CN111349574B - 法布里德巴利酵母、包含其的微生物制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种法布里德巴利酵母D‑1，保藏编号为CGMCC No.16712，保藏日期为2018年11月6日，分类名称为Debaryomyces fabryi。本发明还涉及该法布里德巴利酵母D‑1在普洱生茶发酵中的应用。经本发明的法布里德巴利酵母菌株D‑1发酵的发酵普洱茶呈现花果浓香，汤色变深，儿茶素含量减少，冲泡后茶汤的抗氧化能力提高，饮用后有益于人体健康。

Description

法布里德巴利酵母、包含其的微生物制剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体而言，涉及一种法布里德巴利酵母(Debaryomyces fabryi)、包含该酵母的微生物制剂，及它们在茶叶发酵中的应用。

背景技术

普洱茶通常可被简单的分为普洱生茶和普洱熟茶两种。普洱生茶，是指用云南大叶种晒青毛茶为原料，以自然的方式陈放，不经过人工“发酵”、“渥堆”处理，仅经过加工整理、修饰形状的各种云南茶叶。普洱生茶因陈放而更有价值。陈期五年后，普洱生茶野性开始减退，茶汤如半发酵的乌龙茶，汤色浅栗红亮。随着陈放时间延长，在不同时期自然发酵出荷香、樟香、兰香等不同香气。汤色也从栗红色转为深栗色，茶底从栗色陈化至深褐色。茶味也随时间而慢慢醇滑、厚重，使其风味更加柔和。为了缩短陈化时间，加速物质间转化，科学家们应用各种发酵技术通过接种不同菌种模拟其自然发酵过程。

目前对于改善普洱茶发酵特征所涉及的菌株主要有多菌种(包含酵母和霉菌)复合发酵，用以加快发酵过程及提高茶叶的香气、滋味以及汤色。但由于复合菌种成分复杂，且多数为酵母菌与霉菌复配而成，其发酵条件难于控制，尤其是在同样发酵条件下使霉菌孢子合理萌发且不过量，是近几年来茶叶发酵领域技术的难点和痛点。因此，对于现有发酵技术中存在的难控制、易污染、风味不稳定等核心问题，亟待一种新型简单的发酵技术以克服上述问题，生产出宜于操控、风味独特、茶味醇滑的新型普洱茶。采用单菌发酵，工艺操作简单、可控，是解决上述问题的有效途径。

酵母菌是普洱茶中的优势菌株，研究人员利用纯种酵母菌进行普洱茶发酵，如赵腾飞等用从渥堆发酵中筛选了5种酵母对普洱茶进行纯种发酵，但是结果显示酵母菌纯菌发酵对普洱茶的作用没有自然发酵(多种微生物发酵)的作用明显，降低其中茶多酚(具有很强的抗氧化性)和可溶性糖(缓解茶汤苦涩味、刺激作用)的含量，发酵得到的普洱茶口感不佳(“酵母菌纯种发酵普洱茶初探”，赵腾飞等，食品科技，2012年)。因此，利用单菌纯种发酵仍然存在发酵效果不如自然发酵的缺点。

法布里德巴利酵母(Debaryomyces fabryi)是普洱茶渥堆过程中普遍存在的一种酵母，由于其含量低且不易分离，常常被科学家忽视。本发明人从渥堆发酵普洱茶中分离筛选出一株法布里德巴利酵母，将其人工接种于普洱生茶，能够获得发酵生产品质、抗氧化性优于传统普洱生茶和自然发酵茶的优质发酵普洱茶。

发明内容

第一方面，本发明提供了一种法布里德巴利酵母D-1(Debaryomyces fabryi D-1)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16712，保藏日期为2018年11月6日，分类名称为Debaryomyces fabryi。

第二方面，本发明提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂包含第一方面所述的法布里德巴利酵母D-1。

第三方面，本发明提供了第一方面所述的法布里德巴利酵母D-1或第二方面所述的微生物制剂在制备具有抗氧化作用的茶叶中的应用。其中，所述具有抗氧化作用的茶叶为发酵普洱茶。

