HUT77874A - Módosított humán C3 fehérjék - Google Patents

Description

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/GB95/02121.

A nemzetközi közzététel száma: WO 96/07738.

a 1

A jelen találmány tárgyát új, módosított fehérjék képezik, amelyek képesek stabil C3 konvertázokat létrehozni, az ilyen fehérjéket kódoló DNS szekvenciák, valamint ezeknek a fehérjéknek az alkalmazása terápiás ágensekként, főleg a komplement bioszintézis fehérjék szintjének kimerítésében.

Az emberek és egyéb gerinces élőlények immunválaszában a komplement rendszer funkciói, amelyeknek a legnagyobb a fontosságuk az effektor funkciókban, azaz például a fagocitózisban, citolízisben és olyan sejtek összegyűjtésében, amelyek helyi gyulladásos válaszokat indukálnak [ Rother, K. és Till, G.O. (szerk) : The complement system (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Németország) (1988)] . Ezek a tulajdonságok kívánatosak ahhoz, hogy elimináljuk a támadó patogéneket, azaz például a baktériumokat, de nem kívánatosak akkor, ha a gazdaszervezet szövetei ellen hatnak (azaz például a poszt-iszkémiás reperfúziós sérülésben [Nicol, P.A.E. és Lachmann, P.J.: Immunoi. 24, 259-275 (1973)] ), vagy külső terápiás ágens ellen (azaz például xenograftok hiperakut kilökésénél [ Forty, J., Hasan, R., Cary, N., White, D.J. és Wallwork,

J. : Transplant Proc. 24, 488-489 (1992)] ). Történtek kísérletek arra, hogy megszüntessék ezeket a nemkívánatos tulajdonságokat, a komplement szabályozó fehérjék származékainak kihasználásával, amelyeknek a normális funkciójuk az, hogy elnyomják a komplement aktiválását [Kalli,

K. R., Hsu, P. és Fearon, D.T.: Springer Sémin. Immunopathol. 15, 417-431 (1994); Weisman, H.F. és mtsai:

Science 249, 146-151 (1990)] .

A komplement rendszer sejtjei megtalálhatók mind a sejtek felszínén (receptorok és szabályozók), mind a folyadékfázisban (vérplazma és egyéb extracelluláris környezetek). A válaszok generálásában kritikus lépés a C3 proteolítikus konverziója C3b és C3a fragmensekké. A C3a egy anafilatoxin, amely a C5a-hoz hasonlóan az ingerlés helyére vonzza a mást sejteket, ezzel hisztamin lokális felszabadulását, vazodilációt és egyéb gyulladásos hatásokat eredményez. A természetes C3b-nek megvan a képessége, hogy hozzákötődjön azokhoz a felszínekhez, amely keletkezésének környékén találhatók. Ez a C3b azután a citolitikus komplement komponensekkel (C5-C9) fókuszálja a támadását.

A felszínhez kötött C3b és annak lebomlási termékei a C3 receptorok ligandumaiként is működnek, befolyásolva például a fagocitózist [ Rother, K. és Till, G.O. (szerk) : The complement system (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Németország) (1988)] . A komplement aktiválásnak két távoli bioszintézis útja létezik, amelyek mind a C3-nak C3b-vé való alakulását, és utána következő válaszokat eredményezik. A klasszikus bioszintézis utat általában ellenanyagok és antigének komplexei indítják be, egy enzimkaszkádot iniciálva, amely magában foglalja a Clq, Clr, Cls, C2 és C4 fehérjéket. Az alternatív bioszintézis út egy aktivációs huroktól függ, ami magában foglalja a C3-at magát, és szüksége van a B és D faktorokra.

A C3 C3b-vé (vagy C3i-vé) való konverziója egy olyan terméket eredményez, amely képes kombinálódni a B faktorral, ezzel eredményezi a C3bB (vagy C3iB) faktort. Ezekre a komplexekre a D faktor hat, így keletkezik a C3bBb, ami egy C3 konvertáz, amely képes több C3-at C3b-vé hasítani, ezáltal több C3bBb keletkezik és még töb C3 konvertálódik. Bizonyos körülmények között a C3bBb komplex stabilizálódik a properdin (P) nevű pozitív regulátorral való asszociáció révén. Azonban ez a pozitív-visszacsatolási hurok normális körülmények között egy lassú üresjáratra korlátozódik, szabályozó fehérjék, azaz a H és I faktorok révén.

A H faktor (és a szerkezetileg rokon sejthez-asszociálódó molekulák) (i) leszorítják a B és a Bb-t a C3b5 ről, és (ii) kofaktorként működnek az 1-es faktornál, amely a C3b-t hasítja iC3b-vé, ezzel megakadályozva minden rekombinációt a B faktorral, aminek az lehet az eredménye hogy még több C3 konvertázt hoz létre. A bioszintézis utat felfűtik a C3b amplifikált generálásába, felszínek, azaz például számos bakteriális sejtfal jelenlétében, amelyek megkötik a naszcens C3b-t, és gátolják azt, hogy a H és I faktorok szabályozzák azt. A naszcens C3b is képes endogén sejtekhez kötődni. A komplementtel normális körülmények között érintkező endogén sejteket ennek következtében tovább védik membránhoz kötött regulátorok, azaz például az MCP, DAF és a CR1, amely hasonlóképpen hat a H faktorra.

Van néhány ritka, természetes körülmény, amelyek között a normális folyadékfázisú reguláció nem képes működni, és a spontán C3 konverzió végül a C3-nak a keringésből való spontán eltűnéséhez vezet: (i) A H vagy I faktor genetikai hiányosságai [ Nicol, P.A.E. és Lachmann, P.J.: Immunoi. 24, 259-275 (1973)] , (ii) olyan ellenanyagok (nefritikus faktor) jelenléte, amelyek kötődnek a C3bBb-hez, és gátolják a disszociációt [ Daha,

M.R. és van Es, L.A.: Immunoi. 43, 33-38 (1982)] , és (iii) érintkezésbe lép egy fehérjével a kobra mérgében, amely fehérjét kobraméreg faktornak (CVF) neveznek, ez kombinálódik a B faktorral és egy C3 konvertáz enzimet hoz létre, amely nem tartalmaz C3b-t, és nem érinti a H és J faktor [ Pangburn, M.K. és Muller-Eberhard, H.J.:

• · · ·

Springer Sémin. Immonopathol. Ί_, 163-192 (1984)] . Ezek a tények illusztrálják a komplement leszabályozásának fiziológiai fontosságát specifikus aktiválás távollétében.

Vannak olyan körülmények is, amelyeknél specifikus aktiválás lép fel, de ez nem kívánatos, különösen akkor, ha az a gazdaszervezet ellen irányul (azaz például iszkémia vagy sebészeti beavatkozás miatt megsérült szövet), vagy egy olyan külső anyag ellen, amit szándékosan adtak be terápiás céllal (azaz egy xenograft, mesterséges szerv vagy egy dialízis membrán). A komplement aktiválás eredménye egy nemkívánatos támadás és további károsodás, úgyhogy ezekben az esetekben előnyös lenne, ha blokkolnánk vagy gátolnánk az aktiválást és a választ.

A komplement által közvetített károsodás megelőzésére létező megközelítések a leszabályozó fehérjék (CR1, MCP, DAF, valamint a H és I faktor) használatát célozzák meg, hogy ezzel gátolják a komplement aktiválását. A komplement inhibitorok, mint például az I faktor, a H faktor és a membránhoz kötött fehérjék, mint például a CR1, DAF, MCP elnyomják az alternatív bioszintézis út folyadékfázisú amplifikálását. Emiatt történtek kísérletek arra, hogy ezeket a molekulákat, különösen a CRl-et (ami a leghatékonyabbnak tűnik), arra használják, hogy csökkentsék velük a komplement által közvetített károsodást a fiziológiai helyzetek modelljeiben [ Kalli, K.R., Hsu, P. és Fearon, D.T.: Springer Sémin. Immunopathol.

···· ···· • · · · · · .:.. .:. : ’ ···’

15, 417-431 (1994); Weisman, H.F. és mtsai: Science 249,

146-151 (1990)] .

A H faktor endogén módon van jelen a vérplazmában, nagy koncentrációban (tipikusan 0,3-0,5 mg/ml) [Van den Berg, C.W., Aerts, P.C. és Van Dijk, H.: J. of Immunoi.

Methods 136, 287-294 (1991)] , úgyhogy jóllehet az inhibitorok megnövekedett szintje okoz elnyomó folyadék-fázisú reakciókat, ezeknek a hatékonysága kicsi, ezért nagymennyiségű tisztított fehérjét kellene in vivő beadni (azaz valószínűleg többet, mint az oldható CR1 több mint 5 mg/testsúly kg mennyiségét). Emellett az alternatív bioszintézis utat olyan felszínek aktiválják, amelyeken a H faktor hatása már gátolva van. Miközben ez nem szükségszerűen csökkenti egyidejűleg egyéb faktorok aktivitásait, ugyanezek a faktorok azt sugallják, hogy nem valószínű, hogy teljesen vagy univerzálisan hatékonyak.

A kobraméreg faktor (CVF) azzal a tulajdonsággal rendelkezik, hogy stabil C3 konvertázt hoz létre, amely kísérletileg használható arra, hogy in vivő kimerítsük a komplementet állatokban, valamint in vitro egyéb mintákban (azaz például humán plazmában). A CVF hatékony (például 40 pg/kg képes tönkretenni egy egér komplement aktivitását [Van den Berg, C.W., Aerts, P.C. és Van Dijk,

H. : J. of Immunoi. Methods 136, 287-294 (1991)] ) . Vannak azonban olyan hátrányok, amelyek alkalmatlanná teszik arra, hogy emberekben gyógyászati célokra alkalmazzák őket.

• · · · • 4 · · • ·*

Először is, kobraméregből nyerhetők ki (ez egy nehezen beszerezhető forrás, és veszélyes a kezelése), ezért alaposan meg kell tisztítani a méreg neurotoxinjaitól. Természetesen figyelembe kell venni az anyag beszerzésének problémáit is. Ezt a problémát nem lehet egyszerűen megoldani azzal, hogy a gént ex vivő klónozzuk és expresszáljuk, mivel vannak poszt-transzlációs módosítások, amelyek a kígyóban játszódnak le (specifikus proteolítikus processzálás), és nagyon nehezen lehet (vagy egyáltalán nem lehet) in vitro reprodukálni. Emellett az ehhez a processzáláshoz szükséges enzimek és emésztési körülmények jelenleg nem ismertek. Másodszor, a fehérje az ember számára idegen fehérje, és ezért immunogén. Ez kizárja az ismételt terápiás alkalmazását, amire egy beteg komplement-mentesítéséhez lenne szükség, több hét alatt (azaz például ahhoz, hogy egy xenograft túléljen).

Jóllehet a CVF-nek van szerkezeti és funkcionális homológiája a humán C3-mal [ Vogel, C.W., Smith, C.A. és Muller-Eberhard, H.J.: J. of Immunoi. 133, 3235-3241 (1984)] , de vannak nagy eltérések is, több szempontból is (azaz például a lánc struktúrája, a bioszintézis helye, a komplement szabályozókkal szemben mutatott érzéketlensége, stabil C3 konvertáz létrehozása). Nem a C3 ismert kobra ekvivalenséből származik, amit klónoztak és szekvenáltak már, és amelynek a durva szerkezete és funkciója jobban hasonlít a humán C3-éra mint a CVF-é [ Fritzinger, D.C. és mtsai: J. of Immunoi. 149, 3554-3562 (1992)] .

A CVF egy olyan állat méregspecifikus terméke, amely nagy evolúciós távolságban van a homo sapiens-tői. Ennélfogva nincs gyakorlati jelentősége, hogy genetikai manipulációkat használjunk ennek a fehérjének a módosítására, egy olyan termékké, amely nem-immunogén módon használható emberekben.

Egy alternatív stratégiát terveztünk, ami azon alapul, hogy kikerüljük a fiziológiás szabályozást, és ahelyett, hogy gátolnánk a komplement aktiválását, azt okozza, hogy a rendszer szuper-aktivizálódik. Ennek két alkalmazási lehetősége van. Először is, használható in vivő, hogy aktiválja a komplementet, ameddig egy vagy több komponens kimerül, ennek az eredménye lesz annak a képességnek az elvesztése, hogy helyi válaszokat hozzon létre bármely következő ingerlésre (azaz például egy xenograftra). Másodszor, a szabályozatlan szuper-aktivizálást szándékoltan lokalizálhatjuk egy adott célpontra (azaz például egy vírusra vírusfertőzött sejtre), hogy fokozzuk az adott célpont érzékenységét a komplement által közvetített destruktív válaszokra.

A komplement aktiválás szabályozói szakkifejezést a továbbiakban az összes olyan fehérjére vonatkoztatjuk, amelyek úgy hatnak, hogy gátolják a C3 konverzió amplifikálódását, és nem szándékozunk korlátozni az értelmét azokra a fehérjékre, amelyeknek a génjei az RCA genetikai lókuszban találhatók. Nem vonatkozik azonban felszabályozókra, azaz például a properdinre. A C3 konverzió *· · ·*· 9 • * ·· · · · * • · · · · · • · · · · · («<< ··· · ·· szakkifejezés a C3 proteolitikus konverzióját jelenti C3b-vé és C3a-vá, hacsak külön nem jelezzük az eltérést, és a C3 konvertáz (vagy egyszerűen konvertáz) szakkifejezés jelentése egy olyan enzim (tipikusan egy vagy több fehérjekomponens komplexe; azaz például C3bBb, C2iBb, CVFBb vagy C4b2a), amely katalizálja ezt a reakciót.

A találmány tárgya tehát egy olyan módosított természetes komplement bioszintézis fehérje, amely fehérje képes stabil C3 konvertázt létrehozni.

A természetes szakkifejezés alatt természetben előfordulót, azaz a természetből kinyerhetőt értünk. A meghatározás tehát vonatkozik bármelyik természetben előforduló komplement bioszintézis fehérjére, az előzőkben ismertetett módon módosítva. A szakkifejezés érvényességét nem korlátozzuk faj specifikus fehérjékre. Másszóval, egy módosított humán fehérjét használhatunk például stabil C3 konvertázként egyéb emlősfajokban. Tipikus esetben az azonos fajból származó módosított komplement bioszintézis fehérjéket alkalmazzuk.

A C3-at kódoló DNS szekvencia módosítása például helyspecifikus mutagenezissel, olyan C3 variánst eredményezhet, amely rezisztens a komplement szabályozó fehérjékkel szemben, miközben megtartja a pozitív funkcionális tulajdonságait (hasítás C3b-vé, C3 konvertázokkal) , és a szerkezeti integritási tulajdonságokat (helyes láncszerkezet és egy tiolészter kötés jelenléte). Az alábbiakban »· * .

ismertetett találmány tárgyát a természetes komplement fehérjék, azaz például a humán C3, genetikailag módosított formái képezik, amelynek a C3b fragmense rendelkezik azzal a tulajdonsággal, hogy ellenáll a fiziológiás komplement szabályozásnak. Ennek az ellenállásnak a következtében ezek a molekulák képesek a megfelelő C3 konvertáz stabilizált formáit létrehozni, amelyek a C3 C3b-vé, majd később bomlástermékekké való amplifikált átalakítását okozzák, fiziológiás körülmények között (azaz például in vivő) .

A jelen találmány tárgyát módosított C3 fehérje képezi, amely rezisztens az I faktor által végzett hasításra .

Ezt az elvárást úgy érhetjük el, hogy módosítjuk a fehérjét a proteolítikus hasítási helyeken.

A jelen találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja egy módosított humán C3 fehérjére vonatkozik, amelyben a fehérjét vagy az Arg-1303, vagy az Arg-1320 pozícióban, vagy mindkét pozícióban egy másik aminosavval helyettesítjük. A másik aminosav lehet tirozin, cisztein, triptofán, glutamin, glutaminsav vagy glicin. Az Arg-1303-at előnyösen glutaminsavval vagy glicinnel helyettesíthetjük (kevésbé előnyösen glutaminnal). Az Arg-1320-at előnyösen glutaminnal helyettesíthetjük.

Megfelelően módosított fehérjék előállítására a találmányban a következő stratégiákat alkalmazzuk:

ο*»« «·· * (i) Csökkentjük a H faktor és a rokon fehérjék (azaz például MCP, DAF, CR1) gátló hatására való érzékenységet. A humán C3-ban például a 767-776-os és 1209-1271-es csoportok vesznek részt a H faktor megkötésében [Botto,M., Fong,K.Y., So,A.K., Koch,C. és Walport, M.J.: J. Exp. Med. 172, 1011-7 (1990); Lambris,J.D., Avila,D., Becherer,J.D. és Muller, Eberhard,H.J. : J.

Biol.Chem. 263, 12147-50 (1988)] , és ezek közül a csoportok közül egynek vagy többnek, vagy egyéb, ezeknek a fehérjéknek a működéséhez kapcsolódó csoportoknak a helyettesítése is csökkentheti ezek közül a szabályozó fehérjék közül egynek vagy többnek a kötődését.

(ii) A C3bBb disszociációjának csökkent sebessége. Olyan mutációkat vihetünk be, amelyek erősíthetik a C3b és a Bb közötti kölcsönhatást. Ez eredményezheti mind az enzim spontán dekompozíciójának csökkenését, és megszüntetheti a H faktor (és egyéb szabályozó anyagok) hatékonyságát, a Bb-t C3b-vel helyettesítve.

Ezek kívánatos mutációk, azzal a céllal, hogy csökkentsék a C3bBb-nek mind a spontán, mind a H-faktor által közvetített lebomlását. Még a H faktor távollétében is a folyadékfázisú C3bBb komplex felezési ideje csak körülbelül 10 perc 37 °C-on, még properdin jelenlétében is [ Farries,T.,C.; Lachmann,P., J. és Harrison,R.,A. Biochem.

