BG63606B1 - Модифицирани човешки сз протеини - Google Patents

Модифицирани човешки сз протеини Download PDF

Info

Publication number
BG63606B1
BG63606B1 BG101295A BG10129597A BG63606B1 BG 63606 B1 BG63606 B1 BG 63606B1 BG 101295 A BG101295 A BG 101295A BG 10129597 A BG10129597 A BG 10129597A BG 63606 B1 BG63606 B1 BG 63606B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
protein
factor
protein according
amino acid
convertase
Prior art date
Application number
BG101295A
Other languages
English (en)
Other versions
BG101295A (bg
Inventor
Richard Harrison
Timothy FARRIES
Original Assignee
Imutran Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB9418147A external-priority patent/GB9418147D0/en
Priority claimed from GBGB9509102.1A external-priority patent/GB9509102D0/en
Application filed by Imutran Limited filed Critical Imutran Limited
Publication of BG101295A publication Critical patent/BG101295A/bg
Publication of BG63606B1 publication Critical patent/BG63606B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до природни протеини на обмяната на комплемента, модифицирани така, че протеинът да бъде способен да формира стабилна С3 конвертаза. За предпочитане е модифицираният протеин да е модифициран човешки С3 протеин. Изобретението се отнася също до ДНК последователности, кодиращи такива протеини, заедно с ДНК структури до конюгати, включващи такива протеини и специфична свързваща част, например антитяло, и до приложението им залечение.

Description

(54) МОДИФИЦИРАНИ ЧОВЕШКИ СЗ ПРОТЕИНИ
НаСтОЯШОтО ИЧобоСтОН1112· omwnna оо uoRii иллиЖчпиппии *· J-Uvniv/i ίΛή Vu lxj njvv^xiivixi^ ч- ч vuiuuwx учх X1VUM хгхч^ч^ vtxjz v« м, v* jp txx i 44 протеини, способни да формират стабилни СЗ конВертази, ДНК
ПОСЛ(?С1оВяГП£\НПСГП!1 кпЛРПЙПи! ппоЬпЙа ппптАпип и nrvii лпЬрипртп нм XX4Z4-A ЖЧ.Ч^Ч>4' 11X114^ 111VV1XX4, Х4Ч*у 4* |^4Х4Ч5 44 1А А 41144* 4- 4* 1X£/V1114 411 V*0 V* ХХ£/ V*x 1V1H4 1144 U1V 4*1** като терапевтични агенти, по- специално за приложение при и^ЧеОПваНе нивата на ппотчиии от оОк.саиото мо
Ч-> *4. |/liv ЧХХХЧ. 1111VU111LA 11U IWltlJ XX 14 χνχ^ X XXX XX X 111114 Х1£-'Ч-/ХХ1Ч. иП 4*. Ч-*ХХХ 4Z4J1V4Z11 1СЛ111 V* 114Х веществата.
хора и други venebrata (гръбначни) са от осооено значение за
ΛννυΙτιηΐΗ
41Ζ у X 1 ХЧ М) и 14
Vo то
ХЧ4ЖХХ XV
Яло >А11птл>о ч^х uwk^kixii w Wj възстановяването на клетките, които индуцират локални
R1. ->по лпгпрлип от wRnnn <' WHIU1W111X21114 VIUWC'V^V (1S1 Таон orrt ’>r\Rrkfwi го й^рАапн Рлттипп^ир \ 1и/ А4_1И 4>ХХ хч.4 vt'4Z|_Z 4* Ч-4Л ZlkV.lllllM J VI V. 1 V Ш 111 1 1< <1114 на патогенни организми като бактерии, но са нежеланикогато
ОСЙСтв.ЧГП COeillV ПТькяННтб* Н° тптпппприипЬп (иопп плгт. пт'рх<”иил
Ч^ Ч· V* V--XX X 4' ЧХХХ X 4- LM| у 111 Ulkllll ищч 11 41 liV/41 X 1 VI 1 £./ 414. χΧ'ΧΧ 1 1UV11 ^llllll^'· 11 ЧУ 4 111 W-'X4 1’14 1114’ реперфузионно увреждане (3) или срещу чужд терапевтичен материал (напп XI1 ПСтак^т НО отуП^т а ма ио brpuommupru'ium'iijrni: {1\\
У***-*АЛ£^« Ζ4 4* 1 ХЧ. £-'VX14JF Λ X A A A W V 1 i 1/1V Mj-/. VA11Ч 111.1 114 4 1 1V <111V 1 4 11А11 > 1 1 111 1 11 11 > \
Известни са опити за отстраняване на тези нежелани свойства с
1’ЧПО А.звяи<=“ и а mO'H^ofiun ип 1’омп лр11ритин rv>wл о тооми
UV11V;14>V 11114 ixu A Х^-^Ч/41-» 4'ЧА Ч| А 1 44 XXV* KVltllLi 14 1*14 11X1 11Х и |-'Ч V Т . 1U.1 IX V|?XX V
ПΤΛΟΓΎΊ PHU11 11£7V1114 V4 14, чиято нормална функция е да супресира активацията на комплемента
ИП 1Я\
4/, жОу.
Системата на комплемента Включва протеиниДакто от
ΤΊΓ)Η1»ηΥΊ-2ηΡΤΎΊΤΎΊ Ω 12 Ω 1г Α PIT) If ΩΤΎΊ Ω /ναηοηηχηηιι ιι *ч/зпи * ητν>ητΜΐ\ mnljn 11 nm иииирлпичннпа па шишпаша, ^pvu^viuijvpu и pva^^kuiuvpu^, шала и vui течната фаза (кръвна плазма и аруга екстрацелуларна среоа). X А ΙζΆ V Л ЯЛ. А.' протеолитичното превръщане на СЗ ВъВ фрагментите ( ЗЬ и (За. (.За е
А Λ. Λ.XX ппржп . nmn Imnn lrz-χίι m zx rizizinnnn i * o Γχη nmiR л nnn ХАпптппта ЬдатГп. β anavpu7iaiiivf44un? лииши liuyuunu па ч^^»а нрииаипа масшпипк л.лсшла и мястото на преаизвикателството. което Воаи ао локално
A VA ' VXW ζχ/χβζχχ^<χχ1?·ζ~ιζ·»βηΐΊ43 ii п хп * от л * nil! β Q-innii д z3 m лппп n /irw τχι ι β.ττ η νχ η α 11 m ο л ι 111 V4ww7i\y auanv па личшаппш, иаоиуалашацил u. ypvaa u UJiiaauniv.anu ефекти. Заражаащите се СЗЬ притежават способност оа се сВързВат х х w X о·х
Л...
U.’T ПЯ 1 ΓΐΛίΤΤί W4 ГЗ ЛЧ Ϊ Τ ΓΗ Λ Г\ X m Г»т /ЛПЛ Γ\ 1 Ί ГУ Z'V'T ПП n ft nn 43 TV* nil I ' CIT 11 t fi 4 .3 лит 1HJL’ Орлписпшш VtVV/lV JVlZLUlllVlliV nil L uoyab'cintll !U VU, 14>U ЧхЛЧ-4J тоВа фокусират атаката чрез компонентите на иитолитичните
L ГнЪ /п * 43 X С43 1 Ί m 1 1 /гч гтл AUlVllfKlVKnillU ^4 -/- ч. > /
(.Вързаните на повърхността ( ЗЬ и техните продукти на па лд п отл<1 η η π <*л пш /Ίνττγχ Ιτί ί ί ι ζχι 11i ts /» tv Irntvr* гчопатзттл nmi * <a/im ιη<ιη 11 i уч-ач пч рацил сиеци K|/jnr4W,uvnu|uaiii паши ч_.*и рчцчшнири, п-хч -у и ирачЦи например фагоцитозата (15). Налице са два ясно очертани пътя на
I; /3* <ТЗ А 43 X ТОП TV* 1*1» Z* 1т m 1 1 β пп п ГТ Iz f*1 1 TV» f* β ΖΧ ΖΊ rrm ΖΊ f* f*f* АЗ β Τ4ΊΓ п > nn.j 1 » г» f 4 'З и /''З К мдчиачмчпшпа ампииацид, xivuuiv wyziiii yv ирчириЩапч па ' ’ и ч ./и съответните отгоВори. Класическият път протича обикновено чрез A XX
Ι'ΠΧ «Т^ л 43 1τ Z>1 1 TV* 43 · » t 1 Τ3-» Ί 1 TV4 ГТ Λ ΛΧ ' * Ο 1 Ί τν* 11 ΊΩΠ 11Ι111111111τ>Λη1γΙ< ΛΙΙΊΙΙΧ ГН »» 1 ’ r '1 Г* 1Τ <1 ζ~ι Ζ* I.’ f* Г1 TV1 Ζ* 1W1VU C 14 ГхЧ 111114 СШ111 Uli1ZL·'IV 4 С1Г1111 UC4 11, ипициираигли knouivinu Л.аЧЛ.аЧ|С1ч I4VZU11V
Включва протеините Clq. Clr, Cis, ( 2 и ( 4. Обратният път заВиси от
Гу Irm IlfinilHAniin m Π ί^ν*! ll <lr fl β Ir Λ ΙζΧΙΐβ/ΊΙΙΊ r·» β <*'l* J Л ΤΊ /А f»43 VA 43 <ΊΙ »1 1'1L1A*V>V/V('lll k ΤΙ 1 1ΎΛ 43 алтииацииппаша иритла, и iwv *ι и а lu, ci ναινια iiv tvut чи и пч uu,wy ujvi ui пч фактори В и L).
ί Г V443 β rvi ] 1 1 η Π ΛΐΎ4/4 nn C- R ГП1 V*Z4 η* Ί I 1 1 τ'* ** β 431 1 * .1 <* m β Ζ» lp4 L'p ОиЦО-ПЧ 11 i V πα 4,..7 17 чии ν-.η) приууцира 174 10,441111/(1, които могат да бъдат комбинирани с фактор В, при което се получаВа
Lx ТЗ / 11 А 11 3 1 13 \ ' I 43 Ά 1 1 1,· /АХ Ж1-» A 43 1 Г О1 1 <* О ζχ 1’ m uftiirxo iv ппп βπ -τ/χοίΐζτ m R11O I ηι ч-.в/и али j- хчои bUiviii/ivMu чч амнииираш uvtj c· иоуч.ичшиич па фактор D за получаване на СЗЬВЬ. който е СЗ конВертаза. способна да тллпттлп ni 1 пгчйана nr* Lx ljrxam/t ftnnn nn u rizxrxii nn »л/-ч jjaocpayu ιινι/νηκ. ч..-^ yu ч^и, jvvvuiv uuyu yv hvuv*r 4,^i/i>u и yvpu yu υνголямо превръщане на СЗ. При подобни обстоятелства комплексът
СЗЬВЬ се стабилизира чрез асоцииране с позитивния регулаторен
111 Τ-Τζοοοβ » » <-»» 1 * r/ч Ζ4τν» т/лйп ινηηη τ»/\πιιτνηιβιι п /ч£чтч гч τν» п/ч /»β?τ n^niin iipvnicpyun j. ί 1сзаиииими οιΠ uiOuci шизи Пизипшипа OOpuIii пи wupocirici бримка обикновено е ограничена до бавно отбелязване чрез регулаторни протеини, по- специално фактори Н и I.
фактор Н (и структурно свързани клатъчно- асоциирани / 3 \ _ 11П1 ГХа Z1TV1 β ГЧ Т? 11 ТЗ |*Ч ΛλΤΎΙ Л^З Тч η /п\ non z>m β гч 1г ГЧ TV» /ч 1ттч Лч ГЧ Ιττν» /ЧТЧ yi/ измсиниа и и Du мш vju, и yuj ycuciiit’ci ιναιιινι гчохригчшчзр
В за формиране на повече СЗ конвертази. Пътят е запален'’ в
Q K.fP.A 1111 11ΤΛΩ12 n nonpnnniin n r> Л^*31ч β птчпнт ζ>τν» β 11 от гч no ηηβσ тччгп /ч от » ι Ϊχ<*τν»ζ4 Л1У111£ки1рицирс1Г1С1 сспсрацил ha cju и пуис исшиисши n a. нии иулписнш, ivcliiiaj множество бактериални клетъчни стени, които свързват
X X η ο тч П л1.' ΓΊοηι»ιο z-»o 3 1ч η βπ n-nnonnm аги β ο τν» η χϊ гч т-чхч -vr ’ ι ιιη'ι ιο » » no n лcipuzKyаиз,ил сс и иизнр^илшшниаш hvcuuMHiu pcc.yziuparik през факторите Hui. Зараждащият се СЗЬ е също така спосооен да се
Λ»βη T4xl~O VT * Г И П/Ч ПД11 η 1 1 lr 4 Д TV» In 1 T— ПГЧ/ЧОаЛППП TV* ,O V 4 отт linn ΤΊ/4 β fl nx'l Ί плт 1 1 VL/Upzrw hUlV1 vnycicicririu IV/Vu 111IVU. l_ny UGlhhLlIlil luALiiiunnu iluu ирлпиуши, обикновено изложени на комплемент, са пораои това аопълнително х чу х'
Q ’ Ц 11ПЛ A1311 Ζΐβτ vtonnn тлопттл отчогчтчп L-ητ-ηη Л/ГГЧЗ ΠΑΓηΓΏΙ” защишепи Чрез xvic iviuyannu еии^запи pc ojjicuiiMpu лаши ινχκ^-л «, ι_/ύ~ιι и νι\ι и оействат по схоаен начин като Фактор Н.
V' ЧУ IX
ТЛч β «О OTVS 1 Ί 11 Г> ГЧ « <П/Ч*ЧГЧ Ά ГГ\ А lr/Ч ТЧГТ/Ч^ГЧ nnoill ПП11 ТТГЧ А nftlirt ПТЧ11 1тТЧ» » TV» ХЧ riouvvmnu са ivinkiou мшиш pziyivv ^рещапи ^слииил, при лишии нормалното регулиране на течната фаза не може да се осъществи и
Ζ'ΤΛΖΝ» 1 TV» П1111 ГЧтЧП r\ Τ'» no β T\T 111 Г» no 111. 3 /ЧЛ1 Ί ζ~χβ 1 Ί Z4 Rnnil /ЧП non Λ n Г1 A 1 1 ’» 1 I n r* 1 I ZN
VllVmiiannUlllV XlpC -1/ро1Цс1ПС ПС1 UtnUUriU L’UyU yV C.V ПС pLb'lU.) upunu изчерпване на СЗ от циркулацията: (Ϊ) -генетичен неоостиг на фактор х · х - чу у 1
Т-Т 11111 Т t 1 3 \ / 11 \ _ ПГЛ1 1 ZTTV4 β 1 10ТЛЛ УЧ 11 <1 ПП TV» » 1 TV» £Л Λ О / и Ο Лчтх» 1 TV» nil Лч О 1гТ-»О /МА11 \
ШШ 1 V1/ llpUC UCillMUCllXM ГШ CLnillUlllC/lO. ^nci|/puuinu \pcll\.iliwpu J които се свързват към С ЗЬВЬ и спират дисоциирането (4). и (iii) ./-χβ
1Г гъ Ί Ί TV» О 1Т TV4 У» липиίαινιιi v
У* T4T4Z4TVJ О 1 1 V Ί Z4TV* nmn/nftn ПА НгЧкЧтЧО / .,-1 .О /-»Г»ГЧ 1 > .·>«» ГЧ »-V> 4.4 S\ + ,4 t »\ ίΓ*\ П7\ v lipvHiic ип villi итрииа па лиира ι/иш rc /ic/z/i /и-сх-ь'/ j v 1 )y който се комбинира с фактор В и формира СЗ конвертазен ензим.
ϊζ/ЧП TV» /Ч ПО УЧТ m nll'Zi 1ч » 1 η Z3 r»Z3 Τ-»/4β*ηηβθ /4 TV» Лч O lrvry ГЧТЧП И n T ί 1 d \ I ζχβ «-j лиuiiю nv cuyupzixa- cuu u ric tu ис/илилоо. лзГП (ралШири ii и л Ц-г/, iml/ci илюстрира нормалната физиологична важност на регулацията на /ГТ» * О» ГО1 1ГП Г» ТЛУХ11 ДПТЛПП 11 п опоипжпнпг» nlrrnnftiirini w I4.OlVllJLilVAVlVnilia ilpU лииьа па. С11С цикри UIVIllLlUUpcilik-.
Налице са също и обстоятелства, когато се среща специфично zx Ι.’τνη lRllT»nnO 13 r\. £3 13 £3x1 Z£3 .4 СПА TX ZX nnon 11 n 4 11 A lx A X n TV* ZX O 13 0 Z3£X11 £31 1/» nnami’ aMnmju^ant, no v псллишпи, no- tnvциа/ти^исати c navvnvno срссцу тъкани на грстоприемника (напр. тъкан, увредена от исхемия или при
VI 1 TXX ГТЧ XI 11111 H 13O»*£iZ»n\ 11 t 11 Z»»-»£3111TT ix - 1П11ЛП X g O TV» ОПП η Λ ZX O 13 in TV* onnrioft TV» 1113131» лирурбичпа haivivua^uziu Lpvuy l. unuucn lvicunvpucuk, yaycH ju пиршиишипли цели (напр. ксенотрансплантант. изкуствен орган или сшализна \ Λ. X ' w- 1С7 k xa χ .τίχτχ n и n \ А Izrx-» ’’P’jpp’’ PTT ЪЦ Ο ' ” ζχχ гтх * а» τοι ί τν» ζ» z,z>,,
1V14-lVUjpCLnCl^. niVlllULiUpariL111M na r^UnUL’lLlVlVnUia LHiyU LJM nLAVx'iana CllllClItCL u по- нататъшно уВрежаане, така че в тези случаи би Рило ν' X ν' *r
T»T»O11* r»nil£J OTV* ft ZX Zin Z»ZX WX Λ zxlzi 1 TX Zl »14 11 11 I1V11О1ЮП O IzTV* nftnrvnna TV» zx η ZXTV» X/xR/lrWT' npvtuvAy щссшии ya ci uauivu^u или urLAuOupu симпииирагкши и ишакт/ирс/ь
Съществуващи подходи за предотвратяване на комплемент3, <ΛΖ1!111 TX O 1 3 ZX 3 rd T4£3xl r/xnnzj 113 A »1 V» ΤΧ» 1 · zxxlr £>1111 Z.3TV» ZX 1 1 '» TX£3 '31 ’ A n TV* ATM 111 n TXZXTV» £»11» I » « ivicy uupa.no vupt2i\yanv цели lipiLiu^Lnuoiio nu pcc.jxkaiiiopn u iipoiiicunu (СК1, МСР, DAP и фактор Н а 1) за инхиРиране комплементната
Ζ» lz TV» ηβ nil ПГТ T/Tl 1X1 lixn TV» АГМ1 11 Λ 1.» ZX » f-rX 4 ο X ££3 1 T τν» n Irn tv* zx Jx «χ lz τ-ν» z\v\ T zR o lz W ΑΤΑ Τ-Ϊ » ·» амнииацил. гхплиоишори nu noruickCAVicnina ikuino ψαινιηορ a, yaaiuup 11 u разтВорими производни на мембранно - свързаните протеини СК1.
i.
плг Wl) /ПТТМЛО Al 1 T> Г* TV» IV .3 1111 η zix Ζι ΛΖΐβ n m Π nl /Т» A 11 zRl 1 1r Г» 1 1 11/41111 ζ» ATM 3 X fR'l Α1Ύ A_z/~ri , jhvi Ljupvvupaiij 111c -ти- щизииоша αινιιυιυψυκαμυυηπα оршили. ин алтернативния път. 1 lopagu това са налице опити за използване на
ΤΎ-1 iDTIl I ί/λ Λ ϋϊητ 4 1 1 1Λ/Ά ОТЛЛП 11 η 1 П/Л 1 / 1г ΠΠΤΎΛ/Λ Π π 1 4 О iV <1 <> 1 1 Ζ» ί ί Π η ΖΊ Л лк’· ΖΊ1 1 С ϊ > Ζ>
UROU AVAOXkC Λ.Υ2Ϊ.11, 1Ю“ СИСЦиОЛПи ki\l ^ίΥΟ/ΙΙΑΙΟ LlOC^'УГч.у Cl flCXU“ П Cl у V JI\.y Г1U J O Cl редуциране на комплемент- медиирано увреждане в модели на zR 1 1 -* 1 1 ΖΧ Λ Г»'»1П»П»1 Ζ» 1 3 TV»Т? п т 1 π ί 1 П 1 Q '·. уизиилиии ппи сшщации ic/.
фактор Н е ендогенно присъстващ В кръвната плазма ВъВ Високи ϊζΖΧΙ ΊΊ 1 ΰΐ 1 TV* V» П1 111И / Ζχίχΐ O
KOnu,Cmu|Jciu,liu ^uuuKriuik nu U.
V.
повишените ниВа на инхибиторите да предизВикВат заРаВяне на течноzR nn/»Rn TV» zx TXZX ol ri 111П TV» ZW’ n O TV* O ft 1 X * rrxxlzil ZXZ»W» £3 Ζ» Λ O VX O TV» nlrn 11П XZ\ A ,x » rn ipddUU U.111C pC САЛ. Ц U LA, J 1171ΛΓ1 Uli IU U U ?.V1V/!U1UV11J C LAdUa, 111U1VU *1L CaO/IVIVALI количестВа пречистени протеини следВа да бъдат ВъВеждани in vivo ( »3OT»~ ft 11 A linn lz zvrvi TV» ZV ]’n TXX Ο > -ΙΖΊΙ/χ TVX tX Ζ» Λ zx n r* r*D 1 \ n
FlUllp. U Usk'lUlUUn Mill A11O liK.KVnV HKUlU pCAOinUOpUAVA допълнение, алтернативният път се актиВира чрез поВърхности.
« 1 /-4 z~s TV* ZX £3 zh Ζ-» lz TV»1^^· 1 3 <3 zR Z1 lz TT3 ATA T-T Л 1 a Ζ»Т“» ТЛГГ11 I I zxlz ZX TV» ZX TV* ZX1 1 11Or» <1 ΖΠ 4 ”,! n 1 TV* ZX 4 1 1 ZX
KliyCiiJM v cpC nJ η ol ii a сригсГЛор ai l lv cAipziri. ,2_ι,θΓ*.αΐΑΐο inou nvuay ikiAwniiai iu редуцира активностите на други инхибитори. същите фактори се предполагаме са като че напълно или универсално ефективни, факторът от отрова на кобра (cobra venom factor) (CVF) Притежава свойството да генерира стаоилна СЗ конвертаза, която може да бъде използвана експериментално да изчерпи комплемента у животни in vivo, и в други проби (напр. човешка кръвна плазма) in vilro.
Напр. 40 ,ug/ Kg CVF е в състояние да разруши комплементната активност на мишка (16). Ооаче има и недостатъци, които я правят неподходяща за терапевтична употреба при хора.
Най- напред тя е получена от отрова на кобра (труден източник за получаване и опасен за оабота с него) и пооаои това тпябва аа бъое * £ ' £ О £ внимателно пречистен От невротоксини на отровата. Задължителни movoHocmu има и пои получаване на съоръженията. Този пооблем не з ν 1 « ι ι iviOtkc да voyc Зпооипилсн чрез клониране и експресия на гена ex vivo, шъи като има пост- транслаиионни моаибикаииии. соешани ν змиите (специфични протеолитични процеси), които трудно могат да бъдат възпооизвеоени in vitro.
1ο
В допълнение, неооходимише ензими и условията за разграждане за тези пооиеси почзастояшем са неизвестни. Втопо. ппотеинъпз е с А 1'1
------------.. л ,,Ж .............. __________ . , чулку приизлиу (аалираша/ и иирауи шииа t uiviynOccncη. ιυυα iipvynv/iaca тяхната тепапевтична vnomneoa (напо. оа се оаое възможност на
X У 3. ' £ ΟΟ ксенотрансплантанта да се усвои).
MakaD CFV да притежава някои cmnvkmvnHu и Функционални
---- —... „ Г-а /1~!\ ________.........
AOiviuAUZMiuciiiu с чиисшмш (ι ,· j, шии сощи lipulliC 2Τν<10<1 СЛЛАС 1.VLU различия в два аспекта (напр. структура на веригата, място на ,______q«.„o----..---___.___________________
UllULLlHllICлаша, nt-iyUCillUUlllC/iriULlll nd KW1V11LACмсшппи ркулошири, формиране на стабилна СЗ конВертаза). Той не е получен от p*Lr Ί Ρζ Ω A W IT'S fi V? Ω Ρ.ΤΊ1 nm Π ’» ν» V niivx-x Г\ ra V а nniirs«i n n ζ»χ -хап ζ»τ τβ /111
V IYL7 UU <Χ kk. nil Ш ГШ ^_-7 47111 47111|7471?α Il.il ЛиирЦ, 1Y47U1IJL7 V lV'kk/П UpO-Il U L. l)U1UL y M Ufl, и който в общата си структура и функция напомня много повече nnftniii юл Ί пт 1ά * Ι.-ζχτν» zx. 7T7 ( Q \ ‘tuuLtuivi x___r 4Jiiii\.L7ckfx. 471114, κ_ υ ί ^l>/.
CVh е специфичен за отровата продукт на животни, много nr. * nmill ft oftn * Inillinnnn ППЛ nninonll^ Z1 ч-VS /, ,T ТПЛ - z- s, tit уОЛкППи L-’ V 17V, klXJ Lt, Li 471'1 Г14.* UllinUkULr.UL 47111 /1L//7/L/ JUpttJl.
Γ nrx (1 Z> 1 I wn ZX ft Ζ» η η /X ί ivpavju шииа nt v практично да се използва генетичното манипулиране за модификация
I '1 m 1 1 ν'·» T% f X WX £21113 ft -ГХ П П1 τΐ Г ΤΎ1 1Г ZX П( TV“> r\ 1 //Λΐΐ.’α ΖΊ «1 Fx'T /X £3 1 1 -» τη η * -» ft fl 1 I 11/2
Г1С1 J1147OU. lipL71lIL Un L7 tipOkjjIXJIK лОиши 1V147ZJX4. AJcl UUyt U.h IV.υϋαπ 114.“ имуногенно в хора.
Γ nn n 'im n m 11 iii « in in vs η ο zs λ ο —» -, > t z> r. t ts-s .inn η m τ 1 ft /2» i
1L>I1£1UjU1VZ1HJ,4- 1\1 11UL I lpL kp kLlC-vliklA. CLUllLpUailtUULr
ТЛ /X ZtVzx zn . . Г,,, . Г
LJVkjAUkj, iWUlliU L1основава на преодоляване (заобикаляне) на физиологичното регулиране iiw Ztx Z1V ZX 1 1 nvi 1 ni 1 TS',n a 11 Ζ» V/Wfn 1 c. U- UlVlLVlirU и плииирапк ria 1\4,Р11Ь.1к
U ί t ii -i il супер- активиране на системата. Възможни са две приложения. Най1 1 / : ZlTAZJ <·’ Wl ΛΊ11 VI ZX П\'П Z*1 K CZX -.1.- Λ Z2 Z, ns Zs Λ 1 1 ·Χ V, /-. а >X ft fl 1 1 чу-» Γ.Ί, >П X < . Ζι Τ' TX“1 llftl ITS Ζ» nrt Π « IKlllpLy, 11147 .> Lt 1ГМуЛ.Му IVlUZhL ya ииуч и .> 1147. k.J 11 Ctrl 111 VMM >il aRinui/upanl na комплемента до изчерпване на един или повече компоненти, което ft /'.£14 П ZX X П 'ТГ ’A Ζ» ” '1 nn η ZS ГХ1Л1 1 ZX Ζ» WX TV\ O гл П ZITSn /1’ ТПНГ»П A nV η 4 nil nm '*Z\ft ZXT vvyu y47 jacyva П a LI J47UM47£lMClllliia y:t llpL/y у ци MU. .IVU LL·Ill LI 47J HGUL ' V»|.
I 1 п
II <1 което и да е последващо предизвикателство (като напр.
i’ ··.□. 1 1 /А V~* ζ, T Ί ζ· τη A fit t TVS 0 1111/1 \ T) Wi /ЛГЧП
Is ILIlklll ip 4X1 IL. 11- kill .’.ill <1 0,41/1 ). IJ 111 VpV, може да бъде свободно локализирано в определена мишена (напр. вирус i > л 11 ? in z?x ab ns imnn »» ζ» ft τ ι ητ rzs 1л * o τ-ν» Ire 1 - » z. nnfttiin oft enn us’ft ft........ |·Ύ>1 m Z, 1 » <
или unuiLMnupana и uupy-L Λ_·κιιΐΛαι ^a iivuuluuuui>v 'lyutHiuuiiiLaiivLiiHiia nt.
такава мишена спрямо комплемент- медиирани деструктивни ин илтири.
Терминът “регулатори на комплементната активация^ както е
Π Ί rt/x * 1ft 0’1 mx rlr ftlral zsi ί ft rt ft Л!)н1ги li.7 пило u clri iiivrk, ί aiu чиа uvunixu
ΤΊ Ά η. ΤΎΛ Λ 1 ! 1 111 Zs £3 ί3 Z> ΤΎ1 ft Η 1 П 1 1 ν»-> Л L’ П »1 C't П i IpV’lllV l_i.il LL? усисштици HlUIkU 74 yci инхибират амплификацията на
С? превръщане, и не се ограничава до генетични локуси. 1ой. обаче не включва регулатори- нагоре' като напр. пропердин . “СЗ превръщане’’ се определя като протеолитичното
T'lT'fP ΑτΥΙ.Ι ll /9 UP UPl A flf\lf Π * lrAm Г\ AAt’nA vi rs £> 11 iipvupиьцигги псх V.u ι/ V.ucl., yviYU-iRUiiiu уруам nu v voim’ivriO, U X^.*’ конвертаза” (или просто “конвертаза”) се определя като ензим ( 1 1 If VI Pi Ар «-1 ζ \ If ЛТк-СТХ A Ρ If Ρ ΓΛΤΥΪ Ρ.Α. ** и * u Trvftfxxin тмлгхгт» ηπίΊηβιι 1г τνχ г» · \vuuiknuuvnu ЛО1У11Т IV IUU Olli yt/U ЦДи 11VUU IV 2 ipMlllU unuu U IkUlVlllVrik ΙΊΗία, например. СЗЬВЬ, C3iBb, CVFb или с4Ь2а), катализиращи подоона
Така според първия аспект на изобретението се предлага e pm ppm Αρη пр.р.тп .° 11 ,ι υ\τύί 'irw ггт1_л »> **» r, ,, n 1,’ш r-rx * <-»». < o t з тю <-» » <г<<1ч Д, ,,ι ,,τ-χη,ι vnivuiiii./νπ npMiiiuu.ii μιπ UMivumaiiia πα iumxu.ii/iui\iu 11111a, пид]иуицирап че npomeuHWe в състояние да формира стабилна СЗ конвертаза.
T ϊ A/1 ** CA rirVt rJA’TA ft Ί J IMkj U U J IIV U lllL-’V Π природен източник, кака, определението включва който и да е срещан в
ПППТЧЛ.ПЛ Г-νΛ П П«/\Т*Л£>1 Hl 1 Ί Г» AA1 mil O T-»-» ο 1 Ί A ]> Г-Н 4 rz3 1 ? m n upupuyania ирицкип ria mmivlziha.ina riu ΛΜίνιινιν mu uma, * « Z4 /4 1 1 Ич И 1 I ТЧ Ο 1 1 I О 1 -Т ΖΛ.
iviny иир и и, Vi р ап^лал 111 ил е посочено по- горе. 1 ова определение не се ограничава до видово ον» ОЧИ Λ>Ί 1 mtn nr»nm amit: Г ппрг., и1лциуи*1пи lipt/iiiLunu. u. ujpyou yyiviu може да Ьъде използван като стабилна С 3 конвертаза и в други видове '? 1 ϊ V! 111 ’ Ί 1 1 If 1-3 Pi A ί zx \tr\^rx tv“i An AT o o -rvx »i от*» r\. a -x ft o nn Ϊ z Arn : zR Ч, > i » т-ч ni Til иизаивици. \./υιΐ{\πυυνΐιυ, ινΐΜ<-αιΐι уа инуаш изнилзисши ivivyилри.и^и.у ariu протеини на обмяната на комплемента от същите видове.