第四方面，本发明提供了一种制备发酵普洱茶的方法，所述方法包括将本发明的法布里德巴利酵母D-1或微生物制剂接种至普洱生茶，然后进行纯种发酵。

有益效果

使用本发明的法布里德巴利酵母D-1对普洱生茶进行纯种发酵，可降低普洱生茶中的儿茶素，使普洱生茶苦涩的味道迅速转化；并使经其发酵的发酵普洱茶在冲泡后的茶汤呈现花果浓香，汤色变深，苦涩味变淡，味道更为柔和细腻，以及抗氧化能力提高50％以上，具有明显的抗氧化作用，饮用后有益于人体健康。本发明制备发酵普洱茶的方法采用本发明的法布里德巴利酵母D-1或本发明的微生物制剂进行纯种发酵，工艺操作简单、可控，仅需自然干燥即可完成发酵普洱茶的制作，无需进行二次发酵，大大缩短了工艺时间，便于企业推广应用，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为法布里德巴利酵母的18S rDNA序列。

图2是普洱生茶和自然发酵茶与发酵普洱茶茶汤中的抗氧化能力的对比图表。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本发明中，术语“OTUs(Operation Taxonomy Units)”是指操作分类单元。在本发明中，不同的18S rRNA序列的相似性高于97％即可聚类为一个OTU，每一个OTU代表一个微生物物种。

在本发明中，术语“物种注释”是指对样本OTU中种属的构成进行柱状图可以得到物种组成柱状图，显示组间或组内样品物种分布情况。

在本发明中，术语“渥堆”或“渥堆发酵”是指具有本领域众所周知定义的一种普洱茶发酵过程，通常是指以微生物自身代谢活动为中心，通过胞外酶和湿热环境的协调作用，使茶叶的化学成分发生复杂的变化，进而塑造普洱茶特殊的品质风味的过程。

在本发明中，术语“纯种发酵”是指在无菌条件下向毛茶/生茶中人工接种一种微生物进行发酵的过程，也称为“单菌发酵”或“单菌纯种发酵”。本发明中，术语“毛茶”是指：新鲜茶叶经过杀青，揉捻，干燥等工序后制成的茶叶。在本发明中，术语“生茶”是指：新鲜茶叶采摘后以自然的方式陈放，未经过渥堆发酵处理的茶。

在本发明中，术语“自然发酵茶”是指：新鲜茶叶采摘后，经杀青，揉捻，干燥，增温渥堆，毛茶分级筛选，风干陈化，筛分拼配后制成的茶。

在本发明中，术语“普洱生茶”是指用云南大叶种晒青毛茶为原料，以自然的方式陈放，不经过“人工发酵”、“渥堆”处理的普洱茶。本发明中，术语“普洱熟茶”是指用云南大叶种晒青毛茶为原料，经过渥堆发酵，以人工方式速成发酵而制成的普洱茶。

在本文中，将普洱生茶经人工接种菌种发酵后获得普洱茶的称为“发酵普洱茶”。

本发明中，本发明人从对普洱生茶的渥堆发酵过程中分离、筛选出一株酵母，对该菌株的18s rDNA序列(SEQ ID NO:1)进行扩增、测序以及比对，发现该菌株与Debaryomycesfabryi JCM 2166(GenBank:＝AB013567.1)同源性最高，同源性为99％，因此在分类学上属于法布里德巴利酵母，将其命名为法布里德巴利酵母D-1。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种用于茶叶发酵的法布里德巴利酵母D-1，保藏编号为CGMCC No.16712，保藏日期为2018年11月6日。使用该法布里德巴利酵母菌株D-1对普洱生茶进行纯种发酵，可降低普洱生茶中的儿茶素，使普洱生茶苦涩的味道迅速转化；并使由其发酵后的发酵普洱茶经冲泡后的茶汤呈现鲜甜果香，汤色变深，苦涩味变淡，味道更为柔和细腻，以及抗氧化能力提高，具有明显的抗氧化作用，饮用后有益于人体健康。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种微生物制剂，所述微生物制剂包含本发明所述的法布里德巴利酵母D-1。

