CN103497927A - 表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组bcg活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用，本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因工程技术领域。本发明的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗。本发明首先提供了一种重组BCG活菌菌株，是将编码野生型金葡菌肠毒素蛋白的野生型金葡菌肠毒素基因序列或者编码突变型金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株；本发明还提供了该重组菌株的构建方法以及由其得到的活菌疫苗。该活菌菌株能够在细胞中表达分泌出金葡菌肠毒素蛋白，动物学实验证明，将其作为疫苗接种机体后，可以起到预防和治疗癌症的作用。

Description

表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术构建获得的能够表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗以及其构建方法和应用。 

背景技术

癌症是威胁人类健康和生命的杀手，每年因患恶性肿瘤致死的病例已经上升到各种疾病的首位。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗。尽管医学家们不断完善这3大治疗手段，但许多癌症患者仍然难以得到治愈。由于肿瘤本身易转移和复发，使传统的手术、放疗和化疗效果有限。目前，肿瘤免疫治疗已成为一种比较有效的治疗方法。肿瘤的免疫治疗包括抗体、细胞因子、疫苗和细胞治疗。它是一种新型的主动性免疫疗法。随着肿瘤免疫学和分子生物学的发展,肿瘤与机体之间的相互作用、肿瘤免疫耐受以及肿瘤抗原鉴定都取得了很大的进展,这也促进了肿瘤疫苗的发展。目前,很多抗肿瘤疫苗在动物水平和临床试验已取得令人鼓舞的效果。作为一种高效、无明显毒副作用的肿瘤免疫疗法已经成为了人类预防和治疗肿瘤疾病的必然趋势。 

金黄色葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，以下简称金葡菌)分泌产生的外毒素，肠毒素是金葡菌在宿主体内导致疾病的主要原因。目前，已有超过17种金葡菌肠毒素获得鉴定，包括典型的肠毒素(SEA、SEB、SECs、SED和SEE)以及新发现的多种肠毒素蛋白（Letertre C,et al.J.Appl.Microbiol.2003,95(1):38-43.）。 

超抗原(Superantigen，SAg)是指一类只需极低浓度(1-10ng/ml)就可以激活大量的T细胞活化，产生极强的免疫应答的抗原因子。超抗原的作用途径不需要呈递细胞的加工处理，而是以完整的蛋白质形式呈递给T细胞，其一端与APC膜上的MHCⅡ类分子的非多态区外侧结合形成超抗原MHC复合物，另一端直接与TCR的vβ片段外侧结合，诱导免疫应答反应。 

金葡菌肠毒素蛋白分子作为典型的超抗原物质，对宿主免疫系统具有强烈 的免疫刺激作用。因此，肠毒素很早就开始作为新的抗肿瘤蛋白分子进行研究。肠毒素蛋白分子对肿瘤细胞的杀伤分子机制包括：(1)SAg依赖性细胞毒(SDCC)作用和SAg抗体依赖性细胞毒(SADCC)作用。由于SAg不需要抗原呈递细胞（APC）的处理，能以完整的蛋白质分子形式，一端在抗原结合沟外与APC上的MHC类分子连接，另一端仅与T细胞受体(T cell receptor，TCR)的vβ片段连接，不需APC处理，也不受MHC的限制，在APC外形成MHC类分子-SAg-TCR-vβ复合物，在极低的摩尔浓度(10^-12数量级)下便可刺激存在TCRvβ序列的T淋巴细胞大量增殖，能够在短时间内直接激活具有很强杀伤力的CD8+细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)和与CD4+相关的辅助性T细胞产生，以TCR-vβ-SAg-MHC-II类分子的方式以及MHC-II类分子相关的肿瘤细胞相偶联后产生强力的杀灭作用，对表达具有MHC-II类分子有关的肿瘤细胞进行直接杀灭（Kuge S,et al.J Immunol.1995,154(4):1777-1785.）。(2)细胞因子的直接和间接杀伤作用。超抗原活化的于CD4+相关的T淋巴细胞能分泌包括TNF-α、TNF-β、INF-γ、IL-2、IL-6和IL-12等多种足量的细胞因子。它们不仅能通过直接作用或间接作用的方式杀伤肿瘤细胞，而且可以促使肿瘤细胞增加表达MHC类抗原分子，进一步增强对宿主免疫系统的刺激作用（Matsushita K,et al.Br J Cancer.1996,73(5):644-648.）。(3)超抗原刺激T细胞后，T细胞释放的IL-2、INF-γ和IL-12等细胞因子，可产生广谱抗肿瘤的淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)，进一步产生LAK样细胞毒作用（Lando P,et al.Cancer Immunol Immunother.1991,33(4):231-237.）。 

BCG（Bacillus Calmette-Guérin）作为预防结核病的疫苗已经得到广泛的使用。BCG作为重组疫苗载体具有其他疫苗载体不可比拟的优越性。BCG在全世界范围内应用最广泛，它是一种耐热活疫苗，生产成本低，且应用于实验动物和人体并发症少。因此，把BCG作为活菌疫苗载体，是目前构建重组疫苗的理想选择。 