A /ЧА11 ЛмЬппИМ ч^о ПШ’ Un, ^ОО.ИТ>ПО νι/чо ^/Ί^Ποτ^ι . 1,<ч,·™,·» lvivy иуил ации па v_ „.· ;Д1и\ киуиршцини пиилчуииашим а/кши, например, използвайки същата сайт насочена мутагенеза, може да
ТТГПГХГГХП111 Q А Ω Hl 1 Ώ Ll m !Л Ω 1^/414 тл*»/ч а 'ΛΛΊΐιη'ΛΛΛ,ΐτηηιι nn b-n> cn д ο* «οπιν, llpvy У цири Vapuaillll 11U ЛМи111М V pU U UU111U 1111IU 11 пи IkWiVllUkU A'lV tun регулаторни протеини, при запазване на положителни функционални f* ft /4 14 nm ft O / TX O '1 ”*-JO O x|f Z4 O 11 <4 f, Z4 f’T'T. ГЧ 1 ma A < l’ ГЧ1 1 ft i3 tstvs Ζ» Ο O \ ll V/»nnb ·Τι t '. Al 1 Z>W1 1 l|rn vvuutuiua разсра/иу ant ум ч_~·ν· при о и 1uMiu.7up111a.oa; и лирихих пи put in un и на структурен интегритет (правилна структура на веригата, и до генетично- модифицирани форми на природни комплементни ’''’“’.Ρ.ΤΥί P ' 1 U » I ПОПА IWApan,!··,, C'a 111Ч1ТПА /ΙχτΆη ,Ι <131 ι
HpviiK-unu, напр. “imw cuiuu пищни u..’U ypauuknm нрили/ша свойството на устойчивост на физиологична регулация на комплемента. Поради тази резистентност тези молекули могат да генерират стабилизирани форми от съответната СЗ конвертаза, която Води до усилено превръщане на СЗ В СЗЬ и странични продукти τι о п и, ο а,,,.·.,ζΛ
ПС1 pa,OC.|JCL«S.y Cl ΓΙΑ., U UU Uj UAJllAjOU ТП Oil ία vpvyo \liaiip. Ill 111 1./ f.
В предпочитан Вариант изобретението предоставя модифициран npftanilrn 2 ΠΤΊΓ'.ΓΡ.ΡΙΙΠ ΕάιΊτΤΆ Ρ n/iTV>rmini β пп гчп-ппплвппчо лт жп Ьг»л/\г«. Т huuliuru V/.J iipivjiuv an, lYv/uiiivr c vuiiuu-juu na jJtiJGpajTkLjant can vjjujvjnwp x.
1ова може аа бъде постигнато чрез модифициране на <ч сто стт ii ii m ο ii o пол m αηιι ο -п-ш ι полт ол in m 4411 nm /·» x rncm 0 ииматицинк ha npcancuna npu npuintилишиппишс- lvxcvina.
Специално предпочитан вариант на изобретението се отнася до
1ГГ1 Cl) 1 41111 1 11 Π π 11 1 1 oftzi 1 1 1 Izi 1 /*^2 ΟΟΟΤΎΙϋΙΐη Iri /OOrVIO птчст iiini ι m n » rfl on ж i n i 4 r*. η 1 Ί миуифицираи nUULUUKU v,~· upvilivuil, Auyviliu npvnic un U1J1 v ivxvyифицирип чрез заместване или на Arg- 1303. Arg- 1320 или и двата с друга амино1|Л4ОО ,1 11 11 Ο I I VW Г Ί О ТТ1 О П» 41 11 ГЧ .Ιχ-1 1 СОА 4 11 η 1 ΖΛ’.Ι’-α ΖΊ Ο ίθΤ ΧΊ ГЛ ί' 4ОЛ14П ТТ11 <A-m 1111 nuvcnuna. Друсаша атипи^ииллипа ivivzixc ya cnxyc x ириоип, хдиииин,
Гриптофан. 1 лутамин, Глутаминова киселина или 1 лицин. Arg- 1303 за
ΓιΤΊ/ΛΊη 1ΤΎΛ C111O ПО ’“I <1 Ж CO cm β <1 Π T * T Tm Olnlll/oRn lxil ПО 411110 4 1)1 Г A 1111 1 »11 ί 11Л ирсуиипсшктк vc aaivlvviiiL/a v x -k v iiiaiviiinuua пиплигш iliu x лиЦип ( nv“· малко се предпочита 1 лутамин). Arg- 1320 за предпочитане се замества
W ·» π Г~ 4 Т TTV1 /1 К 1 1
С X /ijliJUlVlUn.
Други подходи за получаване на подходящи модифицирани
RV. L»„R ГЧ ТО · НрОШЛИПи V DUtauHU UOWC/pC111V J 1 иV 11 1С/ L/IWklV/nC'Cllll.
Г) Редуцирана способност за инхибиращи действия на Фактор Н и
CVA ЛП 1 1 ППЛm an n 11 /,,„«« ΛΛΓΌ TUT CD1\ LT Г4ЛТМ11ГГ1Т> β ν'ΛΟΗ -i слиупи npvincunu μιαιψ. ινχν^χ , nni , vivi^. x xanpuivxc p, и ллхр/а остатъците /6/- 7/6 и 1209- 12/1 са въвлечени във фактор Н <n Ri O '» β Ο 1 ι am гч /?П 3/П 11 Ο O * ra r»W> R DUO m Z4 1 1 Λ CO) I Г1 11*11 П oR <111/1 л TV» IV. f>-1 tl n-’upoDantinv x--r j u aaivivvinuanc in v па супа uliu nwc ac util iiivou остатъци иАи на други остатъци, свързано също с действието на тези
W 4 X 4 Ч .· pO/n,mzsnnn » foil'/i по плотпиюп upunituiiu, iviuAkc ya ^сууцира η R i mR η:ιο m η η ο λι1ι1 o i ,1 пю in vuupouaiaiiiu na cyun или uvuvtt can iik,)U регулаторни протеини.
ii) Da οι τη 4 τι ο η n air nv» zi cm ii) ι vyj цирапа скириъш
Aonivi ГЮ ППГП na утиццц^игк na vjui/u. nxuuaiH ya vioyani въведени мутации, които Риха подсилили взаимодействието между СЗЬ и ВЬ. 1ова би довело както до редуциране на спонтанното разграждане на ензима и до понижаване ефективността на фактор Н (и сродни регулатори) при изместване на ВЬ от СЗЬ.
Тези мутации е желателно да редуцират скоростта както на спонтанното, така и на фактор- Н медиираното декомпозиране на СЗЬВЬ. Дори при отсъствие на фактор Н, течно фазовият СлЬВЬ комплекс притежава половин живот само около 10 минути при 37°С в присъствие на пропердин (6). , iii) Човешките СЗ остатъци 752- 761 са въвлечени в свързването на фактор В. Това е дооре съхранен участък В СЗ и олизкофодствена последователност е намепена в С4. Гъй като С4 свъозва хомолога С2 на фактор В, силното сходство на този участък между СЗ и С4, заедно с неговото добро съхранение в СЗ, по- нататък подкрепя ролята му в СЗ като място на свързване на фактор В. Така, измененията в този участък може оа влияе Въоху В асЬинитета и Въоху стабилността на J 1 r' 1 Л. ш·'
VJUDU.
iv) Устойчивостта на други регулатори на комплементната
... I, Q ... Λ'Μ 1 Пл ϋ ,, К -ir'D ¢:,, ¢:,, . „ ,1г~ . . .... Т Т_ ,,,,.
амПииацил мшЮ Vivi, jl/.-vi и ινινι соидм ми иил<г лслошСлпа. начина па оействие на тези оегулатоои е схооен на (bakmoD Н. така че не е и 1 7 L ν’ 1 1 неооходим допълнителен мушагенезис. но сходен начин, някои патогенни организми експресират свои собствени инхибитори на комплементната активация, които често са структурни и функционални хомолози на (bakmoD Н (напо. Vaccinia virus секоетопен . ' I 1 \ L 1J
--------\ т„.........._____„1»».______ ...
исишиу/. icau люлслуЛи нрсунилиаш илупшиирише иш uiviynnuuiv отговори, и би било поеимушестВо способността аа ги атакуват с £ * 1 · ' и/»' , , , /'''’З 1 QQ
Iviuuicnnu vj KwriuCpniairiU СНЗиМи, yCiiiOuHUDU НН шСЗи ЗаЩиши.
v) Мутации, които повишават стабилността на СЗ kC« г-ί M ΡΓΊΤΤϊ Я Sim SI TJFiPQ ΠΏΡ.ΓΪΑΠ.ΩΙίη Δ. Irmnft ПЛОПАТТ) ο ιίο ητΑΑπρη Aim a na A7 Am/Aii ft unuipmaoaiiia ipvo npvnvpyuri. ^xiviiiuunUviiiiiia na lipvnvpyuna cc luuiuuli l;
стабилизиране на СЗЬВЬ комплекса, заравящ спонтанната и фактор hlΆ F> ίϊ * * Ο O * * A Ο ΓΎ * ZA FA * 1 FXZA1 111 nl 1 1) f~T I ZA ZA Z*TVA ZA 11 Λ 1 1 A 11 VX All z* zx τ 1 л z~*s /1\ л It W4 11 ft 1 1 ZX ft TV* A 1 1 1 Ί z* оаииеслцсипа уисициацил, i vua ииаисьшоирщ.пС v пССд|/СК111иигЮ c iTiCnrici фаза, но изглежда по- важно при усилване на процеса, след като той ftail Ο Ο F*TV1 гъ ΥΜΉ 1 1 ТА «“» * ft Π ΤΛΧΤΎΤ Т% ZA /Ίν'/Ч ZA mil A O 1л TV* llftll TA mil A TA ZA ft A TAXTI 1 ZA 'У TAA I *· \ uv ~iv v сша^широл иирл) излудиу/ицо. ukliiuuupu.ui,a. nOvЪрХнОиГП
Повишаването на активността (чрез повишаване на афинитета му)
1. F FA aIf o FA O T 7ΖΊΤΤΧ All ZA ft 1 1 КЧ 0 4 All FT O ft TV) O1 111 Ο ΤΎΊ ZA /ϊχ AAA 11 ΤΊ/Α ΙΑ Ο ZA 1 1 TV* ZA ft Ο ΤΑ rXZA Ж <ZA TV* * 1 TA z* 1MV7ZLW уа У VlllCXIUJU U UCL'Ulllua U 11 K ”111 0-11101 ψαοα. U llOpapU lllVJLJcl Ilpcuviomupa.
спонтанната СЗ конверсия. 1оВа би било особено полезно В комбинация
ZVF*TT 11 1 TV* a 1 ί A Al 1 Al 1 R Al 1 1 1 11 /АИНААИН nA ΑΖΧΤΧΠ c уруаишс iviuyUkpurvciUjUU, 4jnuvo.nu iiu~ cUjjt.
Vi) Мутации, които предотвратяват СЗЬВЬ от постигане на С.З
If rxi 1 ft O TAW* Ο Ο 1 * Ο O 1_F tVA * 1 ft * A ZA FA TV* Ti ZA T O TV) ZX <*O 11 ΑΠΑ 4 “V ft O An ПП11А AFlft А11Г) 1 * O ZA IrtVI 11 ftl 1ΗΠ Γϊ,υηυνρηαοηα aiunuuiwun. lxucaiuu w ионмлоиа aa up *ic pi inane na areiiiui/riuH
СЗ от циркулацията, един нежелан страничен ефект може да бъде
ΖΆΟ ΆΟ 1 1 O1A1 1 ΤΑ A11Z3 11 Ζ, AZA 4 а» Г11 IfzX A 1111ΖΊ ZATVA ft Ο 0 1*0 z4* 1 1 A O lrrV* 111)1111 ta /» T* rvx 11 All ПАН у^сл nc pupctriv па. cuaviviu ivuauil vinua. апа^иладшu*iriLi nvninuyu. v. riauiголеми възможности в тоВа отношение е С5а, който се разцепва от СЗ r* LJCtIzfaii /^2 йл: 1 ft arstn a Ail 11 ш ί ά ι ι » ηι ί 'ο απ τ\ο а1гп n rr ftzstAZM-rtvn ι/л паЙиап z\m C n/lKUU V.-.^ M/ilULpllldohu VUOllMU. 1UJL1 p< CLlYUjU-Zl uv рмлшпсг oauutu U11J афинитета на конвертазата към други молекули на СЗЬ (11) и също /А Ο Λ.Ί па AAal/AV) 1ΊΑ АТТТЛТЧО 1 ГТ 11Т*ОА * η Т1ЛЛ А 1 η I 1 1 R Γ'Ί jvivrytsx y« vzuyv vxzviviii riu к,уп|д.иил mj шации v x__·, mjliiuu отстраняват това взаимодействие.
х rn\ 1 Г Ο ο Iftv* ι * ft * A r\Arv> па 1г ζ^ί Ί Йппт τν* ο Λ Ι’τν* ιιίϊιι /лт ζα хи/ livyuvpviia олшииплъ-ш na глтик.-ршаоошо. плшиипиши място на СЗЬВЬ остатъците от СЗ конвертазния ензим В ВЬ. СЗ
L”ZA^ TTAZXlΊ ZA 11 TV* Ο ΤΎΊ O ftotAnnmllO ΛίΤΤΙ llrill) A1111»* a wa аЬ А 1 1 ZA nry 11 A » пл1’11 <» Ift-ГА 11 ft 1 1 ZA дхншюгкшпаша utpuAuinu ΨΛ шхцаипир/а шаси, nv ya na.iunvu алтнипа конформаиия на В и/ или да свърже и ориентира субстрата за ftn A A cl n ArTx ft π Λ ZATVX Z* TV* TA O TV* Q 11Ο Dk T nftn Fl Al 1 A ATTA A Hl 11 nl i ΗΛ zA 11-> ft n nTVH 1/X 1 1 ZA ft T ft ι ’ илус LAvn iu uv Uin uiipaiiid na vu. ιυυα 11ипастид1цит nc c uoiAumriu, пм uuu всеки случай веоятно има обхват за повишаване активността на
Ь/М 1 A A A т A 111АДА »/ΊΤΤΥΊΑΜ1ηΐ ft ί'* 2 iwnucpinaoajtia npva шации u a o viii) Експресия във функционална форма. Дивият тип СЗ изисква конверсия на СЗЬ,преди да може да се комбинира В нов СЗ конВертазен комплекс. Когато се използва in vivo, необхоаимостта за превръщане в KZ * А
C3 (или C3i) би отложила действието на модифицирания СЗ. Поради това би било желателно или да се даде протеина във форма, способна за
HP ιχ Α ίχ Α β» 1 ΖΧ /Ixzxr»» Г1 1 τΧ Ο 1Ί Ο ηη Ιτζχΐ Ί β аг»ГП Ο ГЧ rt 11111 /X Ο ZXza zxn/xza τ4ν4ζΛΖχβ nmimn A 1 Ί ΖΧ Loauaunu xpwpmupariv χία ixviixL/vpinaoa, ujxlx ya vt Oayv. ixpvyua^>Lxiiiv;iiJv>
формирани конвертазни комплекси. Ето защо преимущество е ppiiapiinn vjpmn vj n тлаппапт Йт β zRtti-iIfii чч απ а л vj ζχ xx-ryx-iizviiizaiiiiza ηη ^х-ч»Л»у» cvtivp/upaxivxiiU nd pvacA-hm uuD уушлциипсити ишпишлпиС na wu сл ни/.
1ова може да бъде постигнато in vitro ( напр. чрез протеолиза).
iv \ IK /ΓζΧΖΊΊ 1 zRl 1 I/ A 1 1 1 111 11П ПГЧ11ТЧЛ All 1 1 Π AAA m Z3 1 1 1 Ί 1?ZX14*V4/X Л1ТТ»Епт \Г» laj тиуиуиКации na xip/upwyriuzi upumiun, хлииши ν.ινζρ»αιιι за вкючване на нови места на разграждане така, че се получават
ПРГ.ТТШГШПТПР \tij оргучтт ’’1’ ιΐΛ/Λ^γΑηη» ni <->*-» /-»βτ тмлй п пдтл V» η Л\ ПI? ТТ» ιίγχ iE-iiuiuynuiiiC у ηαχιιι ици, nvOUXviy uiviu за νυυ^ουαηνιηυ ria xpuKuxvy χ/7 nv онези, необходими изключително за свързването на фактор Н. могат /» о клл ζλ ο τνχ ζχτν4 nm ιλπιιζιιίιι ТЛ/Л λτϊοι in ζΚι ί nan n л tilHi U r> ητΜ 1 > Сйтл a <'m '1 m < ·. ’ t /χ ί > m ya uuydiii ишишрсшхпи xiv иисциуичуп rxa-iurx. ndnpumvp, мхииаши mvguih да бъдат включени така, че подобната на СЗЬ форма на
WMZiiiAnnu^nnn v4Z4 η o tw nm rr It » ζζχτΙλζχ уч «ч rZn zxo τ>ηΊ лтлппоп тчлх ι ί o m n w» π It ivivyиуицирапил им“ пашашил iviclaw ya vuyv уазс.рау<.xi xxlj~ питашurv във форма, която все още свързва фактор В, но е по- малко податлива па
1 л
11СХ
11 1 nlrrm 1 ft Л н η α ппоп ζΚ «X lrTV» ZXVX U 11 Т ипамнииицил пр^з кравлиор χ ι и х.
х) Модификации 6 други участъци, които могат да въздействат
Ж r/\yiaii nm ftn πτν ο у» /4ч у» lr m Ат» T? *1 f iiiii /4x o lrm хчтч ΐ_Ι иоаимиу^иипиилша v xpaixinwp и и/ uzxa ψαχχχχχνρ χχ.
Изобретението се основава на възстановяване на традиционния
TV ГЧ ZW ΖΧ Ζ1 ПАДП гчлпйпйп^и ИЛ Iryxl Ί RpTS У»1 1 r~t A 1 1 “η 1 ρτ»η β ГЧ 1 Ί ΖΧ ηη ,1 ν»ζ> *ЧГМ1Н ххмуллху ηρνο pajuuuanL πα. мяшСртл οα uonvpxxuanv ria u xxv шили начин аа ооезвреаи (аа направи системата нетруооспособна) I» l Ч·» 'U A А. Т Ч?
лпpm pi rn m r* t— ζόίуч nnm * 1111тч-чn » nz4 r\m 1 * /wlronno п л п лzxixrxza-rvxpti 1ι am r\ za χuviixCiviaiiio» i—Ajnv? yvnio^xnuiiivzxxiv npuaumxhul па азиирСиКтн-ию γ възможността за развиване на СЗ конверсия в опреаелено място, и по
A. А VZ т zxи 1 и niiiin ζιη » z-zxtfxi * а и литчо lr/м <ν» » шпт ппйп ζ>ι ι > <ι ΐτν»za zaζϊχza 1λιλλζχν»ч in шиои liCL-iuri yu ινιύυιχίαοιψα лОМП/хСтСИШ- oduuLuiviuiiK ^лр^гхшмрпи механизми аа атакуват специфична мишена.
»-* τ *
Emo защо, крайният ефект ще бъде повишаване количеството на
Τ'л τϊΤΤ. ?· ΙΤί’.ΡΡ.ΤΤΊΓ» Kf 1 '•ОХ ОП 11 ЛтЮ ПЮАтаПП Z»Z3 ftnr QxoxIzzxa ftx ft липиерсилша^Кисшии lviery иуиццрапилш iipuuiuuri ue иииелхуи u uu физиологична среда (напр. кръв), съдържаща регулатори на комп/\ементната иктиВация. Тази актиВност кюзкс ya 5t»qc изиоАзВана както за изчерпване тази среаа на прироания СЗ, така и за ли L X W * zxlx а л поп τχ r* τ Ί £3 χία t* X lrAnftoTOon ζττχχ ζ» ft Ίλο i on ο » rnin лп ο липсишо ιψαην πα v j Копие реилша и zKC/iaiia пшшСНа.
Аналогът на СЗ. чийто СЗЬ- фрагмент е резистентен на » А А
ZX d 1 T ZXTXX X X ZTТЮ a X X a zlx A lxTXX ZX TX F / η ζχ TX XX TX TXZX1 Τ Ό Ci ZX ZX 1111 ΤΎ*ι Λ Ί 1 Λ Ζ» 1 Ί 1 1 Q τχ χ τ хь ЯζΧ Ό ”1 111 ζΟ уе ииШиилпш па yaj\.mty ± ^психр- ириил/иупипк^ОПииапи u npuiviep 1 у иДе свържат фактор Ь, който след това би се разградил с фактор D и
Afton ТЮХ’О » ПГХ VXT X Г»Сл ΖΧΧΧΑΖΧΤΊΧΊΙΙΤΧΑ A ft 1ΊΟ ζχ 1 т тЮ 1 X ft X Ί Ζ» ζ4χ ΖΧ XXX Г A 1 Γ ΤΧΧΧ 1 ПЮПП 11 Ο vue Γΐχπу шши си ес уииицицршь и пеuieuiuuna. (рОрниа. 1 хри /ιιιΩνΗ ria инактиваиия от фактор I, модифицираният СЗЬ ои бил способен
TXZX ft νΧΧ ΖΧΤΑΊ 4 > <ΖΧ ZX A zxft.o nofto IXZxQlXTVXra 1т»л1х!»П no 1 louiiio^uiviu ycl χυυρουα nvuunie тилеК>.ш ria
Фа 1 r τχχ zx τχ T-? n n/xroo.on moftn utvLiiOp и/ и mvua
ZX А
У“ предизвика тяхното инактивиране. Ето защо друго възможно
TX ТХ1 I А ZX '.Ιτοηΐΐο 1 X A Т Я fX ZX 1 X /4хх X 1тг>1 1 11 XX ZX XX X 1 non 11 ft ТЮ ZX ft A 11 X ГХкХЮЛТЮ Д1ПЮ VXT X ίχΐ X A ZX пршшлхллши пи lvivryиуилаидш? инииапи и inwuci иЗОиреГПеиие^ v;u xullziO инактивирането на алтернативен път чрез изчерпване на
ΓΊ It 1ГО 11 ft I X AOTVl ТЮ «X no /4x A Ixxxx zxtx E? A n O 4 ZX О11П.ЗП Ю ZX zxxrzx ZX X ZZX xIxzO ZX A ΟΛ 11Ο TO ZX A ·χ ft n сиешиигюишша. па уалшир x>. jS.ricukvc.u'ieH ПОуХОу iviOzKu уЯ се и.ЗПО/кЗиа оа модифициране на С4 за предизвикване изерпване на 2 и поради това да гАоООП Л11 It- λ oonnaobiirr TXX »Ю ПО 1т ΖΧΈ ΖτΧ * αι rat χ ΤΧΧ no Ο ΙχτΧΧ lift οηηη uu^.>luau Алаиичшкид πuu; ^ci iyuiviiciciviCrimha алшииацид.
Изобретението включва всяка друга протеаза, приожима по
ZX и VI II ταΐ 1 11 ΟΙ 1X11 1 <*TX TX ГГП ГГ\ 2 lx Jx A noil 1 Γ O lx ГХ н ТЮ ZX ft ZX ZX 1 1 ZX ZX XX A ·! 0X1 Ζ* Ή.· zx Olio I 1-Л dhiLlUGU ПС Г1 Г1СХЧ1Ш Clip/llVlG CJ6UU UriJUlVitl, IcOciilO cuyu yk? U.I1C 1Ш
СЗ до СЗЬ, независимо от присъствието на регулатори на
IxZX A ZTX Λ nl ГД 1 Ί ΤΧΧ no XVX Ζ» a IxTVX lift ninirr iyvlvn iz iv iviv 11111n cu11 a ал ιi i uuац ил*
Изобретението включва също ДНК последователности, които ” ZX ZX 1 ч ТЛ А ТХХ ТОЮ/ЧТЮ Z51 V X X ZXTXX 11 О/ОПТООТЮДП П ДТЮ/Л 1Т ГО 1 Т ТХХ /X XX 1'1 ΤΤΊΖ От тхт τίττχχτ ТТ-ЧХ 1 лос] ираш upviiivuu vin ujυιψι ine пие ГПО, leuKITlO и /_u,ijliv Ciupj ix.ni у ри, включващи такива ДНК последователности.
I Т-ТЪЛ TX ZX A A Ο ZXZX ft A ТЮ СЛ * 1 1 ZX ПТЮ n'’* ftlrlzxxiftz» ft Ζ4χ mini ППРОП /Ц111Х пиикуииапклпиеши имичиа ииичли ОНСЗи последователности на нуклеинови киселини, които благодарение на дегенерацията на генетичния кои също коаират аааена аминокиселинна последователност или които са по същество хомоложни на тази последователност. Така тези последователности са Вкючени В обхвата на изобретението.
Последователностите на амино-киселините, които са “‘по същество хомоложни” са също включени в обхвата на настоящото изобретение. “По същество хомологията може да бъде преценена както на нуклеотидно ниво, така и на амино-киселинно ниво. На нуклеотиано ниво, последователностите притежаващи по същество хомоложност?може да бъдат отнесени към онези, които се хибридизират към последователности нуклеинови киселини при строго определени условия (например, при 35 до 65°С в разтвор на сол с около 0. 9 М). На аминожиселинно ниво последователността на протеина може да бъде отнесена като по същество хомоложна на друга протеинова последователност. ако значителен брой от съставните аминоVZ ' X
Irt ·» T-j-rxzxrrft гтЛ vrx» </Ч А /4 ^1/-11/4 Λ-ГГЛ I Ϊ /41 ΊΛ QftCn СА(д, лииСлипи Прили/шиш AMmoAwzLvHwITl. ПОНс 33/6, Ow/6, /ν/б, ou;-v, Vv .·ί·, >3/6 или пори при 99% във възхоаящ реа на преапочитание от аминоt f. 4.Z ί к/ 1 V» киселините може да бъдат хомоложни.
Както бе обсъдено по горе, протеините от изобретението могат да бъдат използвани да се достигнат ефекти на локализирана комплемент активация. Един от начините да се постигне това е конюгирането на протеина към частта, която ще се свърже към желаната мишена. Така, в друг аспект изобретението предоставя конюгат, включващ протеин от изобретението, свързващ към специфична свързваща част, например специфичен свързващ протеин. Пример за такъВ протеин ои било антитяло или негов фаргмент, свързВащ антиген.
Протеините от изобретението се очакваме могат да бъдат
R 1л A IzYU ОП П R ППЛРИ Z*TT^AO V’m C * OZA aIzO * Ά 1 1 VTA OVA ZA TAO Rw> 111 1 O1 1 OzJaoIt'WA X? TTA ZA Ά 1 1
UiViivnCnu u yayvn v^wmn v v/c-jivy zKvviari liivpcuivuHiunvn vkpvrvin. i_/ niuju смисъл изобретението предоставя:
*a\ J I VAZATTA 0 4 1 n fhTTh * ’ Oil ” OTVA ZA Oo rvi ЛтА n A A R ТГП n 1 n A O 7АП > A xl’A n n A 1
Cl ) llpJlllCUll Mill U3UUjJVllIl.nULlllU Л<1 HlVpCLllVUlllU-iriU llpVUkVFZU.4riU4.?
Ь) Приложението на протеин или конюгат от изобретението при
TATAZA1 1 Ά
R ZA/A Z’TT-l R flVYI fb ’1 *A XZOOl 1 lz za Ж ZQ1 1 VTA Ά Г» 1 1 П ΤΑ ZA Λ Ί R ППЛ R 1111 AVn Zimil 11 OTV1 ZA 11 11 ZA От-n 11 OvyLiiiuuiiiu 11a lvivyurx.cuvi.4run _>a. uoiivnouanv lj ииолиулици сшиипиипи на комплементния протеин на обмяната. В частност за приложение
ΉΌ1 1 VTTTO ΑΑτν> β ТА ZA т CtR <Ί11Λ ZATTAAtRa ΤΑ » ГТ1 1 αΤΎΛ A 11 <Ί τ ιντοίν on 1 ί Λ TVA ζ2*ΤΑ11 ΓΤ· При npvyиширашлиапС ишлиир.ллпипи пи Чулхуа материя,
с) фармацевтична форма. Включваща един или поВече протеини •»1*11 V ΖΑ1Ί Ua '1 ZA VTA 11 ZAVTA ’’ 'J/A TA p TTA Ο И 1 Ю WA ZA ППАА1Ю Z> AA1111 11 All TA ZA R O11 O TA ZA ZAAZ ZA ZA .*V 1 1 » 1 1 LLiu nunivcaiiju win uo wpv хич. nuv ши oavyuu u %»yun u/ш iiuuc a 4 ниу<1иу.а1ци
Във фармацевтично отношение носители и/ или ексиипиенти; и лч Μ OVAA ZA ΖΑ ΑΛ ΟΟΑ1 Г11 1ЮА11Л 1 ’ ΖΑ Ъ ΤτΑ 1 Ω1 т 1 1 тТА nil П rrAATWOll n 11 А ΛΟΧ <ml П TTA «А T 7
VI f IVlVlllV/y 0(1 p4_yjU,UpU.ri4 1\.4П*11Х'141¥1411111Г1иЛ lipVlllVUn I1C1 oviviziri CUHCl \ бозайници, който включва прилагане на протеина от изобретението no (лпАПППППптд -» n ИГХД/ЧПАППТП ППА R-t R Ruza nr* ж hoi <011 аРпашп i α ζΚ<ατΑ»»-« na V/VJOCiUnLlL^LllllV, OC1 lipv-yiivnuilia.ri<w UOL· UUy Ilcx *pa.piVlllt^VL/lllU-iria yuj/iUCl.
фармацевтичните форми могат да бъдат представени В
ZAZA T 11 TA ZA 1 11 1 1 p ZA11 1 A 111 1 1 1 TTA Ο ζΊαΖΑΤΑΙ fl 1 zA<T ZA T TAvlznillll zAVTTAO/AO Λ Ο 1 1 ZA IrzA A IIHOZATVaRzA ZAWA уилиращи CyUnUl^UlHV Vj/Wpiviu, 4 V4j ирл\ахци. UlipCyC/lVlIU ixu. kunv VlliDvJ v/111 активния ингредиент 6 една доза. lakaBa единица може да съдържа »<iinin.rrrxr n ο tATAI 1 w KO va 1 TVA rr o l.’rTA ii R Ш 1 11П АПД/ПЮПт nn tlArlAOAlinm nilil
I4.CLUIV/ lviun UIVl Y 1V1, ncllipuivivp X 111J4, 0.14111 uuvn UriGUCUUtmil, OL1 JipV yilVJ nUliiailV
2- 3 mg. 1 орното ограничение, което такава дозираща единиците
Azataa™ azzaaIao ZA *A ZV7T on ΤΑχΙλ ZI Oil OHIO R TnRn tr\ Z1 TTA ZA TTA W Г1 1 ζχίΙλο nm R za /Ja »A IxrTA ZATA1 1 tpvipivici IVlUzLW yCl vuyupzi\a, V U ULLAU L/ OauUVUMVVlll 4111 ΐνίΓΙΙΛΖΓιΛ. UU1UU vpcllklliwpu като условието на третиране, начина на прилагане и възрастта.
ii on ппл nrjiiti аги а но тю 11 ϊ j η ν ϊ wa «а lmlrrY5/\ п огг Ат
UlVC^llFlUVr U V MVlliV/inUV 11JV пи иици\.пша, rVCLlVlilM и WW/piXavVllUZl V7111 икономично естество, кдна примерна дозираща единиците форма може
ОП nl OT ΤΑχ1ζ·ΖΑ ΖΑτΤΑ П/ЛОПАТ 1τ Ο 11 п 1 n тТА .Ά 11*11 ZAZA TAI 1 1 П Л TTA ΖΑ Ο 1τ τΤΑ 1 1 R Ο 1 1 1 > П Ю β Ζΐ П Λ 11 ΓΤ» ya V L/y UpZLVCl V/111 liv/рлу UlkCL Г1С1 XV 111L, UAU yvpu XVV Illg, U1S.111UU4 11 ullc-pcy O'vimi.