在优选的实施方式中，所述微生物制剂为冻干菌剂，更优选处于干粉状的冻干菌剂。所述冻干菌剂是指将本发明的法布里德巴利酵母D-1的菌体经冻干处理后获得的菌剂，通常为干粉状形式。制备所述冻干菌剂的方法是本领域技术人员已知的，例如将菌株的培养液经离心后收集菌体/菌泥，加入冻干保护剂采用真空冷冻干燥技术制备得到。所述冻干保护剂可使用本领域熟知的冻干保护剂，例如多糖或多元醇，包括但不限于麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸、甘油等。

在优选的实施方式中，本发明提供了制备所述微生物制剂的方法，所述方法包括：

1)将本发明所述的法布里德巴利酵母D-1接种至酵母培养基中进行培养，获得所述法布里德巴利酵母D-1的培养液；

2)从步骤1)中获得的培养液中收集所述法布里德巴利酵母D-1的菌体；以及

3)将所述菌体与冻干保护剂混合后经真空干燥，制成所述微生物制剂。

在优选的实施方式中，其中，在步骤1)中，将所述法布里德巴利酵母D-1在YPD液体培养基中于28-32℃、优选30℃，150-250rpm、优选200rpm下培养至少12h、优选至少24h，在培养过程中维持pH为6-7、优选6.5。调节pH的方法是本领域常规技术手段，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，例如向培养液中添加稀盐酸等。

应当指出的是，培养条件只要适用于法布里德巴利酵母D-1的生长繁殖的条件即可，本领域技术人员可根据实际需要对培养条件和培养基进行修改或优化，这些修改和/或优化也在本发明的范围内。

在优选的实施方式中，其中，在步骤1)中，在进行培养之前，还包括对所述法布里德巴利酵母D-1进行活化。在进一步优选的实施方式中，将冷冻保藏的法布里德巴利酵母D-1接种至YPD液体培养基中，于28-32℃、优选30℃，150-250rpm、优选200rpm下活化12h-24h。

在优选的实施方式中，在步骤2)中，从步骤1)中获得的培养液中收集法布里德巴利酵母D-1的菌体的方式可为本领域技术人员已知的方式，例如离心、过滤、浮选分离、分离筛、重力沉降等。本领域技术人员可以根据实际需要选择合适的方法及合适的参数，只要保证菌株的存活力不受影响或基本不受影响即可，例如在4℃、8000rpm离心10min。

在优选的实施方式中，在步骤3)中，所述菌体与所述冻干保护剂以1:3-1:5的体积比进行混合。所述冻干保护剂可使用本领域熟知的冻干保护剂，例如多糖或多元醇。所述冻干保护剂优选选自麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸、甘油，或它们的任意组合。

在优选的实施方式中，所述真空干燥的方法和设备是本领域技术人员熟知的。例如，本发明的真空干燥可在例如真空干燥箱中进行。

在一个实施方式中，本发明提供了上述法布里德巴利酵母D-1或上述微生物制剂、优选冻干菌剂在制备具有抗氧化作用的茶叶中的应用。在优选的实施方式中，所述抗氧化作用的茶叶为发酵普洱茶。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种制备发酵普洱茶的方法，所述方法包括将本发明的法布里德巴利酵母D-1或上述微生物制剂接种至普洱生茶，然后进行纯种发酵。

在优选的实施方式中，所述方法还包括在接种法布里德巴利酵母D-1之前向所述普洱生茶中加入水，以使得相比所述普洱生茶和水的总量，水的含量为30wt％-40wt％。

在优选的实施方式中，将活菌数至少为1×10⁸CFU/mL的所述法布里德巴利酵母D-1的菌液或者由所述微生物制剂配制的活菌数至少为1×10⁸CFU/mL的菌液以5-15v/w％、优选10v/w％的比例接种至所述普洱生茶中。在一些实施方式中，也可将本发明的冻干菌剂直接接种至所述普洱生茶中。

在优选的实施方式中，所述制备发酵普洱茶的方法包括将本发明的法布里德巴利酵母D-1接种至普洱生茶中，在28-32℃、优选30℃下密封发酵至少20h，优选20h-60h，更优选至少24-52h。本领域技术人员可以根据实际需要对发酵液中的活菌数、发酵时间、环境条件和接种比例进行选择和调整，这一点并不会对本发明进行限制。

