肽给予人或其它动物,其用量足以产生治疗或预防效果。抗体可在根据已知方法将抗体与常规的药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂混合而制备的常规剂型中给予人或其它动物。本领域普通技术人员将认识到,待混合的活性成分量、给药途径和其它熟知变量决定了药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂的形式和特征。
药学上可接受的剂型可包括例如:合适溶剂、防腐剂如苄基醇(如果需要)和缓冲液。有用溶剂可包括例如:水、水性醇、乙二醇和膦酸酯和碳酸酯。这些水性溶液包含不多于50%体积的有机溶剂。悬液类型的制剂可包括液体悬浮介质作为运载体,如水性聚乙烯吡咯烷酮、惰性油如植物油或深度精炼的矿物油,或水性纤维素醚如水性羧甲基纤维素。也可存在增稠剂如明胶或藻酸盐,也可采用一种或多种天然或合成的表面活性剂或消泡剂,其中可采用一种或多种悬浮剂如山梨糖醇或另一种糖。这些剂型可含有一种或多种佐剂。
本发明抗体、片段或多肽的给药途径可以是口服、胃肠道外、吸入或局部。本文所用术语“胃肠道外”包括血栓内、静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道或腹膜内给药。胃肠道外给药的血栓内、静脉内和肌肉内形式是优选给药途径。
预防性或治疗性应用本发明人源化抗体的每日胃肠道外和口服剂量方案通常的范围约为0.005-100毫克/千克体重/天,但优选约0.5-10毫克/千克体重/天。
也可通过吸入给予抗体。“吸入”指鼻内和口腔吸入给药。可用常规技术制备这种给药的适当剂型,如气雾剂或计量剂量吸入器。本发明化合物的优选剂量通常的范围约为0.1-100毫克/千克体重,更优选约10-100毫克/千克体重。
也可局部给予抗体。局部给药指非全身性给药。这包括将人源化抗体(或人源化抗体片段)制剂外部给予表皮或口腔(buccal cavity),将所述抗体滴注到耳、眼或鼻中,和不大量进入血流的其它任何方式。全身性给药指口服、静脉内、腹膜内、皮下和肌肉内给药。当然,实现治疗、预防或诊断效果所必需的的抗体量会因所选抗体、所治疗病症的特性和严重性以及进行治疗的动物而不同,最终由医生来判断。本发明抗体的合适局部剂量通常的范围约为1-100毫克/千克体重/天。
虽然可能单独给予本文所述抗体、片段或多肽,但优选将其制成药物制剂。就局部给药而言,活性成分可占制剂重量的0.001-10w/w%,如1-2w/w%,但活性成分可占制剂重量的高达10w/w%,但优选不超过5w/w%,更优选0.1-1w/w%。
局部制剂可包含活性成分以及一种或多种可接受的运载体和任选的任何其它治疗成分。运载体在与制剂的其它成分相容和对其受试者无害方面一般是“可接受的”。适合局部给药的制剂包括适合穿透皮肤到达需要治疗的部位的液体和半液体制剂,如搽剂、洗剂、乳膏、软膏或贴剂以及适合于给予眼、耳或鼻子的滴剂。
滴剂可包含无菌水性或油性溶液或悬液,可通过将活性成分溶于杀菌和/或杀真菌剂和/或任何其它合适防腐剂的合适水溶液制备,优选包括表面活性剂。然后可使得到的溶液澄清,过滤除菌,并用无菌操作转移到容器中。适合包含在滴剂中的杀菌和杀真菌剂的例子是苯硝酸汞或苯乙酸汞(0.002%)、苯扎氯铵(0.01%)和醋酸洗必泰(0.01%)。用于油性溶液制剂的合适溶剂包括甘油、稀醇和丙二醇。
洗剂包括适合施用于皮肤或眼睛的制剂。眼洗剂可包含任选地含有杀菌剂的无菌水溶液,可通过类似于制备滴剂的方法制备。施用于皮肤的洗剂或搽剂也可包括促进干燥和冷却皮肤的物质,如醇或丙酮,和/或保湿剂如甘油或油如蓖麻油或花生油。
乳膏、软膏或贴剂一般是外用活性成分的半固体制剂。它们可通过在合适机器的辅助下将单独的精细分开(finely-divided)形式或粉末形式的活性成分或者它们在水性或非水性流体中的溶液或悬液与油状或非油状基料混合而制备。该基料可包含烃类如硬、软或液态石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂;粘液;天然来源油如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油;羊毛脂或其衍生物,或脂肪酸如硬脂酸或油酸以及醇如丙二醇或大粒凝胶。该制剂中可掺入任何合适的表面活性剂如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或非离子表面活性剂如山梨聚糖酯或其聚氧乙烯衍生物。也可包括悬浮剂如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料如硅石类(silicaceous)二氧化硅,以及其它成分如羊毛脂。
一实施方式的试剂盒包括需要分别在(优选缓冲性)液体运载体中解冻(然后任选地进一步稀释)或悬浮以重建的冷冻或冻干的嵌合或人源化抗体、抗体片段或多肽。该试剂盒也可包括缓冲液和/或赋形剂溶液(液体或冻结形式)-或需要用水重建的缓冲液和/或赋形剂粉末制剂-用于与人源化抗体或人源化抗体片段混合产生适合给药的制剂。因此,含有嵌合或人源化抗体、抗体片段或多肽的试剂盒优选是冷冻、冻干、预先稀释或预先混合的,其浓度使得试剂盒中提供的预定量的热量、水或溶液将产生其浓度和pH足以在体内或体外有效用于治疗或诊断癌症的制剂。