Протеините от изобретението могат да бъдат използвани т
I ПА.
П O ZA^O AHn*Rni1O 1 1 r* 1r АХ 7П 1 Al ZA’ 1 TVA n n W* ZA All OTY1 А» K rt /^ΛίχΟΤΤΑ ZA Π TTA A A Zim R «Α TVt r* oa uuvovunuanv na iwmuxivivivmnnaiiia vuvinvivicu vuvinuAHKavniuuHJU, които биха били желателни,Включват следното:
а) За предотвратяване на комплемент- медиираната деструкиия
А ! 1 i3V!A 1Д £! YYYTYQUf*T^ .A £! WI**! *21 ΐτοο r» ton ziwpuii ο л 11 η ι η wo το οιτητο* nn τοο ο ι ττοο ujxu ^ирСлуалС nd Шрапиишпшапша, Πυ~ иПСцишши tkvCnvinparivi£iia.riiiiariiii (материал, тпансплантиран от различни Виаове животни) и по' А - * Λ * W
РПг1!! 11 Л Λ Ι-ΙΓΥ \Л11 1?'Γ*/3*1-2Γ*Τ**ΤΎί212ζ'** * onwo поти /Iro ηοτοοη ηηιΐζοτοίττι mn ii
Слшцишши netUUMWmUMU Λ.ννηνΑΙΑρ<ΧΠνΐΧίΧαΓ11Α1(ϋ11Α1Μ. yjYMyVinw yWTAVpAXUAliV u реципиентните видове са родствено отдалечени). Реиипиентжгби бил разрушен преди операцията и поддържан 8 това състояние?докато трансплантантгтсе акомодира или бъде изместен от по- конкурентен
Oto о Oil р С. САП.
Изходното третиране би могло да бъде осъществено в рамките
1 О па на
1 г» па lIClIz’n.A.lm Л1П1 ПТЛ.^т 1 m pni1 on * ο 11 too Anil rrwo r·. ГТ/лш « n 11 voo o * 11 η το o o wt ’iii oft ο r ι Z3 иллилаи yiiu iipvyu. inpaiivn/iaixiiiaujUZiAAicu ^дициапшшдпи ραορνωαυαην комплемента би било необходимо по Време на криза на отхвърляне
TT3Α Ω11 ίΙΤΠ Ώ1-1ΤΊ-! Π Λ ΡΏΡΏΙ’ίΤ’Τ1 И »</οτ1·ό no ητ nowo от too too wroo ft οτ 111 moo HApariviiiiaiiaiiiaiiiiia- i xv nvnu/iuia xviuzixv ya xjuyain сииишсшисши v/aaa прилагане на анти- хистаминоВи препарати за контрол на отговора на
ArMJlll ft -T 0100401И1П ί 11 O TOTO ftoo/snn*o wo O 1 1 1 1 n\ Iro WO П TOZiOTT 4 TOO o WO ПТОО ииш,и L’UJiKLkLnu/1 ^rianp. иозиуилатацидJ KaixiO pCSjAliicuii GTH регенерирането на СЗа и/ или С 5а.
o отото 1] <» ft o ti PTY1 12n Irni <rn л □» гйПттл а no пт no от inn n αοργ шниапСши па ikoivAii/kvxviviiixici ivimzlxv ya i/uyv v ищи и преимущестВо при използване на изкустбени органи или тъкани (напр.
mto *110*111 o тлх rior* οτιττ 11 n ii οίητοτοο Ron ΟΎ От*д1г\ lrr*o wo η «ο I two i i ft i i to o IjllunUJIlU AVAUlVAVpanU Ala U.OI\VL111U< Γ. VLiVpvKp AkOvlAlO aKilAU-UapU.
комплементната система. Както е описано по- горе, протеинъгможе да ίοο np no ft oil Iro ΙτΤΥΊΓΪ A 1112 £» IfTT! 11 Ri 12 n Aoni/n Лл*м/п rvonnno ftn ft uoyt tjauan xvarxliiv и ипалишиирапа ipvpivia, yvpua ~ vAuyna t_· uu функционално отношение на СЗЬ или в предварително формирана ft Imo 1 1 ft 1 Ί <Ί /’ft 2 ft ZO TO TOO «Ο Ο r* /1» r> TV* r\ 2 loE?lo\ I1 O 1 /ЛЛП WO no ΫΧΠ no WO ОГМ1 л О-Ю1И1
Ц1\11ШиПС1 V. ikk/n L74. plliciact ^ЛСАААЮ /. it lUUGOHl ya Ouyaill И^илаишш
ТО П който и да е начин, при което активната конВертаза може да се
1 г» ТОТО lr U za 11 Г; 111 1 vol ΤΟΎ « ΙΙΤ^ηΐΙΙ Ο WO О / 1 Ί П ТОТО 1111 т ТЛ<п1лЛПЛЛ11П /ТТ тп 1тч *ТОО ППП/Л ' 1 «О ТО \ пай ι υιντκ па и, up η ^лиуаЩаша ^nmip- uiunpuvt’НОЗпм vjuftyiiiunnu и yp. J.
Друга алтернатива би било третиране ex vivo, например чрез
WO TO o 1 1 «О/Лчт TO Ί Ί r? lip linol.OTi 0111ТГТТООО VOWZIO 1 rnrv· onlrn n Imo 11 ft 11 o tv* o ΐΑΑρα.ιινψ> otiTi nd цир^лацидиш npvo ivAUAiipUiku. ηυννιμ аКшисшаша конВертаза. 1о има преимуществото, че позВоляВа отстраняване на ,1 анафилактични пептиди (СЗа и С5а) и други меаиатори на . ''Τ' Ο * dΊ11 ζτx zx ζ* 1 ί 11 ζ* 1τζχ > ж/х а слItt till /х ттчq ·χ л ζχ Iтхтх хтчх /х ιχί <хъ ап х11 t т ο <-χζχτχχ ζχхч ζχ1τ··» ι ζ·» X U UOkkCU^K. пил ill a. V llUVIVU lVlVWlVlVyn.nO HlCcJlW (пинр. лисншшип U αοΟΠΊνη OiVUU ) (примерно при диализа) преди разрушеният кръВен (или плазмен)
Izzx> m λ ο» roil m zx o ^хгт zx o ftrr τχχ Ί o ГГА ZXZXTX om ti a ft tx nil nan rx-x zx ikuiviii/iuivivmn ya vruyv и/ (jpnalH ’Jupamriu D ПациСпшаЬ) За предотвратяване комплемент- медиираното разрушение ,
A 0 ZX Z»TVX ft no no v» 1 TXT TTX ОПП11 ZX T tftrxoilzA zx 1 X Λ U ζχ nniinon TXX Ζ» All Λ11 « ОПОП11 O 1 11 A v-ivyvinvuu па лиру рщичпи y UjJvzLvyarlC. x xa. иациСпши vu OtLi υΠ€1\ΠΗ/ΰ1Ο нарушен комплемента. както по- горе, за предпочитане преди
Oriorxonn ZTTVX O ( Ч X ZX zx Ir zx Л η Ω ZXVXXTZX ZX 11 » ZZX Ζ» · O <4 TV4 ZX ft ZX 3 n rn zxft Zi nrn ΖΧΖΤ1Ί11ΖΧ Z»ZX iik. рацилша ^nv aku v пуиилиуимО vnCy шииа^ u liiOua v осшОЯгшС vC поддържа, докато опасността от допълнително вътрешно увреждане.
ZX Ύ « άΙλ 1 1 ZX Z»Z3 η Ο 1Τ’ ΖΧ U <ΤΧ Λ ΟΧ f ΤΤΧ Г Ο nil <Χ Mill C ζχ ΤΧΧ Ζ» 1.’ Ζ» 1 ΙΟ ζχ /X ZXTVX ΖΧΤΤΧ ΤΧ 0 5111 у и;хл\аицм w гш iwivlix iv ηινηιη- аиии^илш uivljriria ишапа. nv ut νιηνΓηрапи.
с) Довеждане до минимум на комплемент- медиираното rxoi τχτη η η βοηο τχοοτ τ Α τν* ζχ τνχ ζχτχχ no νι ί τχτττχ -χχ ί η χχ zx xxft τχοχχΐ ’/ί ηηο ϋ τχ-1 οοιι ο а ττη ηη paapj- Luauunv, pv 211110.111 иш nv лирураиппи у ир^утчуanv. и niuou V2iy~iau разрушаването на комплемента следва да Ьъде осъществено след » OTrZXZXtl ZXTVX ZX ТтЙгЧОчДо η ) ΙΟ 1_Ί <Ч /4ч <ЧГМ ZX 1ТТХ Ο XI Iromo/TI'TVO ОП ftx ft ollr ΖΧ Ο X Ί Ζ*Ζχ l.’OWl/l UOAUynVlUU V Χ/pVZTvy O-ilV, nv VpVplVLUlllV U iVlVlJLiOy U111V u CL UUULJIiyaiK VCL r*cunv тези, сходни на описаните по- горе. 1ова може да бъде специално
ТХ ГХ1 1 А ΖΑχΙζί 1 V XTZX ΙζΖΧ -X Ζ» ТХХ ZX Йт ’З Z*TXn ПП/лСлЙ Ζ» ч 1 ZSTTX Ζ4 βΙτΑΐζΧΙΐβζι Т’Х Т 1 zr Π«Ί lpUZXWZIVUlWJ'jrVMC.CUliW U иоиШСШии/ШСШСШи URArU4UU pVilVpKpy О U 71 Γ1(1 исхемичната тъкан посредством циркулацията (напр. миокардиална novoiflin ηοχίτντ οβίΊΙΊηΓΪ XI Ο Ο ZJ ΤΧΖΤΧΊΧΧ ΖΤ XX Ζ4ΤΧ \ иилч.й1иа, ujivijj иоиапил, иосарлгшл и ур. ),
d) Довежаане оо минимум на комплемент- меаии паното
- ' ‘ XZ V » ' I η Ζ» TXT Τ111Ζ34Ί41Ζ3 no XT T A TV* Г» TVX 11 η TX43 nlrnnrt rx X im 1 X TXr-X ZI A zx on TYX XX ОД11 IZ ZXXA-TX A OX ton TVX najiyuivnuv, ρνογϊΐιηαιιι па рцапцил anmuuizi/iu’ uninuwri. ivuminvnitniir медиираните отговори на защита са особено нежелани в аВтоимунни
X Ζ» ix ZX A rrC О1П1ГТ TVA ZX А f ZX λΙτό Zx O R 1,,1,,,,13 ZXTXX 4 /X» ГОТХП * Ano жпппхп ааиишхиаццд, гчишии iviv/yi4V уа ищлшпиаш икмлирудигкурипщ, хемолитична анемия, миастения гравис и колаген- индуиирани артрити tXA X 1 ΤΧ IT Τ/Γ r-χ X X XX ΧΧτΧ β Ζ» 1 X £3 m ΖΧ 11Π 1τΖΧΧ ιΓνΧ Λ ΟΧ ГОП TV4 η Ο ΤΧ-» Ζ» ηη Ζ»ΤΥΧ ox ΓΟ ΤΧ ΖΧ ft VXZ3 » Г/X η η 1х«т1хгчхх шип χχ. J ijiLpUL/aiiCiiiu па rw/ivninvivivninnaiiia vuvnitivia nv гричч па гипчиа епизоди от болестта може да смекчи условията.
ζολ n o/xnftnno XX Zx опрппжпппп тхптлпоппо ХГПИЮПН no ГХААОГИАпЙп ххо ν f ν.-uayauanv па νιινμιιψυηηα шшшсаιιπα muiulαα, нлг iiwjaiiinuL>a па.
комплемент- медиирани имунни механизми. 11ри този подход целта е
A ZX не да се използВа супер^актиВната СЗ конВертаза за получаване на генерализирано изчерпване на СЗ, а вместо да се използва конВертазата, локално да се концентрира СЗ конверсията В желаната мишена. Мишената може да бъде патогенен организъм, като бактерия,
Вирус или друг паразит, или Вредна гостоприемникоВа клетка или m'7x1^5113 1гЛ?ТШ md./fflDl1 *3 IrAomlm ’1*P iiii rkpFiviiiTYnii o o Йпгчттл It « Ir o υκαπ, xccuiiv mylvivpna. Клсшки u/iu игирСхсГЛирагю. u uupjt iwxciiixca., vj конВертазата може да бъде локализирана към мишената или чрез
ΛίΤΙζΏΑΙ-ΙΛ 171711 AIIP /l-lil’!7”' нипйСтпл ftn » αλΦιτ/ι ft пгчоплтип
AURcUinU IXpUllVAcCnuC ^ηα.1ίρ. yupvicilinv UriAvCxVLllU.LJCiriC, VULVIV/IcriV L· V|JVya.llia.? която забавя неговото аиспергиране В общата циркулация) или чрез
ПЗППСИЗА U ОДТТ* ° Ат > «ήιιι/чн очча о Al о-п-гч /ч о по ι » лч л 11 »чч ii ги η а гъ Tn It ο xcvivivunupanC v naviiinia. νχη миидспиша, ncuxp. yayvnv апшшидли. ιααα модифицираният протеин може са Ьъое прикрепен към специфичен
«.*> ·* a w г 1 »
11/7Р A Cl^l 111 11111 1г*чгг лгнлпппл oft.-τ пп оппипл.л
U.1V1V пищшиип H.1U приз AULVXUnXTV Л.р UVlllVVCLriV LUUpjUmil II CL ЦПШ1К, или чрез присъединяване на ДнК кодиращите последователности и plf Γ'ΤΊηΡί*!! CT fll 13 *> Avu-hi/htiw л /гш»лта ft патптпл по Т rv(~2 i&uipvvuA xipu nuuiiiuahC ) net срузииппил ирмикип ^ncnip. v слупил net x.t;vj7 или тежката, или леката верига може аа бъае присъединена към СЗ и
A- VZ А-» *. V»
Ϊτζ\__ £>lr nptYp Л11ТЛ A n n o Q ц * ii ii riftprnp Rptimn nn zoo-rvx Irni г^тшплпп ftn »«*чгчо rev vrvuiipCuupa.na v uziu u yvCixiC DCpaau ya uuyam aUiviuuiiupanu uunxpv
В един пълен Фузионен пептид), или чрез инкорпориране на специфични l//4/711Т7П11111 У1ОГ» * arinft qtys o * llAnrvii 1 / ρητιη o 0 rsorinoini »1 0 л <oft 1111»1 z-*ft ηητγ^'
ХСОуирСИЦи llVV/lCyVL/d.lXlV7inVVlIlU^ liaxxp. -3CL livywnu ria xiwv^unw цип участъци) към ДНК от аВата фузионни партньора (напр. модифициран f' ' t-* Jr- А Λ » t V* Ζ X
CT π ηηρί ι iiЛипи пргууп-т π а rviolro itza пл л Ιτζχ -»ο ти гх п и ч<11Сцил|/и niv arxiiiuxiizuiv^ liiaica. nv npvyj xcinu-iiiv rict vtcxipvtuzl, rcvacixnv са в една смес, да се самоасоциират за формиране на стабилни конюгати. Фузионните продукти могат след това да бъдат приложени локално или в общата циркулация.
ПТШГШКГЧ ( Ζ7<Ά11Ί11 *» ii-ry-i 1 т а /ч-г»-»гх nn плЙ»г τνιπι/χητν»τγ\ л и m/in/kinn kunujuinu (ПииСиЦи CinXllUXlLTUkVLLLV ПО. liut·'ирлгюишши v ivxvyиуици|/ип протеин или на повърхността,или Вътре В липозомата) и/ или Вириони /11QT7T7 Imi 1 *·*Τ*··* *VV· · i“* л W* 1 /7*3 α1γ*γ·τΆ<*1**·*Γϊτ’»’·» лтхлтаппи mn no m rrvi ·» 0 rvi ·>
^xxaxip. xvvlivlxipy upa.Hu yd CKupCvUpa.111 iipvnivunuinv na шдлпихии повърхност) могат също да бъдат използвани за съпътстващо доставяне на антитяло и модифициран протеин. Този подход може да
ГИ.ЛР 11 'ЗПГ'. * ^ft OU /11 !Т1аКгТ*1 U/Л <**хж rzxz»vv*zxr»TVi/3 λ nzx ii a 11 ft [х/з* rixini on 11 n z* nmi’in uuyC uoiivz/kouari y LtpCiviiinU, euivivi4_ulU/iiii4>^\nw lulu u КО1У1члиг1ацил v ypyau лечения, при всеки стадий на процеса на заболяване. Особено подходящ ί f) ΠΓΗ1 Λ Ο'ύ/'ΡΙΊΙΙΡ P ΊΩ nn -rxolrzxftii Ъ-a z*tvx1?-ii onrm nn n * 11 ft oa ii|ou/iv/zi\.vnu< v oa vFiiivuip/uiiziuariC na joarvvuu iviic-iiuvu, umiaiicLAU u циркулация след хирургично отстраняване на тумора. Антитялоx fA/111/Ki 11111 τή 1111 τιλλ тгл/зтт αι τ ι ί rxft 11 Ιχ/λιί l/\r»o-mn zirr 111/3 x/Ainm n 0 (37 nnm lvivy UkpUUjUpan U1114, Иришиипиии RUIllUGillim VUU^V» IVlUGUUl yu UULJCLin използвани ex vivo за отстраняване на патогенната тъкан. Например ·-» *1 χτίχι ’RqL10 11 Q 4 F* ft ’’’Ill1 lx- * η»-»-» 1t1 ι n z> * zazx -m zxft 0 Rr\n ni nno 11 η ζχ<-»τν-» ο ι ί ο * ι i wx 0 oa juui/dnu и и /иикСтичпи jxjiv uiivu u ukuy ιυυυα up/uttyanv ria vuiiiaiia/iuuic.
здрави клетки в пациента.
Оогллгтпл ι n iz/kz-xt 1 n rm 1 imo Irpnrmn iiz3 zn ftnonziwx r> rmnnn nn upaiunv, нимуицитиш^, lvuuiuu nu c uuiiuyaiu u iviiiv uiuiia na реципиента^ледва да бъдат елиминирани от костния мозък преди /
▼ή ΓΏΏηη * ° U Ή-» Ώ ’ 111 СТ nUaii rm zxft 0 x ζζχζιΐ 1 ζίχι 111 nonini rr-rvx nnnrrnoni i zi « ozxft ο χκΐ i-'i uiparivibkan.iiiau,uzi. v/cucn uiOuu mwy икрицирешидш ii^vrinv uri vatyua ya ll свърже с антиген, и тази комбинация трябва да бъде използвана както « «λ » ’»’ 1л rm r> Ir ο τι /ii· 1 и, in ί r* no 0 im 0 Irx rft 0 rm 411¼ r zlxzxi 1 nrm 11 ο χιλΤώ » niin nt u»v. шини u c-v uru, oa ya ainanjuam .'ШМ1|/ициши пелхелапи реактивности ктр. срещу трансплантанта или собствената тъкан).
'T inn rm л rm ovij rx л zx и ι rr ^11 ^i ι л η -ГЗ-ГЧ11 a ζχ χΙχί1» ζη -ι ο гт пат пгчппп η η ζιτιτ ’in υώ,αιιια нклпилисил ии ишш. lipujkozix.uivia. act uijJ4_iiiuparic. пи ypyuu видове, с помощта както на човешки модифицирани производни на ппп-т/зпппто mnlrn τι по тл/геллгттп по тти βιΐΓΐζ\βο ппо ♦ ζχ-ιιι lip/MUlV UI1U11K , UlCLrVCX и ilex имуллаулици ОП 1114. OU UUtJUUV cmCLlUOU.
Предпочитани характеристики на всеки аспект на настоящото пп/зкзпоттрппа in lr η ϊζτν»zx »η β πηίχη Лтхт’’'' nnmolxrm иоиирсшСпич. ea naiuiiu oa ulvru ypyc, aciiviviii /utuunui.
Изобретението ще бъде описано посредством следващите птлпх rzarxii lr zx 11 rx-i r\ z»o п/кг»гчх rann vxzx nnnnn lrzxiirvtzx ζχ n ’in in ζΜ»«ιηιηηιηβη iip»uivivjpu, KUuuivr ua MKpMpivivnu nv ndviun, кииши yu 114. gu ucpanunaua.
Примерите са съпътствани от чертежите, в които:
/ΪΛτ i it m 0 1 · rnnlr ητ»β л nmann/з а пзпо* * o m г» οζιΠ4οη/ιβ<ι m /,1 4 n/л itm η n
Mzuaypa x. никизиа iipuyiiV/AtiaaCiviuiiia iiuv/it yοι_?αιιΐ4.ϊΐι iwin iiu протеина на човешки СЗ.както е копиран в РСЗ:
I П/Х* «гхч ii rvx ο Ό «1 z^-rvx пп-п т» ο ο т ч ζχ£»τ rlr-ft ίΐι ί о ц гни ζχίτιι *1111/311 lrzx ζι \ пиГииЩша nd uiiianyapiiinuzi vynvivy iwvii uiwununuu.aunvη киу;
Фигура 2: показва сДНК последователността в РСЗ;
(с помощта на стандартния едноуквен дезоксинуклеиноВ код за смислената Верига, изписана 5’ - 3’).
фигура 3. показва визуализацията на модифицирани протеини от изобретението.
фигура 4. показВа въздействието на различни мутации Върху
Ц pH кП11ТПЛ1 11 ''Ъ алогиft η гн Λ v/v 1 QO»1*11 А **ΓΥ 1 *2ΟГЛ п г» /4ч п zw» Т ^OUVLUIYU VJ, IkUuiilM U.OlVlA.^lllUa.111 «ГХХ£ X_>W~» U-'IU A15 l-’i-U OU. 4p<xKxilO|J I “ опосредствано разграждане в тези места.
N. b.
X.
ί Г111Лт1ПтР>ТТЧ1 ’’’ДГ1 г\о*г-т->лип
UUMtlinillCiliLinilU O<7XZ1^CU1<X HpUUU.
2. Реакции, осъществени при нормална йонна сила, *2 ΪΛ» rtrn/xrir\ainir»UT¥Mir\niili /τ ηπτνιιι i'xiviy пинрициииширапи и илИш*· л^.^·
4. SUS- PAGE при редукционни условия.
A ft TV Г» ZTT1 ΖΧ ΤτΛ ο /Till ΓΤ • z^uiiivpay иморолрил.
ΤΊ Γ\Ιτ Ω Q R *2 г^лЛттттюц 0 тгптлн τ 111 ftz\z»*vi it r* Ii/xftonilrnn ^**2 on kjZUCJ'pCX w/. LlVrkUOL/CL LlUUUlUyilil yXlllVUn llUULHl ΓΙΟ. ’IVUCLUlkUJl V_-^’ JU инкорпориращ Arg 1303 - > Gin 1303 мутация срещу инактивация от фигура 6. показва анализ на разграждането на СЗ конВертаза, » птттлл * Г> ПТМ 1 Г1Н1 ζγχίχτ 1 * 1111 11 11 ΛΙΠΤΥ» Π τντ Τ 1111 ί I t Λ 11 /XV f Fbl\ nijxxiuptvkcx ιψυ axvLuixkr ivwAAunhu ииПахххици / ~ /~'-г u ι 0 ~ t ov.
1ова е снимка на Westwrn blot, получен от /. 5% полиакриламид p А /Ь 1— ί ηηΖΎΤΠΙ linnillll TTAjrxftnn) Ζ» Λ Λ XT хЗ Д з1хгп Ю/Л /4\Z4-r4OTVT 1 11 Т <011 тглпппжлл ui/yr х-z-vvJx^ рСуу циро-СЦи jv/xvuunj, uiCy Vi'k<rvixipG\pv*|>vuiu*iCri £?
Върху нитроцелулоза, сондиран c бВче антш-чоВешко СЗ антитяло, и
ΡΛΡΖΊ Rt ft’ ζ» /τιίτντιι zxftiixa т ηηΐ/το * лпт? » 1 in nRn
Ux'iCy uuoykuuitluut v tikpuikCuy aohu UiiiiiU“ vu *xv uxviy riWGJMJM^iiurivruM антитяло и повишена хемилуминесценция ( метоа и реагенти за ν · » Д.
детекция от Amercham, UK) върху радиоактивен филм. Реакциите на разграждане и методиката на откриване се провеждат?както е описано в Пример 4, илюстрирано с резултатите на фигура 3.
Ивици 1-4: див тип СЗ (експресиран в COS клетки )
Ивици 5-8: Мутант СЗ (остатъци 7з2 - 754, изменени
СЙу и остатъци 72)8- 760, които освен това са изменени go lily- Ser- Gly ) /plrcnnannrt n и ft ^CiwiiUwlipcxn v lx 4 OTVllxil \ ivivilllkuy
T/Tfti Hili 1 X· rxzarv Aoocftmio пиици X, J. UtJ уиииьЛПк
Ивици 2, 6: + CVFBb
Ивици 3, 7: 4 фактори Μ 4 I
Ивици 4, 8: 4 CVFBb + фактор Η + I
Ивиците, обозачени със стрелки:
А: СЗ алфа- верига
В: СЗ алфа - верига
т V,. Ronmn OC111CL UVJJUC..C1
D: 68 kDa продукт на разграждане на СЗ алфа’- верига
Е: Т-гуюч1х1хо Ronnnn XgVJ ΙίΐνΛΧΛΟ. l/V^UGU
Фигура 7: показва анализ на разграждането на радиоактивно белязан фактор В с фактор D, в присъствието на див тип и ι η η тп и то пп / V\ xvAj'xiia.nixxuixiv ηα ο
Показана е снимка на авторадиографията на SDS- PAGE гел. Всички проби съдържат фактор D и 12? I- белязан фактор В, и се инкубират за 3 часа при 37 С.
Пробите В номерираните иВици ВключВат също:
LJt rzTkZat'X /3 ο X Г oil
X. UJAptp UCtlVl Пи ЧЧМЧ LU
2. 1/125 guB тип C3
3. 1/ 25 див тип C3
4. 1/ 5 guB тип C3 s
-J· · '' 0 ч » AArrv» οίтт /Ό t z\*хг»-»/т ри 1 /10*7 /Il1/101 Λ f ν» -»i 1/100 /Ό1τ-»\ X/ 1V1 v 111СХ11111 4^.7 y UUli 0-111 и Ц U XT 7- / 4J11L, XTJ1 mp U l-ru.7 МШ/
6. 1/5 мутант C3 τι or\r* ΊίχαΠΡ17 iirimonm nipaopvych liicinui
ZXk’X/X.'X 11 η nann ГНГТ f* ЛПЛ VO А 1гл <* O · иииогшшгш νυν стринката.
А. Неразграден 12?1- белязан фактор В (93 kJJa) n АП Ш,, ΤΧΤΧΖΧ/ΊΧΐΙττν^ ИП VX Г» V «χτΑ Γί xi Г ΖΧ Λ 1 1 Ζ3 /«W’\ х/. \j\j rvLzd. iipOyyiviii па. разсро/луит uu j
C. 33 kDa продукт на разграждане (Ba)
Фигура 8. показва изслеаване на SLXS- PACrfc, илюстриращо — * А W < · ж W1 ATI Т*«п И ат А 11 О 1г АХ 111 ZX, Ά Г» т » Z43xlrZTTT /'Οι 11 ТгхИО ψνρινιαραηνιιιν ha rwriivaaui ivivJaxyj ч^^1 и х^хи.
I оВа е оцветяВане с багрило Coomassi на 4% акриламиаен SDSР А /~ЗТТ '343 a wn по_уУ\апутп 11 ν η η ί п lOAnftnn U/xi ίο νη ν л п пта .Av ctn, при пч·** рч у у ц и раси, и уч^кмиил. ί хотч р и par 1 U111V ιιβίΜΗΐ т т v\1.»riv) ииици ииуирлчаш npobu на:
1. POP- IgG
2. C3i
Q α.
ΡΤΛΡ
A JLZ1 “
Cl Г» OTWO A Ixil VUL СШрМАЛи oo mti niionn * чи voiianvnu.
А. Вероятен C3i- Ig(j конюгат (350 kDa) i? m: zonn i-n.ji
17- 471 y.XAJV ViALSO.}
C. IgG (150 kDa)
1 ОТ 7ТХ А о млиоУри s · τχζχΐτ Ο Ο β О nvrivao и a,
О lr Л1 Ί 1/X
A lr ZX3 3 1/X A A rA 11 3 3 TVX o » <3 111 1 £> 1 11 1 1 1 Л^^х 1/АП ft A Am η Ί η 1 1 nt Ruiuvcaiiiiiuniv Мишсппи \~u липисршаопи активности срещу овчи еритроцити.
/Топи ЗА у» Ял 1 1 It А АаРнпЙп AAAIIOlimn 11 A 4 1 1 A 1 1 VX A t 3 1 1 ma Ζ\β)111 £> Al 1 m AA1 1 1 mil 1 K ι ази cpayuiva hurciouci нрицлпша пи лиоирапишс иичи v pun 1рми,иши след покриване с разтвор или на C3i- IgG конюгат, PUP- IgG или C3i.
TXZ4A * Ο. ΖΧ β A 3 3 ZX Am AAAI Alft Olla 301 Ю Al 1 А Л 1 1 Xi 1 3 A lr Al 3 β ΖΛ Am A A 1 1 nuu'ivyuanu vui npuiuuualK, uvnvpupanv na rvunc/v piuaj u фактори Н и ίλ и накрая предизвикване нализис с NGPS в CkD/ EDTA.
I* n l,Tm zx z2j z\aii nnn α β n zam o /хз 1 m а Л4 oxrzx lr aiiIaih mB’T’^AO ηι Ι·ιβι iMG, * it χ 11 a ivarviiiv/ C uiiuvanu u мсшиуишС. ^ cuvivj л.мп1исан1стирсуилиилии aujuv.
лизис е в зависимост от дозата).
T\ziAlll:mil nm n I 3 η Λ om 1 1 1 1 1/£1АЛААП v-купипк сшапуирпши ivivinv/yu n zx· U ’3 ппапа л опп л
Прч- у Са IV Г1 U71
AO AA) 1 ί /»31’11» <11 > » ли. прилиллими li U1V1 примери.
A 1 Г ZX
DUU4KU ivv/ivinv/Hv ίίίίίΐί Hci KviuFiAcmvHina,
А А за описанието,са с човешки произхоо. ооколкото оруго не е посочено.
V/ - С' 17 I ,
11AA * xft nut’ll A AX A 1 3 УТ A Am 1 3 A TV» a ΑΧ ΖI 1 1 1 A * A m 1/Т A A ftnillllru TX V» Am mil'll 11 иопилоиаиаи ишапуapnnia шсрмипилиаия за Mtunixu lyviiituiiu u получените от тях фрагменти (напр. както са включени в nuiiiv-painypvn из n-nVAnnl· Γί >Ί\ Г> U3111V/'1UIX [iDjj. ' .— aaat tnanna maAiriim m ''i^^x''' лд nmitnnn aa хз y v/ii u/xnvnuv шсрминиш vu w umriavn yu която и да е молекулна форма на СЗ без интактна тиолестерна връзка.