金葡菌肠毒素是典型的超抗原物质，极低的浓度就可以刺激机体大量T细胞活化，产生强烈的免疫应答反应，在肿瘤疾病免疫治疗过程中具有巨大的潜能。因此，如果能够使用BCG作为疫苗载体构建金葡菌肠毒素蛋白的活菌疫苗，将其接种机体后使之持续分泌表达金葡菌肠毒素蛋白，刺激机体免疫系统使其 杀伤肿瘤细胞，将有望达到高效预防和治疗人类肿瘤疾病的发生的目的。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的能够用于预防和治疗人类肿瘤疾病的活菌疫苗，特别是提供一种能够胞外表达野生型金葡菌肠毒素蛋白或者突变型金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌疫苗。 

为实现上述目的，本发明首先提供了一种重组BCG活菌菌株，其特征在于：是将编码野生型金葡菌肠毒素蛋白的野生型金葡菌肠毒素基因序列或者编码突变型金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株，所述野生型金葡菌肠毒素基因序列是指野生型金葡菌肠毒素SEA、SEB、SEC2、SED、SEE基因序列，所述突变型金葡菌肠毒素基因序列是指采用PCR的方法引入突变位点对SEA的D227A，SEC2的T20L、T20L/G22E、G22E/N23A和T20L/G22E/N23A进行定点突变改造后所获得的编码低毒或无毒的金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素A227、C20、CTG、CGN、C3基因序列。 

进一步地，所述突变型金葡菌肠毒素A227、C20、CTG、CGN、C3基因序列分别具有如SEQ ID NO:6-10所示的核苷酸序列。 

进一步地，所述重组BCG活菌菌株是将所述野生型金葡菌肠毒素基因序列或者所述突变型金葡菌肠毒素基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。 

进一步地，所述BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上还连接有核苷酸序列如SEQID NO:11所示的BCG分泌信号肽基因序列。 

本发明还提供了上述重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤： 

（1）利用限制性内切酶和链接酶将核苷酸序列如SEQ ID NO:1-10所示的基因序列中的任一个以及核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的BCG分泌信号肽基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，转化到大肠杆菌E.coli TOP10中，获得正确的重组转化子； 

（2）将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定 阳性转化子； 

（3）将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Western blot鉴定表达的金葡菌肠毒素蛋白情况。 

进一步地，上述构建方法中所使用的BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为pMN234穿梭表达载体。 

本发明还提供了一种活菌疫苗，其特征在于：所述活菌疫苗中含有上述重组BCG活菌菌株。 

本发明还提供了上述重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用，其应用方法是将该重组BCG活菌菌株辅以药学上可接受的佐剂制备成疫苗，该疫苗可单独使用也可联合其他药物或者放疗化疗一起使用，使用时经皮内注射，注射量以BCG活菌个数计为10⁶CFU/人，可一次注射，也可分多次注射。 

有益效果： 

本发明成功将野生型和突变型金葡菌肠毒素基因导入BCG活菌菌株中得到了能够在BCG细胞中表达分泌出野生型和突变型金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株。动物学实验证明，将该重组BCG活菌菌株作为疫苗接种机体后，可持续分泌表达金葡菌肠毒素蛋白，刺激机体免疫系统使其杀伤肿瘤细胞，使癌症患者获得强大的免疫治疗，从而达到治疗癌症的目的。本方法为野生型和突变型金葡菌肠毒素蛋白BCG重组抗癌疫苗的生产及应用奠定了基础。 

附图说明

图1是金葡菌肠毒素CTG基因的重组穿梭表达分泌载体pMN-α-CTG的物理图谱； 

图2是本发明重组BCG胞外表达突变型金葡菌肠毒素SEC2蛋白的Western blot鉴定图； 

图3是本发明活菌疫苗治疗肿瘤模型的荷瘤大小比较； 

图4是本发明活菌疫苗治疗肿瘤模型的荷瘤重量比较图。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。 

以下实施例中所用原料来源 

菌株与载体：大肠杆菌菌株E.coli TOP10由本实验室保存，耻垢分支杆菌、BCG由深圳市疾病预防控制中心惠赠。pMN234载体由北京蛋白质组学研究中心惠赠。 

酶与试剂盒：限制性内切酶购自Fermentas公司，连接酶为NEB公司产品，Taq酶购自北京全式金生物科技有限公司。基因组提取试剂盒为OMEGA品牌产品。 

生化试剂：DNA序列、引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所述所有野生型金葡菌肠毒素基因由本实验室前期克隆获得。金葡菌肠毒素SEC2蛋白单克隆抗体为Santas公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。 