J. 253,667-75 (1988)] .

(iii) A humán C3 752-761-es csoportjai vesznek részt a B faktor megkötésében. Ez egy erősen megőrzött régió a C3-ban, és egy szoros rokonságban levő szekvenciát találtak a C4-ben. Mivel a C4 megköti a C2 B faktor homológot, ennek a régiónak az erős hasonlósága a C3-ban és a C4-ben, azzal együtt, hogy erősen megőrződik a C3ban, még inkább alátámasztja a szerepét a C3-ban, mint egy B-faktort kötő helyét. Tehát az ebben e régióban végzett változtatások hatással lehetnek a B affinitására és a C3bBb stabilitására.

(iv) A komplement aktiválás egyéb szabályozóival, azaz például a CRl-gyel, a DAF-fal és az MCP-vel szemben mutatott rezisztencia is kívánatos lenne. Mindegyik ilyen szabályozónak a hatásmechanizmusa hasonlít a H faktor hatásmechanizmusára, tehát valószínűleg nincs szükség további mutagenezisre. Hasonlóképpen, néhány patogén szervezet a komplement aktiválással szemben saját inhibitorait expresszálja, amelyek gyakran szerkezetileg és funkcionálisan is homológok a H faktorral (azaz például a Vaccinia vírus szekréciós peptid [ ] ) . Ezek a molekulák megvédik a betolakodókat az immunválasszal szemben, és ezért előnyös lenne, ha meg lehetne támadni őket az ezekkel a védelmi rendszerekkel szemben ellenálló, célzott C3 konvertáz enzimekkel.

(v) Mutációk, amelyek fokozzák a C3 konvertáz stabilitását properdinnel. A properdinnek az a hatása, hogy stabilizálja a C3bBb komplexet, késlelteti a spontán és H faktor-dependens disszociációt. Ez a stabilizáció hatástalan a folyadékfázisban, de sokkal fontosabbnak tűnik a folyamat amplifikálásában, ha az már egyszer megindult egy alkalmas aktiváló felszínen [ Farries, T., C.,

Lachmann, P.,J. és Harrison, R.,A.: Biochem. J. 252,47-54 (1988)] . Aktivitásának fokozása (növelve az affinitását) felboríthatja az egyensúlyt a folyadékfázisban, és ezzel elősegítheti a spontán C3 konverziót. Ez különösen hasznos lehet az előzőkben ismertetett többi módosítással kombinálva.

(v) Mutációk, amelyek megakadályozzák a C3bBb-t, hogy C5 konvertáz aktivitása legyen. Ha arra használjuk, hogy kimerítsük az aktív C3-at a keringésből, akkor egy nemkívánatos jelenség lehet nagymennyiségű anafilaktikus peptid keletkezése. Ezek közül a leghatékonyabb a C5a, amit a C5-ről néhány C3 konvertáz enzimmel hasítunk le. Ez a reakció valószínűleg függ attól, hogy a konvertáz milyen affinitással rendelkezik egy másik C3b molekulához [ Kinoshita, T., Takata,Y., Κοζοηο,Η., Takeda,J., Hong, K.,S. és Inoue,K.: J. Immunoi. 141, 3895-901 (1988)] , és ezzel a szuppresszió alanya lehet olyan C3 mutációkkal, amelyek eltávolítják ezt a kölcsönhatást.

(vii) A C3 konvertáz növelt aktivitása. A C3bBb konvertáz enzim aktív helye a Bb részben található. A C3b komponens feltehetően úgy működik, hogy egy aktív konformációt ad a Bb-nek és/vagy úgy irányítja a szubsztrátot, hogy a Bb hasson rá. Ez nem ismert, de mindegyik esetben az lehet a cél, hogy mutációkkal fokozzuk a konvertáz aktivitását a C3-ban.

• · (viii) Expresszió egy funkcionális formában. A vad típusú C3-at C3b-vé kell konvertálni, mielőtt kombinálódik egy új C3 konvertáz komplexszé. Ha in vivő használjuk, akkor a C3b (vagy C3i) konverziójának igénye késlelteti a módosított C3 működését. Ezért kívánatos lenne, hogy a fehérjét olyan formában adjuk be, amely képes az azonnali konvertáz képzésre, vagy előre kialakított konvertáz komplexeket adjunk be. Ezért előnyös, ha ex vivő létrehozunk egy funkcionális C3bszerű reagenst. Ezt létrehozhatjuk in vitro (azaz például proteolízissel).

(ix) A természetes fehérje módosításai, amik azt szolgálják, hogy olyan új hasítási helyeket vigyünk be, amelyek révén a B faktor kötődéséhez szükséges peptidrégiók megmaradnak, de a csak a H faktor kötődéséhez szükségesek specifikusan eltávolíthatók. Bevihetők például olyan helyek, amelyek révén a módosított C3 C3bszerű formája tovább hasítható egy olyan formává, amely még megköti a B faktort, de kevésbé érzékeny a H és I faktorok által végzett inaktiválásra.

(x) Módosítás egyéb régiókban, amelyek érinthetik a C3b kölcsönhatását a B faktorral és/vagy a H faktorral.

A találmány azon a felismerésen alapul, hogy megfordítjuk a tradicionális megközelítést, a C3 konverzióját elősegítve a C3 kimerítése céljából, és ezzel működésképtelenné tesszük a rendszert. A találmány tárgya továbbá az a lehetőség, hogy elősegítjük a C3 konverzióját egy • · adott pontban, és ezáltal összeszedjük a komplementdependens effektor mechanizmusokat, egy specifikus célpont megtámadása céljából.

Ezért a végső cél az, hogy fokozzuk a C3 konverzió mértékét, ha a módosított fehérjét egy, a komplement aktiválás szabályozóit tartalmazó fiziológiás közegbe (azaz például vérbe) visszük be. Ezt az aktivitást azután vagy arra lehet használni, hogy az említett közegből kimerítsük a természetes C3-at, vagy lokalizáljuk a C3 konverziót egy megcélzott pontban.

A C3-nak az az analógja, amelynek a C3b-fragmense rezisztens az I faktor működésével szemben (azaz az a származék, amit az 1. példában ismertetünk) megköti a B faktort, amit azután a D faktorral lehasítunk, és végezetül egy inaktív formára disszociál. Az I faktor inaktiválása nélkül a módosított C3b képes lesz arra, hogy ismételten megkössön új B faktor molekulákat, és ezzel elősegítse a saját inaktiválódását. Ezért a jelen találmányban ismertetett módosításoknak egy másik potenciális alkalmazása az alternetív bioszintézis út inaktiválása, a B faktor aktivitásának elhasználásával. Egy analóg megközelítés az lehet, hogy a C4-et módosítjuk, hogy ezzel elősegítsük a C2 felhasználódását, és ezzel működésképtelenné tegyük a komplement aktiválás klasszikus bioszintézis útját.

A találmány tárgyát képezi bármely egyéb proteáz, amelyet analóg módon lehet a C3bBb enzimre használni, ami •··· ···· oda vezet, hogy C3 C3b-vé hasad, a komplement aktiválás szabályozóinak jelenléte ellenére.

A találmány tárgyát képezik továbbá azok a DNS szekvenciák, amelyek egy, a találmány szerinti fehérjét kódolnak, valamint az ilyen DNS szekvenciákat tartalmazó

DNS konstrukciók.

A DNS szekvenciák szakkifejezés minden egyéb olyan nukleinsav szekvenciára vonatkozik, amely a genetikai kód degenerációja következtében szintén az adott aminosav szekvenciát kódolja, vagy amely lényegében homológ ezzel a szekvenciával. Ezek a szekvenciák is a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

Azok a nukleinsav szekvenciák, amelyek lényegében homológok szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak. A lényegi homológiát vagy nukleinsav szinten, vagy aminosav szinten becsülhetjük meg. Nukleinsav szinten azokat a szekvenciákat, amelyek lényegi homológiával rendelkeznek, olyanoknak tekinthetjük, mint amelyek szigorú körülmények között hibridizálódnak a találmány szerinti nukleinsav szekvenciákkal (azaz például 35-65 °C-on, körülbelül 0,9 mol/1 koncentrációjú sóoldatban). Aminosav szinten egy fehérje szekvenciát akkor tekinthetünk lényegében homológnak egy másik fehérje szekvenciával, ha az alkotó aminosavak jelentős százaléka homológiát mutat. Az aminosavaknak legalább 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% vagy éppen 99%-a (a preferencia ebben a sorrendben nő) lehet homológ.

···· ···· ··

Amint az előzőkben tárgyaltuk, a találmány szerinti fehérjéket használhatjuk arra, hogy lokalizált komplement aktiválási hatásokat érjünk el. Ennek elérésének egyik útja az, ha a fehérjét egy olyan egységhez konjugáljuk, amely a célpontban kötődik. A találmány tárgya tehát egy olyan konjugátum, amely a találmány szerinti fehérjét egy specifikus kötő egységhez, például egy specifikus kötő fehérjéhez kapcsolva tartalmazza. Egy ilyen fehérje lehet például egy ellenanyag, vagy annak egy antigénkötő fragmense.

A találmány szerinti fehérjéket azzal a céllal adjuk be egy betegnek, hogy a kívánt terápiás hatást érjük el.

Ebből a célból a találmány tárgyát képezik az alábbiak:

a) Egy, a találmány szerinti fehérje, a terápiában való felhasználás céljából;

b) Egy, a találmány szerinti fehérje vagy konjugátum alkalmazása egy olyan gyógyszer előállításában, amit arra használunk, hogy kimerítsük a komplement bioszintézis út fehérje szintjeit, pontosabban arra használunk, hogy megakadályozzuk egy idegen anyag kilökődését;

c) A találmány szerinti fehérjékből vagy konjugátumokból egyet vagy többet tartalmazó gyógyászati készítmény, amely tartalmaz még egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozót és/vagy töltőanyagot; és

d) Eljárás komplement bioszintézis fehérje szintjének csökkentésére egy emlősben, ami abból áll, hogy az emlősnek beadunk a találmány szerinti fehérjéből, előnyösen egy gyógyászati készítmény formájában.

A gyógyászati készítményeket egységdózisok formájában állíthatjuk elő, amelyek dózisonként előre meghatározott mennyiségű adalékanyagot tartalmaznak. Egy ilyen egység minimumként tartalmazhat például 1 mg aktív adalékanyagot, előnyösen 2-3 mg-ot. Az, hogy egy ilyen dózis maximum mennyit tartalmazhat, számos tényezőtől függ, azaz például a kezelendő állapottól, a beadás módjától, a beteg korától, testsúlyától és állapotától, valamint gazdasági megfontolásoktól. Egy egységdózis tartalmazhat például 10 mg, vagy éppen 100 mg aktív adalékanyagot is.

A találmány szerinti fehérjék használhatók in vivő a komplement rendszer működésképtelenné tételére. Azok a körülmények, amelyek között ez kívánatos lehet, az alábbiak lehetnek:

(a) Azzal a céllal, hogy megakadályozzuk egy transzplantátum, különösen egy xenograft (azaz egy másik állatfajból átültetett anyag), de legfőképpen egy távoli xenograft (ahol a donor és a recipiens távoli rokonságban vannak) komplement által közvetített tönkremenetelét. A recipiens az operáció előtt dekomplementálható, és ebben az állapotban tartható addig, ameddig a transzplantátum vagy alkalmazkodott, vagy egy kompatibilisebb szervvel lett helyettesítve.

Az első kezelést a transzplantáció előtt néhány nappal végezhetjük. További dekomplementációra a kilökődési krízisnél lehet szükség. A kezeléseket antihisztamin reagensek használata kísérheti, hogy ellenőrzés alatt tartsuk az általános gyulladásos válaszokat (azaz például a vazodilatációt), amelyek valószínűleg a C3A és/vagy a

C5a keletkezéséből származnak.

A dekomplementáció előnyös lehet mesterséges szervek vagy szövetek (azaz például mesterséges vesedialízis membránok) alkalmazása esetén, amelyek aktiválják a komplement rendszert. Amint az előzőkben ismertettük, a fehérjét beadhatjuk nem aktivált formában, funkcionális

C3b-szerű formában vagy egy előre elkészített aktív C3 konvertáz (mint például a C3bBb) formájában. Ezt bármelyik olyan úton beadhatjuk, amelyen az aktív konvertáz találkozik a keringő C3-mal (azaz például intravénásán, szubkután, stb.).

Egy másik alternatíva lehet egy ex vivő kezelés, például a keringést egy, az aktív konvertázt hordozó mátrixon át transzfundáltatva. Ennek az lehet az előnye, hogy hagyjuk az anafilaktikus peptideket (C3a és C5a) és a többi kis molekulasúlyú gyulladásos mediátort (azaz például a hisztamint és a dinitrogénoxidot eltávozni (például dialízissel) mielőtt a dekomplementált vért (vagy plazmát) visszajuttatjuk a betegbe.

(b) Azzal a céllal, hogy a nagy sebészeti beavatkozásból eredő, komplement által közvetített károsodást megakadályozzuk. A beteg dekomplementálható, az előzőkben ismertetett módon, előnyösen az operáció előtt (de ha szükséges akkor utána), és ebben az állapotban tartható addig, amíg a komplement által közvetített immuntámadás következményeként fellépő további belső sérülés veszélye fennáll.

(c) Azzal a céllal, hogy a nem sebészeti beavatkozásból eredő, komplement által közvetített károsodást megakadályozzuk. Ezekben az esetekben a dekomplementációt az indító sérülés után kell elvégezni, de a beadás készítményei és módszerei egyébként valószínűleg hasonlítanak azokhoz, amiket az előzőkben ismertettünk.

Ez különösen hasznos lehet akkor, ha a regenerálódás magában foglalja egy iszkémiás szövet keringés általi reperfúzióját (azaz például szívizom iszkémia, fagyási sérülés, égés, stb.).

(d) Azzal a céllal, hogy minimalizáljuk az ellenanyag-antigén kölcsönhatásokból származó, a komplement által közvetített károsodást. A komplement által közvetített védekező válaszok különösen nemkívánatosak az autoimmun betegségekben, amik közé tartozik például a glomerulonefrítisz, hemolitikus anémia, a súlyos izomgyengeség és a ΙΙ-es típusú, kollagénnal indukált arthritis. A betegség súlyos fázisaiban működésképtelenné téve a komplement rendszert enyhíthetjük az állapotot.

(e) Azzal a céllal, hogy egy specifikus célpontot hozzáférhetőbbé tegyük a komplement által közvetített im22 munmechanizmus számára. Ennél a megközelítésnél a cél nem az, hogy a szuperaktív C3 konvertázt használjuk a C3 általános kimerítésének elérésére, ehelyett a konvertázt lokálisan alkalmazzuk, hogy a C3 konverziót a megcélzott pontra lokalizáljuk. A célpont lehet egy patogén szervezet, azaz például baktérium, vírus vagy egyéb parazita, vagy egy káros hatású gazdasejt vagy szövet, azaz például egy tumorsejt vagy egy vírusfertőzött sejt. A C3 konvertázt a célpontra lokalizálhatjuk, vagy lokális alkalmazással (azaz például direkt injekcióval, feltehetőleg egy olyan közegben, amely visszatartja a diszperziót az általános keringéstől), vagy egy célponttal, azaz például egy ellenanyaggal kombinálva. Tehát a módosított fehérjét egy specifikus immunglobulinhoz kapcsoljuk, vagy a fehérjéket kémiai keresztkötésekkel összekapcsolva, vagy a DNS-t kódoló szekvenciákat kapcsolva össze és a fúziós fehérjét expresszálva és tisztítva (azaz például az IgG esetében vagy a nehéz láncot vagy a könnyű láncot kapcsoljuk a C3-hoz, és együtt expresszáljuk a C3-mal, vagy mindkét lánc kombinálható egyetlen teljes fúziós fehérjében), vagy specifikus kódoló szekvenciákat beépítve (azaz például leucin cipzár-szerű doméneket) mindkét fúziós partnert kódoló DNS-be(azaz például módosított C3 és specifikus ellenanyag), oly módon, hogy az expresszált termékek önmaguktól összekapcsolódnak, hogy stabil konjugátumokat hozzanak létre. A fúziós fehérjét azután vagy lokálisan adjuk be, vagy az általános keringésbe.

Liposzómák (amelyek az ellenanyagot a felszínükön hordozzák, a módosított fehérjét vagy a felszínen vagy a liposzóma belsejében hordozva) és/vagy virionok (azaz amelyeket úgy változtattunk meg génsebészeti módszerekkel, hogy a fehérjéket a felszínükön expresszálják) is használhatók az ellenanyag és a módosított fehérje bejuttatására. Ez a stratégia használható közvetlenül, önmagában, vagy egyéb kezelésekkel kombinálva, a kóros folyamat akármelyik szakaszában. Különösen jól használható egy rákos sejt sebészeti eltávolítása után a keringésben maradt rákos sejtek rákos sejtek eliminálására. Az ellenanyaggal-módosított fehérje-konjugátumok is használhatók ex vivő, hogy elimináljuk a patogén szövetet. Például arra, hogy leukémiás sejteket elpusztítsunk egy extrahált csontvelőből, majd a megmaradt egészséges sejteket visszajuttassuk a betegbe.

Egy másik módszer szerint azokat a limfocitákat, amelyeknek nem egyezik az MHC típusa a befogadó MHC típusával, eliminálhatjuk egy csontvelőből a transzplantáció előtt. Emellett a módosított fehérjét kapcsolhatjuk egy antigénhez, és ezt a kombinációt használhatjuk, vagy in vivő vagy ex vivő, hogy nemkívánt aktivitásokkal (azaz például a transzplantátummal vagy saját szövettel szembeni aktivitással) rendelkező limfocitákat támadjunk meg velük.

Ugyanez a technológia használható egyéb fajok kezelésére, vagy a humán módosított fehérjeszármazékot alkal24 mazva, vagy egy hasonló analógot, az sdott fajnak megfelelően átalakítva.

