ES2613306T3

ES2613306T3 - Control de enfermedades de plantas empleando una combinación de una especie de Trichoderma virens y una especie de Trichoderma harzianum competente en la rizosfera

Info

Publication number: ES2613306T3
Application number: ES09790472.6T
Authority: ES
Inventors: William Randolph Martin, Jr.; Christopher Kent Hayes
Original assignee: Bioworks Inc
Current assignee: Bioworks Inc
Priority date: 2008-07-17
Filing date: 2009-07-15
Publication date: 2017-05-23
Anticipated expiration: 2029-07-15
Also published as: EP2320742B1; WO2010009241A3; CA2729244C; MX2011000498A; CN104247718A; CA2729244A1; EP2320742A2; US9681668B2; US20100028303A1; HK1205432A1; WO2010009241A2; CN102159084B; US20150148232A1; CN102159084A

Abstract

Un método para controlar enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora, Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Thielaviopsis, y/o Sclerotium, comprendiendo dicho método: proporcionar una especie competente en la rizosfera de Trichoderma harzianum T22; proporcionar una especie de Trichoderma virens G41; y aplicar la especie de Trichoderma harzianum y la especie de Trichoderma virens a plantas en crecimiento bajo condiciones eficaces para tratar las enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora, Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, y/o Thielaviopsis.

Description

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DESCRIPCION

Control de enfermedades de plantas empleando una combinacion de una especie de Trichoderma virens y una especie de Trichoderma harzianum competente en la rizosfera

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EEUU n.° de serie 61/081.497, presentada el 17 de julio, 2008.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al control de enfermedades de plantas y la potenciacion del crecimiento vegetal empleando una combinacion de una especie de Trichoderma harzianum T22 competente en la rizosfera y una especie de Trichoderma virens G41.

Antecedentes de la invencion

Phytophthora spp. son agentes patogenos de la familia Pythiaceae que se sabe que estan implicados en diversas enfermedades de plantas. La muerte subita del roble, la podredumbre radicular de la soja, la podredumbre del pie y el cuello del manzano, la podredumbre radicular que afecta al castano americano, al rododendro, a la violeta africana o a las fresas son solo ejemplos de enfermedades provocadas por este grupo de patogenos. Generalmente, las enfermedades de plantas provocadas por Phytophthora son considerablemente diffciles de controlar y a menudo conducen a la muerte de la planta. Este patogeno esta ampliamente difundido y es un problema economico para los cultivadores en todo el mundo. Por ejemplo, Phytophthora infestans fue el agente infeccioso de la patata que provoco la Gran Hambruna en Irlanda entre 1845 y 1849. En la actualidad, en America del Norte los cultivadores aun se estan enfrentando a los estragos de este agente patogeno. Muchas de las tecnicas de gestion convencionales, tales como la seleccion de pies de injerto y la modificacion del sitio para controlar a Phytophthora spp. han resultado, en su mayor parte, poco fiables.

La podredumbre del pie y el cuello, provocada por al menos cuatro Phytophthora spp. (Jeffers et al., Phytopathology, 2:533-538 (1982)) es un problema en manzanos ampliamente difundido y muy grave desde el punto de vista economico en el noreste de EEUU. En el estado de Nueva York, esta enfermedad parece ser la causa biologica mas comun de deterioro y muerte prematuros de arboles y, en Pensilvania, muchos cultivadores