培养基：大肠杆菌培养基为LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0；M7H9+ADC液体培养基：称取4.79Middlebrook7H9Broth，溶于900ml去离子水中，加入0.2%的甘油和0.05%的Tween-80，121℃高压灭菌30min，待冷却至45℃加入100mLADC Enrichment，4℃保存；M7H10+OADC固体培养基：称取19g Middlebrook M7H10Agar，溶于900ml去离子水中，加入0.4%甘油和0.1%的Tween-80，混匀，121℃高压灭菌30min，待冷却至50-55℃，加入100mL OADC Enrichment，倒置平板。 

实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如Sambrook等人的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1 

野生型金葡菌肠毒素SEA、SEC2基因脱毒突变改造 

根据相关文献报道（Vladimir S,et al.Toxicon.2004,43:433-438.等）及抗原表位分析网站（http://www.epipredict.de/）预测结果，对野生型金葡菌肠毒素SEA、SEC2基因序列(GenBank登陆号：NM_001126112)进行基因改造，改造位点为SEA的(D227A)、SEC2的（T20L；T20L/G22E；G22E/N23A；T20L/G22E/N23A）氨基酸位点。 

1.设计引物 

利用Gene Tool软件设计相关突变引物，结果如下： 

（1）SEA基因D227A单一位点突变引物 

Forward: 

5'-tgctatatatttatatacaagttaagtcgacaagctt-3' 

Reverse： 

5'-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3' 

（2）SEC2基因T20L单一位点突变引物 

Forward: 

5'-tttaatgggtaatatgaaatatttatatgatgatca-3' 

Reverse： 

5'-ccagtaaactcacttgatttgtgcaactc-3' 

（3）SEC2基因T20L/G22E双位点突变引物 

Forward: 

5'-tttaatggagaatatgaaatatttatatgatgatca-3' 

Reverse： 

5'-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3' 

（4）SEC2基因G22E/N23A双位点突变引物 

Forward: 

5'-tacgatggaggcaatgaaatatttatatgatg-3' 

Reverse： 

5'-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3' 

（5）SEC2基因T20L/G22E/N23A三个位点突变引物 

Forward: 

5'-tttaatggaggcaatgaaatatttatatgatg-3' 

Reverse： 

5'-atatgcatgttttcagagttaatcgtttt-3' 

以上突变引物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。 

2.SEA、SEC2基因各位点基因改造 

利用上述引物对肠毒素SEA、SEC2基因进行定点突变PCR扩增，对扩增产 物进行回收、连接、转化，最终对转化子进行鉴定。具体操作方法及步骤如下： 

（1）25μl的PCR引入突变反应体系为： 

（2）PCR引入突变的反应条件设置为： 

（3）对PCR产物进行1.0%agarose凝胶电泳，检测PCR扩增效果。 

（4）利用Omega D2500-01Gel Extraction Kit对PCR产物进行切胶回收，操作步骤详见说明书。 

（5）PCR突变回收产物Blunting Kination反应： 

I.在微量管中配制一下反应液 

II.37℃反应10min，70℃反应10min。 

（6）Ligation反应： 

I.取上述5中的反应溶液约0.25pmol(5μl)于新的微量管中； 

II.加入5μl Ligation Solution I轻轻混匀； 

III.16℃反应过夜。 

（7）一步法制备大肠杆菌Top感受态细胞： 

将冻存的大肠杆菌Top菌种接种于LB液体培养基上，37℃培养过夜。按1:100的比例重新转接于30ml LB培养基中，37℃，200rpm振摇培养2～3h左右，当OD260达0.4时，置冰上30min，4℃、7000rpm离心5min，弃去培养基，加入冰预冷的SSCS Solution液3ml重悬细菌，充分混匀后，分装每管0.1mL于1.5mL的EP管中，-80℃储存备用。 

（8）连接产物转化大肠杆菌Top10细胞： 

I.将6步骤中连接过夜的反应产物全部加入到100μl的大肠杆菌Top感受态细胞中。 

II.冰浴30min，42℃热击90sec，再冰浴15min。加入1ml无抗性的LB培养液，37℃培养1h。 

III.将上述培养液离心，收集菌体，弃900μl上清后重悬菌体，全部涂于Amp抗性的LB平板中，37℃培养过夜。 

（9）转化子鉴定：从8步骤中挑选阳性转化子进行扩大培养，每个转化子取2管加入15%的灭菌甘油于-80℃冰箱进行保种，另外各取一管转化子菌液送深圳华大基因科技有限公司进行序列测定。通过对测序结果基因序列进行比对来判定是否获得突变改造成功的阳性转化子。 

经过以上实验操作，最终获得了SEA、SEC2基因各位点的突变基因，分别命名为A227、C20、CTG、CGN、C3，它们分别具有SEQ ID NO:6-10所示基因序列。 

