CN1580069A - 一种白介素－2和肠毒素b融合基因及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因重组技术，具体地说是白介素－2(IL－2)和肠毒素B(SEB)的融合基因及其制备，它具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列，以天然SEB基因和突变的IL－2基因为基础，利用PCR技术，设计适当的连接物，将两个基因连接起来制得融合基因；该基因能在大肠杆菌中表达。

Description

一种白介素-2和肠毒素B融合基因及其制备

技术领域

本发明涉及基因重组技术，具体说是一种白介素-2和肠毒素B融合基因及其制备。

背景技术

IL-2是一种激活T-细胞产生在淋巴细胞间作用淋巴因子；人类IL-2是一条由133个氨基酸残基组成的多肽链(Rene Devos，Geert Plaetinck，HildeCheroutre，Guus Simons，Wim Degrave，Jan Tavemier，Erik Remaut and WaltrFiers，Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression inE.coli.，Nucleic Acids Research，1983，11(13)：4307-4323)；分子量为1.5万最近几年IL-2用于肿瘤治疗的研究使人们重视了它的人工置备。

SEB是一种单亚基蛋白质，其前体由266个氨基酸组成，包括N端27个残基构成的信号肽；前体经信号肽酶加工后转变为成熟SEB，其分子量为2.8万(Ranelli DM，Jones CL，Johns MB，Mussey GJ，Khan SA.Molecularcloning of staphylococcal enterotoxin B gene in Escherichia coli andStaphylococcus aureus.Proc Natl Acad Sci U S A.1985；82(17)：5850-5854)。最近几年用于抗肿瘤的导向药物研究；有IL-2和绿脓杆菌毒素制得融合基因的报道(Lorberboum-Galski H，Garsia RJ，Gately M，Brown P S，Clark R E，Waldmann TA，Chaudhary V K，FitzGerald D J，Pastan I.IL2-PE664Glu，a newchimeric protein cytotoxic to human-activated T lymphocytes.J BiolChem.1990；265(27)：16311-16317.)。有关白介素-2和肠毒素B融合基因的研究还未见报道。

发明内容

本发明的的目的是提供一种新的、其表达可用于抗肿瘤靶向药物的白介素-2和肠毒素B融合基因及其制备。

为实现上述目的本发明的技术方案如下：

白介素-2和肠毒素B融合基因，具有序列表SEQ ID NO：1中碱基序列；

白介素-2和肠毒素B融合基因的制备方法，以天然SEB基因和突变的IL-2基因(专利申请号：03111487.3)为基础，通过连接物5′ggtggtggtggtggtggtacc3′制得融合基因；IL-2基因在融合基因的5′端，SEB基因在融合基因的后边，即IL-2的C端通过肽连接物(linker)与SEB的N端相连接。

以天然的SEB基因为模板，采用引物

SEB-F 5′ACGGTACCGAAAGCCAGCCAGATCCTAAACC 3′

SEB-R 5′ACTAAGCTTCTATTACTTTTTCTTAGTCG 3′

通过PCR技术扩增出SEB基因片段；

以突变的IL-2基因为模板，采用引物

IL-2-F 5′ACTGATTACATATGGCTCCGACTTC 3′

IL-2-R 5′ACGGGTACCACCACCACCACCACCAGTCAGAGTAGAGATG 3′

通过PCR技术扩增出IL-2基因片段。

突变后的IL-2基因碱基序列(详见，中国专利申请号：03111487.3)如下：

    1   GCTCCGACTT CTAGCTCTAC CAAGAAAACC

    30  CAGCTGCAGC TGGAACACCT GCTGCTGGAT

    60  TTACAGATGA TTCTGAACGG TATCAACAAC

    90  TACAAGAACC CGAAACTGAC CCGTATGCTG

    120 ACCTTCAAGT TTTACATGCC GAAGAAAGCT

    150 ACCGAACTGA AACATCTTCA GTGTCTAGAA

    180 GAAGAACTCA AACCTCTGGA GGAAGTTCTG

    210 AACCTGGCTC AGAGCAAAAA CTTTCACCTG

    240 CGTCCGCGTG ACTTAATCAG CAATATCAAC

    270 GTAATAGTTC TGGAACTGAA AGGTTCTGAA

    300 ACCACCTTCA TGTGCGAATA TGCTGATGAG

    330 ACAGCAACCA TTGTAGAATT TCTGAACCGT

    360 TGGATTACCT TCTCTCAGTC TATCATCTCT

    390 ACTCTGACT-3′

为表达和药用需要天然IL-2的125位半胱氨酸突变为丙氨酸。

Linker为相对应的肽为6个甘氨酸和1个苏氨酸即：-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Thr-