A találmányt az alábbiakban a példák segítségével ismertetjük, amelyek semmiképpen nem tekinthetők a találmány oltalmi köre korlátozásának. A példákban hivatkozunk a mellékelt ábrákra, amelyeknek rövid ismertetését az alábbiakban adjuk meg:

Az 1. ábrán láthatjuk a humán C3 kikövetkeztetett szekvenciáját, amint azt a PC3 kódolja;

A 2. ábrán láthatjuk a PC3-ban levő cDNS szekvenciáját;

A 3.ábrán láthatjuk a találmány szerinti módosított fehérjék vizualizációját;

A 4. ábrán láthatjuk a különböző, az Arg 1303-at vagy az

Arg 1320-at helyettesítő mutációk hatását a humán

C3-ra, azaz az ezeken a helyeken az I faktor által közvetített hasításra;

Az 5. ábrán láthatjuk annak a humán C3-nak a fokozott rezisztenciáját, amely az Arg 1303 -> Gin 1303 mutációt tartalmazza, az I és H faktor által végzett inaktiválással szemben;

A 6. ábrán láthatjuk egy olyan C3 konvertáz hasításának elemzését, amely a 752-754-es és 758-760-as aminosav csoportokban elmutált;

A 7. ábrán láthatjuk a radioaktív izotóppal jelzett B faktor D faktorral végzett hasításának elemzését, vad típusú és mutáns C3-ak (C3i-ik) jelenlétében;

·· · · ·*·· «··· • · · · • · · · • * · · • ··

A 8. ábrán egy SDS-PAGE vizsgálatot láthatunk, amely illusztrálja egy konjugátum képződését a C3I és az IgG között.

A 9. ábrán láthatjuk, hogy a konjugátum megcélozza a birka eritrociták elleni C3 konvertáz aktivitást.

Az alábbi standard módszerek és meghatározások mindegyik példában alkalmazhatók.

Az összes említett komplement komponens humán eredetű, hacsak nem említjük az eltérést, minden fehérjére és származékaikra standard terminológiát alkalmazva [Rother,K. és Till,G.O. (szerk.) The complement System (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Németország) (1988)] . Emellett a C3i szakkifejezés a C3 bármelyik olyan molekuláris formájára vonatkozik, amely nem tartalmaz érintetlen tiolészter kötést, de megtartja a C3a polipeptidet az a-láncon.

A humán C3 DNS-t és a kódoló szekvenciákat a 2.

ábrán bemutatott módon számozzuk, az EMBL nukleotid adatbázisban használt számozást alkalmazva [ de Bruijn, M.H. és Fey,G.H.: Proceedings of the National Academy of

Sciences, USA, 82, 708-712 (1985)] . A bemutatott szekvenciát mi készítettük, ( 'PC3' ) , amelyről hiányzik a szakirodalomban [de Bruijn, M.H. és Fey,G.H.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 708-712 (1985)] közölt 5' nem-transzlálódó régió első 11 nukleotidja, ezért van az, hogy az első bázis a 12-es sorszámot kapja. A feltételezett iniciációs kodon a 61-63-as ··· ·*»* ·· ···· · ··· • ί · · · · ···· ··· . *_tt · nukleotidokat tartalmazza, a β-lánc N-terminális szerinjét a 127-129-es nukleotidok kódolják, és az α-lánc Nterminális szerin csoportját a 2074-2076-os nukleotidok kódolják.

A fehérjeszekvenciákat az 1. példában bemutatott prekurzor szekvenciának megfelelően számozzuk, ami az 1.

ábrán szereplő DNS szekvencia számított transzlációjának felel meg (az 1-22-es aminosavak várhatóan egy szignálszekvenciát tartalmaznak, ami a bioszintézis során eltávolítódik, és a 668-671-es aminosavak várhatóan akkor távoznak a molekulából, amikor a prekurzor a- és βláncokra hasad) .

Az alábbiakban közöljük néhány rövidítés jelentését.

CVF: kobraméreg faktor;

ELISA: Enzimhez kötött immunadszorbens vizsgálat;

E.coli: Escherichia coli kb: kilobázis

HSV-1: l-es típusú herpesz szimplex vírus;

PBS: foszfáttal puffereit sóoldat;

COS-1: majomvese sejtekből származó sejtvonal.

Az alábbi rövidítések restrikciós endonukleázokat jelentenek: AflII, Dral, DralII, EcoRI, EcoRV, Hindin,

Nael, Nhel, Xbal.

A standard molekuláris biológiai módszerek, azaz például a plazmid-izolálás, agaróz gélelektroforézis, DNS ligálás leírása megtalálható a szakirodalomban [ Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold

Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] . A kétszálú DNS szekvenciáját a United States Biochemicals által szállított Sequenase version 2.0 kittel határozzuk meg. A C3 expressziót ELISA vizsgálattal mérjük, affinitás-tisztított poliklonális birka anti-humán C3-mal előre beborított műanyag lemezeket használva, amihez hozzáadjuk a tenyészet felülúszó mintákat. A megkötött C3-at alkalikus foszfatázhoz konjugált C3 elleni monoklonális patkány ellenanyaggal, valamint a p-nitrofenol kromogén szubsztráttal mutatjuk ki. A vizsgálatot tisztított humán plazma C3-mal kalibráljuk.

Az elemzés során a komplement fehérjék és a CVF tisztítására, valamint az affinitás-tisztított anti-C3 ellenanyagok készítésére használt módszerek megtalálhatók a szakirodalomban [ Harrison, R.A. és Lachmann, P.J.

Handbook of Experimental Immunology (szerk.: Weir, Herzenberg, Blackwell and Herzenberg; Blackwell, Oxford) 4th ed., (1986)] . Ekvivalens reagensek vásárolhatók a Sigma Chemical Company Ltd-től.

A C3-at kódoló cDNS szekvenciát két olyan szegmensből izoláljuk, amit random primer módszerrel feldolgozott, a pGEM4 vektorban (Promega) levő humán máj cDNS könyvtárból izoláltunk. Öt oligodezoxinukleotidot, amelyek megfelelnek a humán C3 kódoló szekvenciában levő ismert szegmenseknek, T4 polinukleotid kinázzal radioaktív izotóppal, azaz [ γ-32Ρ] ATP-vel jelezzük, és próbaként használjuk a könyvtár agaróz lemezekről készített .··. .: ···: ···? .··. ·.·· ... . ..

szűrőlapjainak átvizsgálására. Két kiónt izoláltunk, amelyeknek a mérete körülbelül 4 kilobázis. A restrikciós endonukleázos emésztés, a specifikus oligodezoxinukleotid próbákkal végzett hibridizálás és a részleges szekvencia elemzés azt mutatja, hogy ezek közül az egyik ( Ά13' ) tartalmazza az 5,1 kilobázis méretű hírvivő RNS 5' végét, míg a másik ( Ί344' ) a 3' végig terjed.

Ezért ezek az inszertek körülbelül 3 kilobázis hosszan átfednek, és tartalmaznak egy egyedi EcoRI hasítási helyet. Az A13 inkomplett 5' részét EcoRI és Nhel restrikciós enzimmel emésztjük, majd a B44-ből izolált, EcoRI és Xbal restrikciós enzimes emésztéssel kapott komplett szegmenssel helyettesítjük. Mindkét darabot gélelektroforézissel tisztítjuk, alacsony olvadáspontú agarózban, mielőtt T4 DNS ligázzal összeligáljuk, így kapunk egy PBC3 vektort, amely egy 5,1 kilobázis méretű, a teljes C3 prekurzor fehérjét kódoló DNS-t tartalmaz .

A C3 kódoló régió 5' végéhez kapcsolódó linker szekvenciák két ATG kodont tartalmaznak, amelyek potenciális hamis transzlációs hasítási helyek. Ezeket azután megszakított-plazmid mutagenezissel eltávolítjuk, amint azt az 1. példában ismertetett módszerben leírjuk, egy PL-ATC-3 oligodezoxinukleotid használatával (tagggagacc ggaagcttgc cctctccctc tgtccctctg t), amivel körülbelül 50 bázispárt távolítunk el a linker/adapter DNS-ből, anélkül, hogy megváltoztatnánk a C3 kódoló szekvenciát. Ezt a mutált ► *»· ««»· ·· vektort, amelynek mérete 7,7 kilobázis, és tartalmazza az 5,1 kilobázis méretű C3 DNS szekvenciát plusz 2,6 kilobázist a PGEM4 (Promega) vektorból, PC3 jelzéssel látjuk el.

A PGC3 plazmid C3 kódoló régió szekvenciáját teljesen meghatározzuk, ezzel csak négy különbséget lehetett kimutatni egy korábban publikált humán C3 (S alléi) cDNS szekvenciától [de Bruijn,M.,H. és Fey,G.,H.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 82

708-712 (1985)] .

(i) A C2481—> G és a C2805—» T változások nem változtatják meg a kódot;

(ii) A T1001—> C kódolja a korábban ismertetett HAV

4-1-(Leucin314—> Prolin) polimorf formát [ Botto, Μ. ,

Fong,K.,Y., So,A.,K., Koch,C. és Walport,Μ.,J.: J. Exp.

Med. 172 1011-7 (1990)]; és (iii) A G2716—» A Valin886—» Izoleucin változást kódol, amit korábban nem írtak le a humán C3-ban, jóllehet az Ile megtalálható ebben a pozícióban a patkány és az egér C3-ban.

A mi szekvenciánk tartalmaz start és stopkodonokat, egy komplett szignálszekvenciával, és ennek következtében funkcionális C3-at kell kódolnia.

ELISA-val még 1,7 pg/ml-es szinteket is ki lehetett mutatni, ami vad típusú C3-mal érhető el COS-1 sejt tenyészetek felülúszójában (a transzfekciót lipofektaminnal ·’^ν. .:

·’ ···· ··· · ·* és a pcDNA3 (Invitrogen) expressziós vektorral végeztük). Nincs kimutatható C3 azokban a sejtekben, amelyeket csak a pcDNA3 vektorral transzfektáltunk. Továbbá, az expresszált termék elemzése hasítási reakciókkal, majd ezt követő immunprecipitációval, SDS-PAGE-val és immunblottolással a következőket igazolta:

(i) A primer transzlációs termék megfelelő mértékben processzálódik az érett kétláncú formává;

(ii) ez a termék, a természetes C3-hoz hasonlóan, hasítható C3b-vé C3 konvertázzal (CVFb); és (iii) az expresszált fehérje, a természetes C3-hoz hasonlóan hasítható a H plusz I faktorral, de csak azután válik hasíthatóvá, miután a C3 konvertáz enzimmel C3b-vé konvertáltuk. Ez megerősíti, hogy a mi kiindulási plazmidunk funkcionális C3-at eredményez transzlációba vive.

A C3 kódoló szekvencia készítésének és expresszálásának egy alternatív leírását megtalálhatjuk a szakirodalomban [ Taniguchi-Sidle, A. és Isenman, D.E.: J. Bioi.

Chem. 267: 635-643 (1992)] .

1. Példa

Olyan C3 előállítása, amelyben mindkét I faktor hasítási helyen az arginint (a 1303-as és 1320-as aminosavak) glutamin csoportokká alakítottuk, hogy ezzel megakadályozzuk a C3b fragmens hasítását az I faktorral (a) Mutagenezis

A használt mutagén oligodezoxinukleotid volt a QRI1 (caactgcccagccaaagctccaagatcacc), a QRI2 (gccagcctcctgcaatcagaagagaccaag) és az AFL4149 (taataaattcgaccttaaggtcaccataaaac), valamint a megfelelő antiszensz oligodezoxinukleotidok, azaz a QRIln (ggtgatcttggagctttggctgggcagttg) , a QRl2n (cttggtctcttctgattgcaggaggctggc) és az AFL4149n (gttttatggtgaccttaaggtcgaatttatta).

A QRI1 és a QRIln határozza meg az arginin glutaminnal való helyettesítését a C3 prekurzor szekvenciában az I faktor hasítási helyén a 1303-as aminosav csoportnál (a G3968C3869-et ΆΑ-ra változtatva a cDNS szekvenciában), a QRI2 és a QRl2n ugyanezt a helyettesítést hajtja végre a faktor hasítási helyén az 1320-as aminosav csoportnál (a G4019-es nukleotidot A-ra változtatva).

Az AFL4149 és az AFL4149n egy hasítási helyet visz be az AflIII restrikciós endonukleáz számára a 4149-es pozícióba a cDNS szekvenciában (a C4149-et T-re változtatva) , anélkül, hogy megváltoztatnánk a kódolt aminosav szekvenciát. Ezt a két prímért használjuk markerekként, ami lehetővé teszi, hogy azonosítsuk a sikeres mutagenezist a DNS termék AflIII restrikciós enzimes azonosításával .

A mutagenezist a megszakított plazmid módszerrel hajtjuk végre. Olyan PGC3 sarzsot állítunk elő, ami timidin helyett sok uridint tartalmaz (UPGC3), oly módon, hogy Escherichia coli CJ236 sejtben szaporítjuk 0,25 μ9/Γη! uridin jelenlétében. Ezt a plazmidot Smal •· · ···· restrikciós enzimmel emésztjük, majd a 7,2 kilobázis méretű terméket (USl) agaróz gélen tisztítjuk, hogy eltávolítsunk egy 0,5 kilobázis méretű fragmenst a C3 szekvenciából (1463-1947-es csoportok). A megszakított plazmid másik komponensét (DN2) úgy állítjuk elő, hogy a PGC3-at DralII plusz Nael restrikciós enzimmel emésztjük, majd agaróz gélelektroforézissel kétszer tisztítjuk az 5,1 kilobázis méretű darabot. 200 ng méretű DN2-t keverünk össze körülbelül 500 ng USl-gyel 50 μΐ H₂Oval, 100 °C-ra melegítjük, majd lassan 50 °C alá hűtjük, mielőtt 20-25 μΐ 2XT7 puffért (100 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 14 mmol/1 MgCl₂, 100 mmol/1 nátrium-klorid, 2 mmol/1 ditiotreitol és 1-1 mmol/1 ATP, dATP, dCTP, dTTP, dGTP) valamint 10 nmol/l-t adunk hozzá az egyes 5' foszforilezett mutagén primerekből (az egyik reakcióban a

QRIl, QRI2 plusz AFL4149-et használtuk, a másik reakcióban QRIln, QRl2n plusz AFL4149n-et használtunk). A keveréket újra 70 °C-ra melegítjük 5 percre, majd lassan visszahűtjük 20 °C-ra (30-60 perc alatt). 0 °C-on 10 egység T7 DNS polimerázt plusz 80 egység T4 DNS ligázt adunk hozzá. Az elegyet (össztérfogata 50 μΐ) először 0 °C-on inkubáljuk 5 percig, majd szobahőmérsékleten tartjuk percig, végül 37 °C-on tartjuk 3 óra hosszat. Az egyes elegyekből 1-1 μΙ-t használunk arra, hogy 100 μΐ szuperkompetens Escherichia coli XLl-et (Stratagene) transzformáljunk vele, a szállító előírásai szerint.

• · · · ·

Az ampicillin rezisztens telepeket AflII hasítás alapján vizsgáljuk át, majd a jó mutánsokat 100 ml-es tenyészetekben szaporítjuk, amely tenyészetből izoláljuk a plazmidokat és megszekvenáljuk őket (a C3pa-3876 szekvenáló primert alkalmazva, amelynek szekvenciája: cttcatggtgttccaagcct, a C3 cDNS 3876-3895-ös illeszkedő nukleotidjai), hogy jellemezzük a mutációkat az I faktor hasítási helyén.

A megszakított plazmid mutagenezis egy másik megvalósítási módjának leírását lásd a szakirodalomban [ Hofer, B. ésKuhlein, B. : Methods Enzymol. 217 173-189 (1993); Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. és

Inouye, M. : Bio-technology 636-639 (1984)] .

(b) A mutáns DNS átvitele eukarióta expressziós vektorba

A mutáns plazmidokból származó C3-at kódoló fragmenseket Hindin és Nael restrikciós enzimekkel végzett kettős emésztéssel kivágjuk. A Dral enzimet azért használjuk, hogy a megmaradt plazmidot működésképtelenné tegyük. A C3-at kódoló szekvenciát agaróz gélelektroforézissel tisztítjuk, majd pcDNA3 vektorba (Invitrogen) ligáljuk, amit HindlII és EcoRV enzimekkel linearizáltunk, és borjúbél foszforilázzal defoszforileztünk. A ligáló elegyeket használjuk szuperkompetens Escheríchia coli XL1 transzformálására, amit azután ampicillint tartalmazó lemezekre szélesztünk.

Az ampicillin rezisztens telepek közül véletlenszerűen kiválasztott három vagy négy telepet 2-3 ml-es tenyészetekben szaporítjuk, majd kismennyiségű plazmidot izolálunk belőlük. A korrekt inszertet tartalmazó plazmidot úgy azonosítjuk, hogy a plazmid DNS-t EcoRI, Hindin és AflII restrikciós endonukleázokkal emésztjük. A megfelelő telepeket 100 ml-es tenyészetekben szaporítjuk, majd a plazmidokat standard eljárással tisztítjuk. Ezeket a mutánsokat eredetileg PGC3 plazmádból készítettük, amelyek így megtartották az 5' kódoló régióban lévő két ATG kodont. Ezt a régiót (plusz a C3 kódoló szekvenciából 3 kilobázis méretű 5' részt) Hindin plusz EcoRI restrikciós enzimmel kivágjuk, majd ligálással helyettesítjük a PC3-ból kivágott ugyanolyan fragmenssel. Ezeket a rekonstruált vektorokat standard eljárásokkal izoláljuk, és COS sejtek transzfektálására használjuk.

(c) A vad típusú és a mutáns C3-ak expressziója

A mutáns és vad típusú C3-at tranziens módon expresszáljuk COS-1 sejtekbe lipofectaminenal (GIBCO) COS-1be transzfektált plazmidokról. Tipikus esetben egy standard hatlukas lemezen lukanként 1-1,5 x 10⁵ sejtet transzfektálunk 2-4 pg plazmiddal, 9 μΐ lipofectamine reagenst alkalmazva. A felülúszókat vizsgáljuk, hogy szekretálnake C3-at, és lukanként 0,3-1,7 μg-os kitermelést kapunk, a transzfekció után 3-6 nappal.