实施例2 

BCG穿梭表达载体的构建 

以突变型金葡菌肠毒素CTG基因为例： 

1.pMN-α-CTG穿梭表达载体构建 

质粒pMN234是大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体，同样含有HSP60启动子。 

α分泌信号肽的导入： 

pMN234质粒并不含α分泌信号肽序列，为了让目标蛋白能在分支杆菌中实 现分泌表达，我们在pMN234载体启动子的下游插入一段分支杆菌α分泌信号肽序列，具有SEQ ID NO:11所示核苷酸序列。 

（1）根据pMN234穿梭表达载体的多克隆位点要求，设计α基因克隆引物，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 

Forward:5'-CGCGGATCCATGACAGACGTGAG-3' 

带下划线的碱基为BamH I酶切位点 

Reverse:5'-AAGCTT

CGCGCCCGCGGT-3' 

带下划线和方框的碱基序列分别为Hind III酶切位点和Spe I酶切位点 

（2）利用上述引物，PCR扩增α信号肽基因序列，以结核分支杆菌基因组DNA为模板，反应体系为： 

（3）反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，58℃退火45sec，72℃延伸45sec，30个循环后，72℃延伸10min。 

（4）PCR产物的纯化：PCR产物于2.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察条带，并将条带切胶回收到1.5mL的EP管中，经DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0)回收并纯化目的条带。具体操作方法参见宝生物工程(大连)有限公司切胶回收操作试剂盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0说明书。 

（5）α信号肽基因连接pMD18-T simple Vector，具体操作参照试剂盒说明书进行 

（6）转化：连接反应结束后，将连接产物转化感受态细菌E.ColiTop10。(参见《分子克隆》p98)。 

（7）阳性转化子测序鉴定：挑选阳性转化子接种于含氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中，37℃、200rpm摇动培养过夜，每个转化子取2ml菌液加入16% 的灭菌甘油，混匀后冻存于-80℃冰箱进行保种，另取1ml菌液送深圳华大基因科技有限公司测序鉴定。 

（8）质粒DNA的快速小量提取，方法参照质粒提取说明书进行。 

（9）双酶切：pMD18-α信号肽质粒和pMN234质粒同时用BamH I和Spe I双酶切，酶切体系如下： 

37℃反应40min，70℃灭活10min。按照上面酶切体系，pMD18-α信号肽质粒和pMN-234质粒各反应6管，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收α信号肽基因和pMN-234载体基因，切胶回收方法同前。 

（10）酶切回收产物连接反应：α信号肽基因和pMN-234载体连接反应体系如下，在PCR管中加入： 

混匀后，4℃连接过夜。 

（11）转化：将连接产物转化感受态大肠杆菌E.Coli Top10，Top10感受态细胞的制备及转化方法与前面的方法相同。 

（12）阳性转化子鉴定：菌落PCR鉴定同前，菌落PCR鉴定结果为阳性转化子的菌株送深圳华大基因科技有限公司进行测序测定，将测序结果基因序列正确的转化子命名为pMN-α，储存阳性转化子。 

2.穿梭表达分泌载体pMN-α-CTG的构建 

1.根据穿梭表达分泌载体pMN-α的多克隆位点要求，参考金葡菌肠毒素CTG基因序列，利用Gene Tool软件设计引物，在CTG基因的前端引入Spe I 酶切位点，后端引入Hind III酶切位点。送送生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 

Forward:5'-GACTAGTGAGAGTCAACCAGACCCTACG-3' 

带下划线的碱基为Spe I酶切位点 

Reverse:5'-CCCAAGCTTTTATCCATTCTTTGTTGTAA-3' 

带下划线的碱基为Hind III酶切位点 

2.利用上述引物，以实验室已经构建好的pMD18-CTG质粒为模板PCR扩增，反应体系同前，反应条件参考引物合成说明书中提供的退火温度设定合适的PCR退火温度，其他条件同前。PCR产物经2.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，利用切胶回收试剂盒回收SEC2基因片段，操作方法同前。 

3.CTG基因片段连接pMD18-T simple vector，操作方法参照TaKaRa公司 

18-T simple vector简易说明书。连接产物转化大肠杆菌E.Coli Top10，操作方法同前。挑选阳性转化子测序鉴定，储存阳性转化子pMD-CTG。 

4.pMD-CTG和pMN-α质粒小剂量提取，操作方法参照TaKaRa公司质粒基因小剂量提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0)简易说明书。 

5.pMD-CTG和pMN-α质粒进行Spe I和Hind III双酶切反应(体系及反应条件同前)，切胶回收CTG基因片段和pMN-α载体序列(操作方法参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0切胶回收试剂盒)。 

6.金葡菌肠毒素CTG基因片段与pMN-α载体序列连接，连接产物转化大肠杆菌E.Coli Top10，转化子经菌落PCR及双酶切鉴定，储存阳性转化子pMN-α-CTG。具体操作参考前文。 