3 ζχ ΠΓΜ1 3 3 А Q А ПА * 11 АППт 11 АП βΤ AVT’ А * Ях A RilAllI'l т А пи при нилу ппиапл пи v_^/a пилиш. шииуa г/ирлл шири илрисшит.
Човешката С.З сДНК и кодиращата последователност са
ПАН АЛ All А η 1 Ί 1 > 1? Ο 1 v TV» Уч ΖΧ V» УЧ 1 7 0-0 А 11 УХ 1 3 А Zh 1 1 ОТ 7VX A A A Al f All I TV» A 11 nwiviv pupanu^rcaikinv ν ιιυιναααην na ч/исури v иимиицши n използвано в EMBL нуклеотидните база данни (получени от лит.
\ ϊ Γζχΐτ A A A 1 » A TV» A W/X A Λ А /X /X β A m А Λ 11 A A TV» nmaoanaina i jv/vz'xv у ми an i canuini τν» a χ 11 zx m »» niil а m a v шили mau иаишша структура (ЧЧ 3 ). на която липсват първите ί ί нуклеотида на 5’
3 iX TV» A » » 3 3 A A 1 1 АП 1 11 1 Л ι iv транслирания.
А Рт ΖΧ ixaixn iv/
Ο Аа1т * А ζχβ 071 v уv/ivziayиап доколкото първата база е с номер 12. Вероятният иницииращ кодон β 1 ” Λ 1 ΖΧ 1 ·» β А
L-UV. XIV/ AL7CL
111Έ » А ПЛЧГЛГЧП А Ί
11J CJlllUy U111V V UMlVlC J3LX V Г
Zx 1TA AA113 W> AO n » «1П1 A V»X Д А» <1111 H > Ϊ111Π ми, лмумпши a a amunu“ терминалния серинов остатък от бета- веригата е на нуклеотиди 12/- 129. и
A A коаонът за амино- терминалния сериноВ остатък на алфа- Веригата е *·* л Д А А η о * рЛГГМ] Л11 /11//1 па п^КЛСишиуи хЛ//т— Ζν / 0.
Протеиновата последователност е номерирана съгласно
ППрЬл/ПРППН ΩΠΊ Ω ‘ ΛΡ.Ρ.Ρ 1 ПР..ЛГИ Imlryvxzx a nnlronnnn nn ПАпттп 1 Ьлпгнп liyvnjrpcMpnaiiia ииииуииат^шисш, narJUu v liursdocina no. kpuGV jja x, Кмлшм е предсказана транслация на ДНК послеаоВателността в Приложение 1 Д. А А ί /нпл Длт ί <»Л » mill 1 Ο О zxiizslrftr* /-in ftlr A Innft a m пп »-»ч in * x i n ^aiviunM пии-липи X“ z-z- l\ unaivua ya игСкЮЧиаш ииспалпи последователност, която е отстранена по време на биосинтезата, и
ОХЛЦНА 1Г’ . A 1 111 11 Z41] Г» l/-ft n nn Г)ПГГ\ ПГПЛтХЗтА n n O11»1 йлллтпп атипм л.и.ьишпи uuu м / x w мпалма ya ииуаш мшихирапспи^лмоишм npekypcopw е разграден на алфа и бета вериги).
α о ft ο 111 т ' γνχ о Τ'θ_ /ю m Ьтчптлпп ппплпаппгт ni/nm r\n nrvxQorvn/s м/куиаицишк пм- yu.k илрошспи мопаί\_ пил uivillui k иишис ιιιπυ следният смисъл: CVl·- фактор от отрова на кобра; ELISA, ензимноΩ13 Ω 11К -ЛЕТЦ/ч Ω Π^ΑτίΑΐι11 απιί n τχνχζχίζζ·»· nnh ТД r< zn b» rs *-ι olxi o zszxK · V lx b n л nn η-i n · cL· υροαπα aiviyrivajLupuu,uurina ιψυυα, x__r. wn, jl^ouiimi ινιιια v-мп, ivlz, лилк/иази.
HS V-1, вирус херпес симплакс тип 1; PBS, фосфатно буфериран
VS ri Γχτνχ me. 1 сл lr AOis-н ιιηιη JiniiiH пЛаТПЮпа ОТ*-» s ζ η ί» * η τη nlrn ίχη inrsAiini pcXOUlL/Mp. ΜΜΟ X 4. IkiLlllUina липил, 1ΐυΛ\Τ4ΠαυΐΠ IVKXUiViy riL-IVU vuvpv'im клетки. По- долу са посочени рестрикиионни ендонуклеази:- AfllL Dial,
ΤΟνηΤΟΤ ΐ7/χζχΐ?Т ТТооЮЛЛ Т-Тпгх/ЧТТТ МоЛ КТЦлТ LZiaxxl, ЕЬимхчх, oajia v , niiiuiu, navi, INIlcl, z\Dal.
/^TVSAllnATSTYSnil x/zswnmi
K_zHianya.piiinu ivitmuyu
В литературната справка могат да бъдат намерени методи за
ATV» Α11/Ί AZSTSS1111 X f η * Ζΐΐνττ 4 nvsi 111 XXI1 ΖΧ * ΖΧ·Χ11111111 rsrsnil Л/TTTTSl 1 lx П m /~Ч 1 1 <1 ζχ All VS nilll 1 1 η vniany apnlHu ivjiv^kkxvjiMipnu uuu.iucunnu прмцСу^ри ΚαΓιι 0 иоилирапС ria плазма, електрофореза Върху агарозен гел и ДНК свързвания [211.
I I ftnniin Uotsi Ω bl EJTTZ a -» · <x AT ?β η 11 <s zs rs/sx <ητ 11 rvs n nn Irii ws o nlrft nn n -s ’ i /_«,имипм мкрилкпа ^Цл xxv k l uuiauvuana k нимищша па лиша v ллххпаап
Версия 2. 0, доставен от United Nates Bioc hemicals. Експресията на СЗ
PP ’ 1 ’‘K.iO'Txft ° U ·~» I—» T T<? Λ ΏΤΊΛΡ.Ω Γ* **Ω* /ппί m ο ιιη vs * n zswx w m n/sftn n апппIrii uoivLvyva *1рмл ncuii. ιψυυα v nvivxvu^Iiia па imiLiiiiviaLULu напиики, предварително покрити с афинитетно пречистен оВчи анти- човешки /^*2 lr-'T х< Е 1 Ο θ'0 *7 zx vx о ft γί т ΠΤ\Ω!311 ГУТП 1/Ат 4 л пп ттпапп nrv ап-ш r, тлчап jyuivi л.ииши ll уииаилш приии Mill ivjikiii^pa па vyПкрпашшииа. ννυρυαπ
СЗ се открива с моноклонално плъше антитяло срешу СЗ, конюгирало
Z4Z4 към алкална фосфатаза, и хромогенен субстрат, р- нитрофенол
Ж/чо а тхх 1 Г νχζχίχι ί τχχ сл lr· а * и х тх а τνχ а ·ηη£Ηΐιι a wx an х х zxft rsι х х Ιτχ х rx д αα>.<λ»χ t|sovt|scxiu· прммишС vt Кадиирираш c uptiuunvn чииишли плиомеп e-u
Методите за пречистване на комплементните протеини и (. V1,
използвани в анализа, могат да бъдат установени в литературната номер
Е1,Й„Й Ο 1 ДИ ТЮ 1 Ί 1 X АД А ПОП ТЮ 11 К X А ТЮ ηπ 1X1 А» ΖΧ А АТ А» А тю. X_zIYU uua. тип и рлис<гшш мисаш ишци у и 47 uya.il!
закупени от Sisma Chemical conwanv LTL).
v to- 1 »
СЗ сДНК кодираща последователност гт...т ζ,ηυν lr ZX П11 IA A 1 1 ) A TXZ\AAZXZXZxftA ТЮ ο Λ 1 X ГЧПТЮ A ΙτΖΧΧ X ПтЮ Т*МГТТ 1 *—- А Τ X А ι xa.uu.ci.iiia. cj сдх,х ххс лиуирси-ис- nuuR-yvvaiucuiuvm < iwiiciiipy upana om два сегмента, изолирани от случайно праймирана човешка
ПДЮПААГЧААП п A I I Х-ТЪ'^' АИ А * п АТЮ ah О ПЛПДИП ΖΧτ-ΖΧ Q 1 1 IttVX ГЧТА А ТХ^~3-Т27ДХ4 /РгАТЮДГТ . . черпоур/мс1гю. сДдхххх. иии;шишикс~ nuttna сян иикшири. p/cix^ivi-r ух ιυπκρα;.
Пет олигодезоксинуклеотиаа, съответстващи на известен сегмент /\ТЮ П ZxftoTTlIz А TVA А ϊτ-ZXZXXlTXAltt A ТХ ZX А 4 Д ллй Н ТЮ Л « п ZX A*VX A a АД A ail'n ТЮ ТХ <Х νηιι Ίυυνuxrvaxiia. rucry ириица циии уuociiiie.knUciii, сс vcjiczreani nv радиоактивен начин с Г4 полинуклеотид киназа и [у - 3:Р1 АТф и се използват за сондиране на филтрирани трансфери на библиотеката от агаоозните панички. Изолипат се оКа клона, съоъпжаши инаьпти от
Ik.' ' xJ X 1 _____,v< . ~ Л KU ТЬ.~-------------TV,и . нриилизишслпи ч κυ. а <1г>сраткуа.пс с ридлирикциигши. cnyvnyiwkcaiu, хибридизация със специфични олигодезосинуклеотидни сонди и частичен ,.„VQ_____..._________________--.... ------------- /«А 17»\ Q1..1---Q,C U„„„ есмлнциипсп аполил 11Ол.<ииаш, чс cyan иш шлл ( ζχ,ια ) шииинм υ - крал от 5. 1 kb инбоомаиия. оокато сюлгият (“В44”) се ппостипа по 3 - коая.
Xi ' ' XJ kJ 1 , ’ L L K-f Λ
Тези инс^рти поради това се прбпокриват от приблизително 3 kb, включително уникален EcoRl място на рестрикиионен ензим.
τ т.,„1,~.. -и__Q-----ί ’--------- ί. .... л 1 ί ____а„ ~ г....пт .. хти ,т ..
ί ic икимшслшиийгшлш а учаиноь ηα а ία сс срл-зиа с l^cwivi и ххпсх, и Сс замества с пълен сегмент, изолиран от В44 чрез разграждане с EcoRl и Xbai.. Двете части се пречистват с гел електрофореза върху агароза с ниска точка на топене ппеаи свързване заеано с 14 ДНК лигаза за * V# * VZ получаване на вектор (“PGC3”),съдържаш, 5.
целия СЗ прекурсорен протеин.
А I 113 lr<3rMJ 1Ί ПАА 4 DaR Г| TV» o A 11 АЛТИ 11 ЛПГЧП» ГГЧ kUniVCpnU liw/ivyUaillCxknOcillU U ClipziAVlO
I bh и Ο I I I.T V О а па /ца aav, icviy ираи^а
ЬлАпгчтппгт ττηηπτνι,ι b аиуиращил j ~iauin ил съдържа два А1 (3, които са потенциално фалшиви места за начало на
ΤΥΪΤ.5ΪV?Γ* A Oil 11 CI ! I ПТ\О /111 TDaR. Ω TY2P z»o zxw owvxonrrft o wi птхап v» * nni rn Alз o трапслацил. Aiupayu ιιιυυα iaac w инп.1ир(1плиаш npvo li/iaoAviuLyria мутагенеза, както е описано в метода на Пример 1, с помощта на
Ιΐνΐ^ΛΡΓϊΓΠΗ Л РТ - Д Ί ЬпААПППЛАЛААПЛАпНа/’ AAt αΜααΙά илисиуcowikcu-iij rciic vinuy а cnxc кисщиси.
tgtccctctg t), което делетира приблизително ?>0 двойки бази на линкер/
Q/Ί Ώ ΤΊΤΥΊ/ΎΤΊ14 Ώ ΤΤΤ~ΤϊίΓ 1 > ΩΧ ГО12/*1Д ’ 1 ° зз п ('Ъ- Ιχααιάηιιι птп v»z»r» a oaaR ο w о а п г> '>т ayaniiivrpna /д,ааГс, исз UDixicncnuc па лллуирспцаша нисУксуииапклпиеш.
Гози мутирал вектор, /. / кЬ,съдържаш 3. 1 kb от СЗ сДНК последователността пл1ос 2. 6 кв на последователността от PGEM4 вектора (Promega) се отнася като РСЗ.
·* bn/Ί 11*>*111111 QTY·*) YtU Ω aw.t b аги T)/L/r~ν*οο»«Ίΐηο o i з ο -m · ΊΑ a7 ο * o ax xft a Киуирисцили! утасшил 0111 a iLiaoiviuyu v παπυΛΓίυ сиитср.ч:
и показва само четири различия от публикуваната по- рано човешка СЗ
Ζ» А ΧΛ Λ \ <A i I Ub ПАП « O AaQ O w 0*11 АПТП Γ 1 ( O CjZJjAAAV llOc; AVy VFU O.U1C. ATI Wil 1 [2-J.
(ί) измененията С2481 - >U и С2805 - > 1 не променят к-АГС’ ГЧ · гсоу ирапс liio.
(ii) ΤΊΟΟί - >C кодира описаната no- рано HAV 4-1- (Аевцин 314 X. ГГ ΤΧΛΛΙΙΐό ИА4ИК ГГЧГчЛч!! О А rxvw т ΓΊΛ1· ii при/шп^ liwikUivAopipiia vpvpAvia и (iii) G2716 - >A kooupa Валин 886 - > Изолевиин, който не не ' ' ν' X
ГХГчЬ A Ί <1R Π1Ί ТЧГЧ ТЧ O 1 1 Z\ ft 11 /xftoillbll '2 X Я O Ь А Γ» T1 O m r\ O 13 0» Γ01001 3 ft W 0 0 3 1 TX AX 11’1’1 (~\ y k7f\7kU.y υαπ 1Ю~ punu L7 4UUC UUJtkU MUEdp Ilk y<A V riClAVlCjZC 11 L’ 111O.JU 11VC> LI Li, Liz!
в миши и плъши СЗ.
пълна сигнална последователност и следва, поради това, да кодира
Дчзmlrillizill О л 013 vpj' ПКЦииПШккП \_/U.
гч^
С помощта на ELISA са установени нива αο 1. 7 ие/ ml ексоесипат • ζ о · ио ιι див тип СЗ 8 културални супернатанти на COS-1 клетки (тоансФектиоани с помошта на липо<Ьектамин и осДНКЗ (Invitroeen)
X X X X X L 1 \' —_____________β„1.™--\ — 1,.„ —1„, „„---,____... „ „„ГГТТТГ? О..1----cisviipccuuncn ucmiivpp kzni идсшли, Шапскрсгинирапи и риДилчи ииипир, самостоятелно са пооомииоани нива на СЗ. които тоуоно могат оа
Or ' 1 ' ί . <Jο voydin yCinaHwucnu. uu- nauidniDb, апализош па скищлеиралил приууми c помошта на neakuuu на оазгпажоане. послеавано от • 1 ’ X £ О 'О ____________„ СГЛС η Л СГ..........it . „_______^Ι,.,.,β..
им^пиирсципишацил, jvj- ι civji- и илцпиилицшпс ηΟκαόυα, nc.
(П пъпвичният nDoavkm на тоанслаиия е кооектно поепаботен в у / д t 1 · 111 зряла уиум)срцЖпа ψυρχνια,.
(ii) този nnoovkm може, като птюоания СЗ. аа бъае оазгпааен ао
X / 1 XX,.· ,.· X X хν’ „„ У·? -------- in’rDUi. ,,
v..;u Ош κ,Ο л.иппсршххаа (V ’ ί ии/, и (iii) експоесиоаният поотеин. като ппиооаният СЗ. може оа не
X , X X 1 . 11,, 'XX ____________„ Т Г „ . 1,., Т ---- __С, г__________..... „ .-иоус рааораусп с ψαΛ,ιηνρ и iioivc 1, пи muzli ya woyv paaapaytn uity ппевоъшане ao СЗЬ c СЗ конвеотазен ензим, кова потвъожсава. че 11'0 1JO' , л _____ -ч . ,,,,, , ------- Q ,1-,.
пашилГП u.jAuycn iinaaiviuy милс ya ut>yc шрппслирсш udu у_упкциина.ип
СЗ.
O„ „ . ____---------0,...,. .,, ,1,„______ ,, „1,----------Γ’Ί ja a/uiitpnaniuunu uuuvuanc na cmpyxuiypaina u CKvnpvuunuia na v ,· коаиоаша послеоователност. вижлит. споавка 1251.
ο ι · ο · χ t j
ПРИМЕР 1. Иооогиипане на СЗ. който има аогининови остатъии
----- £0.1 ' 1 при двеше факшор I месшн на разграждане (аминожиселинни позиции
1303 и 1320), превърнати в глутаминови остатъии за предотврхзтяване ______„.1----. .... С?1. Л.-----------„ Д.,. 1.____ г pa^apaznyantniu na U.>u ypaaivicnina с ψαινιηνρ ι.
К4---------- —
a) lviyinaacncauc
Използваните мутагенни олигонуклеотиди са UR11 ( с a a с t g с с
С CL
Гг &
н *ч π <» лг гу 4 <* н «ч гт г» f- н о л л \ ccaaagctccaagaicacc
ΓΥΡΤΟ ( /4 4 Π X» O *4 + H cxx^caaxc aagagaccaag), AFL4149 (taataaaticgacctta г» г» а а π \ r» mnlra x»rr |пл n r».T A.mRomnnma o o* m ο * λι ί ι ί a » n OAiitrlr «алтп ап a cj, a шала ъиици u vuuiiiuviixnuiiK м^оълши\\.1ш илиъипХ iviCuinuy u
OKlln (ggtgatcttggagctttggctgggcagttg), UK12n (c i t g g 1 c 1
ΓΥΤ? T4 η ΓΥΡ T 1 гч anon пжппп Anm Чпчп u ч/xvx хи спСцщрицирахи a a » ra am R a n am λ n «-> пгчтпппч a «ί oaxviwniuanc him па арсипип oa глутамин в мястото на разграждане на фактор 1 при аминожиселинен лат «ч mn Ιζ ”1 2 A 2 ft Γ~^2 тчтчлТхх талт ί лт г» пла a о a aR а-т а » п л аххч 1 1» ло ·4 п а» /ап аш ία мсшахпмА i.'uj и xipc aj-рсирпаша пиииуиианА-Ашисих lnp^o uoivicnc huu на G3968C3969 до АА в сДНК последователността) и GR12 и ОК 12 а /4ч a Ir τν» «ч ii a an tn Arvt /ч ·4 «ч ч /алт ft ο π a ft χ г гг ат лт гч ι1 о тч ο ά пл пйгла» ta ι ·» <ч .·4χ ο lx χ»ι г\гл ο cvpcAiiia. гха смсЦмшм oa.ivxwniuci.ric и xvizic-ixiMinv па раоаратАу αιιν па ψαΑίιΐΜρα при аминожиселинни остатъци 1320 (чрез изменение на нуклеотид
П/1А1 Ω аа Л \
Vl-n/17 yv JAhL4i49 и AFL4149n включват място на разграждане за па ат гч»1Ιχιί плпп г» т ο οπ t а г» η Л-ЯТТ „„I.
ешуинцииппаша inyunjf iviivcioo. .'iiui lijju иизицил последователността (чрез изменение на С4149 в j Ьез промяна на
1галп тч an η т /ч aim ν» i aa * ni in п па а а <ч rxft ο m η · 11 лат
Аму upon an i а амипкгкиъъаигша nvcxivy ииашллписш.
използват като маркери, позволяващи успешния мутагенезис да оъде п п aR pi 1 1ΊΟ /-» Ά о т г» пп Г\ Н 1 ПГ\ п ’I » А а Т 1 a na TTUTT ТЧ ГЧАА1’1гтП ПТЧО-Ч Л ЯН у uiiiGLnvL/Cn na. маоапха na paoapazAy one ηα /α,χχχν lipuyvivnia npco ^ xnxx*
Мутагенезата се осъществява с помощта на метода на “празния тч а ааи rn <ч'f I O Ir дътгчт m лт /** T \ λλλ π o гч-ч an ii a τ утм ι η 1111 ft lviaoxviay . x xclavui Mill Mill x mVu y vx \jvj у, имисаикн najpuyun l· мястото на тимидина, се изготвя чрез култивиране на щам на Е. сок
ГТ727 Q ---------Q„xx А OC ~ . __~ „
V’jxjuu u npUv&uiiuuc nd u. x.-? nix ypuyun. unu iL\aoxviuy uc раог.рал4уа cSmal и 7. 2 kb P4JS1”) от nDoavkma се поечиства на агаоозен гел за \ / X <Jr X X _________/.Q.,, - ,,-. A Z RL r_---Г? — . -------viiiunpannuaric nd u. j au ψρα^χ\ιυηιιχα vin k^<.· ниикуиианклпиишпа (остатъци 1463- 194/). Другият компонент от празния плазмид /‘•гчкгот η/ΛΑΤηΐηβη ппрп рп η 'ΊΤΛ л Ол/л η η Д η ο ~ ΤΛ.-,. ΤΓΐ Μ η ΔΛ Τ »4 ( LSL4.L. ) W HUaVTUUU *ψυθ £30.0 Ο ClJivy ЦПУ I1C1 X U L-Zl C1XXX 11A1VJC 1 UV X U пречистване на 5. 1 частица двукратно чрез електрофореза на агарозен . ПЛА ~~ Г\МТ---- ~--CAA ТК1 Q СА . .1 ТТ п аса. ζΛ/υ ng сс viviccua с приилизитсЛНи ng с\п u ου ui ιΐπν/, нагпява се αο 100 С и се охлажаа бавно оо постигане на темпепатупи,
АчЗ и/ kJ kJ £ . 17 no- ниски urn o0° C, преди да се yuunudiani 20 μΐ до 2.'> μΐ от буфера ?ХТ7 /100 тМ Tris/ Hcl/ пН 7. 4/14 тМ МрСТ ?.тМ пптиотпеитол и
...... ' 1 - ---- ----О ··-- >----- О ‘ ' - 1 - >
__ X X____ А ГГГП Λ А Τ^ΤΊ Д/^ТП J Ί Ч ·η ., J Г”·'ПГП \ . 1 „ _ _ ~ 1 А ____1С ’
1111VJL U111 2Ύ1Γ, CLM. 1 Г , UV 1Г? U1 1Г U C1VJ 1 Г I ПЛЮС 11U 1U ШИШ ШИ J · (ЬосФопилипан мутагенен ппяймеп ( еонятя пеякиия използва CYRI1
I ' * Т Г ------I ----- __г _ ± \ 1 “’ /-¾т тп .. . щ _ л r-т -ί лл ----------------ί-............. .. /~\тп т -> пп тт . ... ί плюс лккьхчу, уругаша реакция иаполаиа mivii, мги.^11 плюс
A FI 4149п), Смесите се нягявят отново но 70“ С за 5 минути н се ___ _ _1______ ,*.О___/___D----- ---- А Г А......'·. _ _ -ΊΛΟ Т~Г____ ПО _ <Т . Ω______ охлаждаш иаини ( тюисчс шн ου · ии мин) ди ν. при υ ν сс уииаияш по
Г\
1U еоншпт от Т/ ПНК полпмепязя плюс 80 естншш Т4 ИНК лпгязя.
• · ----- “ Г ' 1 - ------ - ' - · '.....
Сместа (общ обем 50 μΐ) се инкубира най- напред на 0°С за 5 минути, глрп mnRn ря стяймя трмпрпятгпя чя S icnipvmn п ня1гпяя ря 37° ί -зя Ч ~---~------------------х----------/Г”·----~ -------. ----~ часа. 1 μΐ от всяка смес се използва за трансформиране на 100 μΐ сгперкомпетентни XL1 Е. coli (Sti'ittagcn-e) съобразно инструкциите ι производителя.
VcmniiunRn иа ямпшшлпи Ъпаоипп op rlrnnunnarn zl/71Т разграждане и успешните мутанти се култивират в 100 ml култура, от която са изолирани и съгласувани плазмидите (с помощта на секвениращ праймер СЗра- 3876. с 11 с a i g g i g 1i c c a a g c: c i, който г-.Нпапп г ииклрлтппптр 3RQS иа С'3 рТТТ-ПА τι пуппйктпАптппяпр m мутации в местата на разграждане на фактор I.
За мутагенезис no методиката ипразен плазмид” виж л.ит справка [26, 27].
Ь) Трансфер на мутантна ДНК за еукариотичен експресионен
Вектор.
ТЗ кодиращите фрагменти от мутантни плазмиди се изрязват utsp^ /дКлнъзгу ΓίΩ'ϊΡΠΩ'ύ/.'ΊΩνίρ <* Γ277«ζ»ζ-7ΤΓΤ n \7ζ»ζ»Τ ΓΤ«-ζ»Τ <η· ,πλ ο ftlrxlzxuon no ”ipco yi/uuhu paoc.p<x/ixyaxic uni/tuox u/yu-cx. x/uo χυιμυ x uiulKHlm oa повишаване капацитета на остатъчния плазмид. СЗ кодиращата
ΤϊίΊΡ APflP.R £! ТПР * U zx<**yi on ητ»ζιιΐ 11 nm ft «η no οηοτχζχηηη on a n on ftlz*lzxiifto ft on I f TUX' 2 iivv/ixy vu<xxixC/xriOxxix w нрхЧихшиа it a aoapuovn gl-л u w иклгичиа u pu^i uv вектор (Jnvitrogeri), който е линеаризиран ctiind III uEugRV ензими и
ΛίΡ/Ι^ΛΡ/Ι^/^Ι^Ι 1 * 1 ’’’Ύ Ώ ТУ* ft ° 1111 m η nm 11 η ο л η ο ζΚ /хпж/хтм ι * ο η ο Λη-ιοηηζχηηπ m η yCApvxvpvJpUjiLipCLiи x cvuC/ixya ипшСсшипсиша ψυχψυρίΕΐαοίΕ / кисаци^пгшик.
смеси се използват за трансформиране на суперкомпетентни XL1 Е.
П1 ,ύ/.* О Ir/XlllV»/X mriftn On ТЛГх1гт»1 1 ft O tvx 1τ*τ ί τ-ΗΪ’ΤΧΑ I nil nillllllrn ni FIT rxll'nilin
LUU, V RVUiilU X/lvy UlUUU. LA- llMXVpUUaill IVJ/111 1 y piLШ U. 110X1 U HV U, t OV1 UpA\UUJ,U ампицилин.
Г*' * ,,,» oil yl Z4 OOpOr. Oil,, / γγ, ГМ 1,..1 11/1τγ,1 I Til 1 \ Tin Ί , 1 Z*T11 111 TH 111 , 111 τι TT11 I,!,, . ,111 Xz/i} -lcLLirlO nuyujjariu ^nipu u.iu -iv lliupuy pv juvnivHinnu. na. шшшцилип колонии се култивират в 2- 3 ml култури и плазмидна ДНК се изолира в * K Fl Λ.1 If ΙιΓΛΙΙΙ'·'^ 1 Γ* A Al X» » ΟΙΙτηΔ Z»T Z1T Tvl'AlllIl lr ZXTXn Ι^τν» 1 11 1 1 1 1 1 Ζ» 0 TXTV» 1 1 n,;i lviaziuK ivlaLu,ao. lEiajiviuyuiiic, хиуи^/Еасци Eupticninu unvopmu^L идетифицират чрез разграждане на плазмидната ДНК с рестрикционни
Ω1Ί QTX’jll τίτ * αΠΑΠ ΓηηϋΤ ZJ^^TTT ,4 4Ϊ7ΤΤ ГЧ 1ζζΧ4Ζχη,1η a ciiyuirjилхаои jl-luim, ± ii/tuiu u-xjixx. xuuiiiuuiinumv xvu/iOriuu. раххххихи η iuv ml култури и плазмидите се пречистват по стандартни процедури.
Tsi„ > <τττν» O V> VTA 1 1 ΠΔ 1τΖΧ1 Ί АПА т>1 П1Г»П m ГХ TV» 11 Τ'» ZX TV» AA11 110111114 Ο П τ·» ΖΧ л Т У1 1 О ft О m
LOU 1V1J 11ЮГ1111 и UX IVMriXllipj U.jJO.111 Mill X VJVJ и lin 111UOU nanun CX 111X1) ”10X70111 двата А1(У s У към кодиращите участъци. 1ози участък ( плюс У ЗкЬ nm /^^2 Imzinoniii nm n nzx o л a on· ft o та л 11 zx nm λ o · no -rvi/xfto oa папгтаЙп ζ» T-Tiv»zlTTT uni iy.vy up a uu, ail io iiuu/ixyuL/ainuin uvmj v.xxy inuua xx иорлоиа. c xxxixcixxx плюс EcoRl и се преместват чрез свързване на същия сегмент, изрязан
ZXTV» pz^a I 'noil F»p1rr»VI AFF1 Til Т11ЮОПП ft nlrtv» r»O11 ο « η FA m rxft O F>Z3 И A Anm ft n TV» TA zx vui a ххзи pCtwrixiiip^ upanu ишшири c/icy шииа lx иосишилш им стандартните процедури и се използват за трансфекция на С 08
If a от lri 1 IXlElllIVU.
с) Експресия на аив тип и мутантни СЗ. ζ Λ Ч.А ,
Мутанти и див тип СЗ се експресират от плазмиди.
_ , _________а х^пс -ι ι-.—„и,_________.... ... ......., шрапс(рсмпир<1пи и wj- ± jvwiiiku и иимищша на nuiivypcKuixuviun 4У (G1BCO) съгласно UHcmDvkuuume на пооизВооителя. Обикновено. 1- 1. 5 ’ £4/ л хи ллСхики ϋά ллауспчс иш ишапуаршпа и ьлаусптииа лл/ми^ралпа паничка се трансфектират с 2 - 4 ug от плазмида с помощта на 9 и] липофектаминов реагент. Супернагпангпигпе се изпитват за секреция на СЗ и обикновено 3-6 онн елен тпансФекпиятя се получава ообпВ от - - - - _ - — - - ' О “ — CJ — 1’ — 1 ' — ' ’ ' - - - - __ - - - - . - - - Г\ п 1 *“7 ___ί
и. л-ι. / ug за mi.
гезултати
а) Получаване на мутанти
Изолирани са следните мутанти. наименовани съобразно
Включените мутагенни олигодезоксинуклеотидни послсуоватсхшосши.
(i) 3 мутанта с QP.I1 и QR.12 мутации плюс AFL4149: СЗМ- 2ό.
jT K S' Λ cjivi- 3ό u v jivi- oi;
(ii) 1 мутант c QRI1 u QR12, но без AFL4149: СЗМ- 8< и (iii) 1 мутант c QRI2 u QRI1: C3M- 51 (използван в пример 3)
b) Валидизиране, което вьзуейства функционално въздейства, се πΉΛ^υ ия м^таиии специфично Въведени В мястата на пазгоажаане с фактор I.
СъяляггВяиртп пптНъ.плкпяВя лнпгятя ня ппуяя поопропя В I7R- 450
--------j ------....--------г—.а... ..---1-------... — υΓj .— аг - а — - ~ -----базите около участъка на мутация на всеки мутант.
последователността на един мутант, подучена по тази процедура,
СЗМ- 51 (виж пример 1), е анализирана през целия “процеп” (бази 246331
2)067 )гизползван в мушагенезиса, и не са установени други отклонения от дивият тип последователност.