Eredmények

a) Mutánsok készítése

Ezidáig az alábbi mutánsokat izoláltuk, amelyeket a beépített mutagén oligodezoxinukleotid szekvenciák után neveztünk el:

(i) 3 mutáns, amelyek mind a QRI1, mind a QRI2 mutációkat, plusz az AFL4149-es mutációt tartalmazzák:

C3M-26, C3M-58 és C3M-61;

(ii) 1 mutáns, amely tartalmazza a QRIl-et és a

QRl2-t, de nem tartalmazza az AFL4149-et: C3M-8; és (iii) 1 mutáns, amely tartalmazza a QRl2-t és az

AFL4149-et, de nem tartalmazza a QRIl-et: C3M-51 (a 3.

példában használjuk).

b) Annak validálása, hogy a funkcionális hatások annak következtében léptek fel, hogy a mutánsokat specifikusan az I faktor hasítási helyein vittük be.

A szekvenálással megerősítettük egyéb változások hiányát a 178-350-es bázisok régiójában, amelyek az egyes mutánsok mutált régiói körül találhatók. Az ezzel az eljárással előállítót egyik mutáns, a C3M-51 szekvenciáját (lásd 3. példa) a mutagenezisben alkalmazott teljes 'gap' régióban elemeztük (2463-5067-es bázisok), és nem találtunk egyéb eltérést a vad típusú szekvenciától.

Tovább, az összes mutánsnak egy 2922 bázispárra kiterjedő, reprezentatív szekvenálásával sem lehetett felfedezni egyetlen egypontos mutációt sem, amit a polimeráz által bevitt hibák okozhattak volna. Mindegyik expresszált mutáns a C3 konvertázoknak a természetes C3-ra

jellemző kétláncú szerkezetét és hasítását mutatja, és valószínűtlen, hogy nemkívánt változásokat tartalmaznak, bár nem szekvenáltuk meg őket újra teljes hosszúságukban.

2. Példa

Olyan C3 előállítása, amely az egyik I faktor hasítási helyen (a 1303-as aminosav pozícióban) levő arginin csoport helyett glutamin csoportot tartalmaz

Az 1. példában ismertetett eljárást alkalmazzuk, azzal az eltéréssel, hogy csak az AFL4149 plusz QRI1, vagy az AFL4149n plusz QRIln mutagén oligodezoxinukleotid kombinációkat használjuk a mutagenezisben (azaz nincs

QRI2 vagy QRl2n).

Eredmények

a) A kapott mutánsok mutánst izoláltunk, amelyeket a QRIl-gyel és az AFL4149-es oligodezoxinukleotiddal, de a QRI2 nélkül állítottunk elő. A C3M-I23 mutánst az 1. példában ismertetett módon expresszáljuk.

Ez a fehérje hasítható a CVFBb-vel. A C3b-szerű termék viszonylag (a vad típussal összehasonlítva) ellenáll a 1303-as pozícióban az I és H faktorokkal végzett hasításnak, de még hasítható a 1320-as pozícióban .

3. Példa

Olyan C3 előállítása, amely az egyik I faktor hasítási helyen (a 1320-as aminosav pozícióban) levő arginin csoport helyett glutamin csoportot tartalmaz

Az 1. példában ismertetett eljárást alkalmazzuk, azzal az eltéréssel, hogy csak az AFL4149 plusz QRI2, vagy az AFL4149n plusz QRl2n mutagén oligodezoxinukleotid kombinációkat alkalmazzuk a mutagenezisben (azaz nincs QRI1 vagy QRIln). Emellett az 1. példában alkalmazott módszerrel kaptunk egy olyan mutánst is, amely QRI2 és AFL4149 oligodezoxinukleotidokkal készült, de a QRI1 nélkül.

Eredmények

a) A kapott mutánsok olyan mutánst izoláltunk, amelyek QRI2 és AFL4149 oligodezoxinukleotidokkal, de QRI1 nélkül készültek: C3M51, C3M-Q12 és C3M-Q13. A C3M mutánst az 1. példában leírtak alapján expresszáljuk. Ez a fehérje CVFBb-val hasítható. A C3b-szerű fehérje nem könnyen hasítható a 1320-as pozícióban az I és H faktorokkal, de még hasítható a 1303-as pozícióban. Ez a C3b származék tehát részlegesen ellenáll az I faktornak.

4. Példa

A mutációk funkcionális hatásainak elemzése

A transzfektált COS sejtekből származó felülúszókat (100-400 μΐ) 37 °C-on inkubáljuk 2 óra hosszat:

A COS sejteket az alábbi, pcDNA3-at hordozó inszertekkel transzfektáljuk:

1)	a mutálatlan C3 szekvencia;
2)	mutált C3M-I23 (Arg1303—>Gln-t kódol) ;
3)	mutáns C3M-26 (Arg1303—»Gln-t, Arg1320—»Gln-1
kódol);	és
4)	1 ó ο η mutáns C3M-51 (Arg —»Gln-t kódol).
A	tenyészet felülúszókból a transzfekció után 3

nappal vett 200 μΐ alikvot részeket előkezeljük 2 mmol/1 fenilmetánszulfonil-fluoriddal (0 °C, 15 perc), majd 37 °C-on inkubáljuk 2 óra hosszat, az alábbi anyagokkal:

A) Nincs hozzáadott anyag

B) előre kialakított C3 konvertáz, CVFBb (10 μΐ,

200 μΐ 6,6 μg CVF-et, 100 μg B faktort és 1,4 μg D faktort, 10 mmol/1 MgCl₂-t tartalmazó foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) tartalmazó oldatból, 15 percig 37 °C-on előinkubálva);

C) H és I faktor (5 μg illetve 1 μρ); és

D) CVFBb plusz I és H faktor.

Ezeket azután immunprecipitáljuk 0,6 μρ affinitástisztított birka anti-humán C3 immunglobulinnal szobahőmérsékleten, majd egy óra elteltével 20 μΐ 5%-os szuszpenziót adunk hozzá, ami mosott, formaiinnal fixált Streptococcus sp. C csoport sejteket (G fehérje, Sigma) tartalmaz. Szobahőmérsékleten tartjuk 45 percig, majd a ·’*· .: ···:···:.··.

• · 9* .* * * ···· ··· · ’ * · részecskéket egyszer mossuk PBS plusz 5 mmol/1 NaN₃ összetételű oldattal·, majd egyszer mossuk 20 mmol/1 TRIS-HC1, 137 mmol/1 nátrium-klorid, 0,1 (térf/térf) % Tween 20 összetételű oldattal, pH=7,6, mielőtt eluálnánk 1% SDS/2%

2-merkaptoetanol összetételű oldattal (90-100 °C, 5 perc).

Ezeket az eluátumokat SDS-PAGE-val választjuk szét, elektroblottoljuk nitrocellulózra, majd a C3 csíkokat úgy mutatjuk ki, hogy affinitás-tisztított birka anti-humán immunglobulinnal mint próbával vizsgáljuk át, majd tormaperoxidázhoz kapcsolt szamár anti-birka immunglobulinnal (Sigma) reagáltatjuk, a kimutatást az Enhanced Chemiluminescence szubsztráttal (Amersham) végezzük. Egy Röntgen filmre 2 percig tartó expozícióval készült fényképet mutatunk be a mellékelt ábrák között. A látható C3-eredetű csíkokat nyilakkal jelezzük, az egyes minták (1-4, A-D) azok, amelyeket éppen most ismertettünk. (Az összes mintában jelenlevő, körülbelül 50 kDa méretű (46 és 48 kDa-os csíkok közötti méret) prominens csík az immunprecipitációban használt lg nehéz lánca, és a tormaperoxidázhoz kapcsolt szamár anti-birka immunglobulinnal mutatjuk ki.).

Eredmények (lásd a 3. ábrát)

1. Mindegyik kezeletlen minta (1-A, 2-A, 3-A, 4-A) tartalmaz olyan csíkokat, amelyek a C3 a és β láncai helyes vándorlásának megfelelő csíkok, jelezve, hogy mindegyik mutáns expresszálódik, és helyesen dolgozódik fel a transzláció után. Az ezekben a mintákban jelenlevő 43 vagy 46 kDa méretű csíkok azt mutatja, hogy a tenyészközegben van jelen valamennyi H- plusz I-faktor-szerű aktivitás. A háromnapos bioszintetikus periódus során a C3 spontán hidrolízise olyan C3l-t eredményez, amit ez az aktivitás elhasít. A mutálatlan C3-ban ez okozza a 43 kDa és a 75 kDa méretű csíkok megjelenését (a 75 kDa méretű csík nem látható, mivel (i) elrejti a 75 kDa méretű βlánc, és (ii) a Western biot kifejlesztéséhez használt ellenanyagnak nagyon kicsi az aktivitása a C3 a lánc ezen részéhez: jelenlétét ezt követően igazoltuk, úgy, hogy egy erre a régióra specifikus patkány monoklonális ellenanyaggal (Clone-3)újra megvizsgáltuk. A H- és I-faktorok CVFBb nélküli hozzáadása (1-C, 2-C, 3-C, 4-C) nem hasítja el a megmaradt C3-at, jelezve ezzel, hogy ez aktív C3 (érintetlen tiolészter).

2. A mutálatlan C3-at (1) CVFBb-vel hasítjuk, majd a C3b terméket tovább hasítjuk endogén enzimekkel az 1-Bben, vagy hozzáadott H- és I faktorokkal az 1-D-ben. A 43 kDa méretű esik azt sugallja, hogy az Arg -nal van hasítás, és a 68 kDa méretű csík (hosszabb expozíciónál

1303 zz zz látható) az Arg -nal lejátszódó hasításra utal.

3. A mutáns C3M-I23 (Arg -> Gin) hasítható CVFBbvel, és a termék viszonylag rezisztens az endogén H- és I-faktor-szerű aktivitásra (2-B), maradt megkülönböztethető mennyiségű et' lánc (C3b) , de még hasítható akkor, ha extra H és I faktort adunk hozzá (2-D faktor) . A 43 kDa

, ,, 1320 meretu faktor az Arg -nal lejátszódó hasításra utal (egy, az a' lánc másik fragmensét reprezentáló, 71 kDa-os gyenge csík hosszabb expozíciós időknél látható), de nincs jelen 68 kDa-os csík, jelezve, hogy ez a mutáns rezisztens a mutáns Gln¹³⁰³-nál való hasításra.

4. A mutáns C3M-26 (Arg¹³⁰³—» Gin, Arg¹³²⁰—» Gin) hasítható CVFBb-vel, és a C3b-szerű termék (a' ) rezisztens az endogén H- és I-faktor-szerű aktivitásra (3-B). Nagyon rezisztens volt még további H- és I-faktorokra (3-D), a mutálatlan C3 (1) és egyéb mutánsokkal (2 és 4) összehasonlítva. Volt egy kismennyiségű 46 kDa méretű termék, jelezve, hogy valamennyi hasítás van a mutalt Gin -nál (a kísérő 68 kDa méretű fragmens is látható volt hosszabb expozícióknál). Nagyon kevés, vagy nem kimutatható 43 kDa-os csík van, ami megfelelne bármilyen hasításnak a

Gin -nál. Ennek következteben a 1303-as pozícióban levő

Arg—»Gln mutáció kevésbé hatékony mint a 1320-as pozícióban, az I-faktor által végzett hasítás megelőzésében. (Ez a lassú, megmaradt hasítás megjelenhet a mutáns C3M123-ban (Arg —»Gln) , de a 46 kDa meretú intermedier valószínűleg gyorsan átalakul 43 kDa méretűvé, a mutálatlan Arg -nál lejátszódó további hasítás hatasara).

i

5. A mutáns C3M-51 (Arg —»Gln) hasítható CVFBbvel, és a terméket endogén H- és I-faktor-szerű aktivitással hasítottuk (4-B), valamint még hozzáadott H- és Ifaktorral (4—D). A 46 kDa méretű termék (és egy gyenge 68

1303 kDa-os esik) az Arg -nál lejátszódó hasítást jelez. Azonban egy 43 kDa-os csík hiánya azt mutatja, hogy nincs

99Ω hasítás a mutalt Gin -nál.

5. Példa

A különböző aminosav-helyettesítések összehasonlítása a

1303-as pozícióban

1. Bevezetés

Az előző példákban ismertettük az arg 1303 és az arg 1320 glutaminná való mutációit. Mindkét mutáció az Ifaktor által végzett hasítással szembeni rezisztenciát okoz ezekben a pozíciókban. Azonban van egy kis mennyiségű, de kimutatható mértékű hasítás a gin 1303 pozícióban. Ennek következtében ebben a pozícióban számos egyéb aminosav helyettesítést végeztünk és vizsgáltunk le. Hasítás játszódik le, csökkenő hatékonysággal, ha a 1303-as csoport a következő: Arg > Tyr > [Cys vagy Trp] > Gin > [ Glu vagy Gly] . Ezek váratlan eredmények, mivel (i) mindegyik ismert, természetben előforduló, humán I-faktor által közvetített hasítás az arginin csoportoktól a Cterminális irányában játszódik le, amiből azt a következtetést lehetne levonni, hogy az enzimnek a működéséhez argininre van szüksége; és (ii) ha egyéb csoportoknál is hasítana, akkor arra gondolhatnánk, hogy azoknak elektrosztatikusán hasonlóaknak kell lenniük az argininhez, azaz bázikus csoportnak kell lenniük (lys vagy his) , (például a tripszin szelektíven hasít az arg, lys ·*·· ·*·· vagy his után C-terminális irányban), tehát nem gondolhatnánk a tirozinnál való hasításra.

Ennek következtében az arg 1303 glicinnel vagy glutaminsavval való helyettesítését tartjuk előnyösnek, egy olyan C3 származék előállításához, amely rezisztens az Ifaktorral végzett inaktiválásra.

2. Módszerek

2.1. Mutagenezis: a használt degenerált mutagén primer az alábbi volt: caactgcccagc(gt)(cg)agctccaagatcacc (a zárójelben levő betűk bázisok keverékét mutatják az adott pozícióban). A mutánsokat vagy a megszakított plazmid módszerrel (amit a korábbi példákban ismertettünk) , vagy a megaprimer módszerrel [ V. Picard és mtsai: Nucleic Acids Research 22, 2587-91 (1994)] állítjuk elő, amelyben az 5' primer szekvenciája caccaggaactgaatctagatgtgtccctc, a 3' primer szekvenciája pedig gttttatggtgaccttaagtcgaatttatta volt. Mindegyik mutációt olyan templáton végezzük, amelyben a C3-at kódoló DNS már elmutált, oly módon, hogy a 1320-as aminosav csoport már glutamin, és az AflIII hasítási helyet már bevittük a 4149-es pozícióba (amint azt a korábbi példákban ismertettük) , és DNS szekvenálással igazoljuk.

2.2. Expresszió: a mutánsokat COS sejtekben expresszáltuk, pcDNA3 vektor felhasználásával, amint azt a korábbi példákban leírtuk, bioszintetikus úton [ ³⁵S] metioninnal jelezzük szérummentes táptalajban.

2.3. Vizsgálat: a felülúszókat CVFBb-vel kezeljük (ami a CVF B és D faktorokkal való reakciójában keletkezik magnéziumot tartalmazó pufferben), majd H- és I-faktorokkal, utána anti-C3-mal immunprecipitációt végzünk és redukáló körülmények között végzett SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel választjuk szét (a korábbi példákban ismertetett módon). A gélt fixáljuk, Amersham Amplify reagenssel kezeljük, megszárítjuk, majd autoradiográfiás filmre exponáljuk, így kapjuk az ábrán bemutatott eredményt.

3. Eredmények

A 1303-as pozícióban (1-es hely) az I-faktor által közvetített hasítás, a 1320-as pozícióban (2-es hely) való hasítás nélkül 46 és 68 kDa méretű csíkokat eredményez. Látható, hogy a hasítás a következő sorrendben játszódik le: arg(R) > tyr(Y) > cys(C) és trp(W) > gin(Q) > gly(G) és glu(E). A vad típus (mindkét pozícióban arginin) mindkét pozícióban hasítható, így kapunk 43 és 68 kDa méretű fragmenseket (a 43-as fragmens túl kicsi ahhoz, hogy ezen a gélen látható legyen).

4. Ábra

Az eredmények a 4. ábrán láthatók. Az 1-es pontban (1303-as pozíció) és a 2-es pontban (1320-as pozíció) levő csoportokat a megfelelő sávok felett jelezzük.

6. Példa .:-. ,:. :* ^k :.,:

A H- és I-faktorokkal szembeni fokozott rezisztencia igazolása az arg 1303 gln-né való mutációja után

1. Bevezetés

A korábbi példák az igazolták, hogy az arg 1303 vagy az arg 1320 glutaminná való konverziója azt az adott helyet rezisztensé teszi az I faktor által végzett hasítással szemben. Mindkét pont elmutáltatása a molekulát mindkét pontban rezisztenssé teszi. A továbbiakban igazoljuk, hogy ha csak az arg 1303-at mutáltatjuk gln-re (az arg 1320 megváltoztatása nélkül) , akkor ez a vad típussal összehasonlítva jelentős rezisztenciát eredményez az I- és H-faktorokkal való funkcionális inaktiválással szemben.

2. Módszerek

2.1. Expresszió: Az arg 1303 —> gin mutáció készítését az előző példákban ismertettük. Ezt CHO-ba transzfektáljuk (ez egy általánosan használt, aranyhörcsög petefészek sejtekből származó laboratóriumi sejtvonal) a kalcium-foszfát módszerrel, majd a stabil transzfektánsokat a G418-cal szemben tanúsított rezisztencia alapján szelektáljuk (a Geneticin a Sigma-tól szerezhető be). A sejttenyészet felülúszókat összegyűjtjük, majd az expresszált C3-at részlegesen tisztítjuk nátrium-szulfátos kicsapással (10-20 tömeg/térf % frakció), majd ioncserés kromatográfiával tisztítjuk Q-sepharose és mono-Q-sepharose oszlopon [A. W. Dodds: Methods in Enzymology 223 46 (1993)] .