优选地,这种试剂盒也包括用于重建和应用嵌合或人源化抗体,抗体片段或多肽组合物以治疗或检测癌症的说明书。该试剂盒也可含有用于重建活性组合物的两个或多个组分部分。例如,除嵌合或人源化抗体、抗体片段或多肽外的第二个组分部分可以是双功能螯合剂、双功能螯合物或治疗剂如放射性核素,这些物质与人源化抗体或人源化抗体片段混合时与其形成偶联系统。上述缓冲液、赋形剂和其它组分部分可单独售卖或与试剂盒一起售卖。
本领域技术人员应认识到,本文所述实施方式的嵌合或人源化抗体、抗体片段或多肽的最优量和各剂量间隔由所治疗病症的特性和程度,给药形式、途径和部位,以及治疗的具体动物决定,可用常规技术确定这种优化。本领域技术人员也应理解,本领域技术人员可用常规疗程确定测试来确定最优疗程,即在确定的天数中本发明的嵌合或人源化抗体、抗体片段或多肽每天给药次数。
主题中的嵌合或人源化抗体、抗体片段或多肽也可与其它抗癌药如其它抗体或药物联合给予。
其它实施方式包括具有衍生自能够结合AF-20的抗体的重链或轻链可变区的抗原结合区的重组抗体分子。本文实施方式也包括包含获自结合AF-20的非人抗体的可变区和人恒定区的嵌合抗体。嵌合抗体的可变区优选获自结合AF-20的鼠抗体,恒定区为人恒定区,更优选获自杂交瘤细胞系ATCC编号HB9686产生的鼠单克隆抗体(moAb),恒定区为人恒定区。
另一实施方式包括含有可变重链序列SEQ ID No.或可变轻链序列SEQ ID No.或二者的嵌合抗体。该嵌合抗体优选为chNYR-1002。
其它实施方式包括结合AF-20的人源化抗体或人源化抗体片段(总称为“humoAb”),其中人源化抗体或人源化抗体片段衍生自结合AF-20的非人源抗体。humoAb优选衍生自结合AF-20的鼠单克隆抗体(moAb),humoAb更优选衍生自杂交瘤细胞系ATCC编号HB9686产生的鼠moAb。尤其优选的人源化抗体是huNYR-1002。
另一实施方式包括结合AF-20的人源化抗体或人源化抗体片段,它包含获自结合AF-20的非人抗体的互补决定区(CDR)氨基酸残基和人构架区(FR)氨基酸残基。该CDR优选获自结合AF-20的鼠moAb和人构架区(FR)氨基酸残基,该CDR更优选获自杂交瘤细胞系ATCC编号HB9686产生的鼠moAb和人构架区(FR)氨基酸残基。
尤其优选的人源化抗体或片段包括结合AF-20的抗体或片段,其中轻链可变区的互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和重链可变区的互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)具有以下氨基酸序列:
轻链:
CDR1(SEQ ID NO_)[RASQSIGTSIH];
CDR2(SEQ ID No._)[YASESIS];和
CDR3(SEQ ID No._)[QQSSSWPFT];
重链:
CDR1(SEQ ID NO._)[GYTFAGHYVH];
CDR2(SEQ ID No._)[WIFPGKVNTKYNEKFKG];和
CDR3(SEQ ID No._)[VGYDYFYYFDY]。
本文所述实施方式包括上述人源化单克隆抗体或抗体片段,其中可变区或恒定区中的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代。CDR或FR中的一个或多个氨基酸残基优选被其它氨基酸残基取代。此外,本文实施方式的人构架区(FR)中包括一个或多个氨基酸残基的加入、取代或缺失。
本文所述实施方式还包括上述人源化单克隆抗体或其片段,其中通过取代、加入或缺失氨基酸残基去除了在可变区中鉴定的潜在人辅助性T细胞表位。优选通过取代、加入或缺失氨基酸残基去除了在CDR或FR中鉴定的潜在人辅助性T-细胞表位。
本文所述人源化抗体或人源化抗体片段(“humoAb”)对AF-20的抗原结合亲和力优选至少为衍生出humoAb的抗体的10%。尤其优选的humoAb包含人源化可变重链序列SEQ ID No.或人源化可变轻链序列SEQ ID No.或二者。humoAb更优选包括人源化可变重链序列SEQ ID No.的变体或人源化可变轻链序列SEQ ID No.的变体或二者。
另一实施方式包括含有一个或多个以下多肽的多肽序列:
SEQ ID No._[GYTFAGHYVH];
SEQ ID No.[WIFPGKVNTKYNEKFKG];
SEQ ID No.[VGYDYFYYFDY];
SEQ ID No.[RASQSIGTSIH];
SEQ ID No._[YASESIS];和/或
SEQ ID No._[QQSSSWPFT]。
本文所述实施方式也包括编码上述抗体、多肽或抗体片段的DNA及其任何片段、变体或衍生物。DNA分子优选编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列,从而该抗体或片段特异性结合AF-20,其中轻链可变区的CDR和重链可变区的CDR具有以下氨基酸序列:
轻链:
CDR1(SEQ ID No._)[RASQSIGTSIH];
CDR2(SEQ ID No._)[YASESIS];和
CDR3(SEQ ID No._)[QQSSSWPFT];
重链:
