RO117189B1 - Proteina c3 umana, modificata, secventa adn care o codifica, si compozitie farmaceutica cu aceasta - Google Patents

Proteina c3 umana, modificata, secventa adn care o codifica, si compozitie farmaceutica cu aceasta Download PDF

Info

Publication number
RO117189B1
RO117189B1 RO97-00417A RO9700417A RO117189B1 RO 117189 B1 RO117189 B1 RO 117189B1 RO 9700417 A RO9700417 A RO 9700417A RO 117189 B1 RO117189 B1 RO 117189B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
protein
factor
amino acid
convertase
human
Prior art date
Application number
RO97-00417A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Alexander Harrison
Timothy Charles Farries
Original Assignee
Imutran Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB9418147A external-priority patent/GB9418147D0/en
Priority claimed from GBGB9509102.1A external-priority patent/GB9509102D0/en
Application filed by Imutran Ltd filed Critical Imutran Ltd
Publication of RO117189B1 publication Critical patent/RO117189B1/ro

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424Serine endopeptidases (3.4.21)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Inventia se refera la proteina C3 umana, modificata, capabila sa formeze o convertaza C3 stabila, care poate fi selectata dintre: a) o proteina C3 modificata, in care fie aminoacidul Arg-1303, fie aminoacidul Arg-1320, fie ambii aminoacizi sunt substituiti cu alti aminoacizi; b) o proteina C3 modificata care prezinta sensibilitate redusa la Factorul H si/sau Factorul I, comparativ cu convertaza C3 nativa, numita proteina mentionata prezentand una sau mai multe schimbari aminoacide fata de convertaza C3 umana, nativa, in regiunea corespunzatoare resturilor aminoacide 752-754 si/sau resturilor 758-780 a covertazei C3 native, umane; si c) o proteina C3 modificata care prezinta substituitii de aminoacizi comparativ cu convertaza C3 umana, la nivelul resturilor aminoacide corespunzatoare resturilor 1427, 1431 si/sau 1433 ale convertazei C3 native, umane; la o secventa de ADN care codifica aceasta proteina, precum si la o compozitie farmaceutica cu aceasta.

Description

Prezenta invenție se refera la o proteină C3 umană, modificată, capabilă să formeze o convertază C3 stabilă, secvența ADN care o codifică, și o compoziție farmaceutică cu aceasta, utilizată ca agent terapeutic, în special pentru epuizarea nivelurilor de proteine ale căii metabolice a complementului.
Sistemul complement funcționează în răspunsul imun al oamenilor și al altor vertebrate, fiind de importanța majoră în funcțiile efectoare ca fagocitoza, citoliza și recrutarea celulelor care induc răspunsuri inflamatoare locale (Rother K., Till, G.O. (Ed), 1998, The complement system, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany). Aceste proprietăți sunt dorite pentru eliminarea patogenilor invadatori de tipul bacteriilor, dar nu sunt dorite când sunt activate împotriva țesuturilor gazdei (de exemplu, în reperfuzia post-ischemică, (Crawford-MH, et.all., 19988, Circulation 78:1449-58)) sau împotriva materialului terapeutic străin (de exemplu, respingerea hiperacută a xenogrefelor (Forty J., Hasan R., Cary N., White, DJ., Wallwork, J., 1992, Transplant Proc. 24:488-9)). Au existat încercări pentru eliminarea acestor proprietăți nedorite, prin exploatarea derivaților proteinelor reglatoare ale complementului, a căror funcție este de a suprima activarea complementului ( Kalli K.R., Hsu.P., Fearon, D.T., 1994, Spriger Semin. Imunopathol. 15:417-431; Weisman, HF, et.al, 1990, Science 249:146-51).
Sistemul complement cuprinde proteine atât pe suprafața celulelor (receptori, regulatori), cât și în compartimentul fluidelor (plasma sanguină și alte medii extracelulare). Etapa critică pentru generarea răspunsurilor este conversia proteolitică a C3 la fragmentele C3b și C3a. C3a este o anafilatoxină care, la fel ca C5a, atrage celule mastoide la situl de provocare, având ca urmare eliberarea locală de histamină, vasodilatarea și alte efecte inflamatoare. C3b care apare, are capacitatea de a se lega în jurul sitului său de generare. Această C3b concentrează apoi atacul, prin compontele citolitice ale complementului (C5-C9). C3b legat la suprafața și produsele degradării sale, de asemenea, funcționează ca liganzi pentru receptori C3 care mediază, de exemplu, fagocitoza (Rother K., Till, G.O., (Ed), 19988, The complement system, Springer-Verlag-Berlin-Heidelberg, Germany). Există două căi metabolice distincte de activare a complementului, care, împreună, au ca rezultat conversia C3 la C3b și răspunsurile consecutive.
Calea metabolică clasică este activată în mod obișnuit, de către complexele antigen-anticorp, care inițiază o cascadă enzimatică implicând proteinele C1q, C1r, C1s, C2 și C4. Calea metabolică alternativă, depinde de activarea unei bucle, care implică însăși C3 și care necesită factorii B și D.
Conversia C3 la C3b (sau C3i) determină un răspuns care se poate combina cu factorul B, obținându-se C3bB (sau C3iB). Aceste complexe sunt activate de factorul D, pentru a genera C3bBb, care este o convertază capabilă să cliveze o cantitate mult mai mare de C3 la C3b și împlicit rezultă mai mult C3bBb. în anumite circumstanțe, complexul C3bBb este stabilizat prin asociere cu properdina regulatoare pozitivă (P). Totuși, acest feedback pozitiv este limitat în mod normal la o avansare lentă de proteine regulatoare, reprezentate în mod special de factorii H și I.
Factorul H (și molecule asociate celulei, înrudite structural cu acesta), (i) înlocuiește B și Bb din C3b, și (ii) acționează ca un cofactor pentru factorul I care clivează
C3b în iC3b, împiedicând astfel orice recombinare cu factorul B pentru a forma mai multe convertaze C3. Calea declanșează generarea amplificată de C3b în prezența
RO 117189 Bl suprafețelor, cum er fi pereți celulari bacterieni, care leagă C3b în cursul apariției sale și împiedică reglarea sa de către factorii H și I. C3b care apare este, de asemenea, capabilă să se lege la celule endogene. în mod normal, suprafețele celulelor endogene sunt expuse la complement și, prin urmare, sunt protejate suplimentar, prin regulatori 50 legați la membrană, cum ar fi MCP, DAF și CR1 care acționează în mod similar factorului H.
Există câteva situații întâlnite rar în mod natural, când nu poate avea loc reglarea normală în compartimentele fluide și conversia spontană a C3, având ca rezultat final epuizarea generalizată a C3 din circulație: 55 (i) deficiențe genetice ale factorului H sau I (Nicol, P.A.E., Lachmann, P.J., 1973, Immunol.24:259-275), (ii) prezența anticorpilor (factori nefritici) care leagă C3bBb și împiedică disocierea (Daha M.R., van Es, L.A., 1982, Immunol.43:33-38), și (iii) contactul cu o proteină din venin de cobră, numit factorul veninului de cobră 60 (CVF), care se combină cu factorul B și formează o enzimă de tip convertază C3, care nu conține C3b și nu este afectată de către factorii H și I (Pangburn, Mk, MullerEberhard, HJ, 1984, Springer Semin.lmmunopathol. 7: 163-92). Aceasta ilustrează importanța fiziologică normală a reglării, în sensul reducerii complementului în absența activării specifice. 65
De asemenea, există situații când activarea este specifică, dar este nedorită, în special când ea este îndreptată împotriva țesuturile gazdei (de exemplu, împotriva țesuturilor lezate ischemic sau chirurgical), sau împotriva materialului străin administrat în mod deliberat pentru scopuri terapeutice (cum ar fi o xenogrefă, organ artificial sau o memebrană de dializă). Activarea complementului are ca urmare atacul 70 nedorit și distrugerea suplimentară, astfel că, în aceste cazuri, ar fi benefic să se blocheze sau să se inhibe activarea și răspunsul.
Soluțiile care există pentru prevenirea distrugerii mediate de complement au vizat utilizarea proteinelor inhibitorii (CR1, MCP, DAF și factorii H și I) activării complementului. Inhibitorii complementului, asemănători factorului I, factorului H și derivaților 75 solubili ai proteinelor legate la membrană CR1, DAF, MCP suprimă amplificarea în faza lichidă a buclei căii metabolice alternative. Prin urmare, eu fost încercări în vederea utilizării acestor molecule, în special a moleculei CR1(care este cea mai potentă], la reducerea distrugerii mediate de complement în modele care imită situațiile fiziologice (Kalli K.R., Hsu.P., Fearson, D.T., 1994, Springer Semin. Immunopathol. 80 15:417-431; Wisman, HF et.al, 190, Science 249:146-51).
Factorul H este prezent endogen în plesma sanguină în concentrații ridicate (de obicei 0,3-0,5 mg/ml) (Rother K., Till, G.O., (Ed), 19988, The complement system, Springer-Verlag-Berlin-Heidelberg, Germany), astfel încât, chiar dacă nivelurile crescute ale inhibitorilor reduc reacțiile în faza fluidă, puterea lor este slabă, deci este 85 necesară administrarea unor cantități mari de proteine purificatoare in vivo (probabil în exces de 5mg/kg greutate corporală de CR1 solubil).
Suplimentar, calea metabolică alternativă este activată de suprafețele celulare la nivelul cărora efectul factorului H este deja suprim; în același timp, aceasta nu reduce concomitent, în mod necesar, activitățile altor inhibitori, aceiași factori suge- 90 rând că este puțin probabil ca eficacitatea lor să fie completă sau universală.
RO 117189 Bl
Factorul veninului de cobră (CVF) are proprietatea generării unei convertaze 03 stabile, care se poate folosi experimental pentru epuizarea complementului la animale, in vivo și în alte probe (de exemplu, plasmă sanguină umană), in vitro. CVF este puternic, de exemplu, 40/zg/kg putând să distrugă activitatea complementului la șoarece ( Van der Berg, C.W., Aerst, P.C., Vam Dijk, H., 1991, J.lmmunol. Methods 136: 278-294). Cu toate acestea, există dezavantaje care îl fac necorespunzător pentru utilizare terapeutică la oameni.
în primul rând, el se obține din venin de cobră (o sursă dificil de obținut și periculos de manevrat) și prin urmare, trebuie purificat atent de neurotoxinele veninului. De asemenea, există dificultatea evidentă de a-l procura. Această problemă nu poate fi depășită cu ușurință prin donarea și expresia genei ex vivo, deoarece există modificări posttranslaționale care se întâlnesc la șarpe (prelucrare proteolitică specifică) și care pot fi dificil (sau imposibil) de reprodus in vitro.
în plus, enzimele și condițiile de digestie necesare pentru acestă procesare nu sunt cunoscute în prezent. în al doilea rând, proteina este de origine străină (pentru oameni) și, prin urmare, imunogenă. Aceasta împiedică utilizarea sa în terapie repetată, atât cât ar fi necesar pentru decompletarea unui pacient pe durata mai multor săptămâni (de exemplu, pentru a permite supraviețuirea xenogrefei).
Deși CVF are unele omologii structurale și funcționale cu C3 umană (Vagei, CW., Smith, CA, Muller-Eberhard, HJ., 1984, J.lmmunol. 133:3235-41); el are, de asemenea, diferențe majore în ambele aspecte (de exemplu, structura catenei, situl biosintezei, insensibilitate la factori de reglare a complementului, formarea unei convertaze c3 stabile). El nu este derivat de la echivalentul C3 de la cobră, care este cunoscut, fiind donat și secvențiat, și a cărui structură și funcție se aseamănă, în mare, cu cele ale C3 umană mai mult decât o are CVF (Fritzinger, D.C., et.all., 1992, J.lmmunol., 149:3554-3562).
CVF este un derivat specific veninului unui animal aflat la o distanță mare de homo sapiens pe scara evolutivă. Prin urmare, nu este practic să se folosească manipularea genetică pentru modificarea acestei proteine într-un produs care să poată fi folosit neimunogenic la oameni. Termenul “regulatori al activării complementului” se utilizează aici în scopul includerii tuturor proteinelor care acționează pentru inhibarea amplificării conversiei C3 și nu se intenționează să fie restrâns ca înțeles la acele proteine ale căror gene sunt localizate în locusul genetic RCA. Totuși, el nu include “regulatori pozitivi” cum ar fi properdina.
“Conversia C3 definește conversia proteolitică a C3 în C3b și C3a, cu excepția altor indicații, iar “convertaza C3 (sau simplu “convertază) se definește ca o enzimă (de obicei un complex a două sau mai multe componente proteice; de exemplu, C3bBb, C3iBb, CVFBb sau C4b2a) care catalizează acestă reacție.
Prin “nativă se înțelege întâlnită în mod natural”, cu alte cuvinte, se obține din natură. Astfel, definiția cuprinde orice proteină a căii complementului, întâlnită în mod natural și modificată așa cum s-a definit mai sus. Nu se intenționează să fie restrânsă la specii de proteine specifice. Cu alte cuvinte, o proteină umană modificată ar putea fi folosită ca o convertază C3 stabilă, de exemplu, la alte specii de mamifere. De obicei, se vor folosi proteine modificate ale căii complementului de la aceleași specii.