出于说明的目的，例如，本发明的方案可通过如下段落中的内容而得以实现：

1.一种用于茶叶发酵的法布里德巴利酵母D-1，其保藏编号为CGMCC No.16712。

2.一种微生物制剂，所述微生物制剂包含权利要求1所述的法布里德巴利酵母D-1。

3.如段落2所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂为冻干菌剂。

4.如段落3所述的微生物制剂，其中，所述冻干菌剂为处于干粉状的冻干菌剂。

5.制备段落2-4中任一段所述的微生物制剂的方法，所述方法包括如下步骤：

1)将段落1所述的法布里德巴利酵母D-1接种至酵母培养基中进行培养，获得所述法布里德巴利酵母D-1的培养液；

2)从步骤1)中获得的所述培养液中收集所述法布里德巴利酵母D-1的菌体；以及

3)将所述菌体与冻干保护剂混合后经真空干燥，以制成所述微生物制剂。

6.如段落5所述的方法，其中，在步骤1)中，将所述法布里德巴利酵母D-1在YPD液体培养基中于28-32℃，150-250rpm下培养至少12h，并且在培养过程中维持pH为6-7。

7.如段落6所述的方法，其中，在步骤1)中，将所述法布里德巴利酵母D-1在YPD液体培养基中于30℃，200rpm下培养至少24h，并且在培养过程中维持pH为6.5。

8.如段落5-7中任一段所述的方法，其中，在步骤2)中，所述菌体的收集通过选自以下的方式进行：离心，过滤、浮选分离、分离筛、重力沉降。

9.如段落8所述的方法，其中，所述菌体的收集通过离心进行。

10.如段落5-9中任一段所述的方法，其中，在步骤3)中，所述菌体与所述冻干保护剂以1:3-1:5的体积比进行混合。

11.如段落10所述的方法，其中，所述冻干保护剂选自麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸、甘油，或它们的任意组合。

12.段落1所述的法布里德巴利酵母D-1或段落2-4中任一段所述的微生物制剂在制备具有抗氧化作用的茶叶中的应用。

13.如段落12所述的应用，其中，所述具有抗氧化作用的茶叶为发酵普洱茶。

14.一种制备发酵普洱茶的方法，所述方法包括将段落1所述的法布里德巴利酵母D-1或段落2-4中任一项所述的微生物制剂接种至普洱生茶，然后进行纯种发酵。

15.如段落14所述的方法，其中，将活菌数至少为1×10⁸CFU/mL的所述法布里德巴利酵母D-1的菌液或者由所述微生物制剂配制的活菌数至少为1×10⁸CFU/mL的菌液以5-15v/w％的比例接种至所述普洱生茶。

16.如段落15所述的方法，其中，将所述菌液以10v/w％的比例接种至所述普洱生茶。

17.如段落14-16中任一段所述的方法，其中，所述纯种发酵为在28-32℃下密封发酵。

18.如段落17所述的方法，其中，所述纯种发酵为在30℃下进行密封发酵。

19.如段落14-18中任一段所述的方法，其中，所述纯种发酵进行至少20h。

20.如段落19所述的方法，其中，所述纯种发酵进行20h-60h。

21.如段落20所述的方法，其中，所述纯种发酵进行24h-52h

22.如段落14-21中任一段所述的方法，其中，在接种之前向所述普洱生茶中加水，以使得相比所述普洱生茶和水的总量，水的含量为30wt％-40wt％。

实施例

以下结合具体实施例对本文进行详细描述。下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特别说明，下述实施例中使用的试剂购自Sigma、Thermofisher等公司。

实施例中使用的试剂：

YPD液体培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。

YPD固体培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L。

PDB液体培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L。

实施例1法布里德巴利酵母菌株的筛选与鉴定

1.1样本收集及数据采集

取100g来自云南临沧的普洱生茶在室温下进行渥堆发酵，跟踪普洱生茶发酵全过程，分阶段采集发酵茶叶样品，记录采集时间(渥堆后3天(3d)、15天(15d)、21天(21d)、29天(29d))，样品采集后储存在无菌样品采集管中。将采集后的样品立即储存在-80℃以终止微生物活动。