CDR1(SEQ ID No._)[GYTFAGHYVH];
CDR2(SEQ ID No._)[WIFPGKVNTKYNEKFKG];和
CDR3(SEQ ID No._)[VGYDYFYYFDY]。
本文实施方式也包括编码上述humoAb的轻链或重链的DNA分子。优选的DNA分子编码人源化抗体或其片段的氨基酸序列,从而该抗体或片段特异性结合AF-20,其中轻链可变区的CDR具有以下氨基酸序列:
CDR1(SEQ ID No._)[RASQSIGTSIH];
CDR2(SEQ ID No._)[YASESIS];和
CDR3(SEQ ID No._)[QQSSSWPFT]。
另一优选的DNA分子编码抗体或片段的重链,其中重链CDR的核苷酸序列如下:
CDR1(SEQ ID No._)[GYTFAGHYVH];
CDR2(SEQ ID No._)[WIFPGKVNTKYNEKFKG];和
CDR3(SEQ ID No._)[VGYDYFYYFDY]。
DNA分子优选为表达载体的形式。这种情况下,实施方式还包括用表达载体转化的宿主。此外,本文实施方式包括含有编码上述人源化抗体或人源化抗体片段的轻链和重链的重组表达系统的宿主细胞。
其它本发明实施方式包括表达本文所述嵌合抗体的核酸序列。此外,本文实施方式包括含有该核酸序列的载体。该载体优选为裸露的核酸节段、运载体结合的核酸节段、核蛋白、质粒、病毒、类病毒或转位因子。另一优选实施方式包括产生本文所述嵌合抗体的杂交瘤细胞系。
其它实施方式包括表达上述人源化抗体、人源化抗体片段或多肽的核酸序列。这种情况下,实施方式还包括含有该核酸序列的载体。该载体优选为裸露的核酸节段、运载体结合的核酸节段、核蛋白、质粒、病毒、类病毒或转位因子。另一优选实施方式包括产生本文所述人源化抗体、人源化抗体片段或多肽的杂交瘤细胞系。
某些实施方式包括治疗癌症的组合物,该组合物包含治疗有效量的任何上述的人源化或嵌合抗体、人源化抗体片段或多肽。人源化或嵌合抗体、人源化抗体片段或多肽优选直接或间接与具有治疗活性的效应器部分结合或连接。更优选的,效应器部分是抗癌药、化疗药、细胞毒素、放射性核素、治疗性酶、前药、细胞因子或抗增殖剂。优选的放射性核素是32P、47Sc、67Cu、90Y、105Rh、125I、131I、117mSn、153Sm、166Dy、175Yb、186Re、188Re、194Os、211At、212Bi、213Bi、225Ac或其混合物或组合。
其它实施方式包括一种体内治疗患有表达AF-20的癌症的哺乳动物的方法,该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的上述组合物。优选在手术后给予该组合物。
另一实施方式包括适合体内或体外检测癌症的组合物,该组合物包含诊断有效量的本文所述人源化或嵌合抗体、人源化抗体片段或多肽。该人源化或嵌合抗体、人源化抗体片段或多肽优选直接或间接与可检测标记结合或连接。更优选的,该可检测标记是放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂或配体。优选的放射性核素包括3H、11C、14C、18F、64Cu、76Br、86Y、99mTc、111In、123I、177Lu及其混合物和组合。
其它实施方式包括一种体外免疫检测表达AF-20的癌细胞的方法,该方法包括将癌细胞与上述组合物接触。在此实施方式中,该组合物的人源化或嵌合抗体、人源化抗体片段或多肽优选结合于固体支持物。
另一优选方法包括一种在哺乳动物体内免疫检测表达AF-20的癌细胞的方法,该方法包括给予哺乳动物诊断有效量的适合检测癌症的上述组合物。免疫检测方法优选为体内肿瘤成像。
其它实施方式包括一种体内治疗癌症的方法,该方法包括(i)静脉内给予放射性核素标记的抗体、抗体片段或多肽,(ii)然后用放射性核素活性探针检测肿瘤细胞,和(iii)然后通过手术切除来去除检测到的肿瘤细胞。在此方法中,所述抗体或多肽优选为上述人源化或嵌合抗体、人源化抗体片段或多肽。放射性核素优选为3H、11C、14C、18F、64Cu、76Br、86Y、99mTc、111In、123I、177Lu及其混合物和组合。
本发明实施方式还包括利用上述人源化或嵌合抗体、人源化抗体片段或多肽或者上述DNA分子来产生结合AF-20的抗体、片段或多肽的多肽或变体或衍生物的方法。产生多肽、变体或衍生物的方法优选为噬菌体或酵母展示技术。
现在,参照以下非限制性实施例解释本发明实施方式。
实施例
实施例1-鼠抗体基因的测序
复苏鼠杂交瘤AD20D4,在含有Glutamax I(Invitrogen Corp.目录号61965-026,批号3070663)、补充有20%北美来源的胎牛血清(Invotrogen Corp.目录号16000-044,批号1137907)和1mM丙酮酸钠(目录号11360-039,批号3069371)的Dulbecco改良的Eagle培养基中培养。