• ·· V

2.2. Vizsgálat: Birka eritrocitákat S016 monoklonális ellenanyaggal borítunk [ R. A. Harrison és P. J.

Lachmann: Handbook of Experimental Immunology, 4. kiadás, 39. fejezet (1986)], majd egy 5 térf/térf%-os szuszpenzióból 4,4 ml-t körülbelül 10 μg C2-vel, 24 μg C4-gyel és μρ Cl-gyel (tisztított humán komponensek) inkubálunk 10 percig 37 °C-on CFD-ben [ R. A. Harrison és P. J. Lachmann:

Handbook of Experimental Immunology, 4. kiadás, 39. fejezet (1986)] . Ebből a keverékből 0,8 ml-t azután 105 percig inkubálunk 0,25 ml oldattal, amely tartalmazza a félig tisztított vagy vad típusú C3-at valamint EDTA-t 12,5 mmol/1 végkoncentrációban. A sejteket azután CFD-ben mossuk és 0,1 tömeg/térf% zselatint tartalmazó CFD-ben (CFD-gél) használjuk. A [ ¹²⁵I] -jelzett 4-es klón monoklonális anti-C3 ellenanyaggal végzett radioligand kötődést használjuk annak igazolására, hogy a vad típusú vagy mutáns C3b-ből hasonló mennyiség ülepedett ki.

A vizsgálathoz sejtek 5%-os szuszpenziójából 40 μΙ-t hígítunk 250 μΐ CFD-gélben, majd 50 μΐ-es alikvot részeket 37 °C-on 30 percig inkubálunk 50 μΐ CFD-géllel, amely az I- és H-faktorokból 100, 10, 1 és 0 μρ/ιηΐ-βε hígítást tartalmaz. Azután 0,9 ml CFD-t adunk hozzá, a sejteket centrifugálással ülepítjük, és még kétszer mossuk 1-1 ml CFD-vel. A sejteket azután 100 μΐ olyan CFD-gélben szuszpendáljuk, amely 100 μρ/ml B faktort, 100 μρ/ml properdint, 1 μρ/ml D faktort és 0,3 mmol/1 NiCl₂-t tartalmaz.

percig tartjuk 37 °C-on, majd 0,9 ml CFD-t adunk hozzá, ami 10 mmol/1 EDTA-t és 2 térf/térf% normál tengerimalac szérumot tartalmaz. Tovább tartjuk 30 percig 37 °C-on, majd a nem lizált sejteket centrifugálással ülepítjük és a lízis mértékét úgy határozzuk meg, hogy 412 nm-en megmérjük a a felülúszó abszorbcióját. A 100%-os lízisnek megfelelő abszorbciót sejtek vízben való lizálásával határozzuk meg, majd ebből számítjuk a lízis százalékát.

Ezzel a vizsgálattal a kiült C3b-nek azt a tulajdonságát mérjük, hogy képes-e funkcionális C3bBbP konvertázt kialakítani. Az iC3b-vé való konverzió megakadályozza a konvertáz képződését valamint az ezt követő lízist a szérum/EDTA-ban.

3. Eredmények

Az ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a vad típussal összehasonlítva több mint tízszer annyi I és H faktorra van szükség az arg 1303—>gln mutáns hemolitikus aktivitásának megszüntetésére. Tehát ez a mutáció előnyös egy olyan C3 származék előállításában, amelynek a C3b terméke rezisztens a H- és I- faktorokkal végzett inaktiválással szemben. A hatás vagy annak a következménye, hogy nagyobb a rezisztenciája a 1303-as pozícióban való hasítással szemben (ha az arg gln-né mutált), vagy nagyobb a rezisztenciája a 1320-as pozícióban való hasítással szemben, ha a hasítás először a 1303-as pozícióban játszódik le.

• · · · ····

4. Ábra

Az eredmények az 5. ábrán láthatók. Az X-tengelyen az I- és H- faktorok koncentrációját ábrázoljuk. Q1 jelenti az arg—»gln mutációt. A százalékos lízist a módszerek részben leírtak szerint mérjük.

Eredmények

A humán C3 lényeges tulajdonságait, az ismertetett módosított variánsok alapján, az alábbiakban foglaljuk össze:

(i) A molekulának van egy funkcionálisan C3b-szerű származéka, amelyben kombinálhatja a funkcionálisan aktív humán B faktort, amit azután a humán D faktorral lehet hasítani, ezzel egy olyan enzimet hozva létre, amely képes elhasítani a humán C3-at.

(ii) A származékok aminosav szekvenciái nagyobb homológiát mutatnak a humán C3-mal mint bármely más fajból származó származó olyan C3-mal, amelynek a szekvenciája jelenleg ismert, vagy bármelyik, jelenleg ismert fehérjeszekvenciával. A C3-nak a vad-típusú fehérjében megtalálható, de a módosítottban nem feltétlenül meglevő szerkezeti tulajdonságai közé tartoznak az alábbiak:

(a) A jelen találmány példáiban használt humán C3 variánsok DNS szekvenciáját és a lefordított fehérjeszekvenciát a 2. és 1. ábrán adjuk meg. Ez a fehérjeszekvencia éppen két aminosavban tér a publikált fehérjeszekven··· · ···· ciától [de Bruijn, M.H. és Fey,G.H.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 82, 708-712 (1985)] (a részleteket a példákban adjuk meg) . Feltételezzük, hogy számos más variáns kompatibilis a C3 funkcióval, még akkor is, ha a legtöbb nem lesz jelen a populációban.

(b) A primer transzlációs termék proteolítikusan feldolgozódik két, diszulfid híddal összekötött lánccá, azaz az a (672-1663 csoportok) és a β (23-667-es csoport) lánccá, a szignálszekvencia eltávolításával (1-22-es csoport) .

(c) Az érett fehérje tartalmaz egy tiolészter csoportot a CyslOlO és a Glnl013-as csoport között.

(d) A C3 konvertázok elhasítják a C3-at a C3a eltávolítása céljából (672-748-as csoport). Ezt a reakciót követi a tiolészter csoport felbomlása.

(e) A H-faktor jelenlétében az I-faktor elhasítja a C3b-t az Argl303 és a Serl304 között, valamint az Argl320 és a Serl321 között.

A természetes C3 molekulában végzett módosítások

Az Argl303 helyettesítése Gln-nel

Ezt a módosítást a C3b egyik, I faktorral való hasítása helyén végezzük. A hatás az, hogy csökkenti az I faktorral való hasítás sebességét ebben a pozícióban. A glutaminná való változást azért választottuk, hogy megszüntessük az argininen levő pozitív töltést, ami valószínűleg fontos szerepet játszik az I-faktor szerin···· ···· proteáz aktivitásában, de megtartja a hidrofil karaktert és egy hasonló oldallánc méretet, ami minimalizálja a fehérje tercier struktúrájának mindenféle bomlását. Az ezt a feltételezést alátámasztó bizonyíték az, hogy a mutáció nem akadályozza meg a kétláncú struktúrává való processzálódást, egy tiolészter kialakulását, vagy a C3 C3 konvertázzal való hasítását. Az Argl303-nak egy másik aminosavvá való mutációja hasonló, vagy még ennél is jobb hatást érhet el, amint azt az 5. példában bemutatjuk.

Az is lehetséges, hogy ezt a hasítást úgy csökkentjük, hogy a Serl304-et (a hasítási hely másik oldala) mutáltatjuk el, vagy egy másik olyan csoportot, amely szerepet játszik az enzim-szubsztrát kölcsönhatásban .

Az Argl320 helyettesítése Gln-nel

Ez a módosítás a C3b I faktorral való hasításának másik oldálán van. A hatása az, hogy drasztikusan csökkenti (gyakorlatilag megszünteti) az I faktorral való hasítás sebességét ebben a pozícióban. A glutaminná való változtatást ugyanazon az alapon végeztük, mint amit az előzőkben ismertettünk, és ez a mutáció sem akadályozza meg a kétláncú struktúrává való processzálódást, egy tiolészter kötés kialakulását vagy a C3 hasítását C3 konvertázzal. Ismét igaz az, hogy egy másik aminosavvá való mutáltatással ugyanezt a hatást el lehet érni, és az is igaz, hogy a Serl321 vagy egyéb, az enzim-szubsztrát • · · · kölcsönhatásban résztvevő csoportok mutáltatása is eredményezheti ezt a hatást.

Ha a két mutációt, az Argl303—»Gln és az Argl320—»Gln mutációt kombináljuk, akkor ez megakadályozza a C3b inaktiválódását és ezzel megtartja azt a képességét, hogy egy aktív C3bBb konvertáz egy részét képezze. Egyéb mutációk (beleértve a mutációk kombinációját is), amelyek mindkét hasítási reakciót megszüntetik, szintén alkalmazhatók (azaz például az Arg 1303 —> Glu vagy az Arg 1303 —> Gly is használható az Arg 1320 —» Gin mutációval kombinálva) .

7. Példa

Különböző mutációk, amelyek csökkentik a C3b/C3l kölcsönhatását a H faktorral

7.1. Bevezetés

Más laboratóriumokban bizonyítékokat találtak arra, hogy a C3 átirat primer szekvenciájának 752-761-es csoportjai (lásd 1. ábra) részt vehetnek a H faktorral való kölcsönhatásban. Ezt a megállapítást vagy szintetikus peptidek hatásai alapján [ Ganu, V.S. és Muller-Eberhard, H.J.: Biochemistry 31, 1787-1794 (1992)], vagy korlátozott mutagenezis alapján [Taniguchi-Sidle, A. és Isenman,

D.E.: J. of Immunoi. 153, 5285-5302 (1994)] tették. Azonban egyéb publikált bizonyítékok azt sugallják, hogy csak a 767-776-os csoportok vesznek részt a H-faktorral való kölcsönhatásban, míg a 752-761-es csoportok a B fák52 torral való kölcsönhatásban fontosak [Fishelson: Mól. Immunoi. 28, 545-552 (1991)] . Mi úgy gondoltuk, hogy ennek a régiónak egy kiterjedtebb mutagenezise csökkentheti a H-faktorhoz való affinitást, és ennek következtében kívánatos lehet abból a célból, hogy egy olyan C3 származékot állítsunk elő, amely rezisztens a H-faktorral szemben. Emellett feltételeztük, hogy az elmutálandó fontos csoportok lehetnek a prominens savas csoportok (aszparaginsav és glutaminsav), és kívánatos lenne, hogy semleges csoportokká változtassuk őket, amelyek kisebb valószínűséggel közvetítenek erős kölcsönhatásokat. Ebben a példában a 752-754-es csoportokat változtattuk Asp-GluAsp-ről Gly-Ser-Gly-re, azzal kombinálva, hogy a 758-760as csoportokat Glu-Glu-Asn-ről Gly-Ser-Gly-re változtattuk. Ez a termék gyengébb hasítási jellemzőkkel rendelkezett, ami összhangban van azzal, hogy csökken a H-faktorral szemben mutatott érzékenysége. Ez bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a C3 módosítható úgy, hogy csökkenjen a H-faktorhoz való kötődése, és ezzel a H- és I-faktorokkal szembeni érzékenysége. Ezek a módosítások kívánatosak egy olyan C3 konvertáz előállításához, amely fiziológiás körülmények között stabil.

7.2. Módszer

A mutagenezis, az expresszió és az elemzés módszereit az előző példákban ismertettük. A megszinteti• · · · zált mutagén oligonukleotid az alábbi szekvenciával rendelkezik: agtaacctgggttcgggcatcattgcagatcgggcatcgtttcc.

7.3. Eredmények

A hasítási reakciók eredményei a 6. ábrán láthatók. Ezek azt mutatják, hogy:

1. A CVFBb hozzáadása a vad típusú C3-hoz azt eredményezi, hogy az a-lánc (2. sáv) eliminálódik, mivel a keletkező C3b érzékeny a tenyészet felülúszójában levő alacsony koncentrációjú I- és H-faktorokra. Az expresszió, vagy az azt követő inkubálás során keletkező C3i azonos módon iC3i-vé bomlik. Külső I- és H-faktorok hozzáadása (3. és 4. sáv) ennek következtében nem okoz változást az 1-es és 2-es sávban, mivel a táptalaj maga is tartalmaz elegendő H- és I-faktort ahhoz, hogy teljes hasítás jöjjön létre.

2. Ezzel ellentétben, a mutáns C3 kezelése CVFBbvel (6. sáv) nem eredményezi az α-lánc eltűnését. Keletkezik valamennyi α' , ami megfelel a C3b-nek, de ennek egy része, vagy az egész megmarad, jelezve, hogy az a-lánc létezése nem csupán a CVFBb-vel való hasítás kudarcának az eredménye. Tehát a 2-es sávban megmaradt, hasítatlan α-lánc a C3i-t képviselheti, amit nem hasítottak el az endogén H- és I-faktorok, bár az is lehetséges, hogy ezek közül valamennyi természetes C3-at képvisel, ami akkor marad meg, ha a mutáns a CVFBb-vel szemben részleges re54

I»· ···· · · • · · • · · ► · · zisztenciára tesz szert. Exogén H- és I-faktor nagy koncentrációban való hozzáadása (7-es és 8-as sáv) kimeríti az a és a! láncokat, jelezve, hogy (i) a mutáns nem teljesen rezisztens ezekre a faktorokra, és (ii) a 2-es sávban a CVFBb által nem hasított a lánc inkább a C3i-ből származik (ami hasítható a H- és I-faktorokkal, de nem hasítható a CVFBb-vel) mint a természetes C3-ból (amely hasítható CVFBb-vel, de nem hasítható a H- és I-faktorokkal). Mégsem hasad el az összes α-lánc, még a 8-as sávban sem, valószínűleg azért, mert rezisztens a H- és

I-faktorokra.

Emiatt a 752-754-es csoportok, valamint a 758-760-as csoportok mutációja generálhat egy olyan C3 molekulát, amely még hasítható C3 konvertázokkal, de részlegesen rezisztens a H- és I-faktorok működésére. Egyéb publikált adatok fényében ez a legvalószínűbb, mivel a mutációkkal egy olyan régiót módosítunk, amely részt vesz a H-faktorral való kölcsönhatásban, és emiatt a H-faktorhoz való csökkentett affinitást eredményezi.

8. Példa

Egy pont a C3-ban, amelyet úgy mutáltathatunk, hogy módosítsuk a C3i kölcsönhatását a B faktorral

8.1. Bevezetés

A korábbi példákban igazoltuk, hogy a C3 mutáltatása befolyásolhatja a H- és I-faktorokkal való kölcsönhatásokat. Ahhoz hogy felfedezzünk egyéb helyeket a C3-ban, amelyek kölcsönhatásba léphetnek a B-faktorral, összehasonlítottuk a különböző fajokból származó, ismert szekvenciájú C3 molekulák szekvenciáit, valamint a C4 és egyéb homológ fehérjék elérhető szekvenciáit. Azonosítottuk azt a régiót, amely megfelel a humán C3 1427-1433 csoportjainak, amely részt vehet a C3 és C4 specifikus funkcióiban. Ezek közé tartozhat a B-faktorral (vagy homológjával, a C4 esetében a C2-vel) való kölcsönhatás, de nem szükségszerűen azért, mert egyéb potenciális funkciók közé tartozik a tiolészter képződés, a C3b-vé (vagy C4b formává) való konverzió, a C3 és/vagy C5 szubsztráttal való kölcsönhatás a konvertáz aktivitásban, valamint a kölcsönhatás az I-faktorral és kofaktoraival.

Ezért a kiválasztott csoportokat egy másik homológ fehérje, ebben az esetben a humán C5 megfelelő csoportjává mutáltattuk (a szekvenciák illesztése alapján). Ezáltal a 1427-es csoport Arg-ról Gln-re változott, a 1431-es csoport Lys-ről Asp-re, a 1433-as csoport pedig Glu-ról Ginre. A kapott mutánsról kiderült, hogy érzékeny a C3 konvertáz által végzett hasításra (CVFBb), és a C3b termék hasítható a H- és I-faktorokkal. Azonban ez a mutáns nem támogatja a B-faktor konverzióját Bb plusz Ba-vá, ami függ a B-faktor C3i-hez (vagy C3b-hez) való kötődésétől, így tehát van bizonyítékunk arra, hogy ennek a régiónak a mutációja megszünteti a B-faktorral való kölcsönhatást.

Miközben ez nem kívánatos egy szuperaktív C3 konvertáz generálásánál, azt jelzi, hogy C3 ezen régiójának egyéb **· *·»« módosításai is megváltoztatják a B-faktorral való kölcsönhatást, és ezek közül néhány feltehetően fokozza az affinitást. Ennek az a következménye, hogy az ilyen mutációk fokozhatják a bimolekuláris konvertáz enzim, a

C3bBb (vagy C3iBb) stabilitását és aktivitását.

8.2. Módszerek

Az 1. táblázatban látható illesztések illusztrálják, hogy miért gondoltuk azt, hogy ez a régió mutáltatható lehet. Feltételeztük, hogy bizonyos csoportok jellemzői jól megőrződtek a C3-ban és a C4-ben, de a többi fehérjében ettől eltérnek. A 1427-es, 1431-es és 1433-as csoportokat választottuk, mivel a töltött tulajdonságuk azt jelezheti, hogy ez egy olyan csoport, amely részt vesz a fehérje-fehérje kölcsönhatásban. A változtatásokat a humán C5-ben levő megfelelő csoportokon végeztük, mivel ezek nagyon eltérő elektrosztatikus tulajdonságokkal rendelkeznek, de más konzerválódott csoportok környezetében, amik egy hasonló lokális szerkezetet jelezhetnek.