Modificarea secvenței ADN codificatoare C3, de exemplu, folosind mutageneza dirijată in sit, poate produce o variantă a C3 care este rezistentă la proteinele regulatoare ale complementului, păstrând in același timp proprietăți funcționale pozitive
RO 117189 Bl (clivaj la C3 prin convertază C3) și trasaturile integrității structurale (structura corectă a catenei și prezența unei legături tiolester). Invenția, se referă la forme modificate 140 genetic ale proteinelor complement native, de exemplu, C3 umană, al cărei fragment C3b dobândește proprietatea de a fi rezistent la reglarea fiziologică a complementului. Datorită acestei rezistente, aceste molecule pot genera forme stabilizate ale convertazei C3 corespondente, care produc conversia amplificată a 03 la C3b și, mai târziu, produse de degradare in medii fiziologice (de exemplu, in vivo). 145
Invenția se referă la o proteină C3 umană, modificată, capabilă să formeze o convertază C3 stabilă, proteină care poate fi selectată dintre:
a) o proteină C3 modificată, în care fie a Arg-1303, fie a Arg-1320, fie a ambii aminoacizi sunt substituiți cu alți aminoacizi;
b) o proteină C3 modificată, care prezintă sensibilitate redusă la Factorul H 150 și/sau Factorul I, față de convertază C3 nativă, numita proteină, avănd una sau mai multe substituții de aminoacizi față de convertază C3 nativă, umană, în regiunea corespunzătoare resturilor aminoacide 752-754 și/sau resturilor 758-780, a convertazei C3 native umane, și
c) o proteină C3 modificată, care prezintă substituții de aminoacizi comparativ 155 cu convertază 03 umană nativă, la nivelul resturilor de aminoacizi 1427, 1431 și/sau 1433 din structura convertazei C3 native umane, precum și la o secvență de acizi nucleici care codifică pentru aceasta. Invenția prezintă, totodată, și o compoziție farmaceutică ce cuprinde o cantitate eficientă de proteină, împreună cu unul sau mai mulți excipienți acceptabili din punct de vedere farmaceutic, compoziție care este 160 administrată în scop terapeutic la un mamifer, determinând epuizarea nivelelor de proteină a căii complementului.
Invenția prezintă, de asemenea, o secvență de acid nucleic care codifică pentru această proteină și este reprezentătă de secvența din fig. 1, precum și la o compoziție farmaceutică ce cuprinde o cantitate eficientă din punct de vedere al adiministrării 165 terapeutice de proteină, împreună cu unul sau mai mulți excipienți, din punct de vedere farmaceutic.
Avantajele obținerii de proteine C3 umane modificate se referă și la strategia de producere a acestora.
i) Susceptibilitate redusă la acțiunile inhibitoare ale factorului H și proteinelor 170 înrudire (de exemplu, MO3, DAF, CR1). De exemplu, în C3 umană, resturile 767-776 și 1209-1271 au fost implicate în legarea factorului H și, substituirea unuia sau mai multora dintre aceste resturi, sau a altor resturi, de asemenea, asociate cu acțiunea acestor proteine, ar putea reduce legarea uneia sau mai multora dintre aceste proteine regulatoare. 175 ii) Rata redusă a disocierii C3bBb. Pot fi introduse mutații care ar putea întări interacțiunea dintre C3b și Bb. Aceasta ar avea ca urmare, în ambele, o reducere a descompunerii spontane a enzimei și a reducerii eficacităii factorului H (și regulatori înrudiți) în deplasarea Bb de la C3b.
Aceste mutații sunt dorite pentru reducerea ambelor descompuneri ale C3bBb, 180 spontană și mediată prin factorul H. Chiar în absenta factorului H, faza fluidă a complexului C3bBb are o durată de injumătățire de numai circa 10 min la 37°C, înprezența properdinei ( Farries, TC., Lachmann, PJ, Harrison, RA, 1988, Biochem.
J. 253: 667-75).
RO 117189 Bl iii) Resturile C3 umane 752-761 sunt implicate în legarea factorului B. El constituie o regiune puternic conservată în C3 și o secvență strâns înrudită cu acesta se găsește în C4. Așa cum C4 leagă factorul B omolog C2, asemănarea puternică a acestei regiuni dintre C3 și C4, împreună cu conservarea sa puternică în C3, sprijină în plus rolul C3 ca un factor B de legare la situs. Astfel, schimbările din această regiune ar putea avea efecte asupra afinității B și asupra stabilității C3bBb.
iv) Rezistența la alți regulatori ai activării complementului, precum CR1, DAF 4 MCF ar fi, de asemenea, de dorit. Modul de acțiune al acestor regulatori este, pentru toți, similar factorului H, astfel încât nu vor fi necesare mutageneze suplimentare. în mod similar, unele organisme patogene exprimă proprii lor inhibitori ai activării complementului, care adesea, structural și funcțional, sunt omologii factorului H (de exemplu, peptida secretoare a virusului Vaccinia]. Aceste molecule protejează invadatorii împotriva răspunsurilor imune și ar fi avantajos să fie capabile să îi atace țintit cu enzime convertază C3, rezistentă la aceste apărări.
v) Mutații care măresc stabilizarea convertazei C3 prin properdină. Activitatea properdinei este aceea de a stabiliza complexul C3bBb, întârziind disocierea spontană și dependentă de factorul H. Această stabilizare este ineficientă în faza fluidă, dar pare a fi mai importantă în amplificarea procesului, o dată ce este deja început pe o suprafață de activare corespunzătoare. Creșterea activității sale (prin descreșterea afinității sale) poate răsturna echilibrul din faza fluidă și, prin aceasta, să inițieze conversia spontană C3. Aceasta ar fi utilă în mod deosebit în combinație cu alte modificări descrise mai sus.
vi) Mutații care previn ca C3bBb să posede activitate de convertază C5. Atunci când acesta este folosit pentru epuizarea C3 active din circulație, un efect secundar nedorit ar fi generarea de cantități mari de peptide anafilactice. Cea mai puternică dintre acestea este C5a, care este clivată de la C5 de către aceleași enzime convertază C3. Probabil, această reacție depinde de afinitatea convertazei pentru altă moleculă a C3b (Kinoshita, T., Takata, Y., Kozono, H., Takeda, J., Hong, KS, Inoue, K., 1988, J. ΙιτίΓηυηοΙ.ΊΑΊ : 3895-901) și astfel poate fi supusă suprijinirii prin mutații la C3, care îndepărtează această interacțiune.
vii) Activitate îmbunătățită a convertazei C3. Situsul activ al enzimei convertază C3 C3bBb se află în porțiunea Bb. Probabil, componenta C3b funcționează pentru a impune o conformație activă asupra Bb și/sau pentru a lega și orienta substratul asupra căruia trebuie acționat prin Bb. Aceasta nu se cunoaște, dar în orice caz, aici poate fi scopul sporirii activităii convertazei prin mutații în C3.
viii) Expresia într-o formă funcțională. C3 de tip sălbatic necesită conversie la C3b înainte ca ea să se combine într-un nou complex convertază C3. Când s-a folosit in vivo, o cerință pentru conversie la C3b (sau C3i), va fi întârzierea acțiunii C3 modificate. Prin urmare, ar fi de dorit fie să se administreze proteina într-o formă capabilă să formeze imediat convertază, fie să se administreze complexe convertază pre-formate. Prin urmare, este avantajos să se genereze ex-νινο, un reactiv funcțional asemănător C3b. Acesta ar putea fi obținut in vitro (de exemplu, prin proteoliză).
ix) Modificări la proteina nativă care servește pentru introducerea de situsuri noi de clivaj, astfel că regiunile peptidei necesare pentru legarea factorului B sunt reținute, iar cele necesare exclusiv pentru legarea factorului H pot fi îndepărtate specific. De exemplu, pot fi introduse situsuri astfel, încât forma asemenea C3b a C3 modificată să poată fi clivată ulterior într-o formă care încă leagă factorul B, dar este mai puțin susceptibilă la inactivare prin factorii H și I.
RO 117189 Bl
Modificări în alte regiuni care pot afecta interacțiunea C3b cu factorul B și/sau factorul H.
Invenția se bazează pe inversarea abordării tradiționale prin inițierea conversiei 235 C3 pentru epuizarea C3 și, prin aceasta, pentru incapacitarea sistemului. O aplicație suplimentară a invenției este potențialul inițierii conversiei 03 la un situs particular și, prin aceasta, recrutarea mecanismelor efectoare dependente de complement pentru atacarea unei ținte specifice.
Prin urmare, efectul final va fi creșterea cantitativă a conversiei C3, când 240 proteina modificată se administrează într-un mediu fiziologic (de exemplu, sânge), care conține regulatorii activării complementului. Apoi, această activitate se poate folosi fie pentru epuizarea acelui mediu de C3 nativă, fie pentru localizarea conversiei C3 la o țintă dorită.
Proteina umană C3, modificată, conform invenției, este rezistentă la clivaj prin 245 factorul I. Aceasta se poate obține prin modificarea resturilor proteinei la situri proteolitice.
O realizare a invenției, preferată în mod deosebit, se referă la o proteină umană C3, modificată, în care proteina este modificată prin înlocuirea fie a Arg-1303, fie a Arg-1320, fie a ambilor, prin alt aminoacid. Acest alt aminoacid poate fi tirozină, 250 cistină, triptofan, glutamină, acid glutamic sau glicină. Arg-1303 este înlocuită, de preferință, prin acid glutamic sau glicină, (mai puțin preferat, prin glutamină). Arg1320 este înlocuită de preferință, prin glutamină.
Analogul lui C3, al cărui fragment este rezistent la acțiunile factorului I (de exemplu, derivatul descris in exemplul 1) ar lega factorul B, care apoi ar fi clivat prin 255 factorul B și, eventual, disociat într-o formă inactivă. în absența inactivării prin factorul I, C3b ar fi capabil să lege repetat noi molecule ale factorului B și prin aceasta, să inițieze inactivarea sa. Prin urmare, altă aplicație potențială a modificărilor descrise în această invenție ar fi inactivarea căii metabolice alternative prin consumarea activității factorului B. De asemenea, o abordare analoagă ar putea fi folosită pentru modifi- 260 carea C4în vederea inițierii consumării C2 și, prin aceasta, incapacitarea căii metabolice clasice, a activării complementului.
Invenția include orice altă protează folosită într-un mod analog enzimei C3bBb, care duce la clivajul lui C3 la C3b, în ciuda prezenței regulatorilor activării complementului. 265 “Secvențe ADN” includ toate secvențele de acid nucleic, care, în virtutea degenerescenței codului genetic, codifică, de asemenea, pentru secvența aminoacidă dată, sau care sunt substanțial omoloage la această secvență.
Secvențele de acid nucleic, care sunt “substanțial omoloage” se află, de asemenea, cuprinse în prezenta invenție. “Omologia substanțială” se poate cerceta fie la 270 nivelul acidului nucleic, fie la nivelul aminoacidului. La nivelul acidului nucleic, secvențe care au omologie substanțială pot fi considerate cele care hibridizează la secvențele de acid nucleic ale invenției în condiții stringente (de exemplu, la 35 până la 65C, întro soluție sare de circa O, 9M). La nivelul aminoacid, o proteină poate fi considerată ca substanțial omoloagă la altă secvență de proteină, dacă un număr semnificativ 275 dintre aminoacizii constituenți prezintă omologie. Aminoacizii trebuie să fie omologi cel puțin 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% sau chiar 99%, preferențial în ordinea crescătoare.
RO 117189 Bl
Așa cum s-a discutat mai sus, proteinele invenției pot fi folosite pentru a obține efectele activării localizate a complementului. O cale pentru asigurarea acestei activări este conjugarea proteinei la un radical care va fi legat la ținta dorită. Astfel, într-un alt aspect, invenția asigură un conjugat care cuprinde o proteină a invenției legată la un radical de legare specifică, de exemplu, o proteină de legare specifică. Un exemplu de astfel de proteină ar fi un anticorp sau un fragment care leagă un antigen al acestuia. Proteinele conform invenției vor fi administrate unui subiect, pentru a provoca un efect terapeutic dorit, și vor fi utilizate în producerea unui medicament pentru prevenirea respingerii materialului străin.
Compozițiile farmaceutice pot fi prezentate în forme de doză unitară, conținând o cantitate predeterminată de ingredient activ per doză. O astfel de unitate poate să conțină ca un minim, de exemplu, 1 mg de ingredient activ și de preferință 2-3 mg. Limita superioară pe care o astfel de doză unitară o poate conține, va depinde de numeroși factori cum ar fi condiția de tratat, calea de administrare și vârsta, greutatea și condiția pacientului, precum și cosiderentele economice. Ca un exemplu, o formă de doză unitară poate să conțină o cantitate de ordinul a 10 mg sau chiar 1OO mg de ingredient activ.
Proteinele invenției se pot utiliza pentru incapacitarea sistemului complement. Situațiile când aceasta ar fi de dorit includ următoarele.
(a) In scopul prevenirii distrugerii sau dăunării unui transplant, în special o xenogrefă (material transplantat de la o specie de animal diferită) și, în special, o xenogrefă discordantă (când donorul și receptorul sunt înrudite discordant). Receptorul va fi decomplementat înaintea operației și menținut în această stare până când transplantul fie s-a acomodat, fie a fost înlocuit printr-un organ compatibil.
Tratamentul inițial s-ar putea face cu câteva zile înaintea transplantării. Decomplementarea suplimentară ar putea fi necesara la momentele crizelor de respingere. Tratamentele pot fi însoțite de folosirea reactivilor antihistaminici, pentru combaterea răspunsurilor infamatorii generale (de exemplu, vasodilatarea), care rezultă, probabil, din generarea de C3a și/sau C5a.
De asemenea, decomplementarea ar putea fi benefică în folosirea unor organe sau țesuturi artificiale (de exemplu, membrane de dializă de rinichi artificial) care activează sistemul complement. Așa cum s-a descris mai sus, poate fi dată, ca formă inactivă, o formă funcțională asemenea C3b sau o convertază C3, preformată activ (ca C3bBb). Acestea pot fi administrate pe orice cale prin care convertaza C3 activă se va întâlni în circulație (de exemplu, intravenos, subcutanat etc.).