由107个杂交瘤细胞制备总RNA,注意避免RNA酶污染。采用特别的无RNA酶的试剂,包括无核酸酶的水。用MSE 2000R冷冻台式离心机4℃ 1500rpm离心5分钟以收集细胞,然后用冰冷的PBS洗涤细胞三次。然后将细胞重悬于6mL冰冷的RNA裂解缓冲液(0.14M NaCl,1.5mM MgCl2,10mM Tris pH8.6,0.5% NP-40,其中已加入了5μL RNAseOUT),涡旋10秒。将该溶液覆盖在等体积的24%(w/v)蔗糖和1%NP-40上,冰上放置5分钟。然后用冷冻台式离心机4℃ 4000rpm离心该溶液30分钟。然后取出上层胞质相,加入等体积2×PK缓冲液(0.3M NaCl,0.025MEDTA,0.2M Tris pH7.5,2%SDS)中,加入蛋白酶K(Life Technologies目录号25530-049)使终浓度为200μg/mL。该溶液在37℃孵育30分钟。
用等体积的酚/氯仿(1∶1(w/v))萃取该溶液。将2.5体积100%乙醇加入水相,将该溶液储存在-20℃过夜。离心收集RNA(400rpm 30分钟),然后在真空干燥器中干燥。将RNA溶于H2O(Promega目录号PI19C),通过分光光度计测定浓度(假定A2601=40μg/mL)。将1-2μg加在1.2%琼脂糖凝胶上在TAE中跑胶,以确认RNA的质量:高质量RNA显示出清晰的核糖体条带,并且不显示降解。
用逆转录酶以小鼠IgG恒定区和小鼠K恒定区引物制备VH和VK cDNA,注意避免RNA酶污染。在微量离心管中混合以下物质来制备第一条链可变区cDNA:5μg RNA,10μL 5×逆转录酶缓冲液(Promega目录号M351A),1μL引物(25pmol/μL的H2O溶液(Promega目录号P119C),重链采用MuIgGVH3′(寡核苷酸号152);轻链采用MuIgKVL3′(寡核苷酸号160)),2μL 10mM dNTP溶液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mM,来自100mM母液(Life Technologies目录号10297018)),2μLRNAseOUT(Life Technologies目录号10777019),加H2O(Promega目录号P119C)至50μL。将该溶液加热到70℃ 10分钟,然后缓慢冷却到37℃。加入100单位M-MLV逆转录酶(Promega目录号M530A),将该溶液在37℃孵育1小时,加热到70℃ 15分钟,然后储存在-20℃待用。
然后进行可变区基因的扩增和克隆。在微量离心管中混合5μL第一条链cDNA,5μL 10×Taq聚合酶缓冲液(Life Technologies目录号402028),1μL3′引物(25pmol/μL的H2O溶液,重链采用MuLgVH3′(寡核苷酸号152);轻链采用MuIgKVL3′(寡核苷酸号160)),1μL5′前导引物混合物(混合物中各引物为25pmol/μL),1μL 10mMdNTP溶液,0.5μL Taq聚合酶缓冲液(Life Technologies目录号10342-020),加H2O至50μL。在0.5mL薄壁PCR管中混合除Taq酶以外的所有试剂,在PCR模块上加热到94℃。加入Taq酶,然后对样品进行以下循环:94℃/2分钟,94℃/30秒、50℃/30秒、72℃/2分钟40个循环,最后72℃ 5分钟。在琼脂糖凝胶上运行5μL各反应物,以检测PCR是否产生预计大小(约350bp)的产物。将剩下的产物加样在1.5%低熔点琼脂糖凝胶上,切下DNA条带并纯化。通过与2μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液(Promega目录号C126B)和1μL T4 DNA连接酶(promega目录号M180A)混合然后在15-20℃孵育2小时-过夜将凝胶纯化的V区DNA连接于1μL pGem T-easy克隆载体(Promega目录号A1360)。将该载体转化到感受态大肠杆菌TG1中并接种在LB+IPTG+XGAL+氨苄青霉素平板上。将白色菌落挑到通用容器中的3mL LB+氨苄青霉素中,37℃培养。2-4小时后通过PCR测试检测插入物。取出50μL培养物加到微量离心管中,加热到95℃ 5分钟。然后,在微型离心机中离心5分钟,将上清液取出至干净的试管中。将5μL 10×Taq聚合酶缓冲液、1μL M13正向引物、1μLM13反向引物、1μL 10mM dNTPs、0.5μL Taq聚合酶和H2O与10μL上清液混合,至50μL。
在0.5mL薄壁PCR管中混合除Taq酶之外的所有试剂,在PCR模块上加热到94℃。加入Taq酶,然后对样品进行以下循环:94℃/2分钟,94℃/30秒、50℃/30秒、72℃/2分钟40个循环,最后72℃5分钟。在琼脂糖凝胶上运行10μL各反应物,以检测插入物(在500bp处的条带)。培养物培养过夜,制备用于DNA测序的DNA。
用自动化DNA测序来测定所选克隆(用PCR筛选预计大小的插入物的VH和VK克隆)的DNA序列。从筛选的细菌储存液制备质粒DNA,在通用容器中的含有50μg/mL(或按需)氨苄青霉素母液(Sigma目录号A-0166)(50mg/mL的H2O溶液)的Luria肉汤培养基(LB)(每升H2O中NaCl 10g,胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g)中建立5mL培养物。将该培养物振荡培养过夜或至少5小时。用微型离心机离心该培养物,用Wizard Plus SV小抽试剂盒(Promega目录号A1460)按照厂商说明书纯化DNA。然后,将纯化的DNA重悬于100μL H2O中,用自动化DNA测序设备测序。