По- нататък, представително съгласуване на общо 2922 бази от
Rr*l 11Д «ЛЗI XfXrm Ω11 m 11 IIP on nnlrnn <n 4 и ImlrR n m za η oh ο ο o > глотп/лото inn m on !rnR n wu*i£4u mjinaiiivu nC vci iivHvcu>a_‘iu 1\ал.иаши u da ν υαΓνιυνιιюлшслгт ιιΐΌ*πα;υα мутация, която да е причинена от полимеразно- опосредствани
VJ A 3-311 »T Rr*l 1 1Д Iri 1 onvxnnn в n t ττα «а 1 i-mi i ta rrlx *a -»R nm oRnvinrx п<хр\шСпил. iimiKu vivviycvupanu myiiianiiiu iiOnaouain uuuunu* верижната структура и разграждането от СЗ конвертазните
V Ω Τ'Ω ΙΤΤΤΊ A TV. 1 1Ί. ΠΩ ргхпгчлпппп ^R Τ_Τηίι ζχίζζΐιιζχ 11АТ1/А inft тп ι-та irrimn.imn
A.apcii4iii4puuiiiui\.u па npupv/ynuu най- ииЩи изнилзиапишс mj'inaiiinu като че съдържат някакви изменения, макар че те не са напълно
ГХТАГ» 1 A ZA R ГЧ Г»П П л П ПХ yR П11 П ишпиии и ис«ш1 у van и.
f TJ Ο 1 Ггч * X T1 » O R Ο 1 Ί Λ 1 Ί O /^R Ιτηητηζ» 111 m mA Al 1 11 11 1 1 ZA R Z\nrV1nwT I- TA'x π ruriiui xiUAvnauanv na кииши uivia apaununuu wiiiaiiiur* едно място на разграждане от фактор 1 ( аминожиселинна позиция
RAR \ ТАППТ-П R -X Λ ΪΤΥΠ η В Г11 1Ί ZaR ГХ Г» tVA o TTA 1г iju.'), npv u ирпаш ν uiyinaMunuu иешашЬп,.
Следва се процедурата по Пример 1?с изключение само на това, че
R *,ПТТТ) Ω nnnninRnm в гтугта г» αλίίч ттл z\ » η ααιαοαλΙχαιιπττΙγ * аптпп пп u niaav. rivouca vi uoLiaaouam my liiacvrixiuiiiv uAucvyLouxk.vunj iv.Ywiirayu
АР 4149 плюс GK11 или СгКП (т. е. няма URI2 или С>К12п).
Резултати r*\ FT a *Ί’ηαιιιι x nirn ηιιτηιι
a) nu/ijnvnu iviyinaniiiu
Изолирани са 2 мутанта c 0RI1 u AF4149 , но без 0RI2 : - C3M111
O *Ί А Лг rm mi TTA π m nxj iiianni uni гш
1- Л1Г
OR o
1X-J V л1гПП ТАД ППТАПП v nvnpv 4 upan, ' I * Л1 1 1 ΤΙ TA n TTA О1111 xv<>u npanicun
B -rzxxlrzo lVIVAW
ПН ill ПО ТАПААПППрП O 7 LU It FTnnnnnnnm n n F~O Ia yet vuyv pa^opayCn v v,- ν x χ>ν- пиуиипилш nu v. i’ продукт е относително резистентен (в сравнение с дивият тип) по
Qmnnnionna пп nni A-nnilrnnno txtaii п/аапппгт 1 RAO гчттт zL *а 1х ττα гчтаи Τ ιι шпиииепие na p/aaopazixy ane tipm ииоиццд jlwv will ip anil ivp и x u
ZA U □с още могат да бъдат разградени при позиция 1320. Поради това
V/ AZ А Л VZ Д t ΑΖ
ТЧГЧ/Ч1 >пЙл прииоии
П A ’J П Ami 111М Л Г\ЛЛ11 nmol 1ΤΤΜΊ/Υ V С *lCiUAllU*iriV pLOUUllLllllinU
ΓΤΠΤ/ΤΚ/<Τ?Π 2 ГТпахтиоЙ ипд но Imiimrx imrn ο т-ч μι 11 n н /ч ft /xorvsorvxT Ir tn xiiYiivi и- ± iu;i\ nauanL na kuuuio uivia арсипииии исшашиь при еано място на разграждане с Фактор 1 (амино киселинна позиция
А V» A X ХЛ - А v4»4zaftrT τ4ΐ ·» ο tn ft η *ι?τη<Ίΐ run плтппт! lr j7 ιψιυυρπαιιι u corijInaiviunuu ишшшил..
Следва се процедурата по Пример 1. с изключение на това, че се
КУ A А Л А 11-1ΉΟ Λ ofto fV4 ο Ο 1 Я Η Ά ГГ TtV4 Ο ΟΟ 111111 /ч * ιι ο η η α η η 1τ ο 11 111 τΐχ * ο η-rv» ii r>n Λ 1L/11 /1 ί) ΤΊ ί Ιοί Τ Τ uoixajkoucLiix ναανιν ινι^ шаоугши uAUGvyouacunjicivuiHuyu r'ki τιπ/ lumuv ч/хкх^ или AhL149n. 15 допълнение, използваният метод в Пример 1 също води nzx опни хптгчоонт-н o ГШТЗ AH /1 1 Л0 1 Ί П Aan ГЧОТ1 yu uyun мушапш V 4Z1VXX- ^гхх ντι-τ/, nv MCO Ч/ЛСХХ.
Резултати.
θ\ T/f Ю 4 ПГЛЛГИ! ОО ci) гиплирапи. να χητ^οπηπο ο ηυη ί, лгТ/П/Ю ип^ооГШτι пхушапша с %/ι\ι~. и ьпп/. nv w.> \<ί\ι a
31, СЗМ- С>2, СЗМ- 013. Мутантът СЗМ- 51 се експресира както е z-ч ТЛ1 1 /1 O H n ft ΤΤτΜ1*<ΟΤΛ 1 I /X O 1 1 * тх1то ПО HI ПО H O » nn O HO 1 1 uuuLanu u ххрипхср x. xvou цришу un iviv’znv ya vuyc paoapaycn
ч.. ' A JW.
Подобните на СЗЬ продукти не се разграждат веднага при позиция 1320 ο η 1*тп Атм ί τη zs Γ in Т—Т ii/ч ftoo nuio i m ·»Τ-ο по ίοι η ο ττ-ι тч ο -» -»тч ο no ι ΐι ι τλγμι τ-ι η ή ί ί ι η г-г е уамниришс χ и χ χ, пи uvc νιιχι,ν .vavzlw ya ииуаш paoc.payci’iu при nvoau,u/i
1303. Сто защо, това производно на СЗ е частично резистентно спрямо zknlr-mntx T ψαΛ,ιιιυρ χ1 ГОТЛЛ ft Ϊ-? /f A 130 1110 1 Ί O z4xx nilrunoll O k 1111 ТЧ-» Ο O Tso 1гтП 1 1 Ατη X n ’m Л111Н1 τη o iHrnuvi t . rwiaauo na yv плциипаап ишс kyvrunu vni пцшациинк
Супернатанти (100- 400 μΐ ) от трансфектирани C OS клетки се
UHKyOUpCUll upu J / 3<1 Z, 4dCd c ’ <’гле —v,, o^. ________ ^лптn.r? ___________ .
wo iwiciiiiKu vc uipanvtpcKuiupaiii е рсД-Ц.nw unccpiiiu uni .
1) немутантна СЗ последователност;
п\ row
^.) lviyiiiaHuiria ν-^ινι no /I------.---- А .-ПЗОЗ izj (ь.иуира1ца n.ig.
VJlllb /ЧП
3) мушантна СЗМ- 26 (кодираща Arg130? - >Gln); и
ДЛ k/fVTYt л 14TH14 Q /Ь/чпптчлп! П А
-ту AVly llliirillirici Vz«71YX“ 3 х ^лл/у ираицсх 2~kl g
200 μΐ от културалнишс супернашднти, ВзеиГи 3 дни след трансфекцията, се третират отново с 2 тМ фенилметансулфонилов флуорид (О°С,
Ί -в ,, л ,-.-t -lР х» 1 Ή lviunj и илсу inOud ис uriKjuupani ha J; < 3α ζ, Часа СЪС слеаните вещества:
vJ
A) без добавки;
B) предВарително формирана СЗ конВертаза, CVFBb (10 ill от 200 р^ъдържащи 6. 6 pg CVF, 100 pg фактор В и 1. 4 pg фактор D във фосфатно- буферен разтВор (PBS, съдържащ 10 тМ МгСЬ,
Г> _ 1 Г РПО Ζ“* П 1 И - \ предоарително инкуоиран нао/ cd продължение на 13 минути р
C) CVFBb плюс факторите Н и 1.
След това те се подлагал! на имунопреципитация чрез добавяне на 0. 6 !1п афинитетно пречистен оВчи анти^-^зовешки СЗ имуног,\обул,пн
Т 1 ч. х ·' ** * ' ** j ’ ν'4 · на стайна температура и след 1 час се добавят 20 pl от 5%
CVCnf’P.dlff НЯ ЛЛЛИШПП V ЖпЬппппип r· ЖлпипАпи n-m cy HU il^_/V>XVXVlXli VI Vi UJ1V W V 1 IVlVllllkU ViH CJi!V|7l\7kWVUU sp., група С (протеин и) (Sigma). След 45 минути при стайна токпрпотипо ii ог>гпп111лпгг|да пр пплхтЙот олилЪлотил R PT2Q 3 mK/f MoM J 1 IV 4VXX1V. lUVlllUxRuillV W X i|/vmuv или V yi IVU^UUlllV vr Λ X?V/7 i-lLLIl X T UJ 5 и веднъж В 20 тМ Tris/ HCL, 137 тМ Navi, 0. 1% (v/v) lween 20, pH 7. 6
1ези елуати се разделят чрез SDS- РАСгЬ, подлагат се на електроблотинг върху нитроцелулоза и ивиците СЗ се откриват чрез сондиране с афинитетно пречистен анти- човешки С имуноглобулин,
имуноглобулин (Sigma) и откриване с помощта на “Enchanced
Chemiluminiscence субстрати, доставени от Amersham. Показана е * х rlx «» wi 1 0 1 run zalxv* /хп 1 in ii n iin ιιτιβ ζ*τνν ft 11 τν» a a on ii л van m nnn/xftii τν zx * τ i » i1 tnuiviaa upu iviun члииоицил no чуиъншишчлш ria рчпшсСпОиишС личи филм. Визуализираните^получени от СЗ ивици,са означени със стрелки.
1 ZX TV /та А 1 1 1 1 Г>1 43 XX ΤΧΧΧ^Χ 1 1 / 1 А А Ю \ /* X» ТТХ 43 ТТ1 ΖΧ TV1 1 ЛЛ 1111 TV ZX n WO и ишуиУкПЦНК lipUUU у X Т? ) 40 1114711, U111X40.11 11 ЮО- СОрч.
(ИрисъстВащата Във всички проби ясна ивица от около зО kL>a ( между
A Lk 11 Zx 0 lx I V X» 1 1 β 1 1 Ί 1 1 1 \ 43 TVV ^3 xlx lx X» TW X» ftovnon ИЛ T Zr/~L β 1 1 1 .ΤΤΊΙ ZX V V Д1 1 1 1 т 1 TV Л 1 1 II Π TV η » > 43 ти и W 141_7О ииици/ 4 11142141401110 UipUGU ПО L/ U1V1J flUl 1 рч Ц U11 111 11 UU, LLZ111 L O U Ч установена чрез пероксидазно- удвоен магарешки анти- овчи
1 X ГТП 1/ХЛ * ζχί^τ ТА ИгЛ Luviy пиолии^лип
Ραπτ Τ A VV X» TV 1 Ί / Йп xlx /4x 1 1 IX TV XI \ X чоулташи уиилч tpucjpa ;
1. Всички нетретирани проби (1- A, 2- A, 3- A, 4- А) съдържат nftnil 11 ZMV wn ftn A 11 /XIV ZX г Г11 -TV1 1 V V 11 Ο n л V * z4x Ο n HXZ3TV* XI βανη -XT1 1 Ί X» f « I//X11 Tf ZX ииици vin нраишшиши тиориропч na α,-ιψα u vvina uvpuau na ’ч-.л, rvvuinv показват, че всички мутанти са експресирани и пост^тпранслационно
ZXAO Λ ZX VZ3TV Ο11Ί1 W nftll A 1 Ί ZX 1 Γ V1 1 r>rf ZX W β 1 1 43 TW ZX 4 1 t~y /1 11 · 11 4 A
VV7kOVV1114nU ΙψΟΙ/иЛГШ. lipU4UClllUU4aiU na TJ или TV
1х ϊ \ х» ιιβιιιιιι β rvann
14X70. ииици С 111470 проби показва присъствие на известна фактор Н + фактор 1TV ZX ZX /\ixn Ο V lx TV» nftn/X ЛПП β Ixx 7 A W’V Xl 4 1 1 XI TVl V ZVTX43 zx xi f „z.,, TW Л nn X» VI 1 Л W A η X Л n Л nvywria ai4iuuunvvni μ ivj-ikiiijya.шиша чрчуa. чнитиагта лиурилиза na 4.7
В продължение на 3-днеВния биосинтетичен период продуцира C'3i, /ЛП TV ZX 43 vn X xvn van Z> TW η 1 1 ГУ 1,’IV 1 1 ft 1 1 ZX ЛГП Ό 1 1 OX П7ГИ nvn A 11 Л ·- /’Q TV/χβ X» Ev/uinu 4 раосуаучп ч liiaou aiunucnuuii. xz ntiuyniupariu/i ; 4.-7 niwa генерира ивици от 43 кПа и 7'5 кПа (иВицата от /5 кПа не може да се βη.ηη v/xv xi zxi 1 τνζχβη vjp τν» Q Ιχτνιιο /τ\ ζχτνν 7ч Ι,ΤΧ X» ^43TV ГУ β 43 TVl 1 1 Xl TW O 11 /τΐ t uuyu nvpayu шииа, тч шл чч гчрич \ij vin /7 гчС7а исша исуиааша, и уп;
антитялото, използвано за развиване на оцветяването no western има
Ъ zn АТ/\ X Г ГУ А 1х X» X» IxiW 1 1 βΐ Ί ZX лт XVO 1 11V TV mil 11 n zVtW ZMV Q X» A А. ГУ β z.3 XXI 1 » n TV ry lViriUGV 1V1CUAI4 Cl 0X4111 017 UV4111 чрчиЦч U1UOU 404111 Mill 4,.7 CC XVp GUI p UGU11ILL н'ейното присъствие е съответно потвърдено с плъше моноклонално <x 1 ί τνν 11 τν n * zx w*f Iwo 1τ-ζ>ζ3τν*ζχ а лпап 11 Anin 1/X ν x» m/mn τ ττ i n лпхп lx \
OlllllUlll/UkV, 41U1K , 1W4111V 4 4 114 циуипли 70 111V7U y-iauuuiy.
“Ζ~Ί
Добавянето на фактори Hui без CVhBb ( 1- С, 2- С, 3- С. 4- С) не
VH ') 'IV n xlx/T O ZX ЛПП zni Л Alirj lx ZX 43 XV ZX TVZxlrrk’vftx» 1 1 43 WZ3 XT ЛГИ Z1 β A ΓΙ β χ» nbiviiftan pO7C.pUJXk.ya VOllianCUkUZl —S 14V41114· llUh.UJUUj '14 прч y4111LlLb k/lU-Cl araliU 174 11 4-.7 (тиолестер интактен).
хч .
2. Немутиралият С З (1) се разгражда с CVFbb и СЗЬ npogykmsrno-
ViΏ ΤΎΊ Р.Гт-If <Ά аппптчгаЬпл ζ» onAAnamni onnntni ft 1 Hau iman aaa <x ft т ю ι ί a пашашик w paocpazivya v ипуисинпи Cnuuiviu м x~ xj lulu npyj yOuauniK na фактори Н и 111- А. Ивицата 43 kDa показва разграждане при Arg kDa ивицата (видима при no- дълго експониране) показва пазгражаане при Are130?.
X X U4 χ £7
5¾ 1Д rm ,m — ( A νζτ'^θ··' аггаЬо zxa /4 0 птчАПАПП ζ»
μ. lnjiuaniiunii vjiyi“ ιντνζτνν ya vuyt paoup^ayvη v
С VhBb и продукт^ е относително резистентен на ендогенна фактор Н
L} Т_ fS islfmil ft тлгчипп nmftiici ИП /лггиюпчл nftii Ln * iinnnmft η
I A llUyUUIltl ПЛШ viL/TlMUlll LJ IlpULULlllUUV Г1С1 Mil 11V 1112 LUU U KU.kUKLlllUU от алфа' верига (СЗЬ). но Все още може аа бъае оазгпааен с * * V/ X/ X X X/ •ΏΓίΤΤΊ. A1411 ΓΠί3 C УЗ/Ύ Дч η Ιτ-τν» αλ ΐ_Γ п Τ /0 ΤΛ\ Λ 3 ΙτΤΆα ααα ζττ ’Ътч-ч aaIo-iR/i yvii Uzinuliiv/Апм yuvaucnu чра.лшмр ai u a кми прмуулш пмлалма ιιηη
1^· разграждане при Arg'' ', (слаба ивица при /1 kJJa,представяща другия
TV, II Ο Г1 * 31 Ο ' {Ζ Ζ3 Ш 1 Ί Α Π > η Ο Γ,η Για β 11 Ζ'· <Γ1 1 η ,-..-.11 Г, c Τ .-1-tppcXC.lMX.nill IlCl CUMpa L'CpLXC.Clll 1 cglVlVZTlA. yci v> L»y v L/uyzuicx lipu 11VJ- уилхлг експониране)?но няма ивица 68 kDa. показваща?че този мутант е nPTll.^mPVimPV·» ΐΊΓ! mn а талтЬпппл AA11 1пгтпАЛ*пгг pv .>uvnivгшiCn па раосрадууапл при туширалия. мт . - - _______ __ 1ТМ ___
4. Мутантът UM- 26 (Arg”' - > Gln? Arg^' - > Gin) може да *4 A A <4 AH ZX rail 44 Ztx'UVx 11 АААЛАПИ ГТТЧЛ Пп 51¾ ТЧТЧАПтбгт ί ГХ А Дх A ’ \ ZU vuyv paocpayvn v v v a ми и пмуммпилш na vuu прмуулш; v резистентен на ендогенната Фактор Hui- подобна активност (3- В). Л V* *X
ТаГ, ο z»t in z> m nlrn » ni αία пали лтonm on η π ζί/чтчгт » ι»i·»mο л »ιπτα <? z4x ζ» 1*т пан Г_Т ι ι Τ avu v vuu-см шала ivinucu p/vouviiivrnnvn па у ми шкпишмкпишс ψαιαιιυυυ аа и r (3-1» в сравнение с немутиралите СЗ (Т) и аругите мутанти (2 и 4).
' I V X \ / О X τ« u η 1 111Ю Z2> I rtl/VI/4 A rn A Ir А Ьл A 1111 onm ft *4 Z4TT4 /1 Т1ТЧА ζχττ1ττ44 A IrAOTW fX A f\ 1 ’ A '1 ft A
LllULUUjL. V lVlBMGU МШАЛМ ЛМ.‘k U 1W111 MM Mill TU IVL/U. ll|7Myjy ЛШН, RULlilU ПМЛиаМО.
_ 1 ιηα„ известно разграждане при мутиралия Ulnx (съпътстващият 68 kiJa жгч /> >* /num ZVT 111А ο β,,^,,.ζ „ZX ™ . ,z, J.^zii.imn.iu'l Un.nno νρραχ,ινίΛ. run u ιχιμυ v_ uuyuin npu ihj- yu.iuu vivviiviiupcinx. j- паиицс i_ci пгипли или никакви ивици от 43 kDa. които биха съответствали на което и да е тл niinnilz An ιιο тчтч,^ ΛΤ1 тч f I Z4T4 o Aii тпЙп A τ·ζ» **ч» ^~2Ттч ι птт η 11 η чт п тЧтчту ра>с.р/а/луariv при мт . ххмр/ауи шииаЛ1^’ μιΠ тутаци/ппа ири позиция 1303 е по- малко ефективна?отколкото при позиция 1.520 при
АчЛд ZX ЛЧ Г-УЧ ft A Ζ» rrft nil Д 1 Ί Η η α n Лгч П η ·Ί 11 O nm Д% *4 1T TV» ZX TX T ( I ZX ft «“» ^ηβΐΙΑ ZX r> TV? A rVI ~ 1 1 1 1 fX iipvyMinvpaiii/iucxnv nci риос-ро/луant will кршсшир x. ιυυα мамим mvhiuhi u-iiim разграждане би могло да се срещне при мутанта СЗМ-123 (Arg- > Gin).
но междинният 46 kL>a вероятно бързо се превръща в 43 kDa чрез поii n tv nrnn iint/x тч η n nn n tlx nniiQ wmt t riot л trv> ип л » tin xxaiixcuxlULuricr paoapcxzKyanи npu nuiviVinupa/iuzi
Λ ,.„1320 1 >
_ _ —. _ — - - — . I 4 > t I . . _
5. Мутантът СЗМ- 2>1 (Are“ - >) може aa бъае разгпааен с
V · W ' 4А 4> 1 * 4/
ПТГПк ,i f4 V»X4 ХТЧ ЛхГТПГГ Vjn np V» η П n V4 n tlx Vi η V» V» on a n Л η TO1 111 Л TV» Л Лч ΓΊ 1xW»Z4V4 LJ n c, v x uu u iipvjyj icin biix w р/аос.рал\у a cnyuavnnaxiia Цлсичхххмр x x a
Т X” подобни активност (4- В) и чрез допълнителан фактор Hui (4- L>). 46
ЬТЛп
Λ.1-Ζ Cl
ППГХПТ т|х Vin / 11 ТТПТП П lJClft ОП П TV» Ο Ζζ Q ΙχΤΛ П llftllll Ά П/τΙζ nnft П V» П -» ην» «-» Ή- XT »1 ·. 1 Ο 11|УЧУу j XVL11 yu jy VlllCLriOUCriCXlllCX U(J IkL/Cl uiyuu,<xy liUlk-UOLZCi pcXOC.ptXZLYM Cirik.
при Arg
Обаче липсата на 43 кНа ивица показва,че не се разгражда при
Ж rr’TVT 11ТТЛ Λ 1 1 ΓΤ iviv ширааид
Гтч1»м#о»п Ч цриГук^ и
Ί n ft η 1 1 O 1 t X» тч on * >1111 ~? >1 n 4 Z1 111 /Т ^-Ixi 1 no * ’ 11t Ί Ί 11 П П Ж <O л/vt ft η Π11ΓΙ p/aviiAL/auc ria ^ao.runhu шпилмчкиилшгши. зсипссшиапил при позиция 1303
1. Въвеаение
4»
Γν»Ο XWZ4 Л1 M linn p Х1Ш 1 V ГО Ш 1 X4V»1 1 n П vn irvmnnnn 1ТП Д vn 1304 „ Л.-„ 1230 „. ll^VyAUyilUIlK lljJUlllvyU v; 1U.VCU1.C1 lVlj 111С1Ц1Ш llcirxig X./M..' UZX1U, y глутаминови остатъци. Двете мутации придават устойчивост на тлпптпг»т!тлп£1 пглп λιιοτιι τΊΛ-»ιηηιιι плот Лч гПхттпхчтч Τ η ιτ ο ηη»ιιιια ο у r η * lx <. ι τ рсюер<хлк.уant при unvju иизиции ~ιρ·ο ψαιηηυρ x. vyuank пиаицк c Bia_ir*.a, nc.» откриваема степен на разгаждане при Gin 1303. Поради това в тази птици л η n zt't л/t nztann n it n mi τνη лпи > гт intl’O лт β хч лгмти ι η » гт τ 11 x\ Jxt i no л niinii HVJyUlLyUA vci CUOkjayvnU G UOllUXXXailU lUnUAkkLlllUV ypYOU. aiviurikrikutk.'iuilliu замествания. Получава се оазгоажоане в низхоаящ оео на ефективност.
A X 4·' 4* * 4« * /
1г/ч-тг> т гч ппт ппл.-г lz 1 2 а · А v/ч- I irr *»4. Г ч тс- и * п ПГvv\l 'ч. ^*2-1 тл I τ т п ι νι
ЛА-ГС.С1111ЧУ V7V111C1111 ОГк V. У“к1 X у 1 1ХШ X 1 p/J VJ111 (кУШ U21U
Y j.
Гези резултати са неочаквани^поради: (1) всеизвестните природно л ι in ιιηβοιηΐηι ж η Ιζτύτ лгл Τ ътлппгтлпп г\ Λ тлтл η ilm π η 11 π no vnmpft ηι тлги vp4. сцапи ‘юисшпи vpctiYiiivy^y 1 ivicy иир/апи. раосрилкусшил cc xxyvup исцши крайни до аргининови остатъци, така че би могло да се предположи, че οιτ -гпг rhF^-гч-гчч twiotlxn ft п или nl’lX лпа τ η ατττιιηιιη· ti /ιι\ г>1ххч no ττη τηη Π ζίπ πγλιι V Γ13 UlVlCfl lipuilic ZlkCLU Cl UOUUkL’arK j Cl CipuUXlUIX, и У1!/ С11\_ЧУ Vk. jjllyojy Ciy U 11|1U други остатъци, би могло да се предположи, че те би трябвало да са ο * o Irrvtrmnm n rm iiniin лд-пл, in n Л nvn τν» а ллп ηβοη плт η νιη/τ V /1 1ΤΓ η 1 11 ΙητΓ·\ сЛеКшрОСихсиххи-хххо илсгупи па ait;, in. c. ucnuuvn uvxxxtxxxx un yi}o u/xu 1110;, (напр. трипсиниселективно разгражда С- края до Arg, Lvs или His).
така че не би могло да се предскаже разграждане на тирозиновото заместване.
lopagu товаузаместване на Arg 1303 с glycine или глутаминова киселина се препочита за целите на получаване на производни на СЗ резистентни (устойчиви) на инактиваиия чрез фактор I.
2. Метоаи ! АДх/ТП Й Й * ПЙУ*П А ft ачхчх ΑαοοηώΑ nmiift on ιηττΗοοοηοη x- lVxjiXicl.c.CnC'Ocu иоии/ииапилхи ycGL,nupauiuuvh xvyixiiuAnvh праймер е:
скоби показват смес от бази в тази позиция). Мутанти са «СС» WII 11 А11 Υ* Ά ίΆΤΎΊ П*4» fl λια гмхпнмпгг η 4 αοι *ιί а /лпппоп ft ταζχ юпчпп iwrivnipj Lipariu ll’vu nv MLlnvya im npaonuzi xuicxoivxuy ^c/xiuvcin u xivH parinu примери), или no метода “мегапраймер” (V. Picard et al., Nuc Acid
РосДЗ. O1 ft
XKVO . i-ди/ J X 9 \ι</;τ))7 υ х to» k^
Ι’ΌητηΛ ПАПП1ГЛАГТ TV» ПЛ-ХААО “ A АА A A A A A AZ* iyuuihu npauivivpuixi naoc/pv · u cxv v a. £ a a v ,Λ· aatctagatglgtccctc и праймерът надолу e: gttttatgglgacc
А
а.
Й f f ί Й f f €) Ta 12 V-1’ immnnnii aa aai ni nm ft о гчхп·
Q I I 1 d L L O. liLUnKll ivuiiiciftuu W UL UU^VClliuZlUiini ООрЛ) матрици, в които СЗ- кодиращата ДНК е вече мутирала така?че амино Irη ηα * ιηιηηгию ллт ητγτχ ο О1Т’ТЮП1/ИП tl АД ЛГИ Ап1гпплппм Л»Ю ZXOl'xw» АА
IVU W.'kUliXl UZlill WlllLLlUQlY V Си'1 > Ш CX1VIUM U UIWIUкХХАЦ U-Ulin U./I111 VC1LL111 aa
АНИ е въведен при позиция 4149 (както е описано в по- ранни примери) и
АА TAZXTVxftfT ТХАО11П ПАОО ΥΤΤ-ΓΪΖ* АГГ А * ПаТгЦпПД να хюпхиирусххи ^άχ,χχχν νυοζκαννυαην.
2. 2 Експресия: мутанти се експресират В (JUS кетки с помощта
Ц Й ЧЙГ* ί ! Т—TXF~ *2 ft /ХТА А ΙζαΙτΆΑΖΧ АТХППППА ft ТА /А АЛППП АА11ХГДА11 па рсуД,ххх\<? uvi\.iiiMpa.^rLa.iviiiv с иииисши и ixv” pcinnu npuivivpu, биосинтетично белязани с PS] метионин b свобоана на ceovM соеаа.
С J V* * -> Λ
2. 3. Изпитване: супернатантите се третират с CVFBb (Формиран при взаимодействие на CVh с фактори В и 1J в съдържащ магнезиум буфер) и фактори Н и I, последвано от имунопреципитация с анти- СЗ и разделяне с SDS- полиакриламидна гел електрофореза осъществена при редуциращи условия, (както е описано в по- ранни
Z4 η > ΓΤΊ *11 Ί 1г A1111Z411 Л11 ТЧ/3 Л ПД11 TV* 1 » Г1 к_ aiviiiziucpuivaLyuMrivn pvaoviiin ηα
Amersham, изсушава се и се подлага на авторадиография за получаване
Опосредстваното от фактор I разграждане при позиция 1303 /лпп т 1 \ ЛД •з тч <ч г» ►зтч гчч]г/зг»1ч^21 nni ι 1 ЗЗП / —34 / nrMi Imomжч inrmnnn гч*ч Цаиш x uto paac-poznyαπι. ιψα xjxu (uiuin x-) ^npu nuvniv тушира ум глутамин) продуцира ивици от 46 и 68 kDa. Може да се види, че t-ч o -»r\ Axl’n nil a z>o η/ч * ini n ftr, ft ТЧД/ЧЛ · nrn/D\ Rtv /VI m τπ tCX ,, AV\-p<l j<_.piiZLvyШК L·*- UV.'lj -1CIUCI u pvya. . αιςιιν^ -- Hl y X ) Vj o \ v_ j u up \ ’ T /-(G ) u eiu (b). Дивият тип (аргинин при авете позиции / се разгражпа при . ' W ' ' » *»У А *' ' '
ГЧ ft OTV» Ο ТА/ЧП 1 1 11 И 1 1 Л п П/Ч · ЧТ11 A ft ЛГ1 ώ И А Лчтч О ГД Ч Ί TV» Ч 1 Z4TV» ТЗ /ч A 2 / TV* ft П ТЧГТД * ГГЧ * In » -3 гч yL’Ginv ци^иции oa пиау παυαπν ηα ψρααινικ.шии иш пи -ти ушсирук. ivicvknu за аа бъаат виаими върху този гел) и 68 kDa.
\,Z VZ V/ I·· л rh Ί 1 ЗЧТТЧЛ ~т» мУис^ура
Резултатите са показани на фигура 4. Остатъците в сайт 1 / Г» /Ч А 11 1 1 11 η 1 2 П 2 \ 11 ^пизицид XJUJJ U
Г» «3 η TV» 0 / Ί 2 0АА П^Ч/ЧЛИЛЦаЙл TV» ТЧ/Ч ‘Л/\ТЧД льп /чтуа ft OTV» 111} TV3 iZ> K_a.ui.ti x_ y xj-vj ииизпапииаш ιιυ~ с*мр\_ v uuiiiuv innuinv ивици.