·**· «*«·· « l ·» » Λ • ♦ rzh „.1 in m

QSQQSQSOWQCdCdEdCdCdco

Ί¹ m

rd

SSi-TH4i-i>SE-iEHEHi-ini-inrc;

co co ωωωωωωωωΜωωωωοοω

1. Táblázat

A C3 és a rokon molekulák illeszkedése a humán C3 1427-1435-ös régiójában

CM co

co rd

Cd

Cd

Ed

Cd

Cd

Ed

Ed

Ed

X

ed

cd

a

s

Q

Q

2

O

z-«s a 'Φ e 3 Cd

co rd σ»

co

co

co

CO

co

CO

co

w

co

co

co

>

co

Ed

H

Cd

CM N1

l-l

Hl

H

H

H

H

H

H

>

>

>

H

H

íd

1-q

>

Ed eü o b o co a

rd 00 CM sf

>1

>d

>d

>d

>d

>d

>d

>d

>d

>d

>d

>d

>d

hd

Ed

rd

r-

CM n·

ed

ed

Cd

ed

Cd

cd

Ed

cd

cd

cd

cd

Ed

a

oi

Cd

r-1 u

I—i

(6

tp

£

cd

>1

•rH

co

'fű

3

l—1

G

3

3

3

G

rö

G

'3

Φ

3

Cd

+J

G

i—1

43

G

G

'3

3

tP

l—1

3

o

N

'3

Cd

3

o

Ό

'3

3

'3

ΓΊ

£

'<p

+J

G

43

g

CO

£

'CD

'CD

tP

co

£

'CD

£

aj

3

!p

3

Φ

O

<1>

•1“1

3

Cn

Co

G

3

3

tP

3

Ül

K

ω

Cd

Ed

Ed

X

Cd

cd

W

W

<

o

Cd

H

cd

Φ m

M 'Φ

Φ b

oo

U '3

a)

	N co I
Cd	1 'xP O
Γ—I	(Ό
ω	U

A2M ··· · ···<

Ο ω co >n α ω n q cL cZ q oá pí ο Η Η ω Ο ω H

2 Σ K * K X « üó « « « « W

OO >>>>>>>

ω H H H ω H H

ÍL ft CM ft CM

Egér

Patkány

		U
		fö
		i—1
		(Ö
		£
	>1	•H
	G	G	C
	'(Ö	Φ	'fÖ
G	44	tn	44
'Φ	+J	G	+J
Cn	fÖ	Φ	fÖ
ω	CL	Η	CL

G

-I—l

I-1

Λ

O

I—I

Cn

O

G

-Η ΓΟ

CL G S S

Cö G I-I T-l T-l

CL Sí ct Ft ft • · · ···· ··

A mutagenezis, az expresszió és a C3 hasítási reakciók elemzését a korábbi (1-4.) példákban ismertettük. Az alábbi szekvenciájú mutagén oligonukleotidot szintetizáltuk meg:

tggtgttgaccaatacatctccgactatcagctggacaa.

A B-faktor lebomlásának vizsgálata

Az expresszált terméket a COS sejt táptalajából tisztítjuk affinitás tisztítással, egy Clone-3-Sepharose oszlopon, a 9. példában ismertetett módon. Ezzel a módszerrel a tiolészter felbomlott formájának, a C3i-nek jelentős konverzióját kapjuk. A vad-típusú C3-at ugyanezzel az eljárással izoláljuk. A vad-típusú C3 hígításait (1/5, 1/25 és 1/125) SDS-PAGE gélen futtatjuk (redukáló körülmények között), a mutáns C3-mal együtt, és az ezüstfestés azt mutatja, hogy a mutáns olyan koncentrációban van jelen, ami a vad-típus 1/25-ös hígításánál alig kevesebb, de az 1/125-ös hígításánál jelentősen több mennyiséggel ekvivalens. Ugyanezeket a hígításokat használjuk a B-faktor lebomlásának vizsgálatánál. Ezekből a C3-makból 5 μΐt inkubálunk 3 óra hosszat 37 °C-on 25 μΐ CFD-G-vel, ami 5 μg/ml D-faktort és körülbelül 1,6 μg/ml I-jelzett Bfaktort (körülbelül 1000-2000 dpm/μΐ) tartalmaz. A mintákat azután SDS-PAGE-val elemezzük (redukáló körülmények között, a szárított gél autoradiográfiájával. Az eredmények a 7. ábrán láthatók.

• ·

8.3. Eredmények

Amint az a 7. ábrán látható, a B-faktor hasítása a vad-típusú C3 (C3i) 1/125-ös hígításánál is lejátszódik. Ezzel szemben nem figyelhető meg jelentős hasítás a mutáns C3 jelenlétében, még higítatlanul sem, ami magasabb koncentráció, mint a vad-típus 1/125-ös hígítása.

Ennek következtében úgy tűnik, hogy ez a mutáns nem képes a B-faktor hasítását támogatni, legvalószínűbb, hogy azért, mert csökkent a kötődési affinitása a B-faktorhoz. Ennek következtében van a C3-nak egy régiója, ami elmutáltatható úgy, hogy befolyásolja a C3i (vagy C3b) és a B-faktor közötti kölcsönhatást, és valószínűleg a konvertáz stabilitását is (C3iBb vagy C3bBb).

9. Példa

Az expresszált mutáns C3 molekulák tisztítása

9.1. Bevezetés

Ebben a példában azt igazoljuk, hogy a mutáns C3 molekulák miként izolálhatok egy expressziós közegből, azaz transzfektált eukarióta sejtek tenyészközegéből.

Egyszerű affinitás-tisztítással a C3 molekulák a funkcionális tesztek végzéséhez és ellenanyaghoz való konjugáláshoz megfelelő tisztaságban állíthatók elő a 10. példában ismertetett módon. Jóllehet egy ellenanyagról való elúciót a belső tiolészter jelentős részének hidrolízise kíséri, a C3i termék még megfelelő prekurzor egy aktív C3 konvertáz generálásához, valamint C3i-ellenanyag • · ·

konjugátumok készítéséhez. Ez a megközelítés emellett valószínűleg hasznos az in vivő felhasználáshoz szükséges előállítás során is.

9.2. Módszer

Affinitás-tisztítás Clone-3-Sepharose-on A Clone-3 egy patkány monoklonális ellenanyag, amely specifikus a C3-ra és a származékaira, beleértve a C3b-t és a C3i-t [ Lachmann, P.J. és mtsai: J. of Immunoi. 41, 503-515 (1980)] . Egyéb C3 elleni monoklonális ellenanyagok is hozzáférhetők, és néhány esetben sikeresen használták arra, hogy kismennyiségű humán plazmából C3-at állítsanak elő [ Dodds, A.W.: Methods in Enzymology 223, 46-61 (1993)], ennélfogva valószínűleg használhatók az ex vivő expresszált molekulák izolálására is. Az IgG frakciót Sepharose CL-4B-hez kapcsoltuk, brómcián alkalmazásával [a módszer megtalálható az alábbi szakkönyvben: Harrison és Lachmann: Handbook of Experimental Immunology, 4. kiadás, szerk.: Weir, Herzenberg, Blackwell és Herzenberg; Blackwell, Oxford (1986)] . A tenyészetek felülúszóit vagy közvetlenül áteresztjük egy, ebből a gyantából készült oszlopon (recirkuláltatjuk) , vagy először koncentráljuk 25 tömeg/térf %-os Na₂SO₄-tal kicsapva, majd újra oldatba visszük és dializáljuk PBS, 5 mmol/1 NaN₃-ban. Az oszlopot azután egymás után mossuk (i) PBS, 5 mmol/1 NaN₃ és (ii) 1 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó PBS-sel. A megkötött C3 eluálható 50 mmol/1 nátrium-borát • · pufferrel (pH=10,5), majd azonnal semlegesítjük 0,9 ml-es frakciókat szedve 0,1 ml 1 mol/1 TRSI-HC1 (pH=7) oldatba. Az anyagot azután PBS, 5 mmol/1 NaN₃-ba dializáljuk.

His-jelzést hordozó C3 készítése

A His-jelzés egy hisztidinekből álló szekvencia, amely nikkel-ionokat hordozó oszlopokkal szemben mutat affinitást. Ezt a módszert használtuk az expresszált fehérjék izolálására. Azt gondoltuk, hogy ez hasznos lehet az expresszált C3 molekulák izolálására, ezért inszerciós mutagenezist használtunk egy olyan C3-at kódoló plazmid előállítására, amely 6 hisztidinből álló farkat hordoz a

C-terminálisán (közvetlenül a 1663-as csoport után C-terminális irányban). Ennek a jelzésnek ezt az elhelyezését úgy választottuk meg, hogy minimalizáljuk a természetes

C3 szintézisének, háromdimenziós szerkezete kialakulásának, a processzálásnak és a diszulfid-híd kialakulásának zavarását. A 1661-es csoport egy ciszteincsoport, amely szerepet játszik a diszulfid híd kialakulásában egy a szekvenciában előtte levő csoporttal [ valószínűleg Cys 1537; Dolmer, K. és Sottrup-Jensen, L.: FEBS-Letters 315, 85-90 (1993)] , ezért célszerűnek látszott, hogy az inszerciót ez előtt a szerkezeti rész előtt tegyük meg. A mutációt az 1. példában ismertetett megszakítottplazmid technikával végeztük, az alábbi szekvenciájú oligonukleotiddal:

tgggtgccccaaccatcatcatcatcatcattgaccacaccccc.

• · · · · · ·

A korrekt szekvencia beépülését DNS szekvenálással igazoljuk. Ezt a DNS szekvenciát azután át lehet vinni egy expressziós vektorba. Az eukarióta sejtek transzfekciója után lehetséges affinitáskromatográfiával izolálni az expresszált C3-at, egy nikkelionokat, vagy bármely más, a His-jelzés-hez specifikus affinitással rendelkező anyagot tartalmazó oszlopon.

9.3. Eredmények

Számos mutáns C3-at tisztítottunk a Clone-3-Sepharose-on, beleértve azokat is, amelyeket az 1. és 2. példában ismertettünk, CHO sejtekben expresszálva. A termékek megtartották azt a képességüket, hogy támogatják a B faktor hasítását D faktorral. Ugyanazt a módszert használtuk a B2 példában ismertetett, COS sejtekben expresszált mutáns izolálására. Az SDS-PAGE gélek ezüstfestése azt mutatta, hogy az izolált termékek nem 100%-osan tiszták, de gyakran 50%-os, vagy annál nagyobb tisztaságúak. Ez olyan kiindulási anyagokból származik, amelyek általában kevesebb mint 10 pg/ml C3-at tartalmaznak 10 térf/térf %os borjúmagzat szérum plusz egyéb fehérjék oldatában. Emellett a C3-ak nem bomlanak le az izolálás során, és az endogén H- illetve I-faktor aktivitás eltűnni látszik.

A His-jelzés-sel végzett tisztítás gyengébb elúciós körülményeket igényel egy nikkelionokat tartalmazó oszlopról. Például EDTA-t használtunk. Ennek a módszernek az C3-ra való alkalmazása lehetővé teszi az izolálást anélkül, hogy elrontanánk a belső tiolészter kötést.

10. Példa

A C3i konjugálása ellenanyaghoz és arra való felhasználása, hogy a C3 konvertáz aktivitást egy bizonyos sejt ellen irányítsuk

10.1. Bevezetés

A találmány egyik tárgya az, hogy a mutáns C3 molekulákból származó stabil C3 konvertázok fokozott C3 konverziót okoznak, ami, ha egy bizonyos célpontra lokalizálódik, akkor az adott célpont komplement-dependens megtámadását okozza. A válasz célzásának egy előnyben részesített megközelítése az, hogy a mutáns C3 molekulát, akár a C3i akár a C3b származékot a megcélzott célpontra specifikus ellenanyaghoz kapcsoljuk. Ebben a példában bemutatunk egy működő eljárást ilyen konjugátumok előállítására, ami alkalmazható a mutáns C3i vagy C3b molekulákra és használható egy expressziós rendszerből affinitás-tisztítási módszerrel tisztított anyagra, még akkor is, ha a C3 tiolészter kötése az eljárás során elbomlik. Ha a C3i-t egy olyan ellenanyaghoz kötjük, amely specifikusan kötődik a birka eritrocitákhoz, akkor tovább igazoljuk, hogy a konjugátum fixálja a C3i-t az eritrocita felszínéhez, úgy, hogy a konvertáz, a C3iBbP létrejöhet, ami iniciálja ezeknek a sejteknek a lízisét, ha a többi komplement komponenst normális tengerimalac szérum forrná65 ···· ··· · jában hozzáadjuk (EDTA-ban, hogy megakadályozzuk a C3 konvertázok de novo szintézisét) . Mivel az ellenanyaghoz való konjugáció használható arra, hogy egy C3i molekulát úgy célozzunk be, hogy egy bizonyos sejttípus komplementdependens támadását iniciálja. Ebben a példában humán plazmából származó vad-típusú C3i-t használunk, amely egy C3 konvertázt hoz létre in vitro. In vivő a vad-típusú C3i-t és a C3b-t a H- és I-faktor elbontja. Ennek következtében egy mutáns C3, amit a jelen találmányban levő leírás szerint úgy állítunk elő, hogy rezisztens legyen a H- és I-faktorokra, és így stabil C3 konvertázt hozzon létre, előnyös lenne fiziológiás szempontból.

10.2. Módszer (i) C3i-ellenanyag konjugátum készítése és tisztítása

Az izolált ellenanyag egy poliklonális anti-birka antiszérumból izolál IgG frakció. 1,1 mg-ot 2 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubálunk 75 nmol SPDP-vel konjugációs pufferben (pH=7,5, összetétele: 20 mmol/1 KH₂PO₄, 60 mmol/1 Na₂HPO₄, 0,12 mol/1 NaCl). A PDP-IgG-t gélszűréssel tisztítjuk Superose-6 oszlopon (Pharmacia) (foszfát pufferben, pH=7,4, amely 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmaz) . Egy mintának ditiotreitollal való redukcióját arra használjuk, hogy megbecsüljük, miszerint 4 PDP csoport kapcsolódik egy molekula IgG-hez. A C3i-t úgy állítjuk elő, hogy tisztított C3-at 2 óra hosszat 0,1 mol/1 •·· ···· metilaminnal (pH=7,2) inkubálunk. A fölöslegben levő metilamint gélszűréssel eltávolítjuk, majd konjugációs pufferbe dializáljuk. 18 ml C3i-t keverünk össze 1,7 nmól PDP-IgG-vel 1,26 ml konjugációs pufferben, majd 1 napig inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd ezután 1,5 napig 4 °Con. A 8. ábrán a konjugációs reakcióelegynek egy Coomassie Blue-val festett SDS-PAGE gélje látható, ami azt mutatja, hogy egy körülbelül 350 kDa méretű csík jelent meg, ami nincs jelen sem a PDP-IgG-ben, sem a C3iben. Ezt a csíkot gélszűréssel részlegesen tisztítjuk Superose-6 oszlopon foszfát pufferben (pH=7,4), ami 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmaz, majd PBS-be dializáljuk. A C3 előtt eluálódik, egy olyan térfogatban, amelyből 300-400 kDa-os molekulasúly becsülhető meg globuláris molekulasúly standardokkal való kalibrációval. A konjugátum, a szabad ellenanyag és a nem-kapcsolt C3 koncentrációját Coomassie Blue-val festett SDS-PAGE gél alapján becsüljük meg (nem-redukáló körülmények között). Kétdimenziós SDS-PAGE-vel (az első dimenzió redukálatlan, a második dimenzió redukált) egy olyan mintázat látható, ami megfelel az IgG és a C3i közötti 1:1 konjugátumnak.

(ii) Annak igazolása, hogy a C3-ellenanyag konjugátum használható konvertáz aktivitásnak egy adott sejtre való becélzásához

A konjugátumból 20 μΐ-es hígításokat (0, azaz nincs konjugátum, 1/100, 1/50, 1/10) 1 óra hosszat 37 °C-on in67 kubálunk 100 μΐ, körülbelül 1 térf/térf % birka eritrocitával (CFD-ben előmosva). Párhuzamos inkubálásokat végzünk ekvivalens mennyiségű PDP-IgG vei (nincs C3) és csak C3-mal. A sejteket azután négyszer mossuk CFD-ben és újra szuszpendáljuk 100 μΐ CFD-G-ben. Ebből 50 μΙ-t lizáltatunk 150 μΐ vízzel, majd hozzáadunk 800 μΐ CFD-t, ami mmol/1 EDTA-t és 2 térf/térf % NGPS-t tartalmaz. A konjugátummal borított sejtekből a második 50 μΙ-t 15 percig 37 °C-on inkubáljuk 50 μΐ CFD-G-vel, ami 190 μg/ml

B faktort, 2 μg/ml D faktort, 20 μρ/ml properdint és 0,6 mmol/1 NiCl₂-t tartalmaz, majd 900 μΐ CFD-vel lizáltatjuk, ami 10 mmol/1 EDTA-t és 2% NGPS-t tartalmaz. 30 percig 37 °C-on tartjuk, majd a sejteket centrifugálással ülepítjük (2000 x g, körülbelül 3 perc), majd a felülúszó elnyelését 412 nm-en mérjük. A vízzel kezelt mintákat tekintve 100 %-os lízisnek, és egy sejtet nem tartalmazó blank pufferrel kiszámítjuk a %-os lízist, amint az a 9. ábrán látható. A konjugátum dózisfüggő lízist okoz, míg sem a PDP-IgG, sem a C3i önmagában nem okoz olyan mértékű lízist, ami jelentősen meghaladná azt a szintet, amit ilyen kezelés nélkül kapunk.

10.3. Az eredmények összefoglalása

A használt módszerrel sikeresen lehetett a C3i-t az

IgG-hez kapcsolni, amit az alábbiak mutatnak:

1. Egy 1:1 C3:IgG konjugátumnak megfelelő méretű csík keletkezése (körülbelül 350 kDa) , amit a 8. ábrán levő SDS-PAGE-val igazolunk.