NYR-1002重链V区的DNA和氨基酸序列见图1。从第一批细胞中没有分离到很多重链基因。在第二批细胞中,15个独立克隆产生了相同的完整重链序列。参照其它抗体序列(Kabat EA等,1991)测定CDR的位置。SEQ ID No._(CDR1)、_(CDR2)和_(CDR3)给出了CDR。将NYR-1002 VH氨基酸序列与小鼠重链亚组IIB的共有序列相比,指定为该亚组。
NYR-1002轻链V区的DNA和氨基酸序列见图2。各批细胞中5个独立克隆产生相同序列。参照其它抗体序列(Kabat EA等,1991)测定CDR的位置。SEQ IDNo._(CDR1)、_(CDR2)和_(CDR3)给出了CDR。将NYR-1002 VH氨基酸序列与小鼠κ链亚组V的共有序列相比,指定为该亚组。
实施例2-构建嵌合抗体基因和嵌合抗体
通过将上面实施例1中鉴定的鼠可变区连接于人恒定区来构建嵌合抗体。可通过重叠PCR重组法(如Orlandi等(1989)所述)添加鼠可变区。也参见Daughterty BL等(1991)。扩增克隆的鼠VH和VK基因。用载体VH-PCR1和VK-PCR1(Riechmann等,1988)作为模板,以引入5′侧翼序列、先导内含子和鼠免疫球蛋白启动子,以及包括剪切位点和内含子序列的3′侧翼序列。将产生的VH和VK表达盒克隆入pUC19中,通过测序确认整个DNA序列是正确的。PCR扩增如下:合成一组诱变的寡核苷酸,都是25pmol/μL。该组寡核苷酸包括待突变位点,以便将该DNA序列扩增为一组片段。根据需要突变的位点的数目,设计相邻寡核苷酸。
用各引物对进行PCR扩增:将1μL模板DNA与5μL 10×Pfu聚合酶缓冲液(Stratagene目录号600153-82或Promega目录号M776A),1μL(25pmol/μL)正向引物,1μL(25pmol/μL)反向引物,2μL 10mM dNTPs,0.5μL(1单位)Ptu DNA聚合酶(Stratagene目录号600252-51或Promega目录号M774A)和H2O混合至50μL。这些5′和3′引物包括末端18bp的随机序列。在0.5mL薄壁PCR管中混合除Pfu酶之外的所有试剂,在PCR模块上加热到94℃。加入Pfu酶,然后对样品进行以下循环:94℃/2分钟,94℃/30秒、50℃/30秒、72℃/1分钟(取决于所需延伸长度)15-20个循环,最后72℃5分钟。根据寡核苷酸的Tm将退火温度调节到50℃以上或以下。在琼脂糖凝胶上运行10μL各反应物,以检测预计大小的产物。如果没有产物,退火温度降低5℃,增加PCR循环数,和/或将MgCl2浓度增加到5mM。如果这一轮PCR产生多条条带,需要凝胶纯化正确大小的条带。
在第二轮PCR中,用含有在第一轮PCR加入的末端18bp的第二轮5′和3′引物连接这些产物。第二轮连接PCR的模板是第一轮产生的片段,调整第一轮PCR产物的量以加入大约相等的量。将第一轮PCR的产物与5μL 10×Pfu聚合酶缓冲液(Stratagene目录号600153-82或Promega目录号M776A),2μL(50pmo/μL)5′第二轮引物,2μL(50pmol/μL)3′第二轮引物,2μL 10mM dNTPs,0.5μL(1单位)Pfu DNA聚合酶(Stratagene目录号600252-51或Promega目录号M774A)和H2O至50μL。在0.5mL薄壁PCR管中混合除Pfu酶以外的所有试剂,在PCR模块上加热到94℃。加入Pfu酶,然后对样品进行以下循环:94℃/2分钟,94℃/30秒、50℃/30秒、72℃/1分钟(取决于所需延伸长度)15个循环,,最后72℃ 5分钟。在琼脂糖凝胶上运行5μL各反应物,以检测预计大小(VH表达盒约820bp,VK表达盒650bp)的产物。如果没有产物,退火温度降低5℃和/或增加PCR循环数后重复第二轮PCR。用酚/氯仿和乙醇或Qiagen MiniElute PCR纯化试剂盒(目录号28004)提取PCR产物并使其沉淀。用所需酶(表达盒:HindIII和BamHI)消化得到的产物,加样在1.5%低熔点琼脂糖凝胶上。切下正确大小的DNA条带并纯化。对DNA测序以确认其序列正确和没有引入假(spurious)突变。
将重链和轻链V区基因转移到表达载体pSVgpt和pSVhyg上,这两种表达载体分别包括人IgG1或K恒定区以及在哺乳动物细胞中选择的标记。抗体重链表达载体见图6。图中括号中的位点已被去除。重链表达载体pSVgptHuIgG1基于pSV2gpt(Mulligan和Berg,Science(1980;209:1422-1427))。它包括用于在细菌细胞中选择的氨苄青霉素抗性基因、用于在哺乳动物细胞中选择的gpt基因、鼠重链免疫球蛋白增强区、编码人IgG1恒定区基因和SV40聚腺苷酸序列的基因组序列。用于表达的重链可变区作为HindIII-BamH1片段插入。此表达盒包括鼠重链启动子、信号肽编码序列和信号序列内含子、VH基因、V-C剪接供体序列和内含子序列。