11ример 6. Демонстрация на повишената резистентност спрямо
1 Ί Ί О 1 Г TV» lift А 1111 Л UII СШ.111 UL/ <1Ци/1
Ζ4τν» zK r> Ir-rva ГЧТЧЧ 1 Т мш чраплпмри х
2А2
XJVJ /Ч/Ч Гт! ТЗ ум gill.
Т2.т ftoz^ovjlio
1. 1J L>tDk ijlFlUl
J lo- ранните примери показват, че превръщането както на arg ззп
X^’X^V
П/Ч -» А Т ГТТЗ Г» » ГЧ 111 ПТЧа(7и TV» ГЧ » Ч 1 Г» Г» 11 TV» X ΤΓ»τν» ГЧ п ч» » 1 ft ΤΊ гч ум сь1> uicuviun праси invou иаиш умшмипии па разгражаане от фактор I. Мутацията в аВа сайта прави молекулата
Л A KJ * * * «.ζ X Т ТАТУЛ /Ч1Ч 1 1 1 1 ft ГЧ 11'1 11Ί ТЧ Z4 » ГЧ /Ч <3 Т т О ft ЕгЧДТ-гЧГ» 11 J4 гч ο »ΓΓΤΑΤ»Α/4 ΠΡττΙλ 1111Ζ5 ТЧ/Ч 4 Ί ГЧ τν» »» TV» 3 1’ ytmOuTuua ria ηα pa.:>c<ayi\.yany. и mutiny и ya к ivx/igihm. xjn nuv пм~ nauiain υιν показваме, че мутация на arg 1303 до gin самостоятелно (без изменение в arg 1320) води до приемлива устойчивост, в сравнение с дивия - тип
иг
А А.
П Μ,,Τν,ΛΛ, ζ-. ivxxiiiuy
2. I. Експресия: Получаването на мутацията arg - > gin е описано
Rl.M T!YY11 Υ..<ΆTY I 'd ί-1 ? <Άο1ζττηι·ηηη o ft ί nniiin *
L’ou L/WA.U lipuiviup. r zx C трапuipviviiίup α,Η a u viiv y υυιυ,α ηαννραη ιυριιcl клетъчна линия, получена от оВариални клетки на китайски хамстер)
ПП Κ.ΪΡΗΊΛΓίΩ 1Д Ώ Lr Ω Λ 1 ϊ I 1 d /Kzx/nzl·», n ti ζ»ο плпппппт т-и ηαι τ л ι τ ι х iiv mvuiVya па ка.ли,иСиил tpWKpa.ni, и w iivyvupa.ni uinawinnu трансфектати на базата на устойчивостта им на Cr418 pGeneticin ,
ПП AXTL1 *3 ΏΤ1 P.’*' Cin-rpn \ 1, . лт·. ,,,,,,^ ιι\Λ.ι\ lui'ciri иш Digiiia./. vjut|,hauianuiiuik иш ллчиичпиин. ixyjunj ри w събират и експресираните СЗ се пречистват частично чрез *^7**PH 1 ? ΤΊ1’ТП 0’1 ” Q С п / 1 Λ i 17' /г /Tvrx ζαΙ’ίιτίζτ! η 6 Al 1 Λ rzM 1 η η ηρν цигшшацил u nanipuw vj-'npani iu~ ^v /l f чррал.ци1/1/ u uvnvwniv i ши хроматография Върху О - сефароза и моно- 0 сефароза (A WDodds
О П М?лптпЙоца' ORun япптплпптп r-o плЬппЙпт г· QCV1A Л С1Л1У. > K/L1U V р U»XXXpW Ц Lilli UI VA. llVllpUL'Lllll V v/’V-'JV/ моноклонално антитяло (R A Harrison and Р J Lachmann Handbook of
T-pWtWt Ι1Ί7~\1 syrTff tltlri nlint 50 / 70J?A i ) 11 /I ml ivkr\ l/f ί ΙΑ^-ί ΙΙΙΛΙ ШИПи-Н^Чи^У rilU X-/LUUl'H L/l^/l·. и' | .χ. U7 W / / Ul ~1 1X11 Vlll ,/ \\ ; * j суспенсия след това се инкубира с приблизително 10 pg С2, 24 pg С4
ГЛ ί 1Л __.... ft /^Γ’ΓΑ
j. u,g vi {црСчиишСпи huuciuku лилшОп^тпи) г>а хи lvxun при л х_ и ч_х ls / т>
V
A Harrison and P J Lachman supra). 0. 8 ml от тази смес след това се инкуоира за 10* минути с 0. 2* ш1узъдържащи полу^нзречисшсн мутант или див тип СЗ и ЕОТА ао коайна кониентпаиия 12. 5 тМ. Слео това w xJ 1 ' 1 ’ х ,♦ клетките се промиВаш в CFO, съдържащ 0.1¾ (w/v) желатин (CFO_1Л.
гел). Свързване с белязан c P'T 1 клон на 4 моноклонално анти- СЗ антитяло се използва за потвърждаване на факта, че са депозирани /TVAAl 111 Im ί 11НО пт β А XX TV» А11Й11 π W 11А 11*11 > <1 TW» АП т ail /^^1-¾
VAUynU IVMAUnLUllUU Mill уииил 111U11 или 1V1J llia.rin.ivri.
За изпитването. 40 и.1 от 5% суспенсия на клетки се разоежоа в ' · .· IXV/
ПСП . .1 Γ’ΓΤλ _ _ . ., СП 1 D............. _ _ __/Г_________ - СЛ 1 Ζ^Ί—ГЧ ., μι νι\υ· <хл u ju μι раини часши uc инкуиираш c μι Vdri/- dCA, съпъпжяш пязпежланпя на Фяктопн In Нпо кпяпня коннентпяпия пт
- - а - г----- ’ ι ι и ι .......ι ~ ~ и -ι· “ 1- -· — — ’ -χ ’
100, 10 1 u 0 μ£; ml всеки, при 37°C за 30 минути. След това се добавиш
0. 9 ml CFD, клетките се утаяваш чрез центрофугиране и се промиват двукратно с повече от 1 mi CFD всеки пьт. Клетките се пРптпАилпппгп R 1AA 111 CFD- л пълъгпкяш 1ПЛ ιισ/ml nmR vt.vny ч- хчг». κν. ..ν. .. S. vzy M чл-vv, Λ^ν LAM VI.* хрч*.х., *ν.| . .
100 pg/'mi пропердин, 1 ug/ mi фактор D и 0. 3 тм NicL. След 10 κ rniwmn тоглп т nnno R a F’FFl т_ пг. τολΙζ от 1 П mN/f Т^ТЛПГ Δ ii / niULXVLlIU «ψΜ / X-· w yv/vat'/l V. χ V Ljy LX Ztvct XVI, IV 11X111 X^'X> XXX VI X_ /1.- \ нормален серум от морско свинче. След още 30 мин при 37° с on л паипоинтд l/iamlni op vm n ctR от ппрл и АптппЖттпппир n nmnnn xim n i:-q lXVXlUJU|/aiXUUXV IVlA-llllVU W у 1 1 j tLZXL·' XXX XL 'X^ZX-aA Цх. XXXXl^VZxjzj· V* M-JpCLllX. LA VLUllllXUlXU ; a лизис се определя чрез измерване на абсорбцията на супернатантата τίτλιι 4 1 пт Л Λοηοίλυ iiAunom nlzRn R n a oum no 1 лтпг' η η λγηλρζίζ' а ο .от
Λ ΧΧΧΧΛ» .ί XKZV X-Tj./V/ν^^ΜΧ! VLZ1111 X At' UU CL- XV 11111 ytX iUXJ /<-' 4&U>XUV W χζχχμν у V . Ml VI.·:
количеството клетки, лизирани във вода, докато процент» на лизиса се nonnn*aRn
ΙΛ-J 'ί UV.' V'J χ./ <Χ·
Това изпитване измерва способността на депозираните сЗЬ да /К/лтлх жпгчат /KviaFiniriu о а р о F’RKRKP [’•апЙрпгпооо Ιί^ηρ Rnvinn ат η пп ι xpvj’^iAAvip’L.Lixi 4£/j χ ιχχ v<, t* w t х cxz xi i cl K/Wxxax χχνζι χ с/χ. j^xxxcx^xx.. xxvnuv|?vu/Jnia предотвратява формирането на конвертаза и съответният лизис в
Г»ПГ>Т TK Д / Γ-ΤΛΤΔ V\.|·' у Х*Х/ X-ZX-Z А. χ X.·
гезултатът, показан на фигурата,показва, че са необходими
елиминиране на хемолитичната активност на arg 1303 - > gin мутант.
в сравнение с дивия mun. Гази мутация поради това е преимуществена зз г* τχζχι ί ο ft ζχ ηι ί з > пл з ί 11 n th zx 'ПтХлиттЕгг» га txaai i w £ii im zx i з 11 a no. HpJUOUUyilU 11 Cl TUUlIlU llpoyj lull V pV^LAUlllcrilllClA TILL инактивация от фактор 1 и H. ЬфектЯГби могъл да се дължи както на
е мутирал go gin), или за по- голяма резистентност на разграждане при
ΏΛΟI ] 11 ? * СТ 1 Л ^0 b/x'xzjrvzx рппптлпФАппатА » xzxxlzo ппн iinwzazx <·,«*> » птл/мпт.' wi » 11СПШЦ1Д/1 А^’^О|ГкМС.С111Ю р ClO<LpCLZIX.y О.ПС 111W UlU/liV riClLi“ llcillpcy y cl ΟίΙΙΐυΊΠχ. lipLl позиция 1303.
4. фигура
P Λ ’ Λ TV r> ГИ 11ГИ Ζ» A v zxlr A A Ο n 3 3 330 ЛТЧ 3 3 m ’ТЗ A >4 /Лтз n ’ 1 1 lx n ТИ n ZX4.-X ZX A 3 3 A 3 3 A ft f>
V.Jj^klllCUllUlliC V Cl 11 кЗГхСЮ С1П U Aid XpUG'jJd VZllClLClAVClAllCl Л кЗС/СЗ.З A I Cl Ή Ul' U концентрацията на факторите Hui. 01 представя arg 1303 - > gin
111 ΪΤΙΤΊ Ω ! Ιτ*ζχΐ3£»ϊΐ·ρο<Τΐ3 n лппп^п АЛ nni/£jr»Rri b/xbwzx ζ» АИ11ИППА ft л^тацилшо. i А|/иц1Ш11СИ па лиоисл cc u-oivicpL/ci^rvciiviiid с. uiiucani) р методите.
¢•Λ,ν
Дискусия •«С
ОЛЗлАшНПР ΥΠ ΤΥΩ ^vi 1,ЛГП ’1 bi 3 it o Uzxft mil b1 » Γ'Ί vzx αηιπ aih aiiitij no tliuvnuiin. A-tipclfklAAC pUClll UlkU rict лиинили Aid OllAIldCLAC -AlUL- 11U модифицирани варианти, описани тук^ра както следва:
/ t\ ΑΛζΧΑΖχΙτ-ϊΤλ Ο η-Ι Ο W1 3 TV £3x1 ζ- Γ» ft Ο V ZX ZX ΖΧ ίχ 3 3 ZX ft.T ft zhn mini 11 All r> » 1 Ί <» yi/ AV1 кЛкС Λ.)ϊϊί1111 Ct llpUlll’wZLYCACa \^рс·“ 11UC|UUHC· V 13L? \p> A iruL^UV/i 1CU 11113 отношение производно, в което то може да се комоинира с •·4χτ ’П Iril 1 1 A, Ί n 4 1 I A A 1’ W Ιίβηη /4х A Irw ΑΆ T? IrAVim ZX W <zxxl.*£3 A A a ZX W ГЧ ft A ZX A L-VT ZX .5 cp \ пициинсцши aikinuuvn iparuiivp i_i. литни iviuav v.ztvy liiuuu yet uuijc разграден с човешки фактор L) за формиране на ензим, способен да ixnnxixnnii 3 1 ZX ft ZX 1 3 1 Ιτΐ 1
I -4A.JC.pCty U чииссшли ^ T·’ (ii) Амино-киселинните последователности от производни^· помече хомоложпи na СЗ от хора в сравнение с С3?от който и вид. за който последователността е известна понастоящем.
ZX Ο Λ П VI ·
М<1 ς. Ljp;
или за
IrAAAXA 11 АП £3 ΖΧΤΧΤΤΑΑ 1 1 -» ft £3 r> W 3 Ί Ο Π TX ΑτΧΊ A1 I 11 A R П V ZX A A £3 ZX ZX ft ATVO A 13AATV ivw/Ailiv ci yci c ypvcAA иосссшпа iipuiiicunvuu ниспсумиашс/шист.
Структурните характеристики на СЗ съществуват в дивият тип протеин, но не са задължително модифицирани производни.
ft lr л |z4iιΊ ι woo a iio ζ» λ a ζτΐ i om z> · _ L7ivziKATdniv2kfivF vnvyпиши. “
а) ДНК кодиращата последователност и транслираната
TO TO Z4 WO Ο Ί nioRc nOOJOOoRn WO O * 1 *» r\ om nr* R ООПЛП WO n V»r* iioRonibn C2 nooot 'X ft nn ft n^uinvunuua uvLavyuuainumuuni e>a uayuamuci ha nuuvtunu ujiivaoi-*an t' примерите от описаното тук изобретениеша оаоени на Фигури 2 и L, т от ft z_avv~> I ооо wo an nr*R η ηο^^οοοβη т г> л 11 oom ο,ο ow* * i tn m ft <> om v uuiiivv шпи. ι aau iipuiiicuiiui/e iivrv.ivy vnju.iiiv;ifiv>vAAi vv uuliunuua uu i публикуваната последователност Г21 точно в две аминокиселини / п 1 1 П WO 11 <4 0 ft Ί V ГО ·» TVO о 3 Т ГгхОЮТЛО * П»П ОО ’ 1 О 1 WZ4 ft Ш ’ HY/ypVivUlWV Lil U V Cl У ay VII и V lipu-iviv UUlllV ). A xpvyilVFJkac.Cl W? nv IVAflUGV llUL'V’l
Варианти са конкурентни с СЗ функция, макар повечето да не
η.τ τ x1 o nwo fto’ft «own ft nom’< nnnrrroo V IAUUjV VI11VY VC1111 L’ 11 V/I J Y ϊ 1CX Ц L1Z111JCA.
Ь) Първичният транслаиионен продукт е протеолитично доведе!
io zt ft o /XI ) OX ’ .» .4ч ι ι on o zxft τ τν* nini Roon on o » z4\ r* / Z4 or»n <» m T *111 /-С ft π in . > wo o
,)m yi/v yuv \eiipayriv/ LL'Upjanu uvyuGU, cviy|/cl 'v vvuxain ици. \j ι avw ; и скши (остатъци 23- 6н.), е отстраняване на сигналната последователнос
с) Зрелият протеин съдържа тиолестерна връзка между
d) СЗ конвертазите разграждат СЗ за отстраняване на ( zxnwn n wot ini Zo^Vft *7 4 Q 1 ‘IT n-tn оапЬппп o \ ULUKUll ици V’ / * . “TL* A CL.? Щ рСаГкЦи/l V пол > aoi2on r> om ο n ·-» I τι oft «·· nn nuuxvyuaiia v/in s\ uvuanv т и олеете рн а т а в ръзк а.
ZO \ EJ гчтлпт nwoftilro 1 1 o Anlrrwoo ΐ_T v ) i_? i i|jliv uv ш ι ’ uv и ci yatmiup ax
Anbm ZOW T TO *t T ors ζ» οίτ η «О C' ft Io ». глйтгт ycilVlllMp· A |JO.K>C.|JCXZLVy CX lYXVZLVy \ остатъците Argl303 и Serl304. и между Argl320 и Serl321.
Модификации в природната СЗ молекула.
Заместване на Arg 1303 с Gin
1ази модификация е в един сайт на разграждане на СЗЬ от фактор
Т Т2/4х<а1гту-»ШД*о 7° ла.Аттппап а атопАпта па ппа irsnilr лапа г»т /4х η 1.’ т ζχι-ч Т £- 1—лрс шип) с уа ииу< рсууцираиа cinvnc пша па pa<jc,pa_zivy апс спи vparciiivp 1 при тази позиция. Изменението до глутамин се селекционира за ат гчп ii rrR г» ι ία» па плпптпЙплтл патлЙатхЙапа па агчаппппп Ьлптл ишешрапдиат. па ниоишиипишО патииармапи па apuununa, л.исши
Вероятно е Важно за сериноВата протеазна активност на фактор I.
.Ί/Χ • Ι?/'» А Ιτ/ΛΥΤ1 vto nncfR αιια т гк ·» ·» г» Атчл ζ4χι ι л ппгг jWCVJTVMlllM С UApuWlUdlK 111V гш лИурспри/шил на страничната верига, би могло да минимизира каквито и да са . '>—Τ .... .,1,11 <;τ 11 1^1 C —, R *τ — I.. 111111 „ . .’ι ,Ί τ. „/Xirt, ,1111 ζ, ίί „ ζ, W, τ 1 τ Τ— -1 Γ~^ι iziRii ли α pCUJpJr LU4. пи?! 11U чеши оршицпаша lipVHA ипииа cxiipy хсшу ра. мпсииупа подкрепа за тази презумпция е факта^че мутацията не предотвратява п Txza R τχ.ι ni an am ач R aRt’ Rarni τΙ,ίι a /> tw r>i rlx mtm n /4x aah ri ι n ana w» zx n a tm ilia лцч > τ-> прс upиицапс шм м ум^-^мсралспа сшру ллпу pa, vpwpivxupancти па шиисиплр или разграждането на СЗ с СЗ конвертаза. Мутация на Arg 1303 до друга hi. ri πιο Jriinp tiiii а чглФа x-ч a . zx Ίχη ι ι ii ι a nvzxznon n«ii Алпи t-»zx RiiaaI’ ржаЬт ШииПКГЛиС^ЛиПи iVIMZLW llUUliUt/UL LAUyun U-iU умри 11М“ UUVUIL СЧ|/С1С11Х, както е показано в 11ример 5.
t-Σι ♦ A r/x ‘1 4 ZX Аа /1 R Ύ Ί» rA’Imn T4<3 m т 11ТХЛ11 OtWA 11 а W» Z4 R *1 ПП1 nxl'A/ll x>u lviuuiv ycL c ииошидши pcys цирапсши па шмиа раоарсихчуαι мутация на Serl304 ( другата страна на мястото на разграждане) υ ли ζιτχττηι ι лот ο on Rlxilzxiirs'jiii R аппптл ацлатпагш ί лт zx R -» ζ» ι ι χ χ/χ η a am R ypyc-u Mcinaii ι ици, ид.ни*кгш и с ru uivxriM- t j иитрашпиши uoauiviuyC. исиш
Г? /·»·»»-» ίί — А ИЛ A «*/*« 14 4 it Λ Γ4 Ϊ uiaivicviHuanc nd c \jjlu
Гази мооиФикаиия е в опмгото място на оазгоажаоането на СЗЬ ν» X и-'I . 11ч/
--- 4. „1.____ Γ Г?4. ,1.„-— -. .... ,,... ,......... ,,,-.
иш ψακιηυρ 1. кГПьГt урцчшичпиши рсууцирапс па чпкпчшпа κα пазгоажоане от Фактоп 1 в тази позииия. Изменението на ггтамина се « J Ο 11
...........ю_______а ,, ...... А, utoiUcuiiuMUd при ющиик критерии, unucanu nv- cvpc, и ша^и мутация съию не поедотвпатява ппевпъшането в αβν-^вепижна cmnvkmvna.
1. 1 11 V/ L 1 -- J
4,, — .-------------- ...... ..............I_________ΛΊ Γ'Ί 1-,,Ω ....
(pupiviupanAinv па шиилсишср llau раларолууапс па νά uni vKunutpino.>
Отново. Mvmauufl oo crovaa аминокиселина може oa постигне съшия ' J · ч_· 1 .
ефект, както много мутации на Ser 1321 или други остатъци, Включени ft on 11 * ί zx лттАпгипптп ζχτ-τηζχ ftn nm/ллоп atysIIiio l' Lruuninv мешр/ашпмшм uoauniuyv uuhiuul.
В комбинация, двете мутации. Arg 1303- Gin и Arg 1320- Gin •o vo от η η Λ ο m zxvm τ ί vj Ω ΙγτΤΊΙ 1 ft Ω1111 Q llpk y liaOMCLlll 4^^’Μ Mill U-ΓΙ Cllkll 1 Li L'Cl U, UZ1 as vvsnnrrftnm nftnrrmn аппашлппагп on к--илртишаш luv/шш vuuvuvnvum ya формира част от активна СЗЬВп конВертаза. Други мутации ! (7 lr A Lsmi TVS ΖΛΑ11ΖΧ Irzxx <VX1 Til Л11ПИ гч-m * rt -WS niinii 1 Iron ns zx ο λ in л innn a m zi ft z·» m λ·» ПКАКНишмти 1кимиигшции uni m\тации π лмишм kauiviunupam yi/kiiik реакции на разграждане?също могат да бъдат използвани (например
X / 2 Ί r m Z1 П кХЛ O O 04 111 n ΖΧ * Π ft A 1 1 T1 A T'
IVLUaUlll ya. MUycXlll U-JllM.kOk/GLflU Z“kl 1 F~Z-1 17 Ί Λ 17 A y»zv 1 3 ПР СД-ll- ft I’ZX* ri-\ nn Alin A υυ./ 'uiu или uux viv м аимиипацил с Arg 1320 Gin).
Пример /. Различни мутации, редуциращи Взаимодействието на СЗЬ/ ζίχ п Ιτό-ч zxm Т—J
VpCLIklllMp X 1
X.
Di ft z> ол ппа
LJ UUkyL HUk
Друга лаборатория е получила данни, основани както на
И. J. , 1485. Complement 2: 2/: Bechere.r. J. I). et al., 199'2. Biochemisuy 51:
iseman. U. E. , 1994 J. Immunol, 155·: 5285- 5302). за да предположи, че
(виж фигура 1) би могла да бъде Включена във Взаимодействието с
ΟίχηιΐΛ Αηΐ’311 τ-η »п л 11 Lt ’ft η ι ί ί τ onimn ппо/ίτλλα ο ллт пг> г»плю
МС1 'IV. , UpYGU 11 Υ МС k 1X1». ' L·-ill 1 П yaaiiu ll|/vynvnauuui, 'Щ vaiviv остатъците /6/- /76 са включени Във взаимодействието с фактор Н.
/ G » ОП ftn’» - Till .* \j х να сЛСЛсПи η а a
P
1/ (Fishelson, 1991, Moi. Immunol. 28: 545- 552). Hue обобщихме, че no-
Ik r/4-> 4 П on TlOni’lnlrSA mvuiu ya pvyy цчра афинитета за фактор H и поради това е желателно създаване на СЗ производни, които са устойчиви на фактор Η. 11о- нататък, ние rinnn nywp 1} о ft 11 T**» £t ζχζ*τν* ζ» τν*/τ пп ο ζ» * /ттт ζ> η η η »^η νζ» > ζζχ ·» * ι » ζ, ζ» £χ-τ ηη τν* iiM3iicwiviv5 ·ιν uozivnuiiiv ννΓΠαιιι ици οα ivijишцид иили мисли ya uuyuin изявените киселинни остатъци (аспарагинова и глутаминова киселина) ιι 11 o oil д zx nlm a z* TV* o a η zx ζ* ζ» vxrr z* o rv* τχτχζχχ жоп Ш in nrx η oi ’TH τ*η « η n zx nrvn z* TV* * 111ι
U *14 VU UU’kU ЛДЛаПкАПи ya ииуаш ιιρυινινπι riu yv тлшралпи ииншпици така, че да посредничат за силни взаимодействия. В този пример ние τχτχζχ» тп ι ιν» zx ητν» ζ» τνχττ η η 7 X Ο Ύ X Λ rxrv* Am 11 A rn ft ГД1 n 1τ у ft lip VIVI V IAUA1V1V исшашици / / M-r Mill ZAOp- \J1U Гк-Зр G' МШ“ Wl VJB , С/ комбинация с изменение на остатъци /58- /60 от Glu- Glu- Asn в GlvOV ^”2-11 r ΤΊΓ1ΧΖΧ ΖΊΤ tIf TV* rt TV* r»t*/*rrftll V4O ΓΠΤ1 η Ί T* r» 1111 -vn ν* ζ» Iftv* n T*1 1 OTVX 11 Iri ι no Wl“ Vi). A ApVyj'Iklll Mill lipVZIVU р^у/цирипи XCXpCXIYiilGpUGllicir^LX 11C1 разграждане, заключаващи се в редукция на податливостта на фактор
ТГ : I rxft ζ» nmiTt?T*ii /Kz»1ftv*zi ita C'i > mtEp Z* Z. VX-r ΛΊΛ \ ίΛ ПП Лм 1 1 1 1 ПА nil Ζ* <* ΗδΙΖΙΤ’Ι 1 11-r-l Г 1 A. AWa WUaypU IpaiUUU, “IV X-M MG’/Lll yu vuyv :uuy иуицирип y« р*„ууцира свързването на фактор Н, и поради това и податливостта на фактори
U 11 T rJ <□*!) > </*/*11 zixi llr Л111111 Ζ* Ζ» xlzn А П1111 n n zn AZinft nil a 11 A If zx 11 ft ZXTXrVA
X J U Г. AXOU lvivy иЧри.Л.С1.Ции Gd /ГДЛШШ .OCX Lujyauanv Ilex x -z HUHUL pi 1 ί която е стабилна при физиологични условия.
/. 2 Memoa
ранни примери. Мутагенният олигонуклеотид, който е синтезиран,
TATXI 1 TV* otlr Ζ» ft Ο Π/λ,η * onnft Ζ» TV* П A 1 * ZX zvrv* TV* O llpUlllvZIVaL/a IIULAl у VI/dll IV/1П ULUlllia а g t а а cc t g g g i t c g g g c а t c а t i g c а g g а t c g g g е а l c g I l t c c
Резултатите от реакциите на разграждане са показани на фигура
A ϊ 'ο τχζχΐτ ζ» n ft zitv* no u. iv пмлаоиаш, nv
1. Добавяне на CVPBb към дивия тип СЗ води до елиминиране на
О А /1х Z*«rft ДУМ 1 Ά Пт ζ» /llftlinzt TV* ГГ п If «-> ТТ* ZX {^^2 I* Ifzx ГТ W* ZX Z*. /4* Z* ТХХ Г11»*П11 Z1 & Т* Z* ZT Z4 TV* 4 1 ·» ft ο
ΧΊψα i/vpuaaina (ииици шми ιναιιιν iwzuuv v ψνρινιυραιια ν nuyiuiLiuua на ниски концентрации от фактор Н В културалната супернатанта.
ι Ifzx zttv* zx n zkzxr» nn*nn z* v*z* ft τχη x жо η n nlrnmrxo ζ** ι ζττν* ο 11 * * ί t* zx ft DP* 1л Μ
VJ1, 1X.VZ111JV v tpvpiviuparia nv vpvivtv na vivviipvсилиш или nv L/pvmv na последващата инкубация, е разрушена go iC3i по същия начин (ивици 3 и \ 11 М /\ТЧ Л All TV» /4 ft А 11ΓΓΆ ДЛ АЛЛ * 111г Л А /ой ' АТ τ ηβιιιιιι Ί 11 Т ЛТ Г\т ft <5 т Т I /3 тт 1 Тт 1’ п Т->-» ГА -r J и livpcxyu 11-tW’Cl 11/11V1U pao/kUICCl iviczrvyjy иШДЦЦ X U -X^V UV111UC llinV, 1J1UU tkllUiU средата сама no себе си съдържа достатъчно количество от фактор Н τι Т л 1гт п ft п Аптт л оо /ч о н/чЙопо no т *iia тч ο о о»ч о ο τ ю и X CUVlllUL/nwnillld., ОС1 ytl yuuvyi yu nUx'lHv р<лос.рил\у UllV.
2. В противовес на това, третирането на мутанта СЗ с
CVFBb (ивица б) не води go заличаване на Веригата алфа. Нашие е известно продуциране на алфа , съответстващо на СЗЬ, но някои или. всички от тях остават, което показва че присъствието на алфа веригата не е резултат от прексъсване разграждането с CVIBb. Оставащата нсразграусна алфггверига 3 ивици 2fnopagu това може да представлява С31, която не е била разградена от ендогенните активности на фактори Ни I, макар че е също вьзможно някои от тях пя ппрпптяВят ппппплнп СА
Д“ -*г - а--—. ..... —г-г . α— — появяващи ceyiko м\7тантятроя^.яв'1 л тт ·*· л л ί частична успюичиоост спрямо е \ гои. дооаояне на оисоки концентрации от екзогенните Фактори И и 1 (ивици 7 η к) предизвикват изчерпване на алфа и алфа ‘ вериги, което показвауче (ij А.щтантБГне е напълно устойчив на тези фактори, и (ii) алфа-веригата.
УТ~“Г>1 Л Л Λ /W /1 нсразграусна от ел гво р иоииа _,с предимно получена от νοι ιкоято мгпкр па пъле разгласена от Фактолите Н и 1. но не и от CVFBb) /1 ~ 1 f /-ЛХ 71—ΤΤΊ оместо от природния vo (които може да оьде разграден е w гоо?но не и пт (Ьяктппп 1—ϊ тт 1Ύ Все о’р не Всички от а^Ьа-велигите са разградени дори в следа 8, вероятно поради устойчивостта спрямо фактори II и I.
ТТ /Ч ЛТА-1 Г» Т-ЧТ Т 111’ *7*4 <? w>
1..,111U JCLLU,U lViy тицилша flU UUlllUUl ици 1 U—” / UT, и UU111U111 МЦЦ ...и- . UU могат да генерират СЗ молекула, която може все още да бъде лгчтллп па /- 11Ллтт11>11А т7лтА?1т1 Да 11А pciou^txyνпа v iwriwpinaou, nv ν nuvinunnv vtiiivuiuua na въздействието на фактори H и 1. В светлината на други публикувани a ΖΧ данни, това е по- вероятно, тъй като мутациите са модифицирали
Σ 712 Ω .''^ΤΤΊ'Τ .1?^ *'’“*’*л Rlr л Ιζχιιζαί ί Rt R Ri nin rnnon nmRimmn o 4\nlrmr\r\ Ϊ_Ι i » ппгаппп j^CtVlilUn, KUUIUU 4 V14/114/“14 Г1 M UV L'idUAlUpL UblllL'lK 111U U \рС1Г4111 Up 11 U llVJJUyU това воои αο редуциране афинитета към Фактор Н.
W к ΜΖ * 1 4 *
ГТ η > Ж П 1 1 /пример 6 място ο ι .\ което може да оьде мутагенно променено, така че да измени взаимодействието на C3i с фактор В
8. 1 Въведение
Предходните примери показват, че мутации в СЗ могат да модулират взаимодействията с фактори Н и I. За да бъдат открити други места в СЗ, които биха могли да взаимодействат с фактор В, ние сравнихме известните последователности на СЗ молекулата от различни ВидоВе, а така сьщо и с подходящи последователности за С4 и πηνζπ упмпцпжмп nnnmpiiwn Мир linPHmiizhnnnnavMP гиягтъкя υΓ , ..г -„.....-.j—,-г — , -------------, съответстващ на остатьци 14271433 от човешки СЗ, които може да бъде Включен В СЗ и С4 специфичните функции. Той може да Включва ВзаимодейстВие с фактор В (или неговият хомолог, СЗ, В lav чая С4), но не задължително, тъй като други потенциални функции Включват тиолестерна формация, преВрьщане В СЗЬ (или С4Ь форма), ВзаимодейстВие със субстратна СЗ и/ или СЗ В конвертазна активност и ВзаимодейстВие с фактор I и неговите кофактори. Поради пюоа подбраните остатъци са така изменени спрямо съответните остатъци (основани на подравняване на последователностите).