实施例3 

BCG穿梭表达载体的遗传转化 

BCG在M7H9+ADC培养基中培养至对数生长期，在冰上预冷之后，6000rmp离心5min收集BCG菌体细胞，用10%预冷的经过灭菌处理的甘油清洗菌体三遍，最后用10%甘油悬浮，制备成BCG电击转化感受态细胞。 

提取pMN-α-CTG穿梭分泌表达载体重组质粒，调整浓度都为10μg/ml。取100μl的BCG感受态细胞，加入到0.2cm规格的电击转化杯中，加入5μl浓度为 10μg/ml的穿梭表达分泌载体质粒pSL-CTG或pMN-α-CTG，轻轻混匀后冰上放置10min。使用电转仪（eppendorf）进行电转化。设置参数电压为2.5KV，时间为5ms，电击两次。然后迅速加入无抗生素的M7H9+ADC培养基培养20h，离心收集BCG菌体细胞，涂于kan抗性平板上，大约3-4周长出转化子。 

实施例4 

重组BCG的筛选与鉴定 

pMN234穿梭分泌表达载体均具有卡那霉素抗性。因此，经过卡那霉素抗性平板初步筛选获得的转化子，经菌落PCR初步鉴定后，对PCR阳性结果进行测序鉴定。 

实施例5 

重组突变型金葡菌肠毒素CTG基因的蛋白表达和鉴定 

rBCG-pMN-α-CTG阳性菌株经M7H9+ADC培养基扩大培养后，6000rmp离心10min收集培养基上清液，经滤膜为10KDa大小的超滤管浓缩200倍后，获得重组胞外表达蛋白样品。 

胞外上清浓缩样品进行SDS-PAGE电泳分析（SDS-PAGE电泳方法参照分子克隆）。 

（1）制胶 

a.将玻璃板、隔条及梳子洗净晾干后组成严密的灌胶板； 

b.制凝胶液：按照《分子克隆》的方法分别配制5％浓缩胶和10％分离胶； 

表1配制凝胶液 

Table1preparation of gel 

c.配制好的分离胶液注入两层玻璃板中，避免气泡产生，室温静置30min，然后灌入浓缩胶，插入梳子，室温静置60min。 

（2）上样：将准备好的蛋白样品和蛋白maker按照每个孔5μl的量上样。 

（3）电泳：将上样好的蛋白胶置于蛋白电泳缓冲液中电泳，以80V跑浓缩胶、110V跑分离胶。 

（4）染色和脱色：电泳结束后，取下胶板，小心切去积层胶，并将分离胶放入考马斯亮蓝G-250染色液中染色2h，然后取出，放到脱色液中脱色过夜。 

SDS-PAGE蛋白电泳结果，在实验预期相应的位置出现了条带。 

2.蛋白样品进行Western blot实验验证（Wentern blot实验方法参照abcam公司的经典方法）。 

1）SDS-PAGE聚丙烯酰胺蛋白电泳部分，方法同前。 

2）电泳结束后，取下胶板，切去积层胶，并将分离胶切去一角(左上角)，以便转移后的定位，将胶浸于湿法转移缓冲液中15min。 

3）剪一张与蛋白胶大小略小的PVDF膜，切去一角作为标记，将其浸于100％甲醇中15sec，然后转入去离子水中2min，然后在湿转移缓冲液中平衡5min。 

4）剪10张与胶大小一致的滤纸，于转移缓冲液中平衡15min。 

5）组装湿转移系统：先将Western湿转膜仪的阳极板放在水平桌面上，放上一层海绵，再将5张滤纸放在海绵上，注意不要让滤纸中含有气泡。在滤纸中央放上PVDF膜，将聚丙烯酰胺凝胶置膜上，胶上再放5张滤纸，滤纸上再放上一层海绵，整个过程必须注意赶尽气泡。 

6）放好阴极板，正确连接电极的连线，接通电源，以2mA/cm²恒流转移1h。 

7）电转结束后，取下PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST4℃封闭过夜。 

8）取2ml封闭液于杂交瓶中，加入一抗(鼠抗IgG单克隆抗体，1:1000)，放入杂交箱34℃，杂交2h。 

9）杂交结束后，取出PVDF膜，用TBST清洗三次，15min/次。 

10）取2ml TBST于杂交瓶中，加入羊抗鼠二抗(AP标记，稀释比例1:1500)，常温杂交1h。 

11）重复9步骤操作。 

12）加入BCIP/NBT显色液显色，用去离子水终止显色反应。 

Western blot的结果显示，金葡菌肠毒素突变蛋白rBCG活菌疫苗可以在胞外表达金葡菌肠毒素CTG突变蛋白，并能被金葡菌肠毒素SEC2蛋白的单克隆抗体识别。表明金葡菌肠毒素CTG突变蛋白rBCG活菌疫苗构建成功。 