抗体轻链表达载体见图7。图中括号中的位点已被去除。在HuCK内部有3个EcoR1位点。轻链表达载体pSVgptHuCK基于载体pSVhyg。它包括用于在细菌细胞中选择的氨苄青霉素抗性基因、用于在哺乳动物细胞中选择的hyg基因,鼠重链免疫球蛋白增强子区、编码人κ恒定区基因并包含κ增强子和SV40聚腺苷酸序列的基因组序列。用于表达的轻链可变区作为HindIII-BamH1片段插入。此表达盒包括鼠重链启动子、信号肽编码序列和信号序列内含子、Vκ基因、V-C剪接供体序列和内含子序列。确认嵌合表达载体中的VH和Vκ的DNA序列是正确的。
用电穿孔将重链和轻链表达载体共转染入NSO细胞(欧洲动物细胞培养物保藏中心,Porton,UK,ECACC编号85110503)。用Pvul分别消化约3和6μg的pSVgptHuIgG1和pSVgptHuC质粒。用乙醇沉淀消化的DNA,溶解于20μL dH2O。从半铺满的75cm3培养瓶中重悬细胞,通过1000rpm离心5分钟收集细胞。弃去上清。将细胞重悬于0.5mL Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中,并转移到GenePulser小杯(Bio-Rad)中。通过温和吹打将DNA与细胞混合,在冰上放置5分钟。将该小杯插入Bio-Rad基因脉冲仪(Gene Pulser)电极之间,施加单脉冲170V,960μF。将该小杯放回冰上20分钟。然后将细胞悬液转移到含有20mL DMEM的75cm3培养瓶中,恢复1-2天。然后收获细胞并重悬于80mL选择性DMEM中,将其加入96孔板的各孔中,每孔加200μL等份。
约10天后,测定各孔20μL培养基中存在的人抗体,根据抗体生产水平和孔中的细胞数选择孔进行扩增。用Gilson P200微量移液器(装有黄色尖头)的尖头摩擦表面以重悬所选孔的细胞,将培养基转移到含有1.5mL新鲜选择性DMEM的24孔组织培养板孔中。在补充有10%胎牛血清、0.8μg/mL霉酚酸和250μg/mL黄嘌呤的DMEM中选择表达gpt基因的菌落。用ELISA检测人IgG,以筛选产生人抗体的转染克隆。扩增分泌抗体的细胞系,选择产量最高的细胞系冻存在液氮中。用Prosep-A(Millipore Corp.)纯化嵌合抗体。用ELISA检测人IgG1κ,以测定浓度。
实施例3-鉴定小鼠NYR-1002可变区内所含的人辅助性T细胞表位。
分析实施例1中测定的氨基酸序列,用Peptide Threading软件(Biovation)产生可变区的人T细胞表位图。图5显示了该分析的结果。该分析显示,在NYR-1002共有17个潜在人T细胞表位,VH中有9个,VK中有8个。没有潜在T细胞表位与CDR完全一致。
实施例4-设计修饰的抗体序列
通过取代鼠AF-20抗体可变区中的氨基酸残基设计基本的VH和VK变体序列(NYDIVH1、NYDIVK1),以去除潜在人T细胞表位,但保留(需要时)关键氨基酸:参见图6、7、8和9。基本VH区的DNA和氨基酸序列见图8,基本VK区的DNA和氨基酸序列见图9。
由于产生基本VH和VK变体序列需要进行少量氨基酸取代,这可能影响最终多肽的结合,所以设计了六种其它变体VH(称为NYDIVH1A、NYDIVH2、NYDIVH3、NYDIVH4、NYDIVH5和NYDIVH6)和4其它VK(称为NYDIVK2、NYDIVK3、NYDIVK4和NYDIVK5)。鼠和去免疫V区的氨基酸序列对比见图6(VH)和图7(VK)。变体VH和VK的氨基酸序列改变又引入了一些潜在T细胞表位(分别参见图6和图7的表1)。
实施例5-构建修饰的抗体序列
用重叠PCR重组法构建修饰的可变区,如Orlandi等(1989)所述和上面的实施例2所详述。克隆的鼠VH和VK基因用作将构架区诱变为所需序列的模板。合成几组包含改变区的诱变引物对。用载体VH-PCR1和VK-PCR1(Riechmann等,1988)作为模板,引入包含先导信号肽序列、先导内含子和鼠免疫球蛋白启动子的5′侧翼序列和包含剪接位点和内含子序列的3′侧翼序列。将产生的修饰的VH和VK表达盒克隆入pUC 19中,确认各修饰的VH和VK序列的全部DNA序列是正确的。
从pUC19上切下修饰的重链和轻链V区基因作为HindIII-BamHI表达盒。将它们转移到表达载体pSVgpt和pSVhyg(分别是图3和4)中,这两种表达载体分别包括人IgG1或κ恒定区以及用于在哺乳动物细胞中选择的标记。确认表达载体中修饰的VH和Vκ序列的DNA序列是正确的。
用于表达抗体的宿主细胞系是NSO,一种非免疫球蛋白生产型小鼠骨髓瘤细胞,获自欧洲动物细胞培养物保藏中心,Porton UK(ECACC编号85110503)。用电穿孔将重链和轻链表达载体共转染入NSO细胞(参见上述实施例2)。在补充有10%胎牛血清、0.8μg/ml霉酚酸和250μg/ml黄嘌呤的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中选择表达gpt基因的菌落。用ELISA检测人IgG,以筛选产生人抗体的转染细胞克隆。扩增分泌抗体的细胞系,选择产量最高的细胞系冻存在液氮中。用Prosep-A(Bioprocessing Ltd)纯化修饰的抗体。用ELISA检测人IgG1κ,以测定浓度。也用SDS-PAGE分析了该抗体。
实施例6-表达修饰的抗体