2. A kétdimenziós SDS-PAGE (az első dimenzió nem redukáló, a második dimenzió redukáló) azt mutatja, hogy ez a csík mind IgG-t, mind C3i-t tartalmaz.

3. Ennek a csíknak az elúciós jellemzői a gélszűrés során ismét megegyeznek egy körülbelül 350 kDa méretű molekula jellemzőivel.

4. A konjugátum hemolitikus aktivitással rendelkezik, amivel sem a PDP-IgG sem a C3i nem rendelkezik (9. ábra).

A hemolitikus vizsgálat (9. ábra) tovább igazolja, hogy:

1. A specifikus anti-birka eritrocita ellenanyag a C3i-t a megcélzott sejt(birka eritrocita) membránjára lokalizálja, megakadályozva ezzel, hogy a mosás eltávolítsa (a szabad C3i-vel ellentétben).

2. A konjugátum megtartja a C3i aktivitását, amennyiben még képes egy C3 konvertáz létrehozására properdinnel valamint B- és D-faktorokkal való reakcióban.

3. Ez a konvertáz képes iniciálni a célpont komplement-dependens megtámadását, ebben az esetben azáltal, hogy aktiválja a lítikus bioszintézis utat (C59) az eritrocita lizáltatására.

Más laboratóriumokból származó további eredmények azt mutatják, hogy a kobraméreg faktor kapcsolható egy ellenanyaghoz, és ezek a konjugátumok megcélozhatják az egy bizonyos sejttípus elleni komplement aktiválást

[ Vogel:	Targeted Diagn. Ther.	1, 191-224 (1988);	Muller,
B. és	Muller-Ruchholtz, W.:	Leuk.	Rés.	11,	461-468
(1987);	Parker, C.J., White, V.F.	és	Fáik,	R. J. :
Complement 3, 223-235 (1986);	Petrella	, E.C.	és mtsai: J.

of Immunoi. Methods 104, 159-172 (1987)] . Ezek az adatok alátámasztják azt az állítást, hogy az oly módon módosított C3, amely képes stabil C3 konvertáz, mint például a kobraméreg faktor, létrehozására, használható komplement által közvetített válaszok megcélzására, amint azt ebben a találmányban vázoltuk.

11. Példa

Annak igazolása, hogy a mutáns C3 molekulák a B-faktor lebomlását indítják be normális humán szérumban

11.1. Bevezetés

Az ismertetett találmány fő célja a komplement aktivitás kimerítéses eltávolítása biológiai folyadékokból. A találmányban ismertetünk módszereket olyan C3 molekulák előállítására, amelyek rezisztensek a H- és I-faktorok által való leszabályozásra. Ebben az állapotban megkötik a B-faktort és aktív C3 konvertázokat generálnak. Ezeknek a konvertázoknak az aktivitását a 6. példában alkalmazott hemolitikus vizsgálat demonstrálja. Egy ilyen konvertáz ennek következtében elfogyasztja a C3-at. Ha a konvertáz instabil, akkor disszociál túl sok C3 konvertálása nél·*·· ·»·· kül. Ez azonban lehetővé teszi a friss B-faktor megkötődését, valamint Bb-vé és Ba-vá való konverzióját. Tehát a mutáns C3 elősegíti a B-faktor elfogyasztását, ezzel végeredményben az alternatív bioszintézis út működésképtelenségét okozva. Ha stabil C3 konvertáz keletkezik, akkor a B-faktor bomlása lelassul, de a C3 elfogyasztása felgyorsul. Ebben a példában azt igazoljuk, hogy a mutáns C3 molekulák, amelyeket úgy módosítottunk, hogy rezisztensek legyenek az I-faktorra, de a módosítás ne módosítsa a konvertáz stabilitását, elősegítik a B-faktor felgyorsult elfogyását a humán szérumban. Ezzel szemben a vad-típusú C3 nem okoz jelentős bomlást, valószínűleg azért, mert a vad-típusú C3i gyorsan lebomlik a H- és Ifaktorok hatására.

11.2. Módszer

A mutánsokat az alábbiak szerint állítjuk elő:

Q1R2 Argl303 Gln-re változtatva (2. példa)

Q1Q2 Argl303 Gln-re változtatva, plusz az Argl320

Gln-re változtatva (1. példa)

E1Q2 Argl303 Glu-ra változtatva, plusz az Argl320

Gln-re változtatva (5. példa)

Ezeket a mutánsokat mind CHO sejtekben expresszáljuk, majd Na₂SO₄-gyel kicsapjuk, utána affinitás-tisztításnak vetjük alá Clone-3-Sepharose-on, a B3 példában leírtak alapján. A vad-típusú C3-at (R1R2) hasonlóképpen izoláltuk. SDS-PAGE-val és ezüstfestéssel meghatározva a • » · «

Q1 koncentrációja a vad-típus koncentrációjának 1/5-e és 1/25-e között volt, a Q1Q2 koncentrációja a vad-típus koncentrációjának körülbelül az 1/5-e, és az E1Q2 koncentrációja a vad típus 1/25-e és 1/125-e között volt. Valószínűleg mindegyik preparátumban túlsúlyban vannak azok a molekulák, amelyekben a tiolészter kötés felbomlott (C3i).

Ezekből A C3 készítményekből 10 μΙ-t 1 óra hosszat °C-on 10 μΐ olyan oldattal inkubálunk, ami 20 térf/térf % normál humán szérumot tartalmaz PBS-ben, ami 1 mmol/1 MgCl₂-t, valamint 300 ng ¹²⁵I-jelzett B-faktort (körülbelül 2-300,000 dpm) tartalmaz. Ezután 5 μΙ-t SDS-PAGE-val (redukáló körülmények) elemzünk. A megszárított gélt autoradiográfiás filmre exponáljuk, ami mutatja az érintetlen B-faktornak és hasítási termékeinek megfelelő csíkok pozícióját. Ezeket azután kivágjuk, és megszámláljuk, hogy pontosan meghatározzuk a hasítás mértékét. A csak pufferrel kapott eredményeket háttérként kivonjuk (ez nemcsak a háttér-hasítást öleli fel, hanem a bomlástermékeket és a radioligand készítményben levő egyéb tisztátalanságokat is).

11.3. Eredmények

A B-faktor hasítására kapott értékeket az alábbiakban mutatjuk be:

1/25 vad-típus 1,49 1/5 vad-típus 2,74 »«· »**· *♦ • ι

	72
Q1R2	6,19%
Q1Q2	7,41&
E1Q2	6, 42%

Ennek következtében az I-faktorra rezisztens mutánsok mind magasabb szintű B-faktor hasítást okoznak mint a vad-típusú C3 (C3i) ekvivalens mennyiségei. Magasabb dózisokkal vagy hosszabb inkubációs időkkel az alternatív bioszintézis út teljes lebénítása is elérhető.

Az előző	példákban használt rövidítések a követke-
zők:

CFD	komplett fixáló higítószer [ Harrison és

Lachmann, Handbook of Experimental Immunology, 4. kiadás, szerk.: Weir, Herzenberg, Blackwell and

Herzenberg; Blackwell, Oxford (1986)],

CFD-G olyan CFD, amely 0,1% tömeg/térfogat % zselatint tartalmaz,

PBS	foszfáttal puffereit sóoldat,
NGPS	normál tengerimalac szérum,
SDS-PAGE	SDS-poliakrilamid gélelektroforézis,
SPDP	N-szukcinimidil-3-[ 2-piridilditio] propio-
nát.

... ...,

Claims (27)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Természetes komplement bioszintézis fehérje, amelyet úgy módosítottunk, hogy a fehérje képes legyen stabil C3 konvertázt létrehozni.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti fehérje, amely egy módosított humán fehérje.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti fehérje, amely rezisztensebb az I-faktor által végzett hasításra mint a természetes fehérje.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, ami egy módosított C3 fehérje.
5. 5. A 4. igénypont szerinti fehérje, amely fehérjét módosítottunk, vagy az Arg-1303 vagy az Arg-1320, vagy mindkét aminosav helyettesítésével.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti fehérje, amelyben az Arg-1302 vagy az Arg-1320 aminosavat, vagy mindkettőt glutaminnal, tirozinnal, cisztinnel, triptofánnal, glutaminsavval vagy glicinnel helyettesítjük.
7. 7. A 6. igénypont szerinti fehérje, amelyben az Arg-1320 aminosavat glutaminnal helyettesítjük.
8. 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti fehérje, amelyben az Arg-1303 aminosavat glutaminsavval, glicinnel vagy glutaminnal helyettesítjük.
9. 9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti fehérje, amely a természetes humán C3 konvertázhoz viszonyítva

   .... ...J csökkent érzékenységgel rendelkezik a H- és/vagy az Ifaktorral szemben, és az említett fehérjében a természetes humán C3 konvertázhoz viszonyítva egy vagy több aminosavcsere található, a természetes humán konvertáz 752-754-es és/vagy a 758-780-as csoportjainak megfelelő helyen.
10. 10. A 9. igénypont szerinti fehérje, amelyben az egy vagy több aminosav cseréje savas aminosavak semleges aminosavakra való cseréje.
11. 11. A 9. vagy 1. igénypont szerinti fehérje, amelyben az aminosavak cseréje az Asp-Glu-Asp csoportok cseréje Gly-Ser-Gly aminosavakra.
12. 12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti fehérje, amelyben a természetes humán C3 konvertázhoz viszonyítva egy vagy több aminosavcsere található, a természetes humán konvertáz 1427-es, 1427-es és/vagy a

    1433-as csoportjainak megfelelő helyen.
13. 13. DNS szekvencia, amely az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét kódol.
14. 14. DNS konstrukció (azaz például vektor) amely a 13. igénypont szerinti DNS szekvenciát tartalmaz.
15. 15. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, amelyet terápiás célokra használnak.
16. 16. Konjugátum, amely az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét tartalmaz, egy specifikus kötőegységhez kapcsolva.
17. 17. A 16. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a specifikus kötőegység egy specifikus kötőfehérje.
18. 18. A 17. igénypont szerinti konjugátum, amelyben a specifikus kötőfehérje egy ellenanyag, vagy annak egy antigénkötő fragmense.
19. 19. Eljárás az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, vagy a 16-18. igénypontok bármelyike szerinti konjugátum használatára egy olyan gyógyszer előállításában, amit komplement bioszintézis fehérje szintjeinek kimerítésére használunk.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelyben a gyógyszert idegen anyag kilökődésének meggátlására használjuk .
21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, amelyben a gyógyszert endogén komplement fehérje konverziójának és lerakódásának egy bizonyos helyre való lokalizálására és/vagy amplifikálására használjuk.
22. 22. Gyógyászati készítmény, amely az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét vagy a 16-18. igénypontok bármelyike szerinti konjugátumot tartalmaz, valamint tartalmaz egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy töltőanyagot.
23. 23. A 22. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amit komplement bioszintézis fehérje szintjeinek kimerítésére használunk.

    . 4 ··
24. 24. A 23. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amit idegen anyag kilökődésének meggátlására használunk .
25. 25. A 22. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amit komplement bioszintézis fehérje konverziójának és lerakódásának amplifikálására és/vagy egy specifikus pontba való lokalizálására használunk.
26. 26. Eljárás komplement bioszintézis fehérje csökkentésére egy emlősben, azzal jellemezve, hogy az emlősnek az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét adunk be.
27. 27. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét egy, a 22. igénypont szerinti gyógyászati készítményben adjuk be.

    ifj. Szentpéteri Adám

    H-l

    Tele

    KÖZZÉTÉTELI

    PÉLDÁNY

    PS800775

    1 ábra <·

    1/13

    A humán C3 számított aminosav szekvenciája a PC3 kód alapján (standard egybetűs aminosav kód)

    10 MGPTSGPSLL 20 30 , LLLLTKLPLA LGSPMYSIIT 40 ' PNILRLESEE 50 , TMVLEAHDAQ 60 ( GDVPVTVTVH 70 90 90 100 110 120 DFPGKKLVLS SEKTVLTPAT NHMGNVTFTI PANREFKSEK GRNKFVTVQA TFGTQWEKV 130 140 150 160 170 180 VLVSLQSGYL FIQTDKTXYT PGSTVLYRIF TVNHKLLPVG RTVMVNIENP EGIPVKQDSL 190 200 210 220 230 240 SSQNQLGVLP LSWDXPELVN MGQWKIRAYY ENSPQQVFST EFEVKEYVLP SFEVIVEPTE 250 260 270 280 290 300 KFYYXYNEKG LEVTITAAFL YGKKVEGTAF VIFGIQDGEQ RISLPESLKR IPIEDGSGEV 310 320 330 340 350 360 VLSRKVLLDG VQNPRAEDLV GKSLYVSATV ILHSGSDMVQ AERSGIPIVT SPYQIHFTKT 370 380 390 400 410 420 PKYFKPGMPF DLMVFVTNPD GSPAYRVPVA VQGEDTVQSL TQGDGVAKLS INTHPSQKPL 430 440 450 460 470 480 SITVRTKKQE LSEAEQATRT MQALPYSTVG NSNNYLHLSV LRTELRPGET LNVNFLLRMD 490 500 510 520 530 540 RAHEAKIRYY TYLIMNKGRL LKAGRQVREP GQDLWLPLS ITTDFIPSFR LVAYYTLIGA 550 560 570 580 590 600 SGQREWADS VWVDVKDSCV GSLWKSGQS EDRQPVPGQQ MTLKXEGDHG ARWLVAVDK 610 620 630 640 650 660 GVFVLNKKNK LTQSKIWDW EKADIGCTPG SGKDYAGVFS DAGLTFTSSS GQQTAQRAEL 670 680 690 . 700 710 720 QCPQPAARRR RSVQLTEKRM DKVGKYPKEL RKCCEDGMRE NPMRFSCQRR TRFISLGEAC 730 740 750 760 770 780 KKVFLDCCNY ITELRRQHAR ASHLGLARSN LDEDIIAEEN IVSRSEFPES WLWNVEDLKE 790 800 810 820 830 840 PPKNGISTKL MNIFLKDSIT TWEILAVSMS DKKGICVADP FEVTVMQDFF IDLRLPYSW 850 860 870 880 890 900 RNEQVEIRAV LYNYRQNQEL : KVRVELLHNP , AFCSLATTKR RHQQTITIPP KSSLSVPYVI 910 920 930 940 950 960 VPLKTGLQEV EVKAAVYHHF : ISDGVRKSLK ' WPEGXRMNK TVAVRTLDPE : RLGREGVQKE 970 980 990 1000 1010 1020 DIPPADLSDQ ' VPDTESETRI I LLQGTPVAQM ’ TEDAVDAERL 1 KHLIVTPSGC 1 3EQNMIGMTP 1030 1040 1050 1060 1070 1080 TVIAVHYLDE ‘ TEQWEKFGLE KRQGALELIK 1 KGYTQQLAFR < QPSSAFAAFV 1 KRAPSTWLTA 1090 1100 1110 1120 1130 1140 YWKVFSLAV 1 NLIAIDSQVL CGAVKWLILE KQKPDGVFQE DAPVIHQEMI GGLRNNNEKD 1150 1160 1170 1180 1190 1200 KALTAFVLXS : LQEAKDXCEE QVNSLPGSIT KAGDFLEANY KNLQRSYTVA IAGYALAQMG

    • ·<

    2/13

    1 - 2 ábra 1210 RLKGPLLNKF ' ? Λ — £. «. U LTTAKDKNRW 1230 EDPGKQLYNV 1240 EATSYALLAL 1250 LQLKDFDFVP 1260 PWRWLNEQR 1270 YYGGGYGSTQ 1280 ATFMVFQALA 1290 QYQKDAPDHQ 1300 ELNLDVSLQL 1310 PSRSSKITHR 1320 IHWESASLLR 1330 SEETKENEGF 1340 T7TAEGKGQG 1350 7LSWTMYHA 1360 KAKDQLTCNK 1370 FDLKVTIKPA 1380 PETEKRPQDA 1390 KNTMILEICT 1400 RYRGDQDATM 1410 SILDISMMTG 1420 FAPDTDDLKQ 1430 LANGVDRYIS 1440 KYELDKAFSD 1450 RNTLIIYLDK 1460 VSHSEDDCLA 1470 FKVHQYFNVE 1480 LIQPGAVKVY 1490 AYYNLEESCT 1500 RFYHPEKEDG 1510 KLNKLCRDEL 1520 CRCAEENCFI 1530 QKSDDKVTLE 1540 ERLDKACEPG 1550 VDYVYKTRLV 1560 KVQLSNDFDE 1570 YIMAIEQTIK 1580 SGSDEVQVGQ 1590 CRTFISPIKC 1600 REALKLEEKK 1610 HYLMWGLSSD 1620 FWGEKPNLSY 1630 IIGKDTWVEH 1640 WPEEDECQDE 1650 ENQKQCQDLG 1660 AFTESMWFG CPN

    • · ·

    2 ábra

    C3 cDNS szekvencia a PC3-ban (standard egybetűs dezoxinukleotid kód az értelmes szálra,