1.2样品处理及DNA提取

终止微生物活动后24h内，使用Bioteke全自动核酸提取仪和土壤基因组DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)从采集的发酵茶叶样品中提取DNA，该操作可排除人为误差而导致的DNA提取质量不稳定。

1.3微生物多样性分析

通过18S rRNA高通量测序技术，检测采集的发酵茶叶中普洱茶发酵菌群类型以及相应的丰度信息。为确保数据的准确性和可靠性，测序得到的原始数据(Raw Data)，存在一定比例的干扰数据(Dirty Data)，因此对原始数据进行了拼接、过滤，得到有效数据(CleanData)。基于有效数据进行OTU聚类和物种分类分析，并将OTU和物种注释结合，从而得到每个样本的OTUs和物种注释的基本分析结果。同时对物种注释在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。本实验采用引物：ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG(SEQ ID NO:2))和ITS4(GGACTACHVGGGTWTCTAAT(SEQ ID NO:3))。

1.4菌株分离与鉴定

18S rRNA通量测序技术发现，渥堆后3天样品中法布里德巴利酵母的丰度相对较高(7.88％)，采用倾注法对该样品进行富集分离。具体步骤如下：渥堆后3天采集的茶叶样品5g，加无菌蒸馏水45mL，形成10^-1稀释液，吸取1mL 10^-1稀释液，加入9mL无菌生理盐水中，形成10^-2稀释液，反复以上操作，依次形成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释液，分别吸取1mL10^-5、10^-6、10^-7稀释液置于无菌培养皿中间位置(一个稀释梯度三个平行，共9个平皿)，并向培养皿中倒入20mL冷却至50℃的YPD固体培养基(含50ppm链霉素和100ppm青霉素)；顺时针混匀静置待其凝固完全，倒置于30℃培养箱中培养24h-48h至可见明显的单菌落。随机挑取白色光滑菌落，将挑选的菌落采用梯度稀释纯化法，在YPD固体培养基反复划线后在30℃培养16h-20h，直至菌落在颜色、大小和形态完全一致得到纯化的单菌落。

将纯化后的单菌落转接至50mL PDB液体培养基中，于30℃下200rpm振荡扩大培养24小时。使用百泰克细菌高通量DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司，AU46111-96)提取该菌落的基因组DNA，通过ITS序列对所选菌株进行分类学上的鉴定。用18S rDNA通用引物(上游引物：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’(SEQ ID NO:4)；下游引物：5’-TCCGCAGCTTCACCTACGGA-3’(SEQ ID NO:5))进行18S rDNA PCR扩增。PCR反应体系(50μL体系)为：Sterilized ddH₂O 22μL、2×PCR Master 25μL(其中，2×PCR Master包含3mmol/LMgCl₂，0.2mmol/L dNTP，0.1U/μL Taq DNA Polymerase和2×PCR buffer)、DNA模板1μL、10μmol/L引物2μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环；最后72℃温浴10min。

将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将所得序列结果在NCBI中进行BLAST比对，该菌株与Debaryomyces fabryi JCM 2166(GenBank:＝AB013567.1)同源性最高，同源性为99％。因此筛选出的纯化菌在分类学上属于法布里德巴利酵母，将其命名为法布里德巴利酵母D-1。该酵母保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC No.16712)，保藏日期为2018年11月6日，分类学名称为法布里德巴利酵母(Debaryomyces fabryi)。

实施例2法布里德巴利酵母菌剂的制备

将实施例1中分离出的法布里德巴利酵母D-1制备成冻干菌剂(干粉状)。具体过程如下：

(1)将法布里德巴利酵母菌株D-1菌株以2v/v％接种至200mL的YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养12h，得到种子培养液；

(2)将上述种子培养液以2v/v％接种至置于包含20L灭菌后的YPD液体培养基的20L发酵罐中，发酵液的pH为6.5，在30℃、200rpm下连续培养24h，得到法布里德巴利酵母菌株D-1的培养液；