测定转染细胞克隆的抗体表达。大多数重链和轻链的组合产量很小(参见图10)。NYDIVH5与NYDIVK2组合时产量最高,产生3.6mg纯化抗体。相比较,嵌合抗体产生0.66mg纯化蛋白。NYDIVH1A与任何轻链组合时都不产生抗体。
包含NYDIVH2/NYDIVK2、NYDIVH2/NYDIVK3的抗体在测定中表现最佳,NYDIVH4/NYDIVK5、NYDIVH4/NYDIVK3稍弱。NYDIVH2/NYDIVK2被选作先导人源化抗体。
实施例7-修饰抗体和嵌合抗体的人T细胞实验
在人T细胞增殖实验中测定人源化抗体NYDIVH2/NYDIVK2(huNYR-1002)以及嵌合抗体(chNYR-1002)。用健康供者的血沉棕黄层分离含有抗原递呈细胞(APC)和T细胞的外周血单核细胞(PBMC)。测定这些供者的II型MHC同种异型,选择20名供者,覆盖白种人群中>80%的HLADRB1同种异型。如图11的表1所示,在人T细胞增殖实验中20名供者都没有对人源化抗体huNYR-1002产生显著反应(刺激指数SI>2)。相比较,12名供者对鼠IgG、chNYR-1002有反应,SI>2,但其中5名供者产生边界反应,SI为2-2.5(图11的表2)。对人源化抗体明确的不同的反应证实了鼠可变区氨基酸取代对降低T细胞免疫原性的作用。
实施例8-测定与细胞毒剂偶联的修饰抗体的细胞毒效应
将抗体(huNYR-1002)偶联于各种已知的细胞毒分子,测定它们在癌细胞培养物中的细胞毒作用。通过4-[N-马来酰亚氨基甲基]-环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯的马来酰亚胺活化和大小排阻层析纯化将细胞毒化合物(如甲氨蝶呤和多柔比星)偶联于抗体。采用的取代比率是每摩尔抗体2-10摩尔化合物。
-本文所述实施方式中考虑了不同偶联方法,这是本领域技术人员用本文提供的指导原则能够获得的;
-本文所述实施方式中考虑了偶联的细胞毒分子的不同选择,这在本领域技术人员用本文提供的指导原则能够获得的范围中。
将细胞(如CCL-185细胞)接种在96孔板中,密度为103-105细胞/孔。外围孔不接种细胞。空白孔对照中仅加入化合物、仅加入培养基和化合物加培养基。对照也包括细胞加培养基以及仅有细胞。测试化合物的浓度范围是0.01-0.25μg/mL。板孵育4天,然后根据厂商说明用各种活力测定(如Celltiter 96 Aqueous One Solution(MTS))进行测试。将染料或试剂加入细胞孔中后,板在37℃孵育1-4小时,混合数秒,然后在平板阅读器上读出吸光度。
结果:
发现新制备的化合物(抗体与细胞毒分子的偶联物)比未偶联的细胞毒化合物毒性更高(每摩尔细胞毒化合物)。偶联于抗体的化合物的细胞毒性升高了10-104倍(与偶联于抗体的化合物相比,未偶联化合物产生相同的细胞毒作用需要10-104倍的化合物分子)。培养4天后观察到最大作用。这些结果说明1)抗体偶联物能在细胞毒化合物的浓度较低时产生相等的细胞毒性,暗示对抗体结合较少的非癌细胞和组织的毒性较低;2)抗体偶联物在浓度较低时细胞毒性更高,暗示杀伤癌细胞的效力更高;和3)细胞毒化合物螯合和偶联于单克隆抗体,暗示对抗体结合较少的非癌细胞和组织的毒性较低。
Claims (44)
1.一种重组抗体分子,所述抗体分子包含衍生自能够结合AF-20的抗体的重链或轻链可变区的抗原结合区。
2.一种嵌合抗体,所述嵌合抗体包含获自结合AF-20的非人抗体的可变区和人恒定区。
3.如权利要求2所述的嵌合抗体,包含获自结合AF-20的鼠抗体的可变区和人恒定区。
4.如权利要求3所述的嵌合抗体,其特征在于,所述鼠抗体是杂交瘤细胞系ATCC编号HB9686产生的鼠单克隆抗体(moAb)和人恒定区。
5.嵌合抗体chNYR-1002。
6.一种结合AF-20的人源化抗体或人源化抗体片段,其中所述人源化抗体或人源化抗体片段衍生自结合AF-20的非人抗体。
7.如权利要求6所述的人源化抗体或人源化抗体片段(humoAb),其特征在于,所述humoAb衍生自结合AF-20的鼠单克隆抗体(moAb)。
8.如权利要求7所述的人源化抗体或人源化抗体片段,其特征在于,所述humoAb衍生自杂交瘤细胞系ATCC编号HB 9686产生的鼠moAb。
9.人源化抗体huNYR-1002。
10.一种结合AF-20的人源化抗体或人源化抗体片段,所述人源化抗体或人源化抗体片段包含获自结合AF-20的非人抗体的互补决定区(CDR)氨基酸残基和人构架区(FR)氨基酸残基。
11.如权利要求10所述的人源化抗体或人源化抗体片段,其特征在于,所述互补决定区(CDR)氨基酸残基获自结合AF-20的鼠moAb。
12.如权利要求11所述的人源化抗体或人源化抗体片段,其特征在于,所述结合AF-20的鼠moAb由杂交瘤细胞系ATCC编号HB 9686产生和人构架区(FR)氨基酸残基。
13.一种结合AF-20的人源化抗体或其片段,其中,轻链可变区的互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和重链可变区的互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)由以下氨基酸序列组成:
轻链:
CDR1(SEQ ID NO._)[RASQSIGTSIH]