本发明具有如下优点：

1.本发明为人工制备的一新基因，属首次制得的基因，该基因的表达可用于抗肿瘤靶向药物的研究和药物。

2.应用本发明，可进一步提供直接用于生产IL-2(125Ala)-SEB的工程菌株。

3.本发明基因的表达提供了一种新的蛋白，较好地利用了IL-2的导向功能，可充分发挥SEB的抗肿瘤作用。

附图说明

图1为融合基因在大肠杆菌中表达电泳图；其中：1为中型蛋白标准，2为对照，3为本发明实例工程菌。

具体实施方式

实施例1

一种白介素-2和肠毒素B融合基因及其制备突变基因，具有SEQ IDNO：1所示的序列：

(1)SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)

(a)序列特征：

    *长度：1140碱基对

    *类型：核酸

    *链型：双链

    *拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：白介素-2(human interleukin 2)，肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B)

材料：

菌株和E.coli DH5α、JM109(DE3)为市购获得；

质粒：含有该融合基因的质粒，pTE-30a-(+)表达载体，7ZTS载体(参见中国专利申请02109681.3)本实例构建(也可用市购7Z替代)；

分子生物学试剂：Taq DNA polymerase，Pfu DNA polymerase，dNTP，hind III，Nde I，T4 DNA Ligase皆为美国Promega公司产品，胶回收及质粒提取试剂盒都是上海华舜公司产品，琼脂糖购自FMC生物制品公司，其余产品均为国产分析纯；

仪器：Sprint PCR仪是英国Hybaid公司产品，离心机micromax230由IEC(International Equipment Company)公司制造，基因脉冲转化仪是Bio-Rad产品，DF-D电泳仪是北京东方特力科贸中心产品，ShimadzuDual-Wavelength TLC Sanner，CS-930。

方法和结果：

1.融合基因扩增

采用PCR方法；参考文献：时成波，吕安国，吴文芳，杨立泉等，改变稀有密码子提高SEA的表达水平，《生物工程学报》2002，18(4)：477-480。

2.融合基因的鉴定

1)质粒的提取：参照文献：《精编分子生物学实验指南》和J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》科学出版社1998年版P16-34；

2)PCR引物设计及反应条件：

根据SEQ ID NO：1所示的序列，设计一组引物：

正向引物IL-2-F 5′ACTGATTACATATGGCTCCGACTTC 3′

反向引物SEB-R 5′ACTAAGCTTCTATTACTTTTTCTTAGTCG 3′

第一阶段97℃，1分钟；

第二阶段95℃，40秒；59℃，30秒；72℃，45秒；共30个循环；

第三阶段72℃，5分钟；

以含融合基因的DNA为模板进行PCR；退火温度采用50℃；

反应体系参考文献：J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克

隆实验指南》科学出版社1998年版P680；

3)PCR产物的回收：按上海华舜试剂盒使用说明书操作；

4)PCR产物与7ZTS载体的连接：将7ZTS载体和PCR产物分别用hindIII和Nde I进行双酶切，并用试剂盒纯化，然后与T4buffur，ddH₂O，T4 ligase混合，共10μL，于16℃过夜；次日，于体系中加1μL NaAc，30μL无水乙醇，混匀，-80℃放置20分，室温下15000rpm离心15分；沉淀用75％乙醇洗4次，室温凉干，加入10μL ddH₂O溶解，取5μL转化感受态细胞；感受态细胞(E.coli DH5α)的制备和电击转化方法，按：(J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯《分子克隆实验指南》科学出版社1998年版P49-55)中的方法操作；