Cealaltă alternativă ar fi un tratament ex vivo, de exemplu, prin transfuzarea circulației printr-o matrice care poartă convertaza activă. Aceasta ar putea avea avantajul să permită ca peptidele anafilactice (C3a 4 C5a) și alți mediatori inflamatorii de greutate moleculară joasă (de exemplu histamina și oxidul de azot), să fie îndepărtați (de exemplu, prin dializă) înainte ca sângele decomplementat (sau plasma) să fie returnat pacientulului.
(b) Prevenirea distrugerilor mediate de complement care rezultă de la intervențiile chirurgicale majore. Pacientul ar fi decomplementat, ca mai sus, de preferință înaintea operației (dar dacă este necesar și după aceea), și ținut în această stare până când pericolul de leziune internă suplimentară, datorat atacului imun dependent de complement, s-a diminuat.
RO 117189 Bl
325 (c) Minimalizarea distrugerii mediate de complement, care rezultă de la leziuni nechirurgicale. în aceste cazuri, decomplementarea trebuie să fie realizată după leziunea inițiată, dar compozițiile și metodele de administrare este puțin probabil să fie similare celor descrise mai sus. Această decomplementare poate fi utilă în mod deosebit cănd implică recuperarea de reperfuzare a unui țesut ischemic de către circulație (de exemplu, ischemia miocardică, degerături, arsuri etc.) (d) Minimalizarea distrugerii mediate de complement, care rezultă din interacțiile anticorp-antigen. Răspunsurile defensive, mediate de complement, sunt nedorite, în mod special, în bolile autoimune, care pot să includă glomerulonefrita, anemia hemolitică, miastenia gravis, artrita indusă de colagen de tip II. Incapacitarea sistemului complement în timpul episoadelor severe ale bolii poate ameliora starea.
(e) Pentru a face o țintă patogenă specifică mai susceptibilă la mecanisme imune mediate de complement. în această abordare, scopul nu este folosirea convertazei C3 super active pentru a produce epuizarea generalizată a C3, ci folosirea convertazei locale pentru concentrarea conversiei C3 la o țintă dorită. Ținta poate fi un organism patogen, precum bacterie, virus, sau alt parazit, sau o celulă sau țesut dăunătoare gazdei, cum ar fi o celulă tumorală sau o celulă infectată viral. Convertaza C3 s-ar putea localiza la țintă, fie prin administrare locală (de exemplu, injectare directă, posibil într-un mediu care întârzie dispersia sa în circulația generală), fie prin combinare cu o porțiune care țintește, de exemplu, un anticorp. Astfel, proteina modificată ar putea fi legată la o imunoglobulină specifică fie prin reticularea chimică a proteinelor, fie prin legarea secvențelor care codifică ADN-ul și expresia (și purificarea) proteinei de fuziune (de exemplu, în cazul IgG, s-ar putea atașa fie catena grea, fie cea ușoară, la C3, și s-ar putea co-exprima cu C3, sau ambele catene ar putea fi combinate într-o polipeptidă de fuziune completă), sau prin încorporarea secvențelor de codificare specifică (de exemplu, domeniile asemenea “leucine zipper”) la ADN-ul ambilor parteneri de fuziune (de exemplu, C3 modificată și anticorp specific), astfel că produsele exprimate, când se amestecă, se auto-asociază pentru a forma conjugate stabile. Apoi, proteina de fuziune s-ar putea administra local sau în circulația generală.
De asemenea, ar putea fi folosiți lipozomi (care poartă anticorpul cu proteina modificată, fie la suprafață, fie în interiorul lipozomului) și/sau virioni (de exemplu, prelucrați prin inginerie genetică pentru a exprima proteine pe suprafața lor), pentru coeliberarea anticorpului și proteinei modificate. Această strategie ar putea fi folosită direct, singură sau în combinație cu alte tratamente, la orice stadiu în procesul îmbolnăvirii. în mod deosebit, ea poate fi folosită pentru eliminarea oricăror celule canceroase rămase în circulație după îndepărtarea chirurgicală a unei tumori. De asemenea, conjugatele anticorp-proteină modificată ar putea fi folosite ex vivo, pentru eliminarea țesutului patogen, de exemplu, pentru distrugerea celulelor leucemice de la o măduvă osoasă extrasă și apoi pentru returnarea la pacient a celulelor sănătoase rămase.
Alternativ, limfocitele care nu se potrivesc tipurilor MHC ale receptorului ar putea fi eliminate dintr-o măduvă osoasă înaintea transplantării. De asemenea, proteina modificată ar putea fi legată la un antigen, și această combinație ar putea fi folosită atât in vivo, cât și ex vivo, pentru atacarea limfocitelor cu reactivități nedorite (de exemplu, împotriva transplantului sau țesutului propriu).
330
335
340
345
350
355
360
365
RO 117189 Bl
Aceeași tehnologie ar putea fi aplicabilă pentru tratarea altor specii, folosind fie un derivat de proteină umană modificată, fie un analog similar, făcut corespunzător pentru aceea specie.
Trăsăturile preferate ale oricărui aspect al invenției sunt aceleași pentru fiecare aspect în parte, mutatis mutandis.
în continuare invenția va fi descrisă prin intermediul exemplelor, cu referire la desenele însoțitoare.
Fig. 1 prezintă secvența proteică prevăzută a C3 umană așa cum s-a codificat în PC3; (folosind codul de o literă pentru aminoacizi);
Fig. 2 arată secvența cADN din PC3; (folosind codul standard de o literă pentru deoxinucleotide, pentru banda sens, scris 5’ —> 3’).
Fig. 3 ilustrează o vizualizare a proteinelor modificate ale invenției.
Fig. 4 arată efectul diferitelor mutații la C3 umană, care înlocuiesc Arg 1303 sau Arg 1320 pe clivaj mediat factor I la aceste situsuri.
N.B.
1. Probe marcate biosintetic (35S)
2. Reacții realizate la tărie ionică normală
3. Imunoprecipitat cu anti-C3.
4. SDS-PAGE în condiții reducătoare.
5. Autoradiografie.
Fig. 5 prezintă rezistența sporită la inactivare prin factori I și H a C3 umană, care incorporează mutația Arg 1303 —> Gin 1303.
Fig. 6 prezintă analiza clivajului unei convertaze C3, mutată la resturile aminoacide 752-754 și 758-760. Aceasta este o fotografie a unei Western Blot obținut de la un gel poliacrilamidic 7,5% SDS-PAGE (condiții reducătoare), după transfer electroforetic pe nitroceluloză, sondare cu un anticorp de oaie anti-C3 umană și dezvoltare cu peroxidază hrean cuplată -imunoglobulină anticorp anti-oaie și intensificare a chemiluminiscentei (metodă 4 reactiv de detecție de la Amersham, U.K.) înregistrată pe film raze-X. Reacția de clivaj și procedura de detectare s-au realizat așa cum se descrie în exemplul 4, cu referire la rezultatele prezentate în fig. 3.
Cod:Trasee 1-4: C3 de tip sălbatic (exprimată în celule COS) Trasee 5-8: C3 mutantă (resturile 752—754 schimbate la Gly-Ser-Gly și resturile 758—760, de asemenea schimbate la Gly-Ser-Gly) (exprimată în celule COS).
Trasee 1,5: fără adiție
Trasee 2, 6: + CVFBb
Trasee 3, 7: + factori Η + I
Trasee 4, 8: + CVFBb + factori Η + I
Benzile indicate prin săgețile sunt:
A: C3, catena alfa
B: C3, catena alfa’
C: C3, catena beta
D: produsul de 68 kDa al clivajului catenei alfa’ a C3
E: IgG, catena grea
Fig. 7 prezintă o analiză a clivajului factorului B radiomarcat prin factor D, în prezența C3 de tip sălbatic și mutant (C3i-uri).
RO 117189 Bl
Este prezentată o fotografie a autoradiografiei gelulului SDS-PAGE. Toate probele au conținut factor D și factor B marcat 1251, și s-au incubat timp de 3 ore la 37°C.
De asemenea, probele din traseele numerotate au inclus:
Numai tampon
2. 1 /125 C3 de tip săbatic
3. 1/25 C3 de tip sălbatic
4. 1 /5 C3 de tip sălbatic
5. 1/25 C3 mutant (resturi 1427 Gin, 1431 Asp și 1433 Gin)
6. 1/5 C3 mutant
7. C3 mutant nediluat
Benzile indicate prin săgeți sunt:
A. Factor B marcat1251, neclivat (93 kDa)
B. Produs de clivaj de 60 kDa (“Bb”)
C. Produs de clivaj de 33 kDa (“Ba”)
Fig. 8 arată un studiu SDS-PAGE care ilustrează formarea unui conjugat între C3i și IgG.
Aceasta este o colorație Coomassie a unui gel 4% acrilamidă SDS-PAGE, migrat în condiție nereducătoare.
Traseele numerotate conțin probe de:
1. PDP-lgG
2. C3i
3. PDP-lgG + amestec de reacție C3i
Prin săgeți sunt indicate:
A. Probabil conjugat C3i-lgG (350 kDa)
B. C3i (200 kDa)
C. lgG(150kDa)
Fig. 9 demonstrează activitatea de convertază C3 a conjugatulului împotriva eritrocitelor de oaie. (Acest grafic prezintă % eritrocite de oaie lizate, după acoperire cu diluții fie de conjugat C3i-lgG, PDP-lgG, fie de C3i, urmată de spălare, generarea convertazelor C3 cu properdină și factorii B și D și în final, dezvoltarea lizei prin NGPS în CFD/EDTA, așa cum s-a descris în metode. Numai conjugatul produce liză și această liză este dependentă de doză).
Următoarele metode și definiții standard sunt aplicabile la toate exemplele.
Toate componentele complementului la care s-a făcut referire până aici sunt de origine umană, cu excepția altor specificări, folosind terminologia standard pentru toate proteinele și fragmentele lor derivate (așa cum sunt conținute în referința (Rother, K., Till, G.O, 1988, The complement system, Springer-Verlag-Berlin Heidelberg, Germany).
Suplimentar, termenul “C3i” se referă la orice formă moleculară a C3 fără o punte tiolester intactă, dar care păstrează polipeptidă C3a pe catena alfa.
Secvența de codificare și cADN C3 uman sunt numerotate așa cum s-a arătat în fig. 2, folosind numerotarea utilizată în baza de date nucleotidice EMBL (derivată din referința ( De Bruijin, M.H., Fey, G.H., 1985, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.m 82: 708712). Secvența prezentată este cea a constructului invenției (’PC3’), care pierde
420
425
430
435
440
445
450
455
460
RO 117189 Bl
465
470
475
480
485 ί 490
L
495
500 primele 11 nucleotide ale regiunii 5’ netranslate, raportate în referința (De Bruijin, M.H., Fey, G.H., 1985, Proc.Nati.Acad.Sci. U.S.A.m 82: 708-712), și de aici, prima bază este numerotată 12. Codonul probabil de inițiere se află la nucleotidele cu numerele 61-63, codonul pentru restul serină aminoterminală al catenei beta se află la nucleotidele 127-129, și codonul pentru restul serină amino-terminală al catenei alfa se află la nucleotidele 2074-2076.
Secvența proteinei se numerotează conform secvenței precursoare, așa cum s-a prezentat în fig. 1, care este o translație presupusă a secvenței ADN din Anexa 1 (aminoacizii 1-22 sunt de așteptat să cuprindă o secvență semnal care este independentă în timpul biosintezei și aminoacizii 668-671 sunt de aștepat să fie îndepărtați când se clivează precursorul în catenele alfa și beta).
Abrevierile care urmează au următoarele semnificații; CVF factorul veninului de cobră; ELISA, analiza enzimei legate imunoadsorbant; E.coii, Escherichia coli; kb, kilobază HSV-1, virus herpes simplex de tip 1; PBS, fosfat salin tamponat. COS-1 este o linie celulară derivată din celule renale de maimuță. Următoarele sunt endonucleaze de restricție: - Aflll, Dral, Dralll, EcoRI, EcoRV, Hindlll, Nael, Nhel, Xbal.
Metode pentru proceduri de biologie moleculară standard cum ar fi izolări de plasmid, electroforeză în gel de agaroză și liguri ADN, se pot găsi în referința (Sambrook, J., Fritsch E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning. A. Laboratory Manual, ed.a-ll-a., Cold Spring Harbor Laboratory Press). ADN dublu catenar s-a secvențiat folosind kit ‘Sequenase version 2.0 furnizat de ‘United States Biochemicals’. Expresia C3 s-a măsurat printr-o analiză EUSA, folosind plăci din plastic pre-acoperite cu anticorp policlonal de oaie purificat anti C3 umană, la care s-au adăugat probe ale supernatantului culturii. Legarea C3 s-a detectat cu un anticorp monoclonal de șobolan la C3 conjugat la fosfatază alcalină și substratul cromogen, p-nitrofenol fosfat. Analizele s-au calibrat cu C3 plasmatică umană, purificată.
Metode pentru purificarea proteinelor complementului și CVF, și pentru prepararea anticorpilor de afinitate purificați anti-C3, folosiți în analiză se pot găsi în referința (Harrison, R.A, Lachmann, P.J., 1986, Handbook of Experimental Immunology, Ed. Weîr, Herzenberg, Blackwell, Herzenberg, Blackwell, Oxford, 4th ed). De asemenea, de la Sigma chemical company LTD pot fi procurați reactivi echivalenți.
Secvența de codificare a cADN C3 s-a construit din două segmente izolate dintr-o bancă cADN de ficat uman inițiată randomic, conținută în vectorul pGEM4 (Promega). Cinci oligodeoxinucleotide, corespunzătoare la segmente cunoscute din secvența codificatoare C3 umană, s-au radiomarcat cu T4 polinucleotid kinază și [y32PJATP 4 s-au folosit la transferurile filtrului sondă al băncii de la plăcile de agaroză. S-au izolat 2 clone care conțin inserte de aproximativ 4 kb. Digestia endonucleazică de restricție, hibridizarea la sonde oligodeoxinucleotidice specifice și analiza secvenței parțiale au demonstrat că una din acestea (Ά13’) a inclus capătul 5’ al mesajului 5,1 kb, în timp ce alta (*B44') s-a extins până la capătul 3'.