установени в доуг хомоложен протеин. В този случай човешки С 5. I ака остатък 1427 е изменен от Arg в Gin, остатък 1431 от Lys в Asp, и остатък 1433 от Glu В Gin. Установено е, че полученият в резултат мутант е податлив на разграждане с СЗ конвератаза (CVFBb) и СЗЬ продуктът се разгражда от фактори Н и I. Обаче, тези мутанти не
Т-» Г\ η ΙττΧ,Ο V» ZTTV1 V» ТХО ft TXZT 1 » 1 «”» 11 £i W1 ГХ 1ΊΟ жлЬрб/ЗТЗ X? ft V» A Irxn ο Ιτλπτπγ» Γ» 1 Г» ft 1 1 ГМ » X Ж livy ivpv 11Λ111 llpLL/JJ UW,UHtlllU 11 Ll CL fell 1 Vp JLJ U UU 1L1IUC ЮсЦ IVUUlilV V J C1L·’ UV U-1V1 от свързването на Фактор В в C3i (или СЗЬ). 1 lopaau това, ние * * 1 / 1 чх
O * rn 0011,111 1 1 /.3 λ mm η 1 1 п ГГ rm η ft ΤΠΟΊΙΙ Till Ο птч V V» ГХ 1 Ί 11 4.VΤ Ο β ο npuiiivAvaucLiviv ycuiriu., 14. мушацидша м uivou учисшол. нипиЖаио взаимодействието с фактор В. Докато това е нежелателно за οαΐΛ’ίητΜίιΐΐ пгп л пп oirrwrx nlrrmuRnn lzrxn Йдптт ο -» о rm rx ft οιττηοη уеслнсрацилша nci ujuvp амниигш кипсиршал!, шм u ^ij-icizi преаставлява инаикаиия, че оруги моаификаиии 6 аааения участък от , ЧХ ЧХ ' V'A X ЧХ 1 ех ЧХ а'
J 1 1 /X 17 1/3 ПГЧ/МЖЛПП R 1 Г> 1 п X о о a ii О т Й 11 arm/\ гх Дх п 1 т пя rx ν» Т? 11 iirrlzrxii rvrv» τν» rrv tuuyu 1X1,4. UpWlVlVIlU u^auivivryv UU111L7U4. 11147 V kpGLA-ll J Up 4_J, LL X1Z1I4VFU Vlll 111Z1A.
вероятно ще повишат афинитета. Като следствие, такива мутации m ·-> ο τν» η in/х η n mrtRiini *x τνχ χ-»τν» oon a iirx <ιτν» rm r> 11 nl^mi 1 ft n rx orm *m r» no L’jua»ii vuuj,v yti iiML/uvuiiui ипаиичпиихнша u aiuHUvnuunnia iia бимолекулния. конвертазен ензим СЗЬВЬ (или C3iBb).
S. 2 Методи
Подрежданията, показани на таблица 1,илюсгпрират зашо ние считаме, че този участък е кандидат за мутагенеза. Ние обобщаваме. up уяпяктелите на лялените остатъци са ообре съхпанени в СЗ и С4. но са отчетливо различни в другите протеини. Остатъци 1427, 1431 и изз гд полбпани. тъй като тяхната плипола е показателна за групите, включени В протеин- протеиновите Взаимодействия. Измененията са направени спрямо съответните остатъци в човешки С5, тъй като те показват много различни електростатични свойства, но в рамките на Hwmplrrma мя накпп ηηνρπ гт.лпянрнн пгтятъпп които може 03 показват сходна локална структура.
л
in
2? Q Z Q Q Z ’T Q Z Q ш Q
Q сс н
а. х «Οωω-ιΟω-ι η
-i S S -i -i - > Σ μ- f— b- — — CCQCCCCCCQCCCC
τ·
3
S3
a> S a u co CM
бб C6
□5 5* T
* >»
<u
□5
CM
•to Tj-
Φ 0 □ φ c/> 3 .52 Έ) w Q. E C ¢0 E φ СЛ 3 c co E φ 0 3 c CO E
O o co <0 3 o 3 o co 3
Σ 2 X —1 X s X 2 X X
Murinoglobulin Mouse
AIM Rat
AIM G. Hamster
At 13 Rat
Методите на мутагенезис, експресия и анализ на реакциите на
VC* Η 1ΊΟ 11Л /''ft X» X» ТТ*л1Т11Йп 1г X» lr ft 1 1 ГИ /X X» X» ZXTX1 1 /X X» 1 1 1 » ft wa <*·νζ\ XX 1 Ί 1 1 τν ο ра^аролсу αην ηα κ » να шилииа, лилг/иши чи ипичсши м ирчулмуriuiuv примери (Примери 1 - 4). Синтезирани са мутагенни олигонуклеотида
tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa.
Изпитване за кръговрата на фактор В.
1х Х»ТЗ ТХЛ Χ»τ 1 ТХ X» 1 1 1 1 XI TVX УХ ТХ Г\ZXX т! т TV ниапплттхйп /ХУН глс l_X44iip»4 VUpariU.21111 lipvy\ 14111 4V 11JJV TLILUIUQ Mill WxJ чрез афинитетно пречистване върху колона от Клон- 3- Сефароза*
Г» Ιτ-TW XX O ЛП1 1 Λ η И V ft 1 Γ VI IX V () I ZX Т 1 1 К я АЛ IV хх хз ft XX XT 1 1 XX /х wi 1 л* * « lift η Е Л 1 1 ft 1 памни v viiucanu v upuivitp· 7. i uju ivi4iiivy миуи ум цричвьжиса лишАрси.
на тиоестерната разрушена форма С31. ДиВият тип СЗ се изолира по
Π 1 1 1 T 1 rv W плипп D η ЗИЛ тв л η η η η η Л ΓτΐΐβΐΙΠ win / 1 ·’ 4 υαμίΛίπ пачип» ι а.>^д\уалил riu v|u.v»uzi niu.ii ч_^-· у л; 7 пропускат върху 81)8- PAGE гел (при редуциращи условия) л i t r\ л wx zx XT τχν ο * 1 ί χχ ζ* rr r-tw mi w> x» чамичшиликлпм v глункипша
I ^νοίντ VI 3 /MV zx ΖΧ1 1 ft ПТИ XT ft /3 т t Ο τνζ-χ .1 срсии^гшши иЦСАШДиаПк C'U.
мутантът присъства в концентрации, еквивалентни на малко поl ГГ1 , irr, <XΤΎ1
IVkCUkEkV MILL
Същите разреждания се използват в пробите за кръговрата на фактор n C ..1 ~ — > ,*,,1— ~ - nc ..1___n . C...J
IX Д LU Mill 111C5U V-Д LC UHKVVUpCllil U LU Will Vl'M’ 4J , и>уо[-‘Лч11Ц Д1И1 •т V r~ om (Wmnn Fiji nmnwuiinwHo 1 6 u p/ml om ±_Ί- оеляч/ЗН dwkmnn r>
.....- I. - > --1 --- ....... - - --- --- - . J ,-— (приблизително 1000 - 2000 dpi μι) за 3 часа при 37°С, След това пробите се анализират чрез SDS- PAGE (редуциращи условия) аВшорадиография върлу изсушения гел. Получените резултати са показани на Фиг. 7.
8. 3 Резултати
Както е показано на фии. 7, ясно разграждане на фактор Е сс пет-ипргтвявя пппп ппп 1/ 1?5 ля?пр*1*лямр мя лпКпя тпп СЗ (C3i) И
-----,---------а-г .- -·[- - - * LF Г * j, ......—. ---- у - - - — противовес на това, няма забележимо разграждане в присъствие на мутанта СЗ, дори неразреден, който следва да бъде при концентрация *
ПА- П11 Й Ctm тча orxailr поп о 1 / 1О^ zxrvt Aiiftnn тюрю
11V L/UUMIVO. Mill Приисшш v pUUpUiTVyCinv X/ Ιϊ-J V/111 уииил шип.
Поради това, този мутат очевидно притежава увредена
ΖΊΑ ААААП Axlrn ТЧ A A OrX A χΙ/Ά A X X а ТА ГХ ΧΊΑ /ΚαΕτΧΛΛΑ TJ ЕаДХГХЛ ft Ο ΊΑ ZX ΖΤ TV* X X ZX viiuwun win ya nvyy ирлли рсхоорсАЛку cinxinv па ψυκΙΓιυυ x^, icuciiiv ихрилшпи се аължи на намаляване на способността mv аа се свързва с Фактор В. О » л. ί ί
Emo защо това е участък на СЗ, който може да бъде променен такауче да модулира взаимодействията между’ C3i (или СЗЬ) и фактор В и може
Г*7!,?! 1 П Γ*ΤΤΪ Й^11 Λ. TH a 11 Ω lrzxxx ft xnm a a a txa a //^^2 xT21a n * ix ^’QIaTJIa 1 vu сслЦи uniavcukii winiiia па килии ушазаша или Vduxjuj.
Г rV1 K f A ТЧ 0 1 ГтХАХ 1 X X ATV» ft A X Ю ΧΊΑ a 17 ПтЛ ТЧЛ АХ 1 ТЧ A X Ί Ί1 X П TTVX A 1 X TXA X 1 1 1 Г' 2 Λ K ZX Λ ίχΐ ’X npuMtp x xpv-luviilLJcxiiv па експулсирали mjшапшл u. v iviv. kv i\
Ο 1 βώ/ιαηιιο ' 1 и uwy viiu.u
1ози пример показва как мутантните СЗ молекули могат да ίχ.Τ Z4ATVX Ί X A ZX * Ί Ί ТЧ A X X Ί Ί ΖΧΤΤ4 ZX А ΖΊΟ 1 Ί A 43 1Τ А ТЧ ТЧ £□ A X X ZX 1 Ί Ί Ί Α ΑΤΑΖ3ΖΧΑ ΤΑΖΧΖΊΖΧ^ΊΧΑ ΧΊΑ vuyaiii иоилирали uni уауспа uixuiipwuviilia ир/иусх, Пиуиипа па куртуралната среда на трансфектирани еукариотични клетки. Чрез
ΊΑΤΧΖΧΑΤΊΑΖΧ A /lx 1 Ί X Ί X 1 ТЮЛ TVA VΊ ZX TX r\ Ο X X X 1 ATV> ft A 1 X <3 npwniv oApuriuiiiv.liinv npv nuunuanc > ΓΑ Λ Μπτ 4 η TV* Ο AZ3 ТЧ ZX * 4' ?1 X A ft A TV» ft v.v lklVHVlkYlkUilK uv нилупаиаш задоволителна чистота за функционални тестове и конюгация с
A X X ТЮ X 1ТЮ А Λ ZX TA ZX ХГДТЮААП ΖΧΤ4ΊΊΑΑΧΊ ft I T ТЧ1 X Ж Я£Л A 10 λ/fnlraA Д 4 ХТАИ u atn n z\ rw /К-./ЧДП CirilllUlliZUkV/ 11V IVlUlllVyd., ШШСОЛ L' XXpLL’VlUp^ 16. ivxcxxvcxp икуацилша V1L' yuyvn антитяло да се съпътства от хидролиза в значително съотношение с βπ 1Ί1ΊΧΧ1Ί1ΖΤ ΊΑΑ ί 1 Ад ΑΤΧΑ ΖΛΤΧ η*-* ΖΧ ΖΊΧ ’l’ Г V VY.T 43 ft ZX 43 А111Д ТЧ ZX AVA fX rrx Ί 1 TXTXZxlrXr TTA AZXXA A A иип1ипил шиисснкр, V_ V lipvyy IVin&l V L7UV елце ниулиулш, lipv ГСvpeup ->tl получаване на активна СЗ конвертаза, а така също и за продуииране ни
Г^Х* nnnxnrvxn * zx lrzxi JIzx a nmxx ΤΛ·, XX тЧ/XZWZXZ'i ftciTAZXrVTVXtXzx 43 TXZXZXVZXZXZTXXX Itatvxzx XX-AATV. ---unill U.lilZLkV KUlllVuaillU. XVUU iivy^vvy uvpuAiiinv V пиулиулщ 1YU111V паси:
от npoavkma за приложение in vivo.
Л XZT ·
9. 2 Метод
Λ zK X 1 X X X 1 γ-у» ZX ТТЧ X X ZX юпо XX X X <»ТЮ ft а 1 Ί <3 ΧΊΑ 4 АП ^2 C'oAnnAnn kvpuHUHik liinu npv'шитиагк ηα rv iun- v ислрирсма ,
Клон- 3 е плъше моноклонално антитяло, което е спеиифично за
XX X 1 ZXAZxft X 1ТТ-Ч A ΊΑ T4ZX1 X A ft ZX ΖΊΊ X 1 X RE 4 InmiTH a * 11 A /^*2 Ια XX I 1 St sUm* T) 7 /7* s 1
U riVWUUlllV Ирииоииупщ UILWlUllIumU 4^zVU U Vdl X_>UV ItfflU. Uli, ί . J, Ci Ui.
, 1980, J. Immunol. 41: >03- 515). Подходящи са и други антитела срещу
СЗ и в някои случаи са успешно приложими за изолиране на СЗ от малки
1ггх * 111»оzA-rviЙ п it /лЙтпРп <л «/-»-> <· ζ* ί 7Ч/-. 77/- А Т1/ 7ОПR A if ъ+Ьο Пг· Та«.-»ν* 7 ОR
X4V/lUTVVlllUa lUUVUina /пихни l/UUUJ, Z*X. г» . » jNCMIVUJ MWllUl. AA.-‘.
46- 61U и поради това са вероятно приложими за изолиране на молекули.
O f,’ППТАОШ n n t in Z5-V T Fix TK\ r,r: a nn Ini π л m r» oo Ιζτin л тinr» ϊζτ > κ Глжппг^п ГЧ 1D ο
Λ.νηρ\.ναραιιυ la \iw. xgvu ψ^ακμιΐΛΐιια uC Милица κυινι Α.,-νψα^ναα 4_ ί—~ τυ v помощта на иианоген оромид (методиката може да бъде намерена в
T-T *-«-·» f> л <-> /·/ T ο Ο Ιλιλ^ ζ. 7 Ο Τ-Τ/-.Е ΐΤ Τ-ΤΙ ζΜ4·ί·νι /-ι^ί/^Ι Jim ν-ι » » < « ί ζι 7 Ζ-» г-г
JCt///□<./// ttri/ΙΛ ΧζΌν, llU/LULATUA LSJ jUAUCI trrtx, / UUt it lit { 1/lAt Ц/Н'^
1/1 т::
edn. , Ed. s. Weir. Harzenberg, Blackwell and Herzenberg: Blackwell. Oxford).
колона от тази смола (ре- циркулирана), или най- напред се |r/MJ п ГИЗ ΤΥΑ ТА11 ТА П TTA ΙΙΤΑΡ? ТА ГА£М 3 М ТМ 3 ΤΤΑ П 11 3 1 Ο Г· RS σ-с ί w / хгЧ NT о СГГ JxVZl 1 Цч. 1 1 LL UpUl l ί IpVs/ L i£.'4 V», LLL1 V* 111 С1.Ц U*ZX A ^r—*· ,'L' ^Vl; * /
1
V>
ресолюбилизация и диализа в PbS, 5 тМ NaN?. Колоната след това се
ППЛК/пйо f' F^FRQ 4 ΤΥαΚ/Γ МпМ. Η /ιό т_т_ТАт]гОЗ|Т 1 Л.4 \7θΓ^1 ilpV14U.l./U V \lj л _L>kJ, 11Ш1 kl yil j A JLZ.J, VUyUpZIYUlU, X 1TX ~ - .
; и: 1Свързаният СЗ се елуира с 50 тМ Na боратен буфер, pH 10. 5 и
Tris/ Hcl pH 7. Материалът след това се диализира в PBS, 5 mlv
Получаване на l3, носещ His- lag t
афинитет към колоните, носещи Никелови йони. Този метод е бил считаме, че това би било полезно за изолирането на експресирани
113 3 г»;згА11 1 1 f \ 1.1 Г> 1.1 uilLk pmivi i-- 1!
мутагенезис за генериране на плазмид, кодиращ сЗ с опашка от 6
VI 1 ПТТА 13 П11 VI ГА R11 личш UU U1J NZL.’ LI
L· ο ταγαζαΙζ/ί 3
4ZNZ1A»- W
ί V η тмЯгаЬ nil y 1VIX.£Z4Z4Z1V4- Ul ίΙ-'Π' nrn: С
\.П_ 1 1 1111 ί 1 V> IX
1663). Гази локализация на his lag е подбрана така,че да доведе до
и формирането на дисулфидните мостове на насцентния СЗ. Остатък
1ЛА1 й
1'7'3 1 Ч остатък, предходен в последователността (вероятно Cys 153~, Dobner.
K. and Aotlrup- Jensen, L., 1993, LEJ3S- Lett 315: 85- 90) u nopaau това > А С! Й !Г\ Λ Й л л ria 11 ηηη η ftziii η ιιιι in гтгтч п η /~ι τν» ο '» » ι иосЛСжуа м/кас-мраз j ινιην у а ииуе папраик па ипсСрцилша acty шали структурна характеристика. Мутацията е въведена с помощта на
ГП р Υ14 ’ 1 Й ТТЙ Й V} ** ^ΤΊΤΛ ЛПП11 Л ТЧ*ЛЛ1П1Л^ mnAinftniTA ft I lr»11> Гртл 1 Γ» ТЛЛ* ГЛ111Г*Л Л Т1Г, uivzknuLka.iiicL η а празнил п/казихиу , из им/ ю u cilia u liuumCp X, k ПиМШЦШа 11 Cl мутагенния олигонуклеотид, синтезиан с последователността:
taiuaiLClLLCllLaLl^LLLLaLG,LL·
T21r λ Ιλη ft r» nnm r\ ХНккЮЧиаПк UHJ
11Й τΊΤ*1 n I1 ‘ ’1 n m <» ТЧЛА * оллб л τν» a * ч t zx Am r»o I1CL iipciMUJkilCUUU ilWV^kkyVUCLlllkxknklUlll kk
ТЛЛГЧзЦт ΤΛτΙ,ΤΙ O ft Γ: <\ 11V111M L>pzi\y auu k
ДНК съгласуване. Гази ДНК последователност може сега да бъде
>111 Л ПА
Ц L1Z1 114Х еукариотични клетки би било възможно изолирането на експресирания и п У 1гЛ * Г 1гГЧ4ГЧ11Г» 11 /ЧЛД111 г» U lllro * пйн 1» Z4 4JJ » ί my пит лилипо, nvkk ώ,α иилкдиии иипи, или чрез друг матрикс, който притежава специфичен афинитет за HisТГ
о ί D О *ЧТ Ί Λ TV» Г» ТТЧ 1 1 ' Μ 1 к 3 Y/killCLillU
На Колона- 3- Сефарозата са пречистени множество мутантни
Λ”4* RL· * ЬхИПГИД ΊJIA Л11ДПН АТЛИЛЛПЛ ft ( I vol В ГДтЛН 1 11 Ο ο1γΑτ»·ΛΛΑ11τ»Λ111 1 ft kJ, UlkiklMnUlllk^kriU unkou, Viiuucxriu M xxpuxvikpu X U XL·, klkUllpkkUpaXAU M V11V клетки.Получените продукти запазват способността да подкрепят тч m тппч1лη η n am л п rt /4ч o Irrv» nn I? iman ЛхпIrrv»лг» ^'т Ilin гттча > mm гч η α ιιίππ ι ?; ft a разсра/куапкши ηα ψακιηυρ и през vpaikiiiup ±_/. к ищилш ivikinxiy < изпилл a за изолиране на мутантите, описани в Пример Ь2, експресирани в COS л orv»lri·» гЧ<ч£чЛГ V»1_1/4*V»Z4 ГЧ 1 1 ft O TV» ГГ βη,,Ω ,,ο VT3V DAC.U лдлаЙд nrJrmft η rukkilllkU. VpkUDpilUlllV МЦМк lllZlUCirik ηα I/AMLj Gk/kUUV HUKaJUO.
0 Пк изолираните продукти не са 100% чисти, но често показват чистота.
ПЛ ЛЛ * Л» ХЛ 11Λ41 Г» лПпп ΊΊΓ» чПСС I r\ft Г» 11л(^Л Am 11 nv/члп ί ί m a a ж a tv» атчп л λ ii пи- cv/k/ηνια или рампа па ju/u. хмиа иуиа иш иолиупишд ivianik-pua.iu, обикновено съоъпжаши по- малко от 10 и.е/ ml в 10% ίν/ν) (Ьетален kJ .1. « иЛ \ ' I . ζ,,,,ΐη, ζ,χ,ν,ττ. T ~ It . ,,,,,, D__. ,,., -..
IIICACUIKU ucpyivi WMUU ypytiU fk/vtliionnu пришеини. xj уинолсиис Ml’ Id разредени по време на изолирането, и активността на ендогенните фактори II и I е очевидно ошСшранена.
Пречистването посреаством His-l as вкючва по-меки условия ί 4Ζ V r
Tin a ‘T’nilll Л 1Ί А Ь Λ i /ЧП Л 11/ЧЛ£>1П α ΤΙ ΗΓΟΙΙΙ XJ ПГТГЧП» т V 11ТПА Α Χ β Ζ» Α£4 па ч./1^ациУ1 Για пилила., пмооьЦа пипллиии иипи. х xcxiipuivivp, иопил-ша w
ЬША. Прилагането на този метоа спрямо СЗ порааи това слепва оа
I V/ 4 1 VZ х> »/
връзки.
Пример 10, Конюгаиия на C3i към антитяло и използването й за по F*^ lrrvn Q д глт пп ι η tv л ζ, It т tι β τ ί алта no. ν.^· rvMiiuvршаапшна aivuiuL/iioviii
Ь < .-.-= IV i-‘xΊ Л 1 ϋ Т Й п п Л1 1 11Л
1U. Д XJ 1Н/ЛуЛ пил
Ьдин аспект на изобретението е този, че стабилните СЗ
- ZX t 1 β £S TATV η·111 η A i ттпапн АГА X ГЧ ’ГА п t t ТА 1111 F^^ Ч »А * olrtl * A 111 п ПА11111111 Л TV Τ’ΛΙΙ /tit
IVWriL’k. μι 11 и ' ay lU'.V Ί4 пи Mill мутипшпи V-V lVIM-'lV B.J-kU?VU,V llpu -1 UIIZILIJ yULLT-.n превръщане на СЗ, което,ако е локализирано в определено място, ще
ГЧ /Л1 т TV» 1 1 ГЧ η 1 X ГЧ X /ГЧ А £1 X < £» 1 ι ГУЧ 1 IpUftlVH 1 up и EUIVIIL'K В14- пи 1
А Α β 1 1 At 1 X Γ A TV A A TVi A 1 X A I I АЛ АП /М 1 1 1 Γ»Ί Γ. 111’ Г > T-V τ' зииил uiviaiiici uiiiaivu. xip(.yin/4uniiinu/ni.· i за насочване на отговора е да се куплира мутантната СЗ молекула.
» ’ А IxvV» ГЧ 1 ТА А 1,’ .X 4 1 F^ 1Ч Πηηΐΐΐβ АШ111 1А £5 Ιχ.’Γ X Г ПИ TV! 1 1 TV* ГГ A A ATSOlll'l Ях ПИПА ikaivniv ч.-·ι9 inaivu и iipvu..>L.>vyiiuiiiv, i\ uivi аншиш/ши, нкциуичпи желаната мишена. В този пример ние демонстрираме работната
Т. ГОТА Anlll'-Ί АП жпА1 Г11А/1ПО ПА ТА А 1 X 1 I β А ΙχζχΙτΙζΧΠΑ ТА П 1г ГЧ 1 1 ТА XX А А АТЧ 1 ч /X Т I ' t 1 nivinOyujxa να tpvx'JUupcuiv ни шалиии нишисаши, лииши ^а n^vuiozivu.
мутантни C3i или СЗЬ молекули и могат да бъдат изоползвани върху » » A TV O Al » A * 7 t А Я\1 1 1111 Ά xX ГА МП A AO11 1 1 A TV Л1111 ΑΤΑ /X A ZT /X 1 Ί A £1 1 X A V»A£i nil Alli 1 <ι Ή 1 TV » r машкриалц, ayunumvmnv lipkhuuuvnu oiii yayviia viivxipktuunna (.uumtni.
дори ако тиолетерггна СЗ е разрушен по време на процеса. Чрез
1τ-γ »τΑ Λ 11 ΤΑ η ΠΛ 1 Ί А 1 1 Ττ X ,Γ /X А ГТ £» 1 1 ГЧ nn ТА 1 t TV» XT л ГЧ ΙτΓΧίΛ Ά ΖΧ АПЛИ 11 Яч Ill’ll Χ Ч А£Ч nft -· ,п у ii/kupan v ria ν_—ί ivlhvi уиулпи αηιιιαιιιζίϊΐο^ίνο^ιιιν еил цинични w u/uj към овчи еритроцити, ние по- нататък показваме, че конюгатът zixt llr ЛПА/1 F ’ » Ιτπ IX I ГА AAllll TA 1 1 А ГА A A aQ-T AVI Ί АГ»ГА TA A I? A 11/1 M Г A /А A '41 ZX .'X \j/uivvupa ν-^·ι Λ,υινι лриш^ицишиаша пииирлпмкШ шили, ил mvaw yti vuyv формирана конвертаза, C3iBbP. която да инициира лизиса на тези ' Λ Ota 1’11 lr ZX A A TV» /4 П£3 AA1 1 * Π А А ГА ΑΑΤ’ΛΙΙ 1 7 /X * Г TA ZX 1 1/11 Ί TV» 11 1 1 A lr А» /А A xi X /13’1 TV Z1 ruxvшли^ииаши u. lipujiaaain yp<<u ivumnuiivriiiiu nci липихил-каши β-τ β ·.. οι-* формата на нормален серум от морско свинче (в AD1A за vi A П ZT /-» tv β ТА A m XT β A 1 I /О 11-Λ ft A Λ A A Η ΠΤ’ft r> 11 .5 ГИ Α » 1 A Fa 1 r Al 1 Й/Υ А ΑΛ Λ 'Μ И A (1 nnft A rA <4 < 1 1 f\ ιιμνyviucpuiiviuuiiv. nuuuvupaojuuiKinu na v.·· ikviik/vpiiiaau j. νvywi-αιιιν.ιιιυ конюгацията на антитялото може да бъде използвана, за да насочи С.Ч молекулата за иницииране на комплемент-<заВисима атака на гчттл oo л 014 I· * л yni nan rm ι ·» m 1 ' zx 411 nnn* глух п-юххлпЛп oiift rm »lm o rm n/xft tn nV
MlipUy LAL 11 1L_ IV 111 U 14. X1 111U1X. XMOU lipUlVlvp UJHU.AJUU ytiU 111 Uli V-Zl Mill 'lUULLUliQ плазма, която формира СЗ конвертаза in vitro. In vivo дивият тип C3i и ί* ·*Κ Χτ1·! ll” 1 'ΛλΙ’Ω ft π W· οτν-ι Anlrm/srs EJ τι Τ ΪΙλ-αα ηι ι τΎΊΖχΡη * η η ί ί m 1111
Vk j Γ1U UJjVZLY ClL7Cl.il 1 Mill VpCUklllVp 1 1 U X- llMpCLyU. liivn/Cl 141^: 1110.1’11X11 iu ./, конструирани съгласно дадения патент, които да бъдат устойчиви ί ί n /К n Irrm omi ι u n T ii mom n«nn rm oft n Лхотж nimniiin nrm η οι ι · ι ί г» Д lr ο ι -τ f* .x m rm n -* ria LpciiviiiMpu ii u x и имрауи химии крмртирииЦи miauumiu k,^,-· лмпс^рпюоо, биха били преимущество Във физиологичен смисъл.
1U. 2 Метод ( f \ 1 Ftxo rn rt ’ пгхппс η ттотп лт ft nnzs ii n Γ'Ί ι η 11 -rm ί » m <-r * o b η” l/ч ί a rm ^iy X XpMUJr ЦЦ|ШП4 U 11|74. lUVUlMCXIlL. HU k JI aruii uii ι/и хм кигписаш.
Използваното антитяло e IgG фракция, изолирана от rn Z4 A 1 7 1 - Λ Z4T 1 n л /4 TJ? Ο Ο α n 1 bl 1 A n rm n /X ft 11 1 7 a 7411 rm m /31111 W4 ail A 17 rm 1 1 zs O тт ГХ r 1 I -rm ZV ZS £X 1 ivaiuviui lCL.kk П зассили CirilllU“ UU'IU 4ри111рициШ4П a.nxiiuk-k py 1VX. X. X Illi, CL инкубират със /5 nmol SPDP В конюгационен буфер, pH i. 5 (20 тМ
VU DO п χ-νι 101 к>, * *
V.
Ί K,f ΚΤηΓΊΧ m Ί „поп mn пгтпГ^п rm л x rm л rx n tvat Tvx ry Dnn TnO nz, xx 1 vi .4 avi / j a. uglc. na uiiiauna 11 iv nine pain j pa. x xz 1 ~ L пречиства чрез гел- филтрация върху Супероза- 6 колона (Pharmacia) /ft·, ft zk zx rx Дх r>rm λα a νχτ 7 жоп Щ Ί Л т txxbniii ^17 131/ 4|7MV4|Za.iIIk 1; MV vpc р, рх 1 ? . -г, и и у UpZTVclLM, V. М 1VX i Ч UV-1 1 к у у лцилш ’ <1 ’ !
прооата с дитиотреитол се използва за оценка на 4 PDP групи.
пречистен СЗ c 0. 1 M метиламин. pH 7. 2 ( 2 часа при 3/ Cl Излишъкът rxrm » mmn <010111 no nm nrm m n 11 rrft n птлл “to a An 4 rm rxen no Иг<л » nn/\ zsrm mui ivik-iiikkkaxkiuii ll Miiiviiipa.il/XMa. *ipvo ела* ми-ипрацил, ftULALycanu 47111 диализа в конюгационен буфер. 18 nmole C3i се смесва с 1. / nmole от
DBD r^rz ft 1 ДА rml I rnil Inonill 1 niwn ixTTzRom 11 no linlnrnilTXn AA 1 АП11 11П xzi - i; x. x,'/ ini лмшмоацимис и мууркр и w mifij vuyci .7a x yvu i:a стайна температула. последвано от 1. 5 дни при температура 41.
rh ί 7 nrm n Q m zx 1r η n ft n nil ft om on n rxrx-rm n Pro л T? ϊηο D А ЛД1Т-? r»o *
44/LlvVpa L> llMikLlOL7<l ици4 1И4П k· VUUU1UA31L L71UL UL/cJ’ 1MVJ1_ GUI реакцията на конюгаиия, илюстриращ пояВата на образци rrtxii^x * nniiyna л пл Д in ЪТЛ n Irzxi 1 τη ZX 1ΊΖ2 nrsiins ntn ft nrm linmn ft О1ЛО iipuuaujuuivzuiv ..’.’V ixi-za^ixviuiiiv гк iipuvutuiuaui пиши υ z i/ι огт zvx tcz> nrm <**. а η
Min νΐ4Χχ.νιιΐα. ->α от in rm rx |2
LI LI J V t ’
С31. 1 ези образци са частично пречистени чрез гел- филтрация върхс
C t тт л-rxzx ο r\ F Ir/x » zxn a ft т ft zix zx <4z4x «-» rm л τ ί vx< T/Jxzr» m MJ Λ 07 ZX*r τχχΐ,’ All·. (\ s A 4 Μ,,Π k у не ризи“ и Г4М.:ΐνπα м υυ ψννψαιιι^ ιι му vpcp, px x :. -r, c uy upzxvatv, m. . m i * ·*
У“ след това диализирани в PBS. 1ой е елуиран преди СЗ в обем, от които молекулно тегло от 300 - 400 kDa би могъл да бъде изпитан чрез
Ir A · x ·» w-wt 1 w A n o a a * AWT τ * ПТЛПН > <r> « □%’ * nil awa nn on wwn ι τ L/* Ann on wn rxnnnn a wn ivtx/kUMpupariv v v/wupiapnu iviuatnv.inu viiiaiiyapinu.. хшпцчпшрации мш конюгата, свободно антитяло и некуплиран СЗ се изпитват от w» i ft o wn an a Am o omo Ini χ ι n TЛС T? A. /ft. |_« na * ί τι.