以下是本发明提供的活菌疫苗的动物活体实验 

1.LLC小鼠肺癌动物模型的建立 

小鼠LLC肺癌细胞常规复苏，培养于完全DMEM培养液，37℃、5％的CO2浓度的环境中。传代扩大培养，待达到所需的细胞数量后，以0.1%的胰蛋白酶消化细胞2～3min，加入完全培养基终止胰蛋白酶反应，轻柔吹打收获细胞，1000rpm离心5min后弃上清，以无菌PBS重悬。使用台盼蓝(Trypan Blue)染色法对活细胞进行计数，调整细胞浓度为10⁷/ml。取C57BL/6纯系小鼠于后肢右侧腋下皮下接种LLC小鼠肺癌细胞，每鼠0.2ml细胞悬液。使用活体成像的方法观察小鼠肿瘤模型的生长情况。 

2.金葡菌肠毒素rBCG活菌疫苗抗癌研究 

1）BCG标准株、重组BCG-SEC2和重组BCG-CTG菌株的制备 

挑取含Kan抗性的Middlebrook7H10固体培养基上处于对数生长期的新鲜重组BCG-SEC2和BCG-CTG菌落于Middlebrook7H9液体培养基，37℃、200rmp摇床分别培养约3～4周后，离心弃收集菌体。以无菌PBS淘洗3次，最终悬浮于1ml的PBS中。菌落计数与前文介绍的方法一致。BCG的准备方法与以上介绍的方法相同。调整至合适浓度后备用。 

2）重组BCG-SEC2、BCG-CTG接种LLC肺癌C57BL/6模型小鼠抗癌研究 

(1)动物分组 

将构建成功的LLC小鼠肺癌C57BL/6小鼠肺癌模型随机分4组，共20只，每组5只。分别用相应的重组菌进行治疗。具体操作为： 

A组(PBS对照组)：0.2ml灭菌PBS/只，共5只（编号CA-1--CA-5）； 

B组(BCG对照组)：0.2ml即2x10⁶CFU/只，共5只（编号CB-1--CB-5）； 

C组(BCG-SEC2实验组)：0.2ml即2x10⁶CFU/只，共5只（编号CC-1--CC-5）； 

D组(BCG-CTG实验组)：0.2ml即2x10⁶CFU/只，共5只（编号CD-1--CD-5）。 

(2)疫苗治疗过程 

每次注射0.2ml即2x10⁶CFU/只重组菌，第0、1、2周接种治疗，共三次。 

(3)观测指标 

I.通过活体成像仪定期对小鼠肺癌模型体内的肺癌细胞数量变化进行分析。 

II.于治疗30天后，处死肿瘤模型小鼠，对各分组荷瘤大小及重量进行分析。 

实验结果显示：（1）通过活体成像系统可以看出，BCG-SEC2和BCG-CTG实验组小鼠体内的LLC肺癌细胞增长速度与PBS和BCG实验对照组相比，具有明显的减缓作用，说明BCG-SEC2和BCG-CTG疫苗能在一定程度上抑制LLC肺癌细胞的增长，具有抑癌作用；（2）从最终的荷瘤大小和重量可以看出，BCG-SEC2和BCG-CTG实验组小鼠体内的LLC肺癌细胞荷瘤与PBS和BCG实验对照组相比，大小与重量都小且具有统计学意义（图3、图4）。说明BCG-SEC2和BCG-CTG疫苗对LLC肺癌细胞具有抵抗作用。 

综合以上结果，利用超抗原（金葡菌肠毒素）rBCG活菌疫苗作为人类新型抗癌疫苗具有广阔的应用前景。接种超抗原rBCG活菌疫苗后，可以癌症患者获得强大的免疫治疗，通过调节机体的免疫系统来实现抗癌作用。可以作为抗癌疫苗单独使用，也可以联合其他药物或者放疗化疗一起使用，使癌症患者获得彻底治愈。 

<110> 深圳大学

 

<120> 表达分泌金葡菌肠毒素蛋白的重组BCG活菌菌株、活菌疫苗及其构建方法和应用

 

<160> 11

 

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> 野生型金葡菌肠毒素SEA基因序列

 

<400> 1

atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca   60

cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct  120

gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct  180

aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc  240

ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt  300

gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt  360

gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat  420

aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat  480

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cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat  600

gggaaggttc agaggggatt aatcgtgttt catacttcta cagaaccttc ggttaattac  660

gatttatttg gtgctcaagg acagtattca aatacactat taagaatata tagagataat  720

aaaacgatta actctgaaaa catgcatatt gatatatatt tatatacaag ttaa        774

 

<210> 2

<211> 801

<212> DNA

<213> 野生型金葡菌肠毒素SEB基因序列

 