(3)将上述培养液在8000rpm、4℃，离心10min，收集菌泥，按照菌泥与冻干保护剂(海藻糖和甘油，体积比为1:1)的体积比分别为1:3和1:5加入冻干保护剂，混合后在-80℃预冻12h，并经真空冷冻干燥制成冻干菌粉。

实施例3由法布里德巴利酵母制备的发酵普洱茶

将实施例1获得的法布里德巴利酵母D-1用于制作发酵普洱茶，具体过程如下：

1)种子液制备：将保存的酵母培养液复苏后以2v/v％接种至100mL PDB液体培养基(作为种子培养基)中，在30℃、200rpm下培养18h，用PDB液体培养基将所得的培养液调整至活菌数为约1×10⁸CFU/mL，待用。

2)普洱生茶发酵：向原料普洱生茶(50g)加入无菌水至相比茶叶的总重量水的含量为30wt％，取5mL上述菌液接种至普洱生茶中，充分混合均匀；将接种好的茶叶用封口膜封好后，放置于30℃培养箱中，培养52h。

3)将发酵52h的普洱茶在30℃下烘干。

感官评价：在光线充足无异味的品评室里对发酵52h的发酵普洱茶进行感官评价，评价方法：采用百分制，普洱茶专业品评人员进行感官评价，针对色泽(5分)、条形(5分)、净度(10分)、汤色(20分)、香气(25分)、滋味(25分)、叶底(10分)等指标进行普洱茶品评，得出相应的分数，以平均值表示。

茶汤的制备：将茶具用煮沸的去离子水清洗浸泡5min，然后弃之，称取烘干的普洱茶3.0g，置于150mL评审杯中，倒入150mL煮沸的去离子水至满杯，迅速盖上杯盖，准确计时5min，计时结束后，将茶汤倒入评审茶碗中，进行品评。

感官评定：经法布里德巴利酵母D-1发酵的普洱茶茶叶带梗、匀齐，茶汤汤色红亮，鲜甜且有果香，滋味醇厚回甘，叶底红褐且嫩匀(结果见表1)。

对比例1

除了使用实施例1中从其它阶段采集分离的法布里德巴利酵母(分别编号为D-2、D-3和D-4)替代法布里德巴利酵母D-1之外，以与实施例3相同的步骤获得纯种发酵的发酵普洱茶。对实施例3和对比例1获得的发酵普洱茶进行感官评价对比。结果如表1所示。

表1不同法布里德巴利酵母纯种发酵的发酵普洱茶的感官评价

由表1的结果可以看出，经本发明的法布里德巴利酵母D-1纯种发酵的发酵普洱茶相比于原料(即发酵前的普洱生茶)和其它法布里德巴利酵母纯种发酵的发酵普洱茶，经冲泡后茶汤汤色红亮，鲜甜且有果香，滋味醇厚回甘，叶底红褐且嫩匀，具有更高的评分。

由此可见，使用本发明分离出的法布里德巴利酵母D-1将普洱生茶作为原料进行纯种发酵，工艺操作简单、可控，通过发酵工艺的实施能够使普洱生茶苦涩的味道迅速转化，尤其是能够加速陈化，使汤色变深，提高营养物质，并呈现花果浓香。同时，经纯种发酵后，仅需自然干燥即可完成发酵普洱茶的制作，无需进行二次发酵，大大缩短了工艺时间，便于企业推广应用，具有良好的应用前景。

效果例1法布里德巴利酵母D-1发酵普洱茶的抗氧化作用

样品制备：将茶具均用烧开的去离子水浸泡，将烘干后的茶叶样品(包括采集自云南临沧的原料普洱生茶(以下称为“普洱生茶”)、原料未进行接种在30℃下发酵52h的自然发酵茶作为对照(以下称为“自然发酵普洱茶”)、经法布里德巴利酵母D-1纯种发酵24h和52h(按照实施例3的发酵方法进行发酵)的发酵普洱茶称取3.0g，置于150mL审评杯中，将150mL煮沸的MilliQ超纯水倒满审评杯，迅速盖上杯盖，准确计时5min，计时结束后，将审评杯中茶汤倒入汤碗中以瓷勺取茶汤至茶杯中进行品尝，观察净度、汤色、香气、滋味和叶底后对茶汤进行抗氧化能力检测。