处理后的连接物转化E.coli DH5α感受态细胞，在选择平板上挑选4个白色菌落进行鉴定；4个菌体的质粒进行电泳图谱表明有两个菌可能是转化子，进一步用HindIII和Nde□对这两个菌的重组质粒双酶切，释放出约1100bpDNA片段；初步证明，这两个菌即是转化子；

5)DNA序列测定：将转化的感受态细胞接种于1ML LB培养基中，37℃培养1小时，取100μL涂于含Amp IPTG X-Gal的平板上，37℃培养16小时，提取质粒先进行双酶切初步鉴定。将经过初步鉴定的白色转化子由平板接种于5ml LB(含50μg/ml Amp)培养液中，培养20小时后取4.5ml发酵液离心，得菌体；用试剂盒提取质粒，准备测序。

对两个转化子重组质粒测序结果表明，所克隆的DNA片段含有融合基因的1140bp成熟蛋白基因，其碱基序列设计一致。

3.构建融合基因表达的工程菌：

1)融合基因与PTE-30a-(+)载体的连接及转化：将经测序正确的IL-2突变基因和PTE-30a-(+)载体分别用NdeI和Hind III双酶切；酶切体系如下：DNA 6μl，ddH₂O 10μl，K buffer 2μ1，NdeI和Hind III各1μ1；37℃反应2小时，柱回收；用T41igase将双酶切后的产物连接，连接体系如下：T4ligase buffer 1μl，T4ligase 1μl，双酶切PTE-30a-(+)载体1μl，双酶切PCR产物7μl；

将双切后的目的基因与同样双酶切的PTE-30a-(+)表达载体于15℃连接过夜；向连接体系中加入1μl 3M NaAc，30μl无水乙醇，摇匀，-20℃静置1小时，15000rp离心15分钟；沉淀用75％乙醇洗4次，室温干燥；用10μl ddH₂O溶解，取5μl转化E.coli JM109(DE3)；

挑选8个白色转化子，提取质粒进行双酶切鉴定；用HindIII and NdeI对质粒双酶切，产生约1100bp的DNA片段，初步证实了这8个菌株都是转化子；取9个转化子中之一菌株质粒进行DNA序列的测定；测序结果表明，融合基因完全按预先设计方式连接到7ZTS载体上，碱基序列完全正确；

2)融合基因的表达：分别挑取JM109(DE3)单菌落于LB(含Amp 50μg/ml)中，37℃过夜培养；次日，以1％接种量转接新鲜LB(含Amp 50μg/ml)；当OD₆₀₀达到0.6～0.8时，1.0mmol/L的IPTG诱导，于32℃表达10小时；1ml发酵液的菌体离心，用ddH₂O洗一次，悬于1倍SDS样品加样液，沸水浴煮10分钟，12000g离心2分钟，取15μl进行15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果用薄层扫描仪在波长560nm处扫描；

在工程菌的细胞全蛋白电泳图谱中有一明显表达带，见图1，分子量约43000dalton；OD560薄层扫描显示此表达蛋白占菌体总蛋白的12％。

本发明基因序列为：

atggctccga cttctagctc taccaagaaa acccagctgc agctggaaca cctgctgctg gatttacaga

tgattctgaa cggtatcaac aactacaaga acccgaaact gacccgtatg ctgaccttca agttttacat

gccgaagaaa gctaccgaac tgaaacatct tcagtgtcta gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtt

ctgaacctgg ctcagagcaa aaactttcac ctgcgtccgc gtgacttaat cagcaatatc aacgtaatag

ttctggaact gaaaggttct gaaaccacct tcatgtgcga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga

atttctgaac cgttggatta ccttctctca gtctatcatc tctactctga ctggtggtgg tggtggtggt

accgaaagcc agccagatcc taaaccagat gagttgcaca aatcgagtaa attcactggt ttgatggaaa

atatgaaagt tttgtatgat gataatcatg tatcagcaat aaacgttaaa tctatagatc aatttctata

ctttgactta atatattcta ttaaggacac taagttaggg aattatgata atgttcgagt cgaatttaaa

aacaaagatt tagctgataa atacaaagat aaatacgtag atgtgtttgg agctaattat tattatcaat

gttatttttc taaaaaaacg aatgatatta attcgcatca aactgacaaa cgaaaaactt gtatgtatgg

tggtgtaact gagcataatg gaaaccaatt agataaatat agaagtatta ctgttcgggt atttgaagat

ggtaaaaatt tattatcttt tgacgtacaa actaataaga aaaaggtgac tgctcaagaa ttagattacc

taactcgtca ctatttggtg aaaaataaaa aactctatga atttaacaac tcgccttatg aaacgggata

tattaaattt atagaaaatg agaatagctt ttggtatgac atgatgcctg caccaggaga taaatttgac

caatctaaat atttaatgat gtacaatgac aataaaatcg ttgattctaa agatgtgaag attgaagttt

atcttacgac taagaaaaag

                        SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院沈阳应用生态研究所    屹昌科技集团有限公司

<120>一种白介素-2和肠毒素B融合基因及其制备

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1140

<212>DNA

<213>融合基因

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1140)

<223>

<400>1

atggctccga cttctagctc taccaagaaa acccagctgc agctggaaca cctgctgctg     60

gatttacaga tgattctgaa cggtatcaac aactacaaga acccgaaact gacccgtatg    120

ctgaccttca agttttacat gccgaagaaa gctaccgaac tgaaacatct tcagtgtcta    180

gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtt ctgaacctgg ctcagagcaa aaactttcac    240

ctgcgtccgc gtgacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact gaaaggttct    300

gaaaccacct tcatgtgcga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac    360

cgttggatta ccttctctca gtctatcatc tctactctga ctggtggtgg tggtggtggt    420

accgaaagcc agccagatcc taaaccagat gagttgcaca aatcgagtaa attcactggt    480

ttgatggaaa atatgaaagt tttgtatgat gataatcatg tatcagcaat aaacgttaaa    540

tctatagatc aatttctata ctttgactta atatattcta ttaaggacac taagttaggg    600

aattatgata atgttcgagt cgaatttaaa aacaaagatt tagctgataa atacaaagat    660

aaatacgtag atgtgtttgg agctaattat tattatcaat gttatttttc taaaaaaacg    720

aatgatatta attcgcatca aactgacaaa cgaaaaactt gtatgtatgg tggtgtaact     780

gagcataatg gaaaccaatt agataaatat agaagtatta ctgttcgggt atttgaagat     840

ggtaaaaatt tattatcttt tgacgtacaa actaataaga aaaaggtgac tgctcaagaa     900

ttagattacc taactcgtca ctatttggtg aaaaataaaa aactctatga atttaacaac     960

tcgccttatg aaacgggata tattaaattt atagaaaatg agaatagctt ttggtatgac    1020

atgatgcctg caccaggaga taaatttgac caatctaaat atttaatgat gtacaatgac    1080

aataaaatcg ttgattctaa agatgtgaag attgaagttt atcttacgac taagaaaaag    1140

Claims (4)

1.一种白介素-2和肠毒素B融合基因，其特征在于：具有序列表SEQID NO：1中碱基序列。

2.一种权利要求1所述白介素-2和肠毒素B融合基因的制备方法，其特征在于：以天然SEB基因和突变的IL-2基因为基础，通过连接物5′ggtggtggtggtggtggtacc3′制得融合基因；IL-2基因在融合基因的5′端，SEB基因在融合基因的后边，即IL-2的C端通过肽连接物与SEB的N端相连接。

3.按照权利要求2所述融合基因的制备方法，其特征在于：以天然的SEB基因为模板，采用引物

SEB-F 5′ACGGTACCGAAAGCCAGCCAGATCCTAAACC 3′

SEB-R 5′ACTAAGCTTCTATTACTTTTTCTTAGTCG 3′

通过PCR技术扩增出SEB基因片段；

4.按照权利要求2所述融合基因的制备方法，其特征在于：以突变的IL-2基因为模板，采用引物

IL-2-F 5′ACTGATTACATATGGCTCCGACTTC 3′

IL-2-R 5′ACGGGTACCACCACCACCACCACCAGTCAGAGTAGAGATG 3′

通过PCR技术扩增出IL-2基因片段。