    5'-3' irányban Írva) cctctccct 12 20 ctgtccctct 30 gtccctctga 40 ccctgcactg 50 tcccagcacc 60 atgggaccca 70 cctcaggtcc 80 cagcctgctg 90 ctcctgctac 100 taacccacct 110 ccccctggct 120 ctggggagtc 130 ccatgtactc 140 tatcatcacc 150 cccaacatct 160 tgcggctgga 170 gagcgaggag 180 accatggtgc 190 tggaggccca 200 cgacgcgcaa 210 ggggatgttc 220 cagtcactgt 230 tactgtccac 240 gacttcccag 250 gcaaaaaact 260 agtgctgtcc 270 agtgagaaga ' 280 ctgtgctgac 290 ccctgccacc 300 aaccacatgg 310 gcaacgtcac 320 cttcacgatc 330 ccagccaaca 340 gggagttcaa 350 gtcagaaaag 360 gggcgcaaca 370 agttcgtgac 380 cgtgcaggcc 290 accttcggga 400 cccaagtggt 410 ggagaaggtg 420 gtgctggtca 430 gcctgcagag 440 cgggtacctc 450 ttcatccaga 460 cagacaagac 470 catctacacc 480 cctggctcca 490 cagttctcta 500 tcggatcttc 510 accgtcaacc 520 acaagctgct 530 acccgtgggc 540 cggacggtca 550 tggtcaacat 560 tgagaacccg 570 gaaggcatcc 580 cggtcaagca 590 ggactccttg 600 tcttctcaga 610 accagcttgg 620 cgtcttgccc 630 ttgtcttggg 640 acattccgga 650 actcgtcaac 660 atgggccagt 670 ggaagatccg 680 agcctactat 690 gaaaactcac 700 cacagcaggt 710 cttctccact 720 gagtttgagg 730 tgaaggagta 740 cgtgctgccc 750 agtttcgagg 760 tcatagtgga 770 gcctacagag 780 aaattctact 790 acatctataa 800 cgagaagggc 810 ctggaggtca 820 ccatcaccgc 830 caggttcctc 840 tacgggaaga 850 aagtggaggg 860 aactgccttt 870 gtcatcttcg 880 ggatccagga 890 tggcgaacag 900 aggatttccc 910 tgcctgaatc 920 cctcaagcgc 930 attccgatcg 940 aggatggctc 950 gggggaggtt 960 gtgctgagcc 970 ggaaggtact 980 gctggacggg 990 gtgcagaacc 1000 cccgagcaga 1010 agacctggtg 1020 gggaagtctt 1030 tgtacgtgtc 1040 tgccaccgtc 1050 atcttgcact 1060 caggcagtga 1070 catggtgcag 1080 gcagagcgca 1090 gcgggatccc 1100 catcgtgacc 1110 tctccctacc 1120 agatccactt 1130 caccaagaca 1140 cccaagtact 1150 tcaaaccagg 1160 aatgcccttt 1170 gacctcatgg 1180 tgttegtgac 1190 gaaccctgat 1200

    2-2 ábra • « ·

    4/13

    ggctctccag 1210 cctaccgact - -»- ** tcccgcggca 1230 gtccagggcc ’ 1240 aggacaccgt 12SŰ gcagcctcca 1260 acccagggaa 127Ó atggcgtggc 1280 caaactcagc 1290 accaacacac 1300 accccagcca 1310 gaagcccttg 1320 agcatcacgg 1330 tgcgcacgaa 1340 caagcaggag 1350 ctctcggagg 1360 cagagcaggc 1370 taccaggacc 1380 atgcaggctc 1390 tgccctacag 1400 taccgtgggc 1410 aactccaaca 1420 attacctgca 1430 tctctcagtg 1440 ctacgtacag 1450 agctcagacc 1460 cggggagacc 1470 ctcaacgtca 1480 acttcctcct 1490 gcgaatggac 1500 cgcgcccacg 1510 aggccaagat 1520 ccgctactac 1530 acctacctga 1540 tcatgaacaa 1550 gggcaggctg 1560 ttgaaggcgg 1570 gacgccaggt 1580 gcgagagccc 1590 ggccaggacc 1600 tggtggtgct 1610 gcccctgtcc 1620 atcaccaccg 1630 acttcatccc 1640 ttccttccgc 1650 ctggtggcgt 1660 actacacgct 1670 gatcggtgcc 1680 agcggccaga 1690 gggaggtggt 1700 ggccgactcc 1710 gtgtgggtgg 1720 acgtcaagga 1730 ctcctgcgtg 1740 ggctcgctgg 1750 tggtaaaaag 176Ó cggccagtca 1770 gaagaccggc 1780 agcctgtacc 1790 tgggcagcag 1800 atgaccctga 1810 agatagaggg 1820 tgaccacggg 1830 gcccgggtgg 1840 tactggtggc 1850 cgtggacaag 1860 ggcgtgttcg 1870 tgccgaataa 1880 gaagaacaaa 1890 ctgacgcaga 1900 gtaagatctg 1910 ggacgtggtg 1920 gagaaggcag 1930 acatcggctg 1940 caccccgggc 1950 agtgggaagg 1960 attacgccgg 1970 tgtcttctcc 1980 gacgcagggc 1990 tgaccttcac 2000 gagcagcagt 2010 ggccagcaga 2020 ccgcccagag 2030 ggcagaactt 2040 cagtgcccgc 2050 agccagccgc 2060 ccgccgacgc 2070 cgttccgtgc .2080 agctcacgga 2090 gaagcgaatg 2100 gacaaágtcg 2110 gcaagtaccc 2120 caaggagctg 2130 cgcaagtgct 2140 gcgaggacgg 2150 catgcgggag 2160 aaccccatga 2170 ggttctcgtg 2180 ccagcgccgg 2190 acccgtttca 2200 tctccctggg 2210 cgaggcgtgc 2220 aagaaggtct 2230 tcctggactg 2240 ctgcaactac 2250 atcacagagc 2260 tgcggcggca 2270 gcacgcgcgg 2280 gccagccacc 2290 tgggcctggc 2300 caggagtaac 2310 ctggatgagg 2320 acatcattgc 2330 agaagagaac 2340 atcgtttccc 2350 gaagtgagtt 2360 cccagagagc 2370 tggctgtgga 2380 acgttgagga 2390 cttgaaagag 2400 ccaccgaaaa 2410 atggaatctt 2420 tacgaagctc 2430 atgaatatat 2440 ttttgaaaga 2450 ctccatcacc 2460 acgtgggaga 2470 ttctggctgt < 2480 cagcatgtcg 2490 gacaagaaag 2500 ggatctgtgt 2510 ggcagacccc 2520

    ctcgaggcca cagtaatgca ggacttcttc atcgacctgc ggctacccta ctctgttgtt 2530 2540 2550 2560 2570 2580 • · · ·

    3-2 ábra

    cgaaacgagc 2590 aggtggaaat 2600 zcqaqczqzz 2610 ctctacaatt 2620 accggcagaa 2630 ccaagagctc 2640 aaggtgaggg 2650 tggaactact 2660 ccacaatcca 2670 gccttccgca 2680 gcctggccac 2690 caccaagagg 2700 cgtcaccagc 2710 agaccataac 2720 catccccccc 2730 aagtcctcgt 2740 tgtccgttcc 2750 atatgtcatc 2760 gtgccgctaa 2770 agaccggcct 2780 gcaggaagtg 2790 gaagccaagg 2800 ctgctgtcta 2810 ccatcatttc 2820 atcagtgacg 2830 gtgtcaggaa 2840 gtccctgaag 2850 gtcgtgccgg 2860 aaggaatcag 2870 aatgaacaaa 2880 actgtggctg 2890 cccgcacccc 2900 ggacccagaa 2910 cgcccgggcc 2920 gcgaaggagt 2930 gcagaaagag 2940 gacatcccac 2950 ctgcagacct 2960 cagcgaccaa 2970 gtcccggaca 2980 ccgagtccga 2990 gaccagaatt 3000 ctcctgcaag 3010 ggaccccagt 3020 ggcccagacg 3030 acagaggacg 3040 ccgtcgacgc 3050 ggaacggctg 3060 aagcacctca 3070 ttgtgacccc 3080 ctcgggctgc 3090 ggggaacaca 2100 acatgatcgg 3110 catgacgccc 3120 acggccatcg 3130 ctgtgcattta 3140 cctggatgaa 3150 acggaocagt 2160 gggagaagtt 3170 cggcctagag 3180 aagcggcagg 3190 gggccttgga 3200 gcteatcaag 3210 aaggggtaca 3220 cccagcagct 3230 ggccttcaga 3240 caacccagct 3250 ccgcctttgc 3260 ggccttcgtg 3270 aaacgggcac 3280 ccagcacctg 3290 gctgaccgcc 3300 cacgtggtca 3310 aggtcttctc 3320 tctggctgtc 3330 aacctcaccg 3340 ccatcgactc 3350 ccaagtcctc 3360 tgcggggctg 3370 ttaaatggct 3380 gatcctggag 3390 aagcagaagc 3400 ccgacggggt 3410 cttccaggag 3420 gatgcgcccg 3430 tgatacacca 3440 agaaatgatt 3450 ggcggattac 3460 ggaacaacaa 3470 cgagaaagac 3480 atggccctca 3490 cggcctttgt 3500 tctcatctcg 3510 ctgcaggagg 3520 ctaaagatat 3530 ttgcgaggag 3540 caggtcaaca 3550 gcctgccagg 3560 cagcatcact 3570 aaagcaggag 3580 acttccttga 3590 agccaactac 3600 atgaacctac 3610 agagatccta 3620 cactgtggcc 3630 attgctggct 3640 atgctctggc 3650 ccagatgggc 3660 aggctgaagg 3670 ggcctcttct 3680 taacaaactt 3690 ctgaccacag 3700 ccaaagataa 3710 gaaccgctgg 3720 gaggaccctg 3730 gtaagcagct 3740 ctacaacgcg 3750 gaggccacat 3760 cctatgccct 3770 cttggcccta 3780 ctgcagctaa 3790 aagactttga 3800 ctttgtgcct 3810 cccgtcgtgc 3820 gttggctcaa 3830 tgaacagaga 3840

    tactacggtg gtggccacgg ctctacccag gccaccttca tggtgttcca agccttggct 3850 3860 3870 ' 3980 3890 3900

    4-2 ábra

    caacaccaaa aggacgcccc -.caccaccag gaactgaacc ttgatgtgtc cccscaactg 3910 J i £. . 3930 3940 3950 3960 cccagccgca gccccaagac cacccaccgt atccaccggg aatctgccag ccccctgcga 3970 3930 3990 4000 4010 4020 tcagaagaga ccaaggaaaa -.gagggtttc acagtcacag ctgaaggaaa aggccaaggc 4030 4 0 4 4050 4060 4070 4080 accctgtcgg cggtgacaac ctaccatgct aaggccaaag atcaacccac ctgtaataaa 4090 413 3 4110 4120 4130 4140 ctegacctca aggccaccac aaaaccagca ccggaaacag aaaagaggcc teaggatgcc 4150 4150 4170 4180 4190 4200 aagaacacca tgatccttga gacccgtacc aggtaccggg gagaccagga tgccactatg 4210 4220 4230 4240 4250 4260 tctatattgg acatatccac gacgactggc tttgctccag acacagacga cctgaagcag 4270 4230 4290 4300 4310 4320 ctggcéaatg gcgttgacag atacatcccc aagtatgagc tggacaaagc cttctccgat 4330 434Ó 4350 4360 4370 4380 aggaacaccc tcatcatcca cctggacaag gtctcacact ctgaggatga ctgtctagct 4390 4400 4410 4420 4430 4440

    ttcaaagttc accaatactt taatgtagag cttatccagc ctggagcagt caaggtctac 4450 4460 4470 4480 4490 4500 gcctattaca acctggagga aagctgtacc cggttctacc atccggaaaa ggaggatoga 4510 4520 4530 4540 4550 4560 aagctgaaca agctctgccg tgatgaactg. .tgccgctgtg ctgaggagaa ttgcttcata 4570 4530 4590 4600 4610 4620 caaaagtcgg atgacaaggt caccctggaa gaacggctgg acaaggcccg tgagccagga 4630 4640 4650 4660 4670 4680 gtggactatg tgtacaacac ccgactggtc aaggttcagc tgtccaatga ctttgacgag 4690 4700 4710 4720 4730 4740 tacatcatgg ccattgaoca gaccatcaag tcaggctcgg atgaggtgca ggttggacag 4750 4760 4770 4780 4790 4800 cagcgcacgt tcatcagccc catcaagtgc agagaagccc tgaagctgga ggagaagaaa 4810 4820 4830 4840 4850 4860 cactacctca tgtggggtct ctcctccgat ttctggggag agaagcccaa cctcagctac 4870 4880 4890 4900 4910 4920 atcatcggga aggacacttg ggtggagcac tggcctgagg aggacgaatg ccaagacgaa 4930 4940 4950 4960 4970 4980 gagaaccaga aacaatgcca ggacctcggc gccttcaccg agagcatggt tgtctttggg 4990 5000 5010 5020 5030 5040

    cgccccaact gaccacaccc ccattcc 5050 5060 • · ·· · ·· • · • · ·

    7/13

    3. ABRA r

    alfa alfa

    I

    ifj. Szentpéterí Ádám szabadalmi ügyvivő az S.B.G, & K. Nemzetközi

    Szabadalmi Iroda tagja

    H-ICÖ2 Budapest, Andríssy út 113.

    Telefon: 34-24.950: Fax: 34-24-323 ·« · ····

    8/13

    1- es hely:- RQYGCWER

    2- es hely:- QQQQQQQR

    4. ábra

    Az I-faktor által közvetített hasítás különböző l-es-hely csoportoknál

    1. Bioszintetikusán [35S]-sel jelzett minták

    2. Normális ionerősség mellett végzett reakciók

    3. Anti-C3-mal immunprecipitálva

    4. SDS-PAGE redukáló körülmények között

    5. Autoradiográfia ifj. Szentpéterí Ádám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. &. K. Nemzetközi

    Szabadalmi Iroda tagja í’-’.C'íl Budapest, Andrissy út 113.

    'U.oib.i: 34-24-950: Fax: 34-24-323

    5. ábra

    Az arg 1303 —> gin mutáció fokozott rezisztenciája az X- áa a B-faktorokkal való inaktiválással szambán ·· · ····

    9/13 ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi

    Szabadalmi Iroda tagja

    H-1062 Budapest, Andrássy út i 13.

    Telefon: 34-24-950; Fax: 34-24-323 ·· · ·»·· • · • · · ··· • · • ·· ·· ·

    10/13

    6. ábra: Α 752-754 és 758-760-as csoportoknál elmutált C3 hasításának elemzése

    Ez ecy Western bLotról készített fénykép, amit egy 7,5% poliakrilamidot tartalmazó SDS-PAGE gélről (redukáló körülmények) készítettünk, nltrocellulózra való elektroforetikus transzfer utón, egy birka antl-huir.án C3 ellenanyaggal próbálva, és anti birka Immunglobulinhoz kapcsolt tormaperoxldázzal előhívva, Enhanced Chemilumíneseence-szel (a módszer és a kimutató reagens a Amershamtól származik (UK)) rögzítve F.öntgan-f ilmre. A hasítási reakciókat a 4. példába leírtak alapján végezzük, a 3. ábrán látható eredményekre hivatkozva.

    1-4-es sáv: 5-8-a3 sáv:

    1.5- ös sáv:

    2.6- os sáv:

    3.7- ea aáv:

    4.8- as sáv:

    vad típusú C3 (COS sejtekben expresszálve)

    Mután3 C3 (a 752-754-eu csoportok Gly-Ser-Gly-re cserélve, és a 758-760-as csoportok is Gly-Ser-Glyre cserélve (COS sejtekben expresszálva) nincs semmi hozzáadva +CVFSb

    H- és I-faktorok +CVF3b + H- és I-faktorok < <η υ ο ω

    A nyilakkal jelzett csíkok:

    C3 alfa-lánc C3 alfa'-lánc C3 béta-lár.c

    A C3 alfa'-lánc 68 kDa-os hasítási terméke IgG nehéz lánc ifj. Szentpéteri Adám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi Szabadalmi Iroda tagja I-'-!062 Budapest, Andrássy út 113. i..üön: 34-24-950; Fax: 34-24-323 • ·« ··*«·

    11/13

    7. ábra λ radioaktív izotóppal jelzett B-faktor haaitáaa Dfaktorral, vad tipuaú áa mutáns C3-ak (C3i-k) jelenlétében

    Egy SDS-PAGE gél autoradiográfIájáról készített fényképet mutatjuk be. Mindegyik minta tartalmaz D-faktort éa 1251-vel jelzett B-faktort, éa 3 óra hosszat lnkubáltukéket 37 Celsius fokon.

    A számozott sávokban a minták tartalma:

    1. Csak puffer

    2. 1/125 vad típusú C3

    3. 1/25 vad típusú C3

    4. 1/5 vad típusú C3

    5. 1/25 mutáns C3 (1427-es csoport Gin, 1431-es csoport Asp és az 1433-as csoport Gin)

    6. 1/5 mutáns C3

    7. higítatlan mutáns C3

    A nyilakkal jelzett csíkok:

    A. Hasítatlan 1251-jelzett B-faktor (93 kOa)

    B. 60 kOa-οβ hasítási termék (Bb)

    C. 33 kOa-oo hasítási termék (Ba) ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi

    Szabadalmi Iroda tagja

    H-1062 Budapest, Andríssy út 113.

    Telefon: 34-24-950; Fax: 34-24-323 te ·» ·

    12/13

    8. ábra C3i és IgG közötti konjugátum képződésének igazolása SDS-PAGE-val

    Ez egy 4% akrilamidot tartalmazó, nem-redukáló körülmények között futtatott SDS-PAGE gél Coomassie Blue-val festve.

    A számozott sávok a következő mintákat tartalmazzák:

    1 PDP-IgG

    2 C3i

    3 PDP-IgG + C3i reakcióelegy n öj >

    Nyilakkal jelezve:

    Valószínűleg C3i-IgG konjugátum (350 kDa) C3i (200 kDa)

    IgG (150 kDa) . » _L_ JL· - ³ ifj. Szentpéteri Adám szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Nemzetközi

    Szabadalmi Iroda tagja

    H !C62 Budapest, Andrújsy üt 113.

    ϊ keton: 34-24-950; Fax: 34-24-323 • «««»11'· « ** » · * * ·· ·» ♦ » * *« * · s t ·«· • » · · ·

    V - · t « · ·♦» , · '· r

    13/13

    9. ábra

    Annak igazolása, hogy a konjugátum megcélozza a birka eritrocitával szembeni C3 konvertáz aktivitást