CDR2(SEQ ID No._)[YASESIS]
CDR3(SEQ ID No._)[QQSSSWPFT]
重链:
CDR1(SEQ ID NO._)[GYTFAGHYVH]
CDR2(SEQ ID No._)[WIFPGKVNTKYNEKFKG]
CDR3(SEQ ID No._)[VGYDYFYYFDY]。
14.如权利要求13所述的人源化抗体或人源化抗体片段,其特征在于,在人构架区(FR)中已进行一个或多个氨基酸残基的加入、取代或缺失。
15.如权利要求13所述的人源化抗体或片段,其特征在于,通过取代、加入或缺失氨基酸残基去除了在可变区中鉴定的潜在人辅助性T细胞表位。
16.如权利要求6所述的人源化抗体或人源化抗体片段,其特征在于,所述抗体与AF-20的抗原结合亲和力至少为衍生出所述人源化抗体或人源化抗体片段的抗体的10%。
17.一种包含至少一个以下序列的多肽序列:
a)SEQ ID No._[GYTFAGHYVH];
b)SEQ ID No._[WIFPGKVNTKYNEKFKG];
c)SEQ ID No._[VGYDYFYYFDY];
d)SEQ ID No._[RASQSIGTSIH];
e)SEQ ID No._[YASESIS];和
f)SEQ ID No._[QQSSSWPFT]。
18.一种编码权利要求17所述多肽序列的DNA。
19.一种编码权利要求13所述人源化抗体或片段的氨基酸序列的DNA分子。
20.一种编码权利要求6所述抗体或片段的轻链的DNA分子。
21.如权利要求20所述的DNA分子,其特征在于,所述轻链CDR的核苷酸序列如下:
CDR1(SEQ ID NO._)[RASQSIGTSIH];
CDR2(SEQ ID No._)[YASESIS];和
CDR3(SEQ ID No._)[QQSSSWPFT]。
22.一种编码权利要求6所述抗体或片段的重链的DNA分子。
23.如权利要求22所述的DNA分子,其特征在于,所述重链CDR的核苷酸序列如下:
CDR1(SEQ ID No._)[GYTFAGHYVH];
CDR2(SEQ ID No._)[WIFPGKVNTKYNEKFKG];和
CDR3(SEQ ID No._)[VGYDYFYYFDY]。
24.一种表达载体形式的权利要求19所述的DNA分子。
25.一种用权利要求24所述的表达载体转化的宿主。
26.一种包含编码权利要求13所述抗体或抗体片段的轻链和重链的重组表达系统的宿主细胞。
27.一种产生权利要求2所述嵌合抗体的杂交瘤细胞系。
28.一种产生权利要求6所述人源化抗体或抗体片段的杂交瘤细胞系。
29.一种治疗癌症的组合物,所述组合物包含治疗有效量的权利要求6所述的人源化抗体或人源化抗体片段。
30.如权利要求29所述的组合物,其特征在于,所述人源化抗体或人源化抗体片段直接或间接与具有治疗活性的效应器部分结合或连接。
31.如权利要求30所述的组合物,其特征在于,所述效应器部分选自抗癌药、化疗药、细胞毒素、放射性核素、治疗性酶、前药、细胞因子、抗增殖剂及其混合物。
32.如权利要求31所述的组合物,其特征在于,所述放射性核素选自32P、47Sc、67Cu、90Y、105Rh、125I、131I、117mSn、153Sm、166Dy、175Yb、186Re、188Re、194Os、211At、212Bi、213Bi、225Ac及其混合物。
33.一种治疗患有表达AF-20的癌症的哺乳动物的方法,所述方法包括给予该哺乳动物治疗有效量的权利要求29所述组合物。
34.如权利要求33所述的方法,其特征在于,在手术后给予所述组合物。
35.一种检测癌症的组合物,所述组合物包含诊断有效量的权利要求6所述人源化抗体或人源化抗体片段。
36.如权利要求35所述的组合物,其特征在于,所述人源化抗体或人源化抗体片段直接或间接与可检测标记结合或连接。
37.如权利要求46所述的组合物,其特征在于,所述可检测标记选自放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体及其混合物。
38.如权利要求37所述的组合物,其特征在于,所述放射性核素选自3H、11C、14C、18F、64Cu、76Br、86Y、99mTc、111In、123I、177Lu及其混合物。
39.一种免疫检测表达AF-20的癌细胞的方法,所述方法包括将癌细胞与权利要求35所述组合物接触。
40.如权利要求39所述的方法,其特征在于,所述组合物的人源化抗体或人源化抗体片段结合于固体支持物。
41.一种在哺乳动物中免疫检测表达AF-20的癌细胞的方法,所述方法包括给予该哺乳动物诊断有效量的权利要求35所述组合物。
42.如权利要求41所述的方法,其特征在于,所述免疫检测是体内肿瘤成像。
43.一种治疗癌症的方法,所述方法包括:(i)静脉内给予放射性核素标记的权利要求6所述人源化抗体或人源化抗体片段;(ii)用放射性核素活性探针检测肿瘤细胞;和(iii)通过手术切除来去除检测到的肿瘤细胞。
44.如权利要求43所述的方法,其特征在于,所述放射性核素选自3H、11C、14C、18F、64Cu、76Br、86Y、99mTc、111In、123I、177Lu及其混合物。
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