V Vt/UlliaOJlV “ MLUV UMJ’ A GVA ^11’
JWO ГСЧ Т1ППЛЛ1П11 τ ТА * W ft 11 n \ pvу > циращи Yvauuun^.
Дву- дименсионални SD3- FAGt (първата дименсия нередуцирана.
Rvnorxnmn ηχ 11 <αι ί on ί ι η Г4Л11 r \ r-> nR л лопллоп lxonlrxOni >т an
LUllUpaUia yUlVlV£lVU/l pvy γ цир/игш/ ilUKaOL’U UUp/aJYU,, Г*ипл Y pv 11111V 11 конюгат между IgG u C3i.
(ii) Демонстрация на факта, че СЗ- антитяло конюгат може да пх пп п пп/л « iR пп /та п плапп Imnft MIM.JV UJliO/kOL/ari ya насипи nunu wn A A X 1 A wn A A Fm nRn A A wn AW O111X ’ AWW 44 A O · ЛПП шаопаша ашпимимиш vpvuu,\ Mirpv-y v.iv riu клетки.
on . .1 ~ — , --, ] . .. /n /., _. \ ί : 1 nn 4 ;
μι мш райрк-Лкуапилта γη κυπιυύοιιια ^нлма пишисашj, 1/ ινν, 1, лО 1/101 се инкепипят със 100 Ш от ппиблпзптелно 1% ίνΛ’1 овчи . , / · -в £ ' ~1 ' '·.
_ . ___________,___~O -........ - -1-O..O ., ._________.1-- .......ο ΤΊΤ-γη сришрициши (нреуиаришслни нримиши с скиииалсншни количшиии гигIqG (без СЗ) и СЗ сямостояте\но Клетките след това се промиват 4 η Ζ·Τ Ί“4 л f\f\ 1 Т Т ΖΎ П ·· пмпи о еш и се ресуспендират до ιυυ μι п;о, гюследоано от доиаоянс ня 800 it! CFD, съуърЯсящ 10 πτΧί EDTA. u 2¾ iv/ v) NCPS,}|pv?jj.rnc 50 ul от CFD от покритите с конюгат клетки се инкубират за
ID IviUH Гфи ft7oZ^ а ЧП ill Z^TnT^ fft· г»7.п%.гхл1лп111 1 ОП lift/ ml Я\ а Ιλττα гчгл ТЗ ft ι ι rr 7 ml ν · ν .-*л/ рг V- л i.y v v»y м μ· лл txw. lilt *р vuJA.iixvzp lin μ§/ ml пропердин и 0. 6 тМ Niti;, последвано от лизис с 900 μί СН).
AT ПТ mlrnill 1Λ ννχλ/f T2?T''^rT' Λ 11 ί τ τ· ’MZft.OQ f“* *Ο/Τ ft Λ ΚΓ111Ί Wrnxl v uyupvixaiu, am iuivi jl^az izi u .a /с * ' > . чхл v_y. v_-/kvy -,’м niun npu.
клетките се утаяват чрез центрофугиране (2000 х е. около 3 мин) и wwwn nnn n m а а w a w wwx ni cr x x a nx tw o wt x a wn nn m a m a ao nnx jo wft a it a 41? w wn f миши nnaina ciucu^vu,uzi ria v y liv рпашашпаша w uoivivpva ria т л — пш. νпомощта на Н2О- третираните проби като 100% лизис и буфер.
τ ι at /т.т r-nlrnni It·* own lm wo 1ι η 1x τ τ a » o
IV V L>y ирллаш, xvriv 111IYU, UV UJHUV.lv τη ТЧА1 1Ο11 VV»ttT 1 τ Α Λ X 1 AX 1 А А I» nlrm A '4 W/T 1» A A A 1 χ A прицкriiiibl na v nvRiuaiiu на фигура 9. Конюгатьтпродуиира зависимо от дозата лизиране.
AIwLt-AWAA T T X 1 wn /4 Τ)Τ^ϋ_ T ZXrZft 1 X 1 X wn A /* 2 X AO т гАлтлттп * xta no ftwA/ттт z>a НоЬл Rmzx уУЛаШМ nuiliv Α Ι-/! “ Ιτ,^Λ пиши X- .’1 vaiVLMUlllV/llllVJYllM 1IV LJMy/llll yv ΙΥΟ-ΙΧ иинш u да е значим лизис над наблюдавания в отсъствие на такава rx £х тч о /ч τνχ 1 хо иираиишка.
1П 2 ΓΑοααμ 1 an ii o nn Aonn 4 m am iirno iv. v к/ииОкцупие na pvoj/uiiaiiiuinv
Използваният метоа е успешно аоказателство за куплипането на
6^2t Lt’t К.Т T ^*62 1xq1ttv*/x o r**/x It a a a tt rx rxrv* · vji nuivi K.ОЛ1 Ilu C nuKaoanu vni .
1. формирането на връзка с подходящ размер (около 3^0 Ша) за 1:
6^*2 · T It/XT T 1/X r\ ty tv* τ*/χΐτ a a nn rxrv Q? TJ A 62 C' 11 A /4x1 TO Q ± ν,ν. lYunivccuLi, uuikciodii ши JiJd· i zA.4_FxL Ha фиС- v.
2. Дву- дименсионалният SDS- PAGE ( първа дименсия неΤ4ΖΖ» АТГ1 1 11 ТЧ O 11 A RtVAOH Al 1 I/O 11 Л n ГТлл Д At 4 1 1 1 A n 11 n 4 v*/xlxooftr* ITO TV* пот * «ттп/xftz* pvy у цирапа, ишира уитупъилруу^цирапау пилаопа^пч. iiitju vuvjwv съдържащ двата IgG и С 31.
4 IT η 11 1 Ю1111 И ГИ η VA ΤΧ οΐχτν* ОТЧТ 1 /*TV* IT lx Ο 11 А ГИЛ411 ft 1 T/Ч/X ft O ftn АТП’ ΊΖ5 4
v. х^уацииппаНш ларамисришшаа na nivou uuyuut иЬрлу gw филтрация показва, че отново се състои от молекула с около Зг>0 kDa.
/1 V at τ l/ч —* a tvw4*Vtx zxIt a a ft η ναι r o m rx 4 11 tv* TTTTiio a It tv* nftn a z*vv* It acta* rx nn z.x τ- 1\ипюсанг41ии1каз1*ал^п1атилицш7па ами uvnwni, iwziniv rie. <
показана нито с FDP- IgG. нито с C3i.
ГТ /X 11 A 11* A TV* IT lx va* r A tV* A 4 Ii TV* 111111 O TV* А ТЧТЧ/ХУЧ A / бТЧт * O тЧ/xlx Ο O ft гл ИЛ лш пашашиал^пштилишиппаша npwa ^\рис·· j} пилаши, ’k
ί. Специфичното анти- овче еритроиитно антитяло локализира
6^2* ΙτΓΤ » K > ΓΛ* mnoi 1 A TV* A TTA 1 П 1111О1И1 A TV* n lr 4 ДТИ lx A ( аЙ1111 /ЗТЧТ 1TV*T4/X1 ill tv* V κ_ -·ι lYuivi iviviviirpciriaiiia na luumCnnaiiia ikAtJinva ^иипи ^ришрицишJ, предотвратявайки я от отмиване при изплакването (в противовест
1ΊΠ oft ЛАЛП1 Ί Τ 1 TV* Ο 6^2ΐ\ πα еииииупишк
2. Конюгат®гсъхранява активността на C3i по отношение на
TV*/xfto ITO TV*/xfl ft on AT11A 11ΑΤΙΆ /ТО /4х /ХТЧХ Cl T ТЧ A 6^2 lx /XI T ft O T4TV* Ο r* A ΙΙΤΤΑΤ τ4ΟθΙχ*1ΤΤΟ A niwa, iv шии l/vv шДе ivivzlw. ya ψυρηιιιρα \_v Kvnuvpmaoa npvo рч. anцllzl v пропердин и факторите В и D.
Έητίΐ Ι/ΑΙΐίΙαΑΤΤίηΠη 1 1 Alba /4 0 1 1 ft 1 HI T 11 T ТЧ A t’A* /А 4 O* /О11ГТ* -» A ft T t /»* T X .r <> v. 1ази липи<р1паоа iuuav yu ииициира Kuivuiiuvicnnr дамииui\ia атака върху мишената, в дадения случаи чрез активиране налитичния
Τ4.Τ TV* O\ 4 11T11A ITO Г* ТЧ1 T TV* ТЧ /X1 1 1 1 TV* A
11U111 V’ X) JdAUJUL na VpUllipVU,Ullia.
Допълнителни данни от други лаборатории показват, че факторът /X TV* rXTV* ТЧ/X ft A TTA 1x/X V* ТЧ A * Г/Хч1/ O HO ητ n® IxtTV* λ 1 T ТЧ η ТТ Ir.T ЖГ H А /X Ο Τ T /X ATI TV* T 1 TV* ГТ Л /X τι T T a win vnipwa na κνυρα ya vOyC nj iiziupaxi ikiiivi yayvnv ишнитдли u nt тези конюгати могат да насочат комплементната активация срещу определен клетъчен тип (Vogel. 1988, Targeted. Diagn. J her.. 1:191- 224;
aj.
UfUA IVILILIOI “ A U4V/to lASlLlto-.
τι7
7ПР7 t „,,1- τ>„„
AP'kJ/ , IjCUA. . JVCJ.
7.
11.
Γ' < .
J., White, И 7. and talk, R. J., 1986, Complement 3: 223- 235; Petrella. Е. C. et a! T K/f/yfloryrlc 7/)./· 7>0
Hi, .X.'S/ft U. inuuu/ivi. XUt-MtVWJ 1VT.
7771 Tao Ϊ1 ЛПШ111 AC ft nn/llrntJnn Х/Х-/. 1 V sj V» yujxnu vu I' I JA'y llj-’X 11U
l.J o t Iti твърдението, че СЗ модифицирани така, че да бъдат способни да
ЬгчккГкЛ iivvpa, могат да бъдат използвани за насочване на комплемент-^медиирани
ТТах «лпотпоп 11 σ н «и връщането на фактор ь в нормален човешки серум,
Най- голямата полза от описаното тук изобретение е биологични течности. Изобретението описва методи за производство това състояние те ще свържат фактор В и ще генерират активни СЗ ./UJ 1
Ь/ли^рптооп Δ bmnftkinr'mm о ип ττίλ οιι VnuRpnm опп пркхлиптпппоп о /wrn η VI рЧ1 2 i JtY-21 1 Ml '1X \J\- XI 1 1 1 1 IA ilu XIXVJH 1W1J L'V J U V y V m VI IVIX 1|/U Λ J ; i: »-,·:·.!
хемолитичната проба, използвана в Пример 6, такава конвертаза,
Λ Ιό о а λιί ω mo nui <ά . uiv iiviiuvpuiuouuiu v livviiiuvuxuiu, inn щч < ·_ уисоциира без много превръщане на СЗ. обаче, това ще позволи
мутантната сЗ ще промотира консумацията на фактор В, водещ до елемент от алтернативната обмяна, и неговата неспособност да амплифицира стимулирането на класическата обмяна. Ако се формира
консумацията на сЗ иде бъде понижена. Поради това и двете ситуации лЪа А OTHPAUll 13 ГИПП11 ТПГ\11Х ЖАТЛ UHA ΠΡλίΑΌΡτηηΐΐηΟΚ/η па клттоптпи l_ II ГАХЧ- 11X11 IV ϊ XI 1VI. ХЛ UlV<rU IQ? VlXtlV'P' 1AU4V yv 1VXV/IJV411|.ZUX|..’<11VIV , IV xUyillUJUiHIU v ► молекули, които са модифицирани така,че да станат резистентни на фактор I, но без какВато и да е модификация за изменение на лт ι л п ллтпт л пл ешаишшитшш па кА11 Й/Згчт Л > п ТИ А ΠΑΛΙ/ΑτηΐΙΑΠ η а Й11111 л Й η 11 л ftvx'r ninnnmA 11'1 ипиертахаша, иримишира нииишаишк ирикцап\.ти иа фактор Б В човешки серум. ДиВият тип СЗ, обратно, причинява
ТЧТ 111 OlJZi ft ГЗ TXZX ГТ W» 11 Л ТЧ АТЧ A ZXT Т ТЧ-» А Ζ41 Ί ft 1 1 пт TV» 1 Ч ТЧ Ύ /3 <111 4 п А □ папинкАпи ириицапс, иирилшпи пмрауи тима, he yui/uznn шип \^^·ι < vuanu разграден от факторите Η и I.
11. 2 Метод
ПолуЧсНИтс Мутанти СН СЛСуНЩЛС.
Л.,~12Л? Q ΛΊ~ __П\
Ц5МСП1Пи U VJlli ^lipUlVlCJJ ^.)
Q1Q2 Argl303 изменени в Gin, плюс Argl320, изменени в Gin /ТТ--------А ^XXpUlVltp J.J
Ь1О2 Аге1303. изменени В Gin. плюс Are 1320. изменени В Gin
V ' ' 1_· ' (± ipuivicp М )
Т>„,,,.1.., . —-------,1, .____________ Q /ΊΤ/Л К . а. . _____Г.‘
DcunMi invau м^шапши ta vivvnpwupanu u <uv κ/xvintvu и vzivy шии са пречистени чрез преципитаиия с Na2SO4, последвано от афинитетно
---------Q-------A---- 2 C--1. .,---., 1.-1---- ζ___________O ТТ —... ..- D?
npcnuviiwanc na νιυικ- π- jvpnanjsc, Kdnuiu c uiiuvanu u xxpuivivp ix.,·
Дивият тип СЗ (R1R2) се изолират по схоаен начин. Чрез SDS- i’AGr • ’ \ < 1 U> £ __-___ίΖ ________β,—.-β I. _________________ ГЛ1 .. ___J. — , 1 С х ον νρνυορηυ ицисишиаш, хиптпшрацимша па ч^х £ ivitzts.yy х/ ./ . . -< ! Л -ч ... U X, — ·’ VlLl аивия тип. концентрацията на 0102 е около 1/ 5 от оивия ,Х ' ’ L ' — ~ СХ тип. и ι — ....., —_......--— ..- ci/'τ - .. ,.ι----1 / ις ., -ι / mi —„. „.,β.,„ ьипцс.ншрацилпш η<ι τιν4_ ν ivivA.yv χ, и. χ,· χχ.^ ши уииим шии.
nnocivkmu вероятно съоъпжат голямо количество от разрушени £ О- i иХ £ £ £ Г· шии/ихширпи милели ιν..’ΐ).
10id от течи СЗ nnoovkmu се ннктбипят с 10 til пячтВоп ня ;,0<:> Д ’ ί - ; - -J ------ . .---Ζ 1 - . 1 - * Г ..... ' ’
v) нормален човешки серум β PBS, съдържащ 1 гпМ MgCB^u приблизително 300 ng белязан е 1_Т фактор В (приблизително ?- 300 000 ирт) за ι час при p/’V. илед пюоа ρ μι се анализират чрез зиз- г/лигг. ι при редуциращи условия). Изсушеният гел се подлага на авторадиографиране за индикация на позициите на Връзките, m nrvRnrv ητνβ n ill ii ччп ntiiv nlrrvnnrr жлвпзлп ϋ ii ηοηηβιιτνα птзплт ιΐζτνίι no e ovinwe iiiviiiL/ciLUjU. no. uriinaieiixnu/i vycifYinexp xi u xxvwuuxxiu iipVJyj leniti na разграждане. След тоВа те се изрязват и преброяват за правилно гч mmo zno л r“Ti ч ο ηιν ДПО1 ч гтп хч η η ν* η η TV η Ίζ η зпо Τ~Τ гх лчтччочччт τν ο atv ζχίι ι ч /\atv η R ni’/kon ук/кДПУ vine lierilna nci piciovpciAvyСХГ1С. 1 XeLiJ-IVllUiUC VlllVUriWlllU C’ MJ 4pc P се приемагза база (включваща не само базата за разграждане, но също и nwAT rlz-τν» t I TV O 11 n nm TV n tlzA Г» 710 и n 1-ST --1П -join V» ni 1 w O A 1 ·» IIAirimnlllll i-*n R npMyjleinише па уаосролхуапС u ypvcu хамиршшеди, памиусици v< м радиографски белязания продукт ).
11. 3 Резултати
Г m * 1Т1Ю11П τν o atv Ann ahtv n ·. i <·. vn ->3νητ1’л nil a пилучепише ешмипмеши no. рцпсуи/Гкуane
111-1 ΑηΙττνΛη П nn mmUn ппччч, пи чрахехпмр xj1 eo. nwrecxacxnu по- долу / 'У Ъ n»i ft τν» Tin 1 A 0 6½. x x-j yuu 111U11 “ ’ — ' X- ,.'L'
1/ 5 див тип - 2. /4%
XVI η 3 4Z nvi.
0102
- /. 41%
Г1ГЛЗ
JL- I
L-. TV ГЧ Ίηΐΐΐ/Χ ftmilllril H^TV nv 111 1 Un 1 1 Π zk П PrV AV X/lllU оаЩС, ULU41S.U ItHlUUnum ΓΙΟ- ψαΐΥΙΙΐν^/
Τ »<ΤΎτνη11τνη ппп ЛТТ111 IV Л TV
X 1VXY inclilinu npL/y J циуинх по- високи нива на фактор В разграждане^отколкото дивият тип СЗ / \ П' V» m ЗГ\ * Ο» *11 Xl/\nil 11111 τη vs
11W GU.'IVIVIU yUOU U1U lljj va m » in ιιηίητηιιvnnzn xivr- yt>;kc.w иплуvupuns.
пълно изчерпване на алтернативния кръговрат.
ТЛзпА л n R n ini τν» ο 37 Irm ппюпнп R mm. ο αχά nun τν о птЧ1 ч w fnni т R 1х * Ini1 R гч τν · хл .ядлпиciiiшие клнкуалцегшл е· преу.емупише xxpuivxepu игемипиаш.
У ED, разтворител на комплементната фиксаиия (дефиниран в *·» ηα/π-jv/t u/tu x.:*ww, пи;:ш edn. , ted. s. Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg: Blackweli. Oxford):
Γτ Ζ'Τ.ΓΤΤ-ΤΤ'ύζηΐΙΙ Л 1 /\Ί? 'χΛ ψ<3 A 3TV11U · Алл/Котпин. АиЖпПРП
ν..·ι ν.» v-л Dy и£//А\а<ц v/. л /и \ ♦» ' ; л чр v’t-vj/ ci j * j а л vz муучрчл разтвор; NcPS. нормален серум на морско свинче; SDS- PAGE, SDSпл Aimlznii a αχηιηυο a a аоЬпзпаЛл^отп· QPT^P Μ ζητίζιι ηυυχ mnn л ι j v.iuuo |3U.xiiiviuyiiu. c«v;i Vzik.ikuipvyv£'\. /a, uzi ъ/ a , a t c t ицииип1к<у u.i
Cl.
η. Lпиридилтио] пропионат.

Claims (27)

  1. Патентни претенции
    1. Природен протеин на обмяната на комплемента, модифициран така, че протеинът да е способен да формира стабилна СЗ конвертаза.
  2. 2. Протеин съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че е модифициран човешки протеин.
  3. 3. Протеин съгласно претенциите 1 или 2, характеризиращ се с това, че е устойчив на разграждане с фактор I.
  4. 4. Протеин съгласно която и да е от претенциите от 1 до 3, характеризиращ се с това, че представлява модифициран СЗ протеин.
  5. 5. Протеин съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че е модифициран чрез заместване на Arg-1303 или Arg1320, или и на двата чрез друга аминокиселина.
  6. 6. Протеин съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че Arg-1303 или Arg-1320, или и двата са заместени с глутамин, тирозин, цистин, триптофан, глутаминова киселина или глицин.
  7. 7. Протеин съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че Arg-1320 е заместен с глутамин.
  8. 8. Протеин съгласно претенциите 6 или 7, характеризиращ се с това, че Arg-1303 е заместен с глутаминова киселина, глицин или глутамин.
  9. 9. Протеин съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че има понижена възприемчивост спрямо Фактор Ни/ или Фактор I по отношение на природна човешка СЗ конвертаза, като този протеин има една или повече аминокиселинни изменения в сравнение с човешката СЗ конвертаза в участъка, съответстващ на аминокиселинни остатъци 752-754 и/или остатъци 758-780 от природната човешка СЗ конвертаза.
  10. 10. Протеин съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че едно или повече от аминокиселинните изменения са изменения от кисели аминокиселинни остатъци в неутрални аминокиселинни остатъци.
  11. 11. Протеин съгласно претенция 9 или 10, характеризиращ се с това, че измененията в аминокиселинните остатъци са измененията от Asp-Glu-Asp в Gly-Ser-Gly.
  12. 12. Протеин съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че има аминокиселинни изменения по отношение на природната човешка СЗ конвертаза при аминокиселинни остатъци, съответстващи на остатъци 1427, 1431 и/или на природна човешка СЗ конвертаза.
  13. 13. ДНК последователност, характеризираща се с това, че кодира протеин съгласно която и да е от претенциите от 1 до 12.
  14. 14. ДНК структура, характеризираща се с това, че включва ДНК последователност съгласно претенция 13.
  15. 15. Приложение на протеин съгласно претенциите от 1 до 12 за терапевтични цели.
  16. 16. Конюгат, включващ протеин съгласно която и да е от претенциите от 1 до 12, характеризиращ се с това, че протеинът е присъединен към специфична свързваща част.
  17. 17. Конюгат съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че специфичната свързваща част е специфичен свързващ протеин.
  18. 18. Конюгат съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че специфичният свързващ протеин е антитяло или антиген, свързващ фрагмента.
  19. 19. Приложение на протеина съгласно която и да е от претенциите от 1 до 12 или на конюгата съгласно която и да е от претенциите от 16 до 18 за производство на средство за изчерпване нивата на комплементните протеини от обмяната на веществата.
  20. 20. Приложение на протеин съгласно претенция 19, характеризиращо се с това, че средството служи да предотвратяване отхвърлянето на чужда материя.
  21. 21. Приложение на протеин съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че средството служи за локализиране и/или амплификация на превръщането на ендогенен комплементен протеин и преместването му в специфично място.
  22. 22. Фармацевтична форма, включваща един или повече протеини, съгласно която и да е от претенциите от 1 до 12 или конюгат, както е определен в която и да е от претенциите от 16 до 18, характеризираща се с това, че включва един или повече подходящи във фармацевтично отношение носители или ексципиенти.
  23. 23. Фармацевтична форма съгласно претенция 22, за приложение като средство за изчерпване нивото на комплементния протеин на обмяната.
  24. 24. Фармацевтична форма съгласно претенция 23 за приложение като средство за предотвратяване отхвърлянето на чужда материя.
  25. 25. Фармацевтична форма съгласно претенция 22 за като средство за локализиране и/или амплифициране на комплементната протеинова конверсия и преместване на друго специфично място.
  26. 26. Метод за редуциране комплементния протеин на обмяната при бозайници, характеризиращ се с това, че включва въвеждане в бозайника на протеин съгласно която и да е от претенциите от 1 до 12.
  27. 27. Метод съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че протеинът се въвежда включен като компонент от състава на фармацевтична форма съгласно претенция 22.
BG101295A 1994-09-08 1997-03-07 Модифицирани човешки сз протеини BG63606B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9418147A GB9418147D0 (en) 1994-09-08 1994-09-08 Modified proteins
GBGB9509102.1A GB9509102D0 (en) 1995-05-04 1995-05-04 Modified proteins
PCT/GB1995/002121 WO1996007738A2 (en) 1994-09-08 1995-09-08 Modified human c3 proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG101295A BG101295A (bg) 1997-12-30
BG63606B1 true BG63606B1 (bg) 2002-06-28

Family

ID=26305590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG101295A BG63606B1 (bg) 1994-09-08 1997-03-07 Модифицирани човешки сз протеини

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5849297A (bg)
EP (1) EP0779922B1 (bg)
JP (1) JPH10505241A (bg)
CN (1) CN1104501C (bg)
AT (1) ATE273388T1 (bg)
AU (1) AU707004B2 (bg)
BG (1) BG63606B1 (bg)
BR (1) BR9509172A (bg)
CA (1) CA2197888A1 (bg)
CZ (1) CZ290596B6 (bg)
DE (1) DE69533359T2 (bg)
ES (1) ES2224133T3 (bg)
FI (1) FI970979A0 (bg)
HU (1) HUT77874A (bg)
NO (1) NO971059L (bg)
NZ (2) NZ292565A (bg)
PL (1) PL319040A1 (bg)
RO (1) RO117189B1 (bg)
RU (1) RU2194713C2 (bg)
SK (1) SK29697A3 (bg)
WO (1) WO1996007738A2 (bg)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SK121798A3 (en) 1996-03-07 1999-04-13 Imutran Ltd Native protein of a complement line, a fragment or variant of protein, dna sequence coding a protein, dna construct, a conjugate containing protein, pharmaceutical composition and use of protein
EP0972200A1 (en) * 1997-03-06 2000-01-19 Bion Diagnostic Sciences, Inc. Screening and treatment using complement regulator or receptor proteins
US6221621B1 (en) 1997-03-06 2001-04-24 Bard Diagnostic Sciences, Inc. Methods of screening for colorectal cancers in which a complement Factor I or related protein is associated
WO2001092295A2 (en) * 2000-05-30 2001-12-06 University Of Toronto Ligands for cd21 and compositions thereof for modulating immune responses
US6756476B2 (en) * 2001-04-30 2004-06-29 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 2021 daltons
US7294688B2 (en) * 2001-04-30 2007-11-13 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1348 daltons
US6998243B2 (en) * 2001-04-30 2006-02-14 Syn X Pharma, Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1793 daltons
US7314717B2 (en) * 2001-04-30 2008-01-01 Nanogen Inc. Biopolymer marker indicative of disease state having a molecular weight of 1562 daltons
US7179610B2 (en) * 2001-11-23 2007-02-20 Nanogen Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers indicative of insulin resistance
US7097989B2 (en) * 2001-11-23 2006-08-29 Syn X Pharma, Inc. Complement C3 precursor biopolymer markers predictive of type II diabetes
WO2005107785A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 University Of Hawaii Human complement c3 derivates with cobra venom factor-like function
US10206998B2 (en) 2005-01-12 2019-02-19 Proteonova, Inc. Modular targeted therapeutic agents and methods of making same
WO2006076417A1 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Proteonova, Inc. Method for making targeted therapeutic agents
WO2010056399A1 (en) * 2008-11-17 2010-05-20 Incode Biopharmaceutics, Inc. Method and composition for modulating the immune system and various inflammatory conditions comprising complement depletors
RU2542404C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения функциональной активности компонента с4 комплемента человека
RU2542401C1 (ru) * 2013-11-06 2015-02-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ определения функциональной активности компонента с2 комплемента человека
US11903996B2 (en) * 2015-10-07 2024-02-20 David C. Fritzinger Modulators of complement function
CN113214373B (zh) * 2020-02-06 2022-08-30 深圳华大基因股份有限公司 新包虫病抗原Murinoglobulin-2蛋白
US11918624B2 (en) * 2020-06-10 2024-03-05 Kelsius Laboratories LLC Therapeutic composition for use in the treatment of COVID-19 and other cytokine storm associated disorders

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4661347A (en) * 1982-11-12 1987-04-28 Scripps Clinic Cytotoxic compositions

Also Published As

Publication number Publication date
NO971059D0 (no) 1997-03-07
CZ290596B6 (cs) 2002-08-14
BR9509172A (pt) 1997-11-25
ATE273388T1 (de) 2004-08-15
NZ333949A (en) 2000-06-23
US5849297A (en) 1998-12-15
EP0779922A2 (en) 1997-06-25
ES2224133T3 (es) 2005-03-01
WO1996007738A3 (en) 1996-03-28
SK29697A3 (en) 1998-01-14
CZ68597A3 (en) 1997-11-12
PL319040A1 (en) 1997-07-21
FI970979A (fi) 1997-03-07
CN1162335A (zh) 1997-10-15
CN1104501C (zh) 2003-04-02
AU707004B2 (en) 1999-07-01
NO971059L (no) 1997-05-07
FI970979A0 (fi) 1997-03-07
HUT77874A (hu) 1998-09-28
EP0779922B1 (en) 2004-08-11
DE69533359T2 (de) 2005-07-28
DE69533359D1 (de) 2004-09-16
RU2194713C2 (ru) 2002-12-20
AU3477295A (en) 1996-03-27
BG101295A (bg) 1997-12-30
MX9701783A (es) 1997-10-31
RO117189B1 (ro) 2001-11-30
WO1996007738A2 (en) 1996-03-14
NZ292565A (en) 1999-03-29
CA2197888A1 (en) 1996-03-14
JPH10505241A (ja) 1998-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG63606B1 (bg) Модифицирани човешки сз протеини
JP6262721B2 (ja) 敗血症の予防用または治療用の組成物
EP3030252B1 (en) Compounds and methods for inhibiting phosphate transport
JP5913115B2 (ja) 胃腸障害のための処置
EP2987497B1 (en) Composition for treating and preventing ischemic damage
CN109310732A (zh) 用于阻止或减缓前列腺癌的进展的神经丝肽
CA2571350A1 (en) Peptides for inhibiting the interaction of protein kinase a and protein kinase a anchor proteins
US6221657B1 (en) Modified human C3 DNA sequences and vectors
AU726187B2 (en) Down-regulation resistant C3 convertase
Checler et al. [TRP11]-neurotensin and xenopsin discriminate between rat and guinea-pig neurotensin receptors
WO1994018237A1 (en) Novel peptide having receptor activity and dna coding for said peptide
Ekhlasi-Hundrieser et al. Point mutations abolishing the mannose-binding capability of boar spermadhesin AQN-1
DE60120187T2 (de) Verkürztes bard1 protein und dessen diagnostische und therapeutische anwendungen
KR20160076556A (ko) 난소 기능 보존용 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2004069857A2 (en) “peptides, compositions and uses thereof”
Rebollo et al. Peptides that inhibit binding between set and caspase-9
US7074889B2 (en) Identification of a new cytotoxic activity from the ink of Aplysia punctata
KR20160097244A (ko) 항산화 효과를 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
KR101170215B1 (ko) 우성 음성 돌연변이 단백질 ｒ１４７ｅ 및 ｙ８１４ａ, 및 이들의 의학적 용도
KR20160126519A (ko) 발기부전 치료 활성을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2007052854A1 (en) Use of the gonadotropin-releasing hormone ii antagonists and its analogues
Seger Structural characterization and biological activities of the amino-terminal fragments of pro-opiomelanocortin
Nierengarten New approaches to generating semi-synthetic post-translationally modified proteins
MXPA97001783A (es) Proteinas c3 humanas modificadas
KR20070047576A (ko) 고나도트로핀 방출 호르몬 ｉｉ 작용억제제 및 이의유사체의 용도