Prin urmare, aceste inserte s-au suprapus prin 3 kb, care includ un situs enzimatic de restricție EcoRI unic. Secțiunea 5’ incompletă a A13 s-a tăiat cu EcoRI și Nhel și s-a înlocuit cu segmentul complet izolat din B44 prin digestie cu EcoRI și Xbal. Ambele piese s-au purificat prin electroforeză în gel în agaroză cu punct de topire scăzut, înaintea ligării împreună cu T4 ADN ligază pentru a produce un vector (‘PGC3’) care conține 5,1kb ale ADN-ului care codifică în întregime proteina precursoare C3.
505
RO 117189 Bl
Secvențele linker 5’ la regiunea de codificare C3 au conținut 2 ATG-uri care sunt situsuri de start de translație, potențial false. Prin urmare, acestea au fost îndepărtate prin mutageneză plasmid-gapped, așa cum s-a descris în metoda exemplului
I, folosind o oligodeoxinucleotidă PL-ATC-3 (tagggagacc ggaagcttgc cctctccctc tgtccctctg t), care a deletat aproximativ 50 baze perechi ale ADN-ului linker/adaptor, fără modificarea secvenței de codificare C3. Acest vector mutant, 7,7 kb care conține 5,1 kb ale secvenței cADN C3 plus 2,6 kb ale secvenței din vectorul PGEM4 (Promega), este denumit ca PC3.
Regiunea de codificare C3 a plasmidului PGC3 s-a secvențiat complet și a arătat numai 4 diferențe față de o secvență cADN C3 umană publicată anterior (allela “5”) (De Bruiji, M.H., Fey, G.H., 1985, roc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 82 : 708-712).
(i) schimbările C2481—> G, și C2805—> T nu modifică codificarea;
(ii) T1001—> C codifică forma polimorfică HAV 4-1-(Leucină 314 —> Prolină) descrisă anterior ( Botto, M., Fong, K.Y., So, A.K., Koch, C., Walport, M.J., 199D,
J. Exp.Med); și (iii) G2716—> A codifică Valină886 —> Izoleucină, care nu a fost raportată anterior în C3 umană, deși lle se găsește în această poziție în C3 de șoarece și șobolan.
Secvența noastră include codoni de start și stop, cu o secvență semnal completă și, prin urmare, vor codifica 03 funcțională.
Prin ELISA s-au detectat niveluri de până la 1,7 bag/ml C3 de tip sălbatic exprimate în supernatantele culturii de celule COS-1 (transfectate folosind lipofectamină și vectorul de expresie pcDNA3 (Invitrogen)). Numai cu vectorul pcDNA3, nu s-a produs C3 detectabilă de către celule transfectate. Mai mult, analiza produsului exprimat prin reacții de clivaj, urmate de imunoprecipitare, SDS-PAGE și imunoblotting, a demonstrat că:
(i) produsul translației primare a fost corect prelucrat în forma matură bicatenară;
(ii) acest produs a fost, asemenea C3 nativă, clivabil la C3b prin convertază C3 (CVFBb) și (iii) proteina exprimată a fost, asemenea 03 native, neclivabilă prin factor H plus I, dar devine ciivabilă după conversie la C3b prin enzima convertază C3. Aceasta confirmă că plasmidul nostru de start poate fi translat în C3 funcțională.
Pentru o descriere alternativă a unei construcții și expresii a unei secvențe de codificare C3, vezi referința Taniguchi-Sidle, A., Iseman D.E., 1992.J.Biol.Chem. 167:635-643.
Exemplul 1. Producerea C3 care are resturi arginină la ambele situsuri de clivaj, factor I (pozițiile aminoacide 1303 și 1320) convertite la resturi glutamină pentru prevenirea clivajului fragmentului C3b prin factor I.
a) Mutageneză
Oligodeoxinucleotidele mutagene folosite au fost QRI 1 (caactgcccagccaaagctccaagatcacc), QRI 2 (gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag), și AFL 4149 (taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac) precum și oligodeoxinucleotidele antisens corespondente, QRI 1 n (ggtgatcttggagczzzggctgggcagttg), QRI 2n (cttggtctcttctgattgcaggaggctggc) și AFL 4149n (gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta)
510
515
520
525
530
535
540
545
550
555
RO 117X89 Bl
QRI 1 și QRI 1 n specifică înlocuirea argininei pentru glutamină la situsul de clivaj factor
I la restul aminoacid 1303 din secvența precursoare C3 (prin schimbarea
G3968C3969 la AA în secvența cADN) și QRI2 și QRI2n efectuează aceeași substituție la situsul de clivaj al factorului la restul aminoacid 1320 (prin schimbarea nucleotidei G4O19 la A).
AFL4149 și AFL4149n introduc un situs de clivaj pentru endonucleaza de restricție Aflll la poziția 4149 în secvența cADN (prin schimbarea C4149 la T) fără modificarea secvenței aminoacide codificate. Acești 2 primeri s-au folosit ca markeri, permițând ca mutageneza reușită să fie identificată pe baza clivajului produsului ADN prin Aflll.
Mutageneza s-a efectuat folosind metoda ‘gapped plasmid’. S-a preparat o șarjă de PGC3 (‘UPGC’), îmbogățită în uridină în locul timidinei prin creștere în E.coli tulpina CJ236, în prezența de 0,25 mg/ml uridină. Acest plasmid s-a digerat cu Smal și produsul 7,2 kb (‘US Γ) s-a purificat pe gel de agaroză pentru îndepărtarea unui fragment de 0,5 kb din secvența C3 (resturile 1463-1947). Alt component al plasmidului gapped (‘DN2’) s-a preparat prin digestia PGC3 cu Dralll plus Nael și purificarea de două ori a piesei de 5,1 kb prin electroforeză în gel de agaroză. S-au amestecat 200 ng DN2 cu aproximativ 5oo ng US1 în 50 ml HaO, încălzită la 10O°C și răcită încet până sub 5O°C, înainte adăugâd 20ml până la 25 ml de tampon 2XT7 (100 mM Tris/HCI/pH 7,4/14 mM MgC12, 100 mM NaCI, 2 mM ditiotreitol și 1 mM fiecare dintre ATP, dATP, dCTP, dTTP și dGTP) plus 10 nmol din fiecare primer mutagen fosforilat 5’ (o reacție a folosit QRI1, QRI2 plus AFL4149, altă reacție a folosit QRI1n, QRI2n plus AFL4149n). Amestecurile s-au reîncălzit la 70°C pentru 5 min și s-au răcit încet (pe durata a 30-60 min) până la 2O°C. S-au adăugat, la O°C, 10 unități de ADN polimerază T7 plus 80 unități ADN ligază T4. Amestecul (volum total 50 ml) s-a incubat întâi la 0°C, timp de 5 min, apoi la temperatura camerei 5 min și în final la 37°C timp de 3 h. S-a folosit 1 ml din fiecare amestec pentru transformarea a 100 ml E.coli XL1 supercompetentă (Stratagene), în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
S-au selectat colonii rezistente la ampicilină pentru clivaj Aflll, și mutantele obținute s-au crescut în culturi de 100 ml din care s-au izolat plasmidele și s-au secvențiat (folosind un primer de secvențe C3pa-3976, cttcatggtgttccaagcct, care împerechează nucleotidele 3876-3895 ale cADN C3) pentru caracterizarea mutațiilor la situsurile de clivaj factor I.
Protocolul alternativ pentru mutageneză gapped plasmid se va consulta din: Hofer, B., Kuhlein, B., 1993, Methods Enzimol. 217: 173-189;
b) Transferul ADN-ului mutant la vector de expresie eucariotă
Fragmentele de codificare C3 din plasmidele mutante s-au excizat prin dublă digestie cu Hindlll și Nael. De asemenea, a fost inclus Dral pentru incapacitarea plasmidului rezidual. Secvența de codificare C3 s-a purificat pe gel de agaroză și s-a ligatîn vectorul pcDNA3 (Invitrogen) care a fost linearizat cu enzimele Hindlll și EcoRV și de fosforilat cu fosforilază intestinală de vițel. Amestecurile de ligare s-au folosit pentru transformarea E.coli XL1 supercompetente, care apoi s-a etalat pe plăci de cultură care conțin ampicilină.
selecție oarecare (trei sau patru) colonii rezistente la ampicilină s-au crescut în culturi de 2-3 ml și s-au izolat la scară mică plasmidele ADN. Plasmidele care conțin
RO 117189 Bl insertul corect s-au identificat prin digestia plasmidului ADN cu endonucleaze de restricție EcoRI, Hindlll, șiAflII. Coloniile corespunzătoare au fost crescute în culturi 605 de 100 ml și plasmidele au fost purificate prin procedura standard. Aceste mutante s-au construit inițial de la PGC3 și astfel au reținut cele două ATG-uri 5’ la regiunea de codificare. Această regiune (plus 3 kb 5' ale secvenței de codificare C3] au fost excizate cu Hinlll plus EcoRI și înlocuite prin ligarea aceluiași segment decupat din PC3. Acești vectori reconstruiți s-au preparat prin procedura standard și s-au folosit 610 pentru transfecția celulelor COS.
c) Expresia C3 de tip sălbatic și mutantele
Mutantele și C3 de tip sălbatic s-au exprimat tranzitoriu de la plasmidele transfectate în celule COS-1 folosind lipofectamine® (GIBCO) urmând instrucțiunile producătorului. De obicei, s-au transfectat 1-1,5 X 1O5 celule per godeu într-o placă 615 de cultură standard cu 6 godeuri cu 2-4 mg de plasmid folosind 9ml de reactiv lipofectamină. Supematantele s-au cercetat pentru secreție C3 și în mod obișnuit, sau obținut randamente de 0,3-1,7 mg per ml supernatant la 3-6 zile după transfecție.
a] Generarea mutantelor 620
S-au izolat astfel, mai departe, următoarele mutante denumite conform secvențelor oligodeoxinucleotidice, mutagene care au fost încorporate:
(i) 3 mutante cu ambele mutații ORI 1 și QRI 2 plus AFL 4149 :C3M-26, C3M- și C3M-61;
(ii) 1 mutantă cu QRI 1 și QRI 2, dar fără AFL4149: C3M-8; și 625 (iii) 1 mutantă cu QRI2 și AFL4149, dar fără QRI1: C3M-51 (folosită în exemplul 3).
b] Validarea efectelor funcționale care s-au datorat mutațiilor introduse specific la situsurile de clivaj factor I
Secvențierea a confirmat absența altor alterări în 178-350 baze din jurul 630 regiunii mutate a fiecărei mutante. Secvența unei mutante produsă prin această procedură, C3M-51 (vezi exemplul 3), a fost analizat prin întregul ‘gap’ (baze 2463-5067) folosit în mutageneză și nu s-a găsit nici o altă deviație de la secvența de tip sălbatic.
Mai mult, secvențierea reprezentativă a unui total de 2922 baze de la toate mutantele nu a arătat nici o singură mutație punctiformă, care ar fi putut fi cauzată 635 de erori mediate de polimerază. Toate mutantele exprimate au prezentat structura bicatenară și clivaj prin convertaze C3, caracteristic C3 nativă în rezumat; este puțin probabil ca mutantele folosite să conțină orice alte schimbări nedorite cu toate că ele nu au fost re-secvențiate complet.
Exemplul 2. Producerea C3 care are restul arginină la un situs clivaj factor I 640 [poziția aminoacidă 1303] convertit la un rest glutamină
S-a urmat procedura exemplului 1, cu excepția faptului că, în mutageneză, s-au folosit numai oligodeoxinucleotidele mutagene AFL4149 plus QRI1 sau AFL4149n plus QRHn (adică, fără QRI2 sau QRI2n).
S-au izolat 2 mutante cu QRI1 4 AFL4149, dar fără QRI2:C3M-123, 27. 645
Mutanta C3M-123 s-a exprimat cum s-a descris în exemplul 1. Această proteină a fost clivabilă prin CVFBb. Produsul asemenea C3b a fost relativ (comparat tipului sălbatic) rezistent la clivaj la poziția 1303 prin factorii I și H, dar a putut încă să fie clivat la poziția 1320. Acest derivat C3b este prin urmare parțial rezistent la factor.
RO 117189 Bl
Exemplul 3. Producerea C3 care are restul arginină la un situs de clivaj factor
I [poziția aminoacidă 1320] convertit la un rest glutamină
S-a urmat procedura de la exemplul 1, cu excepția faptului că, în mutageneză, s-au folosit numai oligodeoxinucleotidele mutagene AFL4149 plus QRI2, sau AFL4149n plus QRI2n (adică, fără ORII sau QRI1n). Suplimentar, metoda folosită în exemplul 1 a dat de asemenea, o mutantă cu QRI2 4 AFL4149, dar fără QRI1.
S-au izolat 3 mutante cu QRI2 4 AFL4149, dar fără QRII: C3M-51, C3M-Q2, C3M-Q13. Mutanta C3M-51 s-a exprimat cum s-a descris în exemplul 1. Această proteină a fost clivabilă prin CVFBb. Produsul asemenea C3b nu a fost clivat cu ușurință la poziția 1320 prin factorii I și H, dar el a putut fi încă clivat la poziția 1303. Acest derivat C3b este prin urmare, parțial rezistent la factor I.