<400> 2

atgtataaga gattatttat ttcacatgta attttgatat tcgcactgat attagttatt   60

tctacaccca acgttttagc agagagtcaa ccagatccta aaccagatga gttgcacaaa  120

tcgagtaaat tcactggttt gatggaaaat atgaaagttt tgtatgatga taatcatgta  180

tcagcaataa acgttaaatc tatagatcaa tttctatact ttgacttaat atattctatt  240

aaggacacta agttagggaa ttatgataat gttcgagtcg aatttaaaaa caaagattta  300

gctgataaat acaaagataa atacgtagat gtgtttggag ctaattatta ttatcaatgt  360

tatttttcta aaaaaacgaa tgatattaat tcgcatcaaa ctgacaaacg aaaaacttgt  420

atgtatggtg gtgtaactga gcataatgga aaccaattag ataaatatag aagtattact  480

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aaggtgactg ctcaagaatt agattaccta actcgtcact atttggtgaa aaataaaaaa  600

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aatagctttt ggtatgacat gatgcctgca ccaggagata aatttgacca atctaaatat  720

ttaatgatgt acaatgacaa taaaatggtt gattctaaag atgtgaagat tgaagtttat  780

cttacgacaa agaaaaagtg a                                            801

 

 <210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> 野生型金葡菌肠毒素SEC2基因序列

 

<400> 3

gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggtacg   60

atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct  120

gtagataaat ttttggcaca tgatttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat  180

tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa  240

gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat  300

gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga  360

aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga  420

aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac  480

ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca  540

tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg  600

atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat  660

aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggataa  720

 

<210> 4

<211> 777

<212> DNA

<213> 野生型金葡菌肠毒素SED基因序列

 

<400> 4

atgaaaaaat ttaacattct tattgcatta ctctttttta ctagtttggt aatatctcct   60

ttaaacgtta aagccaatga aaacattgat tcagtaaaag agaaagaatt gcataaaaaa  120

tctgaattaa gtagtaccgc gctaaataat atgaaacatt cttatgcaga taaaaatcca  180

ataataggag aaaataaaag tacaggagat caatttttag aaaatacttt gctttacaaa  240

aaatttttta ctgaccttat caattttgaa gatttattaa taaacttcaa ttcaaaagaa  300

atggctcaac atttcaaatc taaaaatgta gatgtttacc ctataagata tagcattaat  360

tgttatggtg gtgaaataga taggactgct tgtacatatg gaggtgtcac tccacacgaa  420

ggtaataaat taaaagaacg aaaaaaaata ccaatcaatt tgtggataaa tggtgtacaa  480

aaagaagttt ctttagataa agttcaaaca gataaaaaaa atgttaccgt acaagaatta  540

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tatgatttat ttgatgttaa gggtgatttt cccgaaaaac aattacgaat atacagtgat  720

aataaaacat tatccacaga gcaccttcat attgacatct atttatatga aaagtag     777

 

<210> 5

<211> 774

<212> DNA

<213> 野生型金葡菌肠毒素SEE基因序列

 

<400> 5

atgaaaaaaa cagcatttat actactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca   60

cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct  120

gaattacaaa gaaatgcttt aagcaatctt aggcaaattt attattataa tgaaaaagct  180

ataactgaaa acaaagagag tgatgatcag tttttagaga atactttgtt atttaaaggt  240

tttttcacag gtcatccatg gtataacgat ttattagtag atcttggttc aaaagatgct  300

actaataaat ataaagggaa aaaagtagac ttatatggtg cttattatgg atatcaatgt  360

gctggaggca caccaaataa aacagcatgt atgtacgggg gtgtaacatt acatgataat  420

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acagtaccta tagataaagt taaaacaagc aaaaaagaag taactgttca agagctagat  540

cttcaggcaa ggcattattt acacggaaaa tttggtttat ataactcaga cagctttggc  600

ggtaaggtgc aaagaggctt gattgtgttt cattcttctg aagggtccac ggtaagttat  660

gatttgtttg atgctcaagg gcaatatcca gatacattat taagaattta cagagataat  720

aaaactatta attcagagaa cctccatatt gatttgtatt tatacacaac ttga        774

 

<210> 6

<211> 774

<212> DNA

<213> 金葡菌肠毒素SEA突变型A227基因序列

 

<400> 6

atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca   60

cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct  120

gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct  180

aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc  240

ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt  300

gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt  360

gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat  420

aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat  480

acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat  540

cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat  600

gggaaggttc agaggggatt aatcgtgttt catacttcta cagaaccttc ggttaattac  660

gatttatttg gtgctcaagg acagtattca aatacactat taagaatata tagagataat  720

aaaacgatta actctgaaaa catgcatatt gctatatatt tatatacaag ttaa        774

 

<210> 7

<211> 720

<212> DNA

<213> 金葡菌肠毒素SEC2突变型C20基因序列

 

<400> 7

gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggttta   60

atgggtaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct  120

gtagataaat ttttggcaca tgctttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat  180

tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa  240

gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct acttttcatc caaagataat  300

gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga  360

aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga  420

aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac  480

ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca  540

tatgagacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg  600

atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat  660

aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggataa  720

 