依据总抗氧化能力(T-AOC)测试盒说明书(南京建成生物工程研究所A015)对样品进行检测，结果如图2所示。经法布里德巴利酵母D-1发酵后获得的发酵普洱茶经冲泡后茶汤的抗氧化能力比原料普洱生茶及自然发酵普洱茶有所增加，在发酵52h后可增加50％以上，具有明显的抗氧化作用，饮用后可有益于人体健康。

效果例2法布里德巴利酵母D-1发酵普洱茶的儿茶素变化

众所周知，儿茶素是茶叶苦涩的重要表征参数，测试由法布里德巴利酵母D-1发酵的发酵普洱茶中儿茶素含量的变化。

样品制备：0.2g样品(效果例1中使用的原料普洱生茶、自然发酵普洱茶、经法布里德巴利酵母D-1发酵24h和52h后的发酵普洱茶)，均匀粉碎试样于10mL离心管中，加入70℃预热过的70％甲醇5mL，充分混匀后立即移入70℃水浴，浸提20min(每隔5min搅拌一次)，将上清液转移至10mL容量瓶，重复上述步骤对残渣再浸提一次，合并提取溶液，冷却至室温，定容后待用。

样品检测：依据国标GB8313-2008进行儿茶素含量检测，普洱生茶和自然发酵茶作为对照样品，经法布里德巴利酵母D-1发酵24h和52h的发酵普洱茶作为检测样品，结果如表2所示。

表2：不同样品中儿茶素含量的对比

由表2可以看出，原料普洱生茶经自然发酵52h后儿茶素的含量基本不变，而经过法布里德巴利酵母D-1纯种发酵24h后，儿茶素总量开始降低，纯种发酵52h后儿茶素总量降低10％左右。因此，经本发明的法布里德巴利酵母D-1纯种发酵的普洱生茶中儿茶素总含量降低，使感官评价中茶叶的风味苦涩味变淡，茶汤颜色变深，味道更为柔和、细腻。

序列表

<110> 中粮营养健康研究院有限公司

<120> 法布里德巴利酵母、包含其的微生物制剂及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1690

<212> DNA

<213> 法布里德巴利酵母(Debaryomyces fabryi)

<400> 1

tgaatgtcca gattaagcca tgcatgtcta agtataagca atttatacag tgaaactgcg 60

aatggctcat taaatcagtt atcgtttatt tgatagtacc tttactactt ggataaccgt 120

ggtaattcta gagctaatac atgctaaaaa tcccgactgt ttggaaggga tgtatttatt 180

agataaaaaa tcaatgcttt tcggagctct ttgatgattc ataataactt ttcgaatcgc 240

atggccttgt gctggcgatg gttcattcaa atttctgccc tatcaacttt cgatggtagg 300

atagtggcct accatggttt caacgggtaa cggggaataa gggttcgatt ccggagaggg 360

agcctgagaa acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgcaaatt acccaatccc 420

gacacgggga ggtagtgaca ataaataacg atacagggcc ctttcgggtc ttgtaattgg 480

aatgagtaca atgtaaatac cttaacgagg aacaattgga gggcaagtct ggtgccagca 540

gccgcggtaa ttccagctcc aatagcgtat attaaagttg ttgcagttaa aaagctcgta 600

gttgaacctt gggcttggtt ggccggtccg cctttttggc gagtactgga cccaaccgag 660

cctttccttc tggctaacct ttcgcccttg tggtgtttgg cgaaccagga cttttacttt 720

gaaaaaatta gagtgttcaa agcaggcctt tgctcgaata tattagcatg gaataataga 780

ataggacgtt atggttctat tttgttggtt tctaggacca tcgtaatgat taatagggac 840

ggtcgggggc atcagtattc agttgtcaga ggtgaaattc ttggatttac tgaagactaa 900

ctactgcgaa agcatttgcc aaggacgttt tcattaatca agaacgaaag ttaggggatc 960

gaagatgatc agataccgtc gtagtcttaa ccataaacta tgccgactag ggatcgggtg 1020

ttgttctttt tttgacgcac tcggcacctt acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg 1080

ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg 1140

agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg gaaactcacc aggtccagac acaataagga 1200

ttgacagatt gagagctctt tcttgatttt gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt 1260

ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat aacgaacgag accttaacct actaaatagt 1320

gctgctagct tttgctggta tagtcacttc ttagagggac tatcgatttc aagtcgatgg 1380

aagtttgagg caataacagg tctgtgatgc ccttagacgt tctgggccgc acgcgcgcta 1440

cactgacgga gccaacgagt attaaccttg gccgagaggt ctgggaaatc ttgtgaaact 1500

ccgtcgtgct ggggatagag cattgtaatt attgctcttc aacgaggaat tcctagtaag 1560

cgcaagtcat cagcttgcgt tgattacgtc cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgcta 1620

ctaccgattg aatggcttag tgaggcctcc ggattggttt aaagaagggg gcaactccat 1680

ctggaacgtc 1690

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggactachvg ggtwtctaat 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtagtcatat gcttgtctc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccgcagctt cacctacgga 20

Claims (22)

1.一种用于茶叶发酵的法布里德巴利酵母D-1，其保藏编号为CGMCC No.16712。

2.一种微生物制剂，所述微生物制剂包含权利要求1所述的法布里德巴利酵母D-1。

3.如权利要求2所述的微生物制剂，其中，所述微生物制剂为冻干菌剂。

4.如权利要求3所述的微生物制剂，其中，所述冻干菌剂为处于干粉状的冻干菌剂。

5.制备权利要求2-4中任一项所述的微生物制剂的方法，所述方法包括如下步骤：

1)将权利要求1所述的法布里德巴利酵母D-1接种至酵母培养基中进行培养，获得所述法布里德巴利酵母D-1的培养液；

2)从步骤1)中获得的所述培养液中收集所述法布里德巴利酵母D-1的菌体；以及

3)将所述菌体与冻干保护剂混合后经真空干燥，以制成所述微生物制剂。

6.如权利要求5所述的方法，其中，在步骤1)中，将所述法布里德巴利酵母D-1在YPD液体培养基中于28-32℃，150-250rpm下培养至少12h，并且在培养过程中维持pH为6-7。

7.如权利要求6所述的方法，其中，在步骤1)中，将所述法布里德巴利酵母D-1在YPD液体培养基中于30℃，200rpm下培养至少24h，并且在培养过程中维持pH为6.5。

8.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，在步骤2)中，所述菌体的收集通过选自以下的方式进行：离心，过滤、浮选分离、分离筛、重力沉降。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述菌体的收集通过离心进行。

10.如权利要求5-7中任一项所述的方法，其中，在步骤3)中，所述菌体与所述冻干保护剂以1:3-1:5的体积比进行混合。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述冻干保护剂选自麦芽糖、海藻糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、苏氨酸、甘油，或它们的任意组合。

12.权利要求1所述的法布里德巴利酵母D-1或权利要求2-4中任一项所述的微生物制剂在制备具有抗氧化作用的茶叶中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其中，所述具有抗氧化作用的茶叶为发酵普洱茶。

14.一种制备发酵普洱茶的方法，所述方法包括将权利要求1所述的法布里德巴利酵母D-1或权利要求2-4中任一项所述的微生物制剂接种至普洱生茶，然后进行纯种发酵。

15.如权利要求14所述的方法，其中，将活菌数至少为1×10⁸CFU/mL的所述法布里德巴利酵母D-1的菌液或者由所述微生物制剂配制的活菌数至少为1×10⁸CFU/mL的菌液以5-15v/w％的比例接种至所述普洱生茶。

16.如权利要求15所述的方法，其中，将所述菌液以10v/w％的比例接种至所述普洱生茶。

17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，所述纯种发酵为在28-32℃下密封发酵。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述纯种发酵为在30℃下进行密封发酵。

19.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，所述纯种发酵进行至少20h。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述纯种发酵进行20h-60h。

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述纯种发酵进行24h-52h。

22.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，在接种之前向所述普洱生茶中加水，以使得相比所述普洱生茶和水的总量，水的含量为30wt％-40wt％。

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