Exemplul 4. Analiza efectelor funcționale ale mutațiilor
S-au incubat supernatante (100400 ml) de la celule COS transfectate la 37°C, timp de 2 h, cu:
Celule COS s-au transfectat cu pcDNA3 care conține inserte ale:
1) secvența C3 nemutantă
2) mutantă C3M-123 (care codifică Arg1303® Gin);
3) mutantă C3M-26 (care codifică Arg1303® Gin, Arg132q® Gln);și
4) mutantă C3M-51 (care codifică Arg132Q® Gin)
Sau pretratat 200ml din supernatantele culturii, luate la 3 zile după transfecție cu 2 mM fluorură de fenilmetansulfonil (0°C, 15 min) și apoi s-au incubat la 37°C timp de 2 h cu următoarele:
A) fără adiție;
B) convertază C3 preformată, CVFBb (10 ml din 200 ml conținând 6,6 mg CVF, 100 mg factor B și 1,4 mg factor D în fosfat salin tamponat (PBS) care conține 10 mM MaCI2, preincubat la 37° C, 15 min);
C) factorii H (5 mg) și I (1 mg); și
D) CVFBb plus factori H și I.
Apoi, acestea au fost imunoprecipitate prin adăugarea a 0,6 mg imunoglobulină de oaie purificată cu afinitate anti-C3 umană la temperatura camerei și după 1 oră adăugarea a 20 m1 dintr-o suspensie 5% de celule spălate de Streptococcus sp., Grup C, fixate formal ină (proteină G) (Sigma). După 45 min la temperatura camerei, particulele s-au spălat o dată în PBS, 5 mM NaN3 și o dată în 20 mM Tris/HCI, 137 mM NaCI, 0,1% (v/v) Tween 20, pH 7,6 înaintea eluării în 1% SDS/2% 2mercaptoetanol (9O-IOO°C, 5 min). Aceste eluate s-au separat prin SDS-PAGE, s-au electroblotat pe nitroceluloză și benzile C3 s-au detectat prin sondare cu imunoglobulină de oaie purificată cu afinitate anti-C3 umană, urmată de peroxidază de hrean cuplată la imunoglobulină de măgar anti-oaie (Sigma) și detectare folosind substrate “Enhanced Chemiluminescence, furnizate de Amersham. Este prezentată o fotografie a unei expuneri de 2 min la film raze X. Benzile vizibile, derivate C3, sunt indicate prin săgeți marcate și probele individuale (1-4, A-D) sunt cele tocmai descrise. (Banda proeminentă de circa 50 kDa (dintre benzile 46 și 68 kDa) prezentă în toate probele, este catena grea a IgG folosită în imunoprecipitare și detectată prin peroxidază de hrean cuplată la imunoglobulină de măgar anti-oaie).
1. Toate probele netratate (1-A, 2-A, 3-A, 4A) conțin benzi ale migrării corecte pentru catenele alfa și bete ale C3, care arată că sunt exprimate toate mutantele și
RO 117189 Bl sunt prelucrate posttranslațional corect. Prezența benzilor de 43 sau 46 kDa în aceste probe arată prezența unei activități asemenea factor H + factor I în mediul de cultură. Hidroliza spontană a C3 în timpul perioadei biosintetice de 3 zile produce C3i care este clivat prin această activitate. In C3 nemutantă, aceasta generează benzi de 43 kDa și 75 kDa (banda de 75 kDa este invizibiă deoarece (i) ea este mascată de 700 catena beta de 75 kDa, și (ii) anticorpul folosit pentru dezvoltarea western blotnilui are activitate foarte mică împotriva acestei porțiuni a catenei alfa a C3: prezența sa s-a confirmat ulterior prin resondare cu un anticorp monoclonal de șobolan, “Clone-3”, care este specific pentru această regiune) Adăugarea factorilor H și I fără CVFBb (1-C,
2-C, 3-C, 4-C) nu clivează C3 rămasă, arătând că aceasta a reprezentat C3 activă 705 (tiolester intact)
2. C3 nemutată (1) este clivată prin CVFBb și produsul C3b este clivat în continuare prin enzime endogene în 1-B sau factorii adăugați H și I în 1-D. Banda de 43 kDa arată clivaj la Arg1320, și banda de 68 kDa (vizibilă la expuneri mai lungi) arată clivaj la Arg1303 7 1 0
3. Mutanta C3M-I23 (Arg1303® Gin) a fost clivabilă prin CVFBb și produsul a fost relativ rezistent la factorul endogen H și activitate asemenea I (2-B), cu cantități distincte de catenă alfa' (C3b) persistente, dar încă a fost clivabil când s-au adăugat suplimentar factor H și I (2-D). Produsul 43 kDa arata clivaj la ArgiBiC (o pată estompată la 71 kDa care reprezintă alt fragment al catenei alfa’, care poate fi observat în 715 expuneri mai lungi), dar nu a fost prezentă nici o bandă 68 kDa, dovedind că această mutantă este rezistentă la clivaj la Gin1303 mutant.
4. Mutanta C3M-26 (Arg1303® Gin, Arg132Q®Gln) a fost clivabilă prin CVFBb și produsul asemenea C3b (alfa*) a fost rezistent la factorul endogen H și activitate asemenea I (3-B). De asemenea, el a fost foarte rezistent la factorii suplimentari H 720 și I (3-D) în comparație cu C3 nemutată (1) și alte mutante (2 și 4). A existat o cantitate mică de produs 46 kDa care indică ceva clivaj la Gin1303 mutat (fragmentul însoțitor de 68 kDa a fost de asemenea, vizibil pe expuneri mal lungi). A existat 43 kDa puțină sau nedetectabilă, care ar corespunde la orice clivaj la Gin1320. Prin urmare, mutația Arg®Gln la poziția 1303 este mai puțin eficientă decât cea la poziția 725
1320 la prevenirea clivajului prin factor I. (Acest clivaj rezidual lent poate fi întâlnit de asemenea, în mutanta C3M-123 (Arg 1303 ® Gin), dar intermediarul 46 kDa este probabil prelucrat rapid la 43 kDa prin clivaj ulterior la Arg1320)
5. Mutanta C3M-51 (Arg132q® Gin) a fost clivabilă prin CVFBb și produsul s-a clivat prin factorul endogen H și activitatea asemenea I (4-B), 4 suplimentar, prin 730 factor H și I (4-D) Produsul 46 kDa (și banda estompata 68 kDa) arata clivaj la Arg Totuși, absența unei benzi 43 kDa arată că ea nu este clivată la Gin1320.
Exemplul 5. Compararea diverselor substitutuții aminoacide la poziția 1303
Exemplele anterioare au descris mutații ale arg 1303 și arg 1320, la resturi glutamină. La acele poziții, ambele mutații au în comun rezistentă la clivaj prin factor 735 I. Cu toate acestea, a existat un grad mic, dar detectabil de clivaj la gin 1303. Ca urmare, la această poziție au fost făcute și testate numeroase alte substituții aminoacide. Are loc clivaj în ordinea descrescătoare a eficacității când restul 1303 este: Arg > Tyr > [Cys sau Trp] > Gin > [Glu sau Gly). Aceste rezultate sunt neașteptate, deoarece (i) toate clivajele cunoscute, întânite în mod natural mediate de factorul I 740 uman, se petrec la C-terminal al resturilor argininei, altfel s-ar deduce că enzimă a
RO 117189 Bl avut o cerință pentru arginină și (ii), dacă se clivează la alte resturi, s-ar putea prezice că ele vor trebui să fie similare electrostatic arg, cu alte cuvinte, un rest bazic (lys sau his), (de exemplu, tripsina clivează selectiv Cterminal la arg, lys, sau his), astfel încât nu s-ar putea prezice clivaj al substituției tirozinei.
Prin urmare, substituția arg 1303 cu glicină sau acid glutamic este preferată în scopul creării unui derivat al C3 rezistent la inactivare prin factor i.
Metode utilizate:
1. Mutageneza: primerul mutagenic degenerat folosit a fost: caactgcccagc(gt) (ag) (cg)agctccaagatcacc (literele din paranteze indică amestec de baze la acea poziție). S-au construit mutante fie prin metoda gapped-plasmid (cum s-a descris în exemplele anterioare), fie prin “megaprimer method” (V.Picard et al., Nuc Acid Res 22: 2587—91, (1994)), în care primerul din amonte a fost caccaggaactgaatctagatgtgtccctc și primerul din aval a fost gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta.
Toate mutațiile s-au realizat pe matrițe în care ADN care codifică C3 a fost deja mutat, astfel că restul aminoacid 1320 a fost glutamină și s-a introdus un situs de restricție pentru Aflll la poziția 4149 (așa cum s-a descris în exemplele anterioare) și care a fost confirmat prin secvențiere ADN.
2. Expresie: mutantele s-au exprimat în celule COS folosind vectorul pcDNA3, așa cum s-a descris în exemplele anterioare, marcat cu (35S) metionină în mediu fără ser.
3. Analiză: supernatantele s-au tratat cu CVFBb (format prin reacția CVF cu factori B și D în tampon conținâd magneziu) și factori H și I urmat de imunoprecipitare cu anti-C3 și separare prin electroforeză. SDS în gel poliacrilamidă realizată în condiții reducătoare (așa cum s-a descris în exemplele anterioare). Gelul s-a fixat, s-a tratat cu reactiv “Amplify” Amersham, s-a uscat și s-a expus la film autoradiografic pentru a obține rezultatul prezentat în figură.
Clivajul mediat factor I la poziția 1303 (sit 1), fără clivaj la 1320 (sit 2) (unde acesta a fost mutat la glutamină) produce benzi de 46 și 68 kDa. Se poate observa că se petrece clivaj în ordinea: arg(R) > tyr(Y) > cys(C) 4 trp(W)> gln(Q) > gly(G) și glu(E). Tipul sălbatic (arginină la ambele poziții) este clivat la ambele poziții pentru a produce fragmente de 43 (prea mici pentru a fi vizibile pe acest gel) și 68 kDa.
Rezultatele sunt prezentate în fig. 4. Resturile la situl 1 (poziția 1303) și situsul 2 (1320) sunt indicate deasupra traseelor respective.
Exemplul 6. Demonstrarea rezistenței sporite la inactivare prin factori I și H după mutația arg 1303 la gin
Exemplele de mai sus au demonstrat că transformarea arg fie la 1303, fie la 1320 la glutamină, face acel situs rezistent la clivaj prin factor I. Mutația ambelor situsuri face o moleculă care este rezistentă la clivaj la fiecare situs. Vom demonstra în continuare că numai mutația arg 1303 la gin (fără modificare la arg 1320) are ca urmare o rezistență considerabilă comparativ cu tipul sălbatic, la inactivare funcțională prin factorii I și H.
Metodă utilizată:
1. Expresie: prepararea mutației arg 1303® gin s-a descries într-un exemplu anterior. Aceasta s-a transfectat în CHO (o linie celulară comună în laborator, derivată din celule ovariene de hamster chinezesc) prin metoda fosfatului de calciu, și
RO 117189 Bl transfectanții stabili s-au selectat pe baza rezistenței la G418 (“Geneticin” accesibil de la Sigma). S-au colectat supernatante de cultură și C3 exprimata a fost purificata parțial prin precipitare cu sulfat de sodiu [10-20% (g/v) fracție] și cromatografie de schimb ionic pe sepharoză Q și sepharoză mono Q (A W Dodds Methods Enzymol 223: 46 (1993)).
2. Analiză: S-au acoperit cu anticorp monoclonal S016 eritrocite de oaie (R A Harrison și P J Lachmann Handbook of Experimental Immunology 4th Edition cap. 39(1986)) 4 apoi 4,4 ml dintr-o suspensie 5% (v/v) a fost incubată cu aproximativ 10 mg C2, 24 mg C4 și Img CI (componente umane purificate) timp de 10 min la 37°Cîn CFD (R A Harrison 4 P J Lachmann, supra). Apoi, 0,8 ml din acest amestec s-a incubat 105 min cu 0,25 ml conținând C3 mutantă semipurificată sau de tip sălbatic și EDTA până la o concentrație finală de 12,5 mM. Apoi, celulele s-au spălat în CFD 4 s-au folosit în CED care conține 0,1% (g/v) gelatină (gel CED). S-a folosit radioligand de legare cu anticorp monoclonal anti-C3,clona 4, marcat cu [125l] pentru a confirma că s-au depozitat cantități similare de tip sălbatic sau mutantă C3b.
Pentru analiză, s-au diluat 40 m1 dintr-o suspensie 5% de celule în 250 m1 gel CFD 4 s-au incubat alicote de 50 m1 cu 50 m1 gel CFD conținând diluții ale factorilor I și H până la concentrații finale de 100, 10, 1 și O mg/ml fiecare, la 37° C timp de 30 min. Apoi, s-au adăugat 0,9 ml de CED, celulele s-au peletat prin centrifugare și s-au spălat de 2 ori mai mult cu 1 ml CFD de fiecare dată. Apoi, celulele s-au resuspendat în 100 m1 gel CFD conținând 100 mg/ml factor B, 100 mg/ml properdină, 1 mg/ml factor D și 0,3 mM NaCla. După 10 min la 37°C, s-au adăugat 0,9 ml CFD conținând 10 mM EDTA și 2% (v/v) ser normal de cobai. După încă 30 min, la 37°C, celulele nelizate s-au peletat prin centrifugare și gradul lizei s-a determinat prin măsurarea absorbanței supernatantului la 412 nm. Absorbanța echivalentă pentru liză 100% s-a determinat de la 1 alicot de celule lizate în apă și, de aici, s-a calculat procentul lizei.
Această analiză măsoară capacitatea C3b depozitate de a forma o convertaza C3bBbP funcțională. Conversia la iC3b previne formarea convertazei și liza ulterioară în ser/EDTA.