<210> 8

<211> 720

<212> DNA

<213> 金葡菌肠毒素SEC2突变型CTG基因序列

 

<400> 8

gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggttta   60

atggagaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct  120

gtagataaat ttttggcaca tgctttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat  180

tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa  240

gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat  300

gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga  360

aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga  420

aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac  480

ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca  540

tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg  600

atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat  660

aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggataa  720

 

<210> 9

<211> 720

<212> DNA

<213> 金葡菌肠毒素SEC2突变型CGN基因序列

 

<400> 9

gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggttta   60

atggagaata tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct  120

gtagataaat ttttggcaca tgctttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat  180

tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa  240

gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat  300

gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga  360

aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga  420

aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac  480

ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca  540

tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg  600

atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat  660

aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggataa  720

 

<210> 10

<211> 720

<212> DNA

<213> 金葡菌肠毒素SEC2突变型C3基因序列

 

<400> 10

gagagtcaac cagaccctac gccagatgag ttgcacaaat caagtgagtt tactggttta   60

atggaggcaa tgaaatattt atatgatgat cattatgtat cagcaactaa agttatgtct  120

gtagataaat ttttggcaca tgctttaatt tataacatta gtgataaaaa actaaaaaat  180

tatgacaaag tgaaaacaga gttattaaat gaagatttag caaagaagta caaagatgaa  240

gtagttgatg tgtatggatc aaattactat gtaaactgct atttttcatc caaagataat  300

gtaggtaaag ttacaggtgg taaaacttgt atgtatggag gaataacaaa acatgaagga  360

aaccactttg ataatgggaa cttacaaaat gtacttataa gagtttatga aaataaaaga  420

aacacaattt cttttgaagt gcaaactgat aagaaaagtg taacagctca agaactagac  480

ataaaagcta ggaatttttt aattaataaa aaaaatttgt atgagtttaa cagttcacca  540

tatgaaacag gatatataaa atttattgaa aataacggca atactttttg gtatgatatg  600

atgcctgcac caggcgataa gtttgaccaa tctaaatatt taatgatgta caacgacaat  660

aaaacggttg attctaaaag tgtgaagata gaagtccacc ttacaacaaa gaatggataa  720

 

<210> 11

<211> 120

<212>  DNA

<213> 分支杆菌α分泌信号肽序列

 

<400> 11

atgacagacg tgagccgaaa gattcgagct tggggacgcc gattgatgat cggcacggca   60

gcggctgtag tccttccggg cctggtgggg cttgccggcg gagcggcaac cgcgggcgcg  120

Claims (8)

1.一种重组BCG活菌菌株，其特征在于：是将编码野生型金葡菌肠毒素蛋白的野生型金葡菌肠毒素基因序列或者编码突变型金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素基因序列导入BCG活菌菌株后得到的重组菌株，所述野生型金葡菌肠毒素基因序列是指野生型金葡菌肠毒素SEA、SEB、SEC2、SED、SEE基因序列，所述突变型金葡菌肠毒素基因序列是指采用PCR的方法引入突变位点对SEA的D227A，SEC2的T20L、T20L/G22E、G22E/N23A和T20L/G22E/N23A进行定点突变改造后所获得的编码低毒或无毒的金葡菌肠毒素蛋白的突变型金葡菌肠毒素A227、C20、CTG、CGN、C3基因序列。

2.根据权利要求1所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于：所述突变型金葡菌肠毒素A227、C20、CTG、CGN、C3基因序列分别具有如SEQ ID NO:6-10所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于：是将所述野生型金葡菌肠毒素基因序列或者所述突变型金葡菌肠毒素基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上后导入BCG活菌菌株中得到的重组菌株。

4.根据权利要求3所述的重组BCG活菌菌株，其特征在于：所述BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上还连接有核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的BCG分泌信号肽基因序列。

5.一种活菌疫苗，其特征在于：含有权利要求1至4任一项所述的重组BCG活菌菌株。

6.权利要求4所述的重组BCG活菌菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）利用限制性内切酶和链接酶将核苷酸序列如SEQ ID NO:1-10所示的基因序列中的任一个以及核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示的BCG分泌信号肽基因序列克隆到BCG-大肠杆菌穿梭表达载体上，转化到大肠杆菌E. coli TOP10中，获得正确的重组转化子；

（2）将上述在大肠杆菌中构建好的穿梭表达载体导入到BCG活菌菌株中获得重组BCG活菌菌株，并通过抗生素筛选、PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定阳性转化子；

（3）将上述获得的重组BCG活菌菌株经扩大培养，收集培养液上清，上清液经超滤管适当浓缩后进行Western blot鉴定表达的金葡菌肠毒素蛋白情况。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：所述BCG-大肠杆菌穿梭表达载体为pMN234穿梭表达载体。

8.权利要求1至4任一项所述的重组BCG活菌菌株在制备预防和治疗人类肿瘤疾病的药物中的应用。

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