Rezultatul prezentat în figură arată că sunt necesare mai mult decât de 10 ori factor I și factor H pentru a anula activitatea hemolitică a mutantei arg 1303 ® gin, când s-a comparat la tipul sălbatic. Prin urmare, această mutație este avantajoasă pentru crearea unui derivat al C3, al cărui produs C3b este rezistent la inactivare prin factori H și I. Efectul s-ar putea datora fie rezistenței mai mare la clivaj la poziția 1303 (când arg este mutată la gin], fie rezistenței mai mari la clivaj la poziția 1320, când clivajul poate avea loc inițial la poziția 1303. Rezultatele prezente în fig. 5.
Axa X arată concentrația factorilor H și I. Qi reprezintă mutația arg 1303 ® gin. Se măsoară X% liză, așa cum s-a descris în metode.
Trăsăturile esențiale ale C3 umane, luând în considerare variantele modificate descrise aici sunt precum urmează:
(i) Molecula are o funcționalitate asemenea derivatului C3b, prin aceea că se poate combina cu factorul B uman, activ funcționali, care apoi poate fi clivat prin factor D uman, pentru a forma o enzimă capabilă să cliveze C3 umană.
(ii) Secvențele aminoacide sunt omoloage mai mult la 03 de la oameni decât la C3 de la oricare altă specie pentru care este prezentă o secvență cunoscută, sau pentru
790
795
800
805
810
815
820
825
830
RO 117189 Bl oricare altă secvență proteică cunoscută prezentă. Trăsăturile structurale ale C3, prezentă în proteina de tip sălbatic, dar nu în mod necesar în derivații modificați, le includ pe cele care urmează:
(a) Secvența care codifică ADN și secvența proteică translată pentru varianta C3 umană, folosite în exemplele invenției descrise aici, sunt date în Figurile 2, 4 respectiv, 1. Această secvență de proteină diferă de secvența publicată [2] la chiar 2 aminoacizi (detalii sunt date în exemple). Se apreciază că mult mai multe variații sunt compatibile cu funcția C 3, chiar dacă majoritatea nu vor fi prezente în populație.
(b) Produsul translației primare este prelucrat proteolitic în 2 catene linkate disulfură, alfa (resturi 672-1663) și beta (resturi 23-667), cu îndepărtarea secvenței semnal (resturi 1-22) (c) Proteina matură conține o legătură tiolester între resturile Cys1O1O și Gln1O13.
(d) Convertaze C3 clivează C3 pentru a îndepărta C3a (resturi 672-748). Această reacție este urmată de ruperea legăturii tiolester.
în prezența factorului H, factorul I clivează C3b între resturile Arg1303 și Seri 304, și între Arg1320 și Seri 321.
Modificări la nivelul moleculă C3 nativă înlocuirea Argl303 prin Gin
Această modificare este la un situs al clivajului C3b prin factor I. Efectul este să se reducă rata clivajuiui prin factor I la această poziție. Schimbarea la glutamină s-a ales pentru a îndepărta încărcarea poziței a argininei, care probabil trebuie să fie importantă pentru activitatea serin protează a factoruiui I, păstrând în același timp, un caracter hidrofil și o mărime similară a catenei laterale, care va micșora orice distrugeri la structura terțiară a proteinei. Dovada care sprijină această presupunere este că mutația nu împiedică prelucrarea într-o structură bicatenară, formarea unui tiolester sau clivajul C3 prin convertază C3. Mutația Argl303 la alt aminoacid poate duce la un efect similar sau chiar unul superior, așa cum s-a demonstrat în exemplul
5.
De asemenea, poate fi posibil să se reducă acest clivaj prin mutarea Seri 304 (altă parte a situsului de clivaj) sau altor resturi implicate în interacțiunea enzimăsubstrat.
înlocuirea Argl320 prin Gin
Această modificare este la alt situs clivajului C3b prin factor I. Efectul este să se reducă drastic (virtual, să se desființeze) rata de clivaj prin factor I la această poziție. Schimbarea la glutamină s-a făcut pe aceleași criterii descrise mai sus și această mutație la fel, nu împiedică prelucrarea într-o structură bicatenară, formarea unui tiolester sau clivajul C3 prin convertază C3. Din nou, mutația la alt aminoacid poate atinge același efect, așa cum poate mutația Seri 321, sau mutația altor resturi implicate în interacțiunea enzimă- substrat un combinație, cele două mutații, Argl303Gln și Argl320-Gln, protejează C3b de inactivare și de aici mențin capacitatea sa de a forma o parte a unei convertaze C3bBb activă. De asemenea, s-ar putea folosi alte mutații (inclusiv, combinații de mutații) care desființează ambele reacții de clivaj (de exemplu, Arg 1303 Glu sau Arg 1303 Gly s-ar putea folosi în combinație cu Arg 1320 Gin).
RO 117189 Bl
Exemplul 7. Diverse mutații care reduc interacțiunea C3b/C3i cu factor H Alte laboratoare au ajuns la concluzia că, fie pe baza efectelor peptidelor sintetice (Ganu, 880 V.S. 4 Muller—Eberhard, H.J., 1985, Complement 2: 27; Becherer, J.D. et al., 1992, Biochemistry 31:1787-1797), fie a mutagenezei limitate (Taniguchi-Sidie, A. 4 Isenman, D.E., 1994, J. Immunol. 153: 5285—5302), pentru a sugera că resturile 752-761 din secvența primară a transcriptului C3 (vezi, fig. 1) ar putea fi implicate în interacțiunea cu factorul H. Cu toate acestea, altă dovadă publicată sugerează 885 că numai resturile 767-776 sunt implicate în interacțiune cu factorul H, în timp ce resturile 752-761 sunt importante pentru interacțiune cu factorul B (Fishelson, 1991, Mol. Immunol. 28: 545-552). Noi am presupus că mutageneza mai extinsă a acestei regiuni trebuie să reducă afinitatea pentru factorul H și, prin urmare, să fie de dorit pentru obiectivul creării unui derivat C3, care este rezistent la factorul H. Mai mult, 890 noi am presupus că pentru producerea unei mutații ar putea fi utilizate resturile acide evidente (acizii aspartic și glutamic) și că va fi de dorit ca ele să fie schimbate cu resturi neutre, cu probabilitate redusă de a media interacțiuni puternice. în acest exemplu, noi am schimbat resturi 752-754 de la Asp-Glu-Asp la Gly-Ser-Gly, în combinație cu schimbarea resturilor 758-760 de la Glu-Glu-Asn la Gly-Ser-Gly. Produsul a 895 prezentat caracteristici de clivaj redus, consecvente cu o reducere în susceptibilitatea la factor H. Aceasta asigură dovada că 03 se poate modifica pentru reducerea legării factorului H și, de aici, susceptibilitatea la factori H și I. Aceste modificări sunt dorite pentru crearea unei convertaze C3, care este stabilă în condiții fiziologice.
Metodele de mutageneză, expresie și analiză, s-au descris în exemplele ante- 900 rioare.
Oligonucleotidă mutagenă care s-a sintetizat a avut secvența: agtaacctgggttcgggcatcattgcaggatcgggcatcgtttcc.
Rezultatele reacțiilor de clivaj sunt prezentate in fig. 6. Acestea arata că:
1. Adăugarea de CVFBb la C3 tipul sălbatic, are ca urmare eliminarea catenei 905 alfa (traseu 2), deoarece C3b care se formează este susceptibilă la concentrații scăzute de factor I și H în supernatantul culturii. C3i care s-a format în timpul expresiei sau acestei incubări ulterioare s-a descompus la iC3i în același mod. Adăugarea factorilor exogeni I și H (traseele 3 și 4), nu modifică traseele 1 și respectiv, 2, deoarece mediul însuși conține suficientă activitate de factor H și I pentru efectuarea clivajului 910 complet.
2. în contrast, tratamentul mutantei C3 cu CVFBb (traseu 6) nu are ca urmare dispariția catenei alfa. Există o generare de alfa’, corespondentă la C3b, dar o parte sau toată din aceasta rămâne, arătând că persistența catenei alfa nu este doar rezultatul unui eșec al clivajului prin CVFBb. Prin urmare, catena alfa care rămâne 915 neclivata în traseul 2, poate să reprezinte C3i, care nu s-a clivat prin activitățile endogene ale factorilor H și I, deși este de asemenea posibil ca ceva din aceasta să reprezinte C3 nativă, care persistă dacă mutanta a dobândit o rezistență parțială la CVFBb. Adăugarea de concentrații ridicate de factori exogeni H și I (traseele 7 și 8), produce epuizarea catenelor alfa și alfa', indicând că (i) mutanta nu este complet 920 rezistentă la acești factori, și (ii) catena alfa neclivată prin CVFBb în traseul 2, mai degrabă este derivată predominant de la C3i (care este clivabilă prin factorii H și I, dar nu și prin CVFBb), decât de la C3 nativă, (care este clivabilă prin CVFBb, dar nu și prin factorii H și I). Catena alfa încă nu este clivată în totalitate, chiar în traseul 8, probabil datorită rezistenței la factorii H și I.
925
RO 117189 Bl
Prin urmare, mutația resturilor 752-754 și resturilor 758-760 poate genera o moleculă C3, care încă poate fi clivată prin convertaze C3, dar este parțial rezistentă la acțiuni ale factorilor H și I. Din punct de vedere al altor date publicate, aceasta este cel mai probabil datorită mutațiilor care au modificat o regiune implicată în interacțiune cu factor H și, de aici, a rezultat o afinitate redusă pentru factor H.
Exemplul 8. Un situs în C3 care poate fi mutat pentru modificarea interacțiunii C3i cu factor B
Exemplele anterioare au demonstrat că mutații la C3 pot modula interacțiunile cu factori H și I. în scopul descoperirii altor situsuri din C3 care ar trebui să interacționeze cu factor B, noi am comparat secvențele cunoscute ale moleculelor C3 de la diferite specii, precum și cu secvențe accesibile pentru C4 și alte proteine omoloage. Noi am identificat regiunea corespondentă la resturile 1427-1433 ale C3 umane, care ar putea fi implicate în funcțiunile specifice C3 și C4. Aceasta ar include interacțiunea cu factorul B (sau omologul său, C2, în cazul C4), dar nu în mod necesar, deoarece alte funcțiuni potențiale includ formarea tiolesterului, conversia în C3b (sau forma C4b), interacțiunea cu C3 substrat și/sau CS în activitatea convertază și interacțiunea cu factor I și cofactorii săi. Prin urmare, resturile selectate s-au mutat la resturile corespondente (pe baza aliniamentelor secvenței) găsite în altă proteină omoloagă, în acest caz C5 umană. Astfel, restul 1427 s-a schimbat de la o Arg la Gin, restul 1431 de la o Lys la Asp, și restul 1433 de la un Glu la Gin. Mutanta rezultantă s-a dovedit a fi susceptibilă la clivaj prin convertază C3 (CVFBb) și produsul C3b a fost clivat prin factori H și I. Cu toate acestea, această mutantă nu sprijină conversia factorului B la Bb plus Ba, care este dependentă de legarea factorului B la C3i (sau C3b). Prin urmare, s-a demonstrat că mutația acestei regiuni a diminuat interacțiunea cu factor B.
în timp ce aceasta este nedorită pentru generarea unei covertaze C3 superactive, se asigură o indicație că alte modificări la această regiune a C3 vor modifica, de asemenea, interacțiunea cu factor B și unele dintre acestea vor crește probabil afinitatea. Drept consecință, astfel de mutații pot să crească, de asemenea, stabilitatea și activitatea enzimei convertază bimolecuă C3bBb (sau C3iBb)
Aliniamentele prezentate în tabelul 1 ilustrează de ce s-a considerat că această regiune a fost un candidat pentru mutageneză, presupunând că respectivele caractere ale anumitor resturi au fost bine conservate în C3 și C4, dar diferite distinct în alte proteine. Resturile 1426, 1431 și 1433 au fost selectate, deoarece natura încărcării lor ar putea fi indicatoare a grupurilor implicate în interacțiuni proteină-proteină. Schimbările au fost făcute la resturile corespondente în CS umană, deoarece acestea au prezentat proprietăți electrostatice foarte diferite, dar în contextul unor altor resturi conservate care ar trebui să indice o structură locală similară.
RO 117189 Bl
965
Aliniamentele secvențelor C3 și molecule înrudite pentru regiunea resturilor 1427-1435 ale C3 uman. Rest (uman)
970
975
980
985
990
995
1000
1005
Metodele de mutageneză, expresie și analiză ale reacțiilor de clivaj ale C3 au fost așa cum s-au descris în exemplele anterioare (exemplele 1-4). Oligonucleotida mutagenă s-a sintetizat cu secvența: tggtgttgaccaatacatctccgactatoagctggacaa.
Analiza pentru refacerea factorului B
Produsul exprimat s-a purificat din mediul de celule COS prin purificare de afinitate pe o coloană Clone-3-Sepharose, așa cum s-a descris în exemplul 9. Această metodă rezultă în conversia considerabilă a formei tiolester descompusă, C3i. C3 de tip sălbatic s-a izolat prin aceeași procedură. Diluții ale tipulului sălbatic C3 (1/5, 1/25 4 1/125) s-au migrat pe un gel SDS-PAGE (condiții reducătoare) împreună cu mutanta C3, și colorația argint a arătat că mutanta a fost prezentă la o concentrație
1010
1015
RO 117189 Bl echivalentă plus la ușor mai puțin decât diluția 1/25, dar mult mai mult decât diluția 1/125 a tipului sălbatic. Aceleași diluții au fost folosite în analiza refacerii factorului B. S-au incubat 5 ml din aceste C3 cu 25ml de CFD-G conținând 5 ml /ml factor D și aproximativ 1,6 mg/ml de factor B marcat 125l (aproximativ 1000—2000 dpm/pl) timp de 3 ore la 37°C. Apoi, probele s-au analizat prin SDS-PAGE (condiții reducătoare) cu autoradiografia gelului uscat. Rezultatele sunt prezentate în fig. 7.
Așa cum s-a arătat în fig. 7, clivajul distinct al factorului B are loc chiar la o diluție e 1 /125 a C3 de tip sălbatic (C3i). în contrast, nu s-a observat nici un clivaj semnificativ în prezența mutantei C3, chiar nediluată, care ar putea fi la o concentrație mai ridicată decât proba 1/125 a tipului sălbatic. Prin urmare, această mutantă pare a avea o capacitate deteriorată de a susține clivajul factorului B, cel mai probabil datorită unei reduceri în afinitatea sa de legare pentru factorul B. Ca urmare, aceasta este o regiune a lui C3, care poate fi mutată pentru a modula interacțiunea dintre C3i (sau C3b] și factorul B și poate, de asemenea, stabilitatea convertazei (C3iBb sau C3bBb).
Exemplul 9. Purificarea moleculelor C3 mutante, exprimate
Acest exemplu demonstrează modul în care molecule C3 mutante pot fi izolate dintr-un mediu de expresie, cum ar fi mediul de cultură al celulelor eucariote transfectate. Prin simpla purificare de afinitate, moleculele C3 sunt obținute la o puritate suficientă pentru teste funcționale și pentru conjugare la anticorp, prin metoda descrisă în exemplul 10.
Deși eluția de la un anticorp este însoțită de hidroliza unei proporții considerabile a tiolesterului intern, produsul C3i este încă un precursor corespunzător pentru generarea unei convertaze C3 active. De asemenea, această abordare, probabil, trebuie să fie utilă ca parte a preparării necesare pentru utilizare in vivo.
Purificare de afinitate pe Clone-3-Sepharose
Clone-3 este un anticorp monoclonal de șobolan care este specific pentru C3 și derivații săi, incluzând C3b și C3i (Lachmann, P.J. et al., 1980. J. Immunol.41: 503—515). Sunt accesibili alți anticorpi monoclonali împotriva C3 și, în unele cazuri, au fost folosiți cu succes pentru izolarea C3 din cantitățile mici de plasmă umană (Dodds, A.W., 1993, Methods Enzymol. 223: 46-61) și probabil, de asemenea, trebuie să fie aplicabili pentru izolarea moleculelor exprimate ex vivo. Fracția IgG s-a cuplat la Sepharose CL-4B folosind bromură de cianogen (metodologia se poate găsi în Harrison și Lachmann, 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4th edt., Ed. Weir, Herzenberg, Blackwell and Heryenberg; Blackwell, Oxford). Supernatantele de cultură au fost fie trecute direct printr-o coloană din această rășină (recirculate), fie mai întâi s-au concentrat prin precipitare cu 25% (g/v) Na2S04 și resolubilizare și dializă în PBS, 5 mM NaN3. Apoi, coloana s-a spălat succesiv cu (i) PBS, 5 mM NaN3 4 (ii) PBS conținând 1 M NaCI. C3 legată eluează cu tampon borat de Na 50 mM, pH 10,5 și se neutralizează imediat prin colectarea a 0,9 ml fracțiuni în 0,1 ml Tris/HCI 1M, pH 7. Apoi, materialul se dializează în PBS, 5 mM NaN3.
Prepararea C3 care conține o His-Tag “His-Tag este o serie de resturi histidină care prezintă afinitate pentru coloane care conțin ioni Ni. Această metodă a fost folosită pentru a ajuta la izolarea proteinelor exprimate. S-a considerat că aceasta ar putea fi utilă pentru izolarea moleculelor
C3 mutante exprimate, astfel că s-a folosit mutageneza de inserție pentru a genera un plasmid care codifică C3 cu o coadă de 6 resturi histidină la terminusul carboxi
RO 117189 Bl
1065 (imediat carboxi terminal restului 1663). Aceasta localizare pentru his-tag s-a ales astfel, încât să se reducă intereferența cu sinteza, plierea, procesarea și formarea punții disulfură a C3 în curs de apariție. Restul 1661 este un rest cisteină care este implicat într-o punte disulfurică la un rest mai timpuriu din secvență (probabil, Cys 1537; Dolmer K. 4 Sottrup-Jensen, L., 1993, FEBSLett 315: 85—90) și, prin urmare, pare a fi prudent să se facă inserția în spatele acestei trăsături structurale. Mutația a fost introdusă folosind tehnica gapped-plasmid” folosită în exemplul 1, folosind oligonucleotidă mutagenă sintetizată cu secvența: tgggtgccccaaccatcatcatcatcatcattgaccacaccccc.
încorporarea secvenței corecte s-a confirmat prin secvențierea ADN. Această secvență ADN poate fi transferată acum la un vector de expresie. După transfecția celulelor eucariote, va fi posibil să se izoleze C3 exprimată prin afinitate pentru o coloană care conține ioni Ni, sau prin oricare altă matrice cu afinitate specifică pentru “His-Tag.
Un număr de mutante C3 au fost purificate pe Clone-3-Sepharose, incluzând pe cele descrise în exemplele 1 și 2, exprimate în celule CHO. Produsele au reținut capacitatea de a susține clivajului factorului B prin factor D. Aceeași metodă a fost folosită pentru izolarea mutantei descrise în exemplul B2, exprimată în celule COS. Colorația argint a gelurilor SDS-PAGE a arătat că produsele izolate nu au fost 100% pure, dar adesea, apar a fi mai mult decât sau egal cu 50% pure. Aceasta vine de la materiile prime care conțin în general, mai puțin de 10 Ig/ml C3 în 10% (v/v) ser fetal de vițel plus alte proteine celulare. Suplimentar, C3 nu au fost degradate în timpul izolării și activitatea endogenă factor H și I pare să fi fost îndepărtată.
Purificarea în virtutea “His-Tag implică condiții medii de eluție dintr-o coloană care conține ioni Ni. De exemplu, s-a folosit EDTA. Aplicarea acestei metode va permite prin urmare izolarea C3 fără ruperea punții tiolester intern.
Exemplul 10. Conjugarea C3i la anticorp și utilizare pentru țintirea activității convetază C3 Împotriva unei celule particulare
Un aspect al invenției este că, convertaze C3 stabile derivate la molecule C3 mutante vor produce conversia sporită C3 care, dacă s-a localizat la un situs țintă particular, va iniția atacul dependent de complement al acelei ținte. Abordarea preferată pentru țintirea răspunsului este să se cupleze molecula C3 mutanta, fie ca derivat C3i, fie ca derivat C3b, la un anticorp specific pentru ținta dorită. In acest exemplu, se demonstrează o metodologie de lucru pentru formarea de astfel de conjugate, care este aplicabilă la molecule mutante C3i sau C3b și se poate folosi pe material purificat prin afinitate de la un sistem de expresie, chiar dacă tiolesterul C3 s-a descompus în proces. Prin cuplarea C3i la un anticorp care se leagă specific la eritrocite de oaie, noi vom demonstra în continuare că, conjugatul fixează C3i la suprafața eritrocitului astfel încât se poate forma o convertază, C3iBbP, care inițiază liza acestor celule când alte componente complement sunt furnizate sub forma unui ser normal de cobai (în EDTA pentru prevenirea formării de novo a convertazelor C3). De aici, conjugarea la anticorp se poate folosi pentru a ținti o moleculă C3i pentru inițierea atacului dependent de complement al unui tip particular de celulă. Acest exemplu folosește C3i de tip sălatic, din plasmă umană, care formează in vitro o convertază. C3. In vivo, C3i 4 C3b de tip sălbatic sunt descompuse prin factor H și I. Prin urmare, o mutantă C3 construită conform acestui brevet trebuie să fie rezistență la factori H și I 4și care să formeze o convertază stabilă. C3, care va fi avantajoasă într-un context fiziologic.
1070
1075
1080
1085
1090
1095
1100
1105
1110
RO 117189 Bl
1115
1120
1125
1130
1135
1140
1145
1150
Generarea și purificarea conjugatului C3i-anticorp
Anticorpul folosit a fost fracțiunea IgG izolata de la un anticorp policlonal iepure anti-eritrocită de oaie. S-au incubat 1,1 mg cu 75 nmol de SPDP în tampon de conjugare, pH 7,5 (20 mM ΚΗΡΟ, 60 mM Na2HP04, 0,12 M NaCI] timp de 2 ore la temperatura camerei. S-a purificat PDP-lgG prin filtrare în gel pe o coloană. Superose-6 (Pharmacia) (într-un tampon fosfat, pH 7,4, care conține O,12M NaCI). Reducerea unei probe cu ditiotreitol s-a folosit pentru estimarea a 4 grupuri PDP cuplate per molecula de IgG. S-a preparat C3i prin tratamentul C3 purificat cu 0,1 M metilamină, pH 7,2 (2 ore la 37°C). Excesul de metilamină s-a îndepărtat prin filtrare în gel urmată de dializă în tampon de conjugare. S-au amestecat 18 nmol de C3i cu 1,7 nmol de PDP-lgG în 1,26 ml tampon de conjugare și s-au incubat 1 zi la temperatura camerei, urmată de 1,5 zile la 4°C. fig. 8 arată un gel SDS-PAGE colorat Coomassie Blue al amestecului reacției de conjugare, care evidențiază apariția unei specii de aproximativ 350 kDa care nu a fost prezentă nici în PDP-lgG sau C3i. Această specie a fost purificată parțial prin filtrare în gel pe coloană Superose-6 într-un tampon fosfat, pH 7,4, care conține 0,5 M NaCI și apoi s-a dializatîn PBS. S-a eluat înaintea C3, într-un volum din care a putut fi estimată, o greutate moleculară de 300400 kDa prin calibrare cu standarde globulare de greutate moleculară. Concentrațiile conjugatului, lipsit de anticorp și necuplată, au fost estimate de la un gel SDS-PAGE colorat Coomassie (condiții nereducătoare). SDS-PAGE bidimensional (prima dimensiune neredusă, a doua dimensiune redusă) a arătat o imagine compatibilă cu 1:1 conjugat între IgG și C3i.
(ii) Demonstrarea că poate fi folosit conjugatul C3 anticorp pentru activitate covertază țintită împotriva unei celule particulare.
S-au incubat 20 ml diluții ale conjugatului (O (fără conjugat), 1/1 DO, 1/50, 1/10) cu 100 ml de aproximativ 1% (v/v) eritrocite de oaie (prespălate în CED] pentru 1 h la 37°C. S-au realizat incubări paralele cu, cantități echivalente de PDP-lgG (fără C3) și numai C3. Apoi, celulele s-au spălat de 4 ori în CFD și s-au resuspendat la 100 ml în CFD-G. Din aceasta, s-au lizat 50 ml cu 150 ml Ha0, urmat de adăugarea a 800 ml de CFD care conține 10 mM EDTA și 2% (v/v) NGPS. Alți 50 ml de celule acoperite conjugat s-au incubat 15 min la 37°C, cu 50 ml de CFD-G conținând 190 mg/ml factor B, 2 mg/ml factor D, 20 mg/ml properdină și 0,6 mM NiCI2, urmat de liză cu 900 ml de CFD conținând 10 mM EDTA și 2% (v/v) NGPS. După 30 min, la 37°C, celulele s-au peletat prin centrifugare (2000 x g, circa 3 min] și s-a măsurat absorbanța optică a supematantului la 412 nm. Folosind probe tratate cu H20 ca liză 100% și un tampon blanc lipsit de celule, s-a calculat liza % așa cum s-a prezentat în fig. 9. Conjugatul a produs liză dependentă de doză în timp ce nici PDP-lgG, nici C3i singur nu au generat nici o liză semnificativă peste cea observată în absența oricărui asemenea tratament.
Metoda folosită s-a dovedit de succes pentru cuplarea C3i la IgG, așa cum s-a arătat prin:
Formarea unei benzi de mărime corespunzătoare (circa 350 kDa) pentru un conjugat C3:lgG 1:1, arătat prin SDS-PAGE în fig. 8.
SDS-PAGE-bidimensional (prima dimensiune neredusă, a doua dimensiune redusă) a arătat că această specie a conținut atât IgG, cât și C3i.
3. Eluția caracteristică a acestei specii pe filtrare în gel este din nou consecventă cu o moleculă de circa 350 kDa.
1155
RO 117189 Bl
4. Conjugatul prezintă o activitate hemolitică care nu este prezentată nici de PDP-lgG, nici de C3i (fig. 9)
Analiza hemolitică (fig. 9] a demonstrat suplimentar că:
Anticorpul specific anti-eritrocită de oaie are localizat C3i la membrana celulei ținta (eritrocită de oaie], împiedicând ca el să fie îndepărtat prin spălare (spre deosebire de C3i liber)
2. Conjugatul păstrează activitatea lui C3i prin aceea că, încă este capabil să formeze o convertază C3 prin reacție cu properdină și factori B și D.
3. Această convertază poate iniția atacul dependent de complement al țintei, în acest caz prin activarea căii litice (C5-9) pentru liza eritrocitului.
Date suplimentare din alte laboratoare arată că factorul venin de cobră se poate cupla la un anticorp și că aceste conjugate pot ținti activarea complementului împotriva unui tip particular de celulă (Vogel, 1988, Targeted. Diagn. Tner., 1: 191-224; Muller, B. 4 Muller-Ruchholtz, W., 1987, Leuk. Res. 11: 461—468; Parker, C.J., White. V.F. 4 Falk, R.J., 1986, Complement 3:223-235; Petrella, E.C. eta/., 1987, J. Immunol. Methods 104:159-172). Aceste date susțin punctul de vedere că C3, modificată astfel încât să fie capabilă să formeze o convertază C3 stabilă, asemenea factorului venin cobră, ar putea fi folosită pentru țintirea răspunsurilor mediate de complement, așa cum s-a evidențiat în această invenție.
Exemplul 11. Demonstrația conform căreia molecule mutante C3 induc refacerea factorului B În ser uman normal
Un scop principal al invenției descrise aici este epuizarea consumativă a activității complement din fluide biologice. Invenția descrie metode pentru fabricarea moleculelor C3, care sunt rezistente la reglarea în sens descrescător prin factori H și I. în această stare ei vor lega factor B și vor genera convertaze C3 active. Activitatea acestor covertaze este demonstrata prin testul hemolitic folosit în exemplul 6. Prin urmare, o astfel de convertază va consuma 03. Dacă convertază este instabită, ea va disocia fără multă conversie C3. Totuși, aceasta va permite legarea factorului B proaspăt și conversia sa la Bb și Ba. Astfel, mutanta C3 va iniția consumarea factorului B, ducând în final la incapacitarea căii alternative și incapacitatea sa de a amplifica stimularea căii clasice. Dacă se formează o convertază C3 stabilă refacerea factorului B va fi redusă, iar consumarea C3 va fi crescută. Astfel, ambele situații pot fi de dorit. In acest exemplu am demonstrat că molecule C3 mutante care sunt modificate pentru a le face rezistente la factor I, dar fără nici o modificare a stabilității convertazei, inițiază refacerea accelerată a factorului B în ser uman. în contrast, C3 de tip sălbatic nu produce nici o refacere semnificativă, probabil pentru că C3i de tip sălbatic se degradează rapid prin factori H și I.
Mutantele s-au preparat după cum urmeaza: Q1R2 Argl303 schimbată la Gin (Exemplul 2) QIQ2 Argl303 schimbată la Gin, plus Argl320 schimbată la Gin (Exemplul 1) E1Q2 Argl303 schimbata la Glu, plus Argl320 schimbată la Gin (Exemplul 5)
Toate aceste mutante s-au exprimat în celule CHO și apoi s-au purificat prin precipitare cu NaaS04, urmată de purificare de afinitate pe Clone-3-Sepharose, așa cum s-a descris în exemplul 3. în mod similar, s-a izolat C3 de tip sălbatic (RIR2). Prin SDSPAGE, colorație argint, concentrația de Qi a fost între 1/5 și 1/25 din tipul sălbatic, concentrația de Q1Q2 a fost de circa 1/5 din concentrația tipului sălbatic și
1160
1165
1170
1175
1180
1185
1190
1195
1200
RO 117189 Bl concentrația E 1Q2 a fost între 1/25 și 1/125 din concentrația tipului sălbatic. Toate preparatele au conținut probabil o majoritate a moleculelor tiolester descompuse (C3i). S-au incubat 10 ml din aceste preparate C3 cu 10 ml dintr-o soluție de 20% (v/v) ser uman normal în PBS conținâd 1 mM MgCI2 și aproximativ 300 ng factor B marcat 125l (aproximativ 2-300 000 dpm) timp de 1 h la 37°C. Apoi, s-au analizat 5 ml prin SDS-PAGE (condiții reducătoare). Gelul uscat s-a expus la film autoradiografic, pentru indicarea pozițiilor benzilor care corespund factorului B intact și produselor sale de clivaj. Apoi, acestea s-au excizat și s-au numărat pentru determinarea cu precizie a gradului de clivaj. Valoarea obținută numai în tampon s-a scăzut ca fond (cuprinzând nu numai clivajul fondului, ci și produsele degradării și alte impurități prezente în prepararea radioligandului).
Gradele rezultate ale clivajului factorului B sunt prezentate mai jos:
1/25 tip sălbatic ..................................1,49%
1/5 tip sălbatic ...................................2,74%
Q1R2 ..........................................6,19%
Q1Q2 ..........................................7,41%
E1Q2 ..........................................6,24%
Astfel, toate mutantele rezistente la factor I produc niveluri mai mari de clivaj ale factorului B decât cantități echivalente ale tipului sălbatic C3 (C3i). Cu doze mai mari sau incubări mai lungi, va rezulta incapacitarea completă a căii alternative.
Abrevierile folosite în exemplele anterioare includ: CED, diluant fixare complement (definit în Harrison și Lachmann. 1986, Handbook of Experimental Immunology, 4th ed., Ed. Weir, Herzenberg, Blackwell și Herzenberg; Blackwell, Oxford); CFD-G, CED care conține 0,1% (g/v) gelatină PBS, fosfat salin tamponat; NGPS, ser normal de cobră; SDS-PAGE, electroforeză SDS în gel de poliacrilamidă SPDP, Nsuccinimidil-3-(2-piridilditio) propionat.
Revendicări

Claims (10)

1. Proteină C3 umană modificată, capabilă să formeze o convertază C3 stabilă, caracterizată prin aceea că poate fi selectată dintre:
a) o proteina C3 modificată în care fie aminoacidul Arg-1303, fie aminoacidul Arg-1320, fie ambii aminoacizi sunt substituiți cu alți aminoacizi;
b) o proteina C3 modificată care prezintă sensibilitate redsă la Factorul H și/sau Factorul I, comparativ cu convertază C3 nativă, numita proteina menționată prezentând una sau mai multe schimbări aminoacide față de convertază C3 umană nativă, în regiunea corespunzătoare resturilor aminoacide 752-754 și/sau resturilor 758-780 a convertazei C3 native umane; și
c) o proteină C3 modificată care prezintă substituții de aminoacizi comparativ cu convertază C3 umană, la nivelul resturilor aminoacide corespunzătoare resturilor 1427, 1431 și /sau 1433 ale convertazei C3 native umane.
2. Proteină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aminoacidul Arg-1303, fie aminoacidul Arg-1320, fie ambii aminoacizi sunt substituiți cu glutamină, tirozină, cistină, triptofan, acid glutamic sau glicină;
3. Proteină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că una sau mai multe substituții de aminoacizi sunt reprezentate de substituții ale unor resturi de aminoacizi cu caracter acid la resturi de aminoacizi cu caracter neutru.
RO 117189 Bl
1250
4. Proteină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că substituțiile de resturi de aminoacizi sunt reprezentate de substituții ale fragmentului Asp-Glu-Asp cu Gly-Ser-Gly.
5. Proteină conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că intră în componența unui conjugat care are capacitate de legare la o proteină specifică de legare, precum un anticorp sau un fragment antigenic de legare.
6. Secvență ADN care codifică o proteină definită în revendicarea 1, caracterizată prin aceea că este reprezentată de secvența din fig. 2.
7. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că, cuprinde o cantitate eficientă din punct de vedere al administrării terapeutice de proteină definită în revendicarea 1, împreună cu unul sau mai mulți purtători sau excipienți acceptabili farmaceutic.
8. Compoziție farmaceutică conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că administrarea acesteia în scop terapeutic, la un mamifer, determină epuizarea nivelelor de proteină a căii complementului.
9. Compoziție farmaceutică conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că administrarea acesteia în scop terapeutic, la un mamifer, previne respingerea substanțelor de origine starăine.
10. Compoziție farmaceutică conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că administrarea acesteia în scop terapeutic, la un mamifer, determină localizarea și/sau amplificarea conversiei proteinei complementului endogen și depozitarea ei la nivelul unui situs specific.
RO97-00417A 1994-09-08 1995-09-08 Proteina c3 umana, modificata, secventa adn care o codifica, si compozitie farmaceutica cu aceasta RO117189B1 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9418147A GB9418147D0 (en) 1994-09-08 1994-09-08 Modified proteins
GBGB9509102.1A GB9509102D0 (en) 1995-05-04 1995-05-04 Modified proteins
PCT/GB1995/002121 WO1996007738A2 (en) 1994-09-08 1995-09-08 Modified human c3 proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO117189B1 true RO117189B1 (ro) 2001-11-30

Family

ID=26305590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO97-00417A RO117189B1 (ro) 1994-09-08 1995-09-08 Proteina c3 umana, modificata, secventa adn care o codifica, si compozitie farmaceutica cu aceasta

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5849297A (ro)
EP (1) EP0779922B1 (ro)
JP (1) JPH10505241A (ro)
CN (1) CN1104501C (ro)
AT (1) ATE273388T1 (ro)
AU (1) AU707004B2 (ro)
BG (1) BG63606B1 (ro)
BR (1) BR9509172A (ro)
CA (1) CA2197888A1 (ro)
CZ (1) CZ290596B6 (ro)
DE (1) DE69533359T2 (ro)
ES (1) ES2224133T3 (ro)
FI (1) FI970979A (ro)
HU (1) HUT77874A (ro)
NO (1) NO971059L (ro)
NZ (2) NZ333949A (ro)
PL (1) PL319040A1 (ro)
RO (1) RO117189B1 (ro)
RU (1) RU2194713C2 (ro)
SK (1) SK29697A3 (ro)
WO (1) WO1996007738A2 (ro)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP9900789A3 (en) 1996-03-07 2001-10-29 Imutran Ltd Down-regulation resistant c3 convertase
EP0972200A1 (en) * 1997-03-06 2000-01-19 Bion Diagnostic Sciences, Inc. Screening and treatment using complement regulator or receptor proteins
US6221621B1 (en) 1997-03-06 2001-04-24 Bard Diagnostic Sciences, Inc. Methods of screening for colorectal cancers in which a complement Factor I or related protein is associated
WO2001092295A2 (en) * 2000-05-30 2001-12-06 University Of Toronto Ligands for cd21 and compositions thereof for modulating immune responses
US6756476B2 (en) * 2001-04-30 2004-06-29 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2021 daltons
US6998243B2 (en) * 2001-04-30 2006-02-14 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1793 daltons
US7314717B2 (en) * 2001-04-30 2008-01-01 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1562 daltons
US7294688B2 (en) * 2001-04-30 2007-11-13 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1348 daltons
US7179610B2 (en) * 2001-11-23 2007-02-20 Nanogen Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers indicative of insulin resistance
US7097989B2 (en) * 2001-11-23 2006-08-29 Syn X Pharma, Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers predictive of type II diabetes
WO2005107785A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 University Of Hawaii Human complement c3 derivates with cobra venom factor-like function
US10206998B2 (en) 2005-01-12 2019-02-19 Proteonova, Inc. Modular targeted therapeutic agents and methods of making same
EP3431503A1 (en) * 2005-01-12 2019-01-23 Proteonova, Inc. Method for making targeted therapeutic agents
WO2010056399A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Incode Biopharmaceutics, Inc. Method and composition for modulating the immune system and various inflammatory conditions comprising complement depletors
RU2542401C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека
RU2542404C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека
US11903996B2 (en) * 2015-10-07 2024-02-20 David C. Fritzinger Modulators of complement function
CN113214373B (zh) * 2020-02-06 2022-08-30 深圳华大基因股份有限公司 新包虫病抗原Murinoglobulin-2蛋白
US11918624B2 (en) * 2020-06-10 2024-03-05 Kelsius Laboratories LLC Therapeutic composition for use in the treatment of COVID-19 and other cytokine storm associated disorders

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4661347A (en) * 1982-11-12 1987-04-28 Scripps Clinic Cytotoxic compositions

Also Published As

Publication number Publication date
FI970979A0 (fi) 1997-03-07
AU3477295A (en) 1996-03-27
BG101295A (en) 1997-12-30
AU707004B2 (en) 1999-07-01
CN1162335A (zh) 1997-10-15
NO971059L (no) 1997-05-07
FI970979A (fi) 1997-03-07
CN1104501C (zh) 2003-04-02
ATE273388T1 (de) 2004-08-15
WO1996007738A2 (en) 1996-03-14
ES2224133T3 (es) 2005-03-01
DE69533359T2 (de) 2005-07-28
JPH10505241A (ja) 1998-05-26
BG63606B1 (bg) 2002-06-28
CA2197888A1 (en) 1996-03-14
CZ68597A3 (en) 1997-11-12
NZ333949A (en) 2000-06-23
DE69533359D1 (de) 2004-09-16
EP0779922B1 (en) 2004-08-11
PL319040A1 (en) 1997-07-21
HUT77874A (hu) 1998-09-28
SK29697A3 (en) 1998-01-14
MX9701783A (es) 1997-10-31
US5849297A (en) 1998-12-15
WO1996007738A3 (en) 1996-03-28
CZ290596B6 (cs) 2002-08-14
RU2194713C2 (ru) 2002-12-20
BR9509172A (pt) 1997-11-25
NZ292565A (en) 1999-03-29
NO971059D0 (no) 1997-03-07
EP0779922A2 (en) 1997-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RO117189B1 (ro) Proteina c3 umana, modificata, secventa adn care o codifica, si compozitie farmaceutica cu aceasta
JP4344136B2 (ja) アポリポタンパク質類似体
US8119601B2 (en) Voltage dependent anion channel (VDAC1) compositions and methods of use thereof for regulating apoptosis
US6221657B1 (en) Modified human C3 DNA sequences and vectors
US6268485B1 (en) Down-regulation resistant C3 convertase
EP2004680B1 (en) N-terminal vdac variants and uses thereof
US20040185038A1 (en) Methods for reducing immunogenicity of polypeptides
KR101651330B1 (ko) 세포투과성이 우수한 tat-a20 융합단백질의 제조방법 및 이의 용도
EP2989119B1 (en) Use of inhibitory peptides for the treatment of inflammatory diseases
JP3819712B2 (ja) 細胞内信号伝達を攪乱させる合成ペプチド
RU2238322C2 (ru) Протеин, обладающий способностью к образованию с3-конвертазы, днк, вектор, конъюгат и их использование
MXPA97001783A (es) Proteinas c3 humanas modificadas
Clark et al. Site-specific 32P-labeling of cytokines, monoclonal antibodies, and other protein substrates for quantitative assays and therapeutic application
WO2021007436A1 (en) Tricyclic peptide as protein binders and modulators and uses thereof
IL194466A (en) Variants of the V-N terminal of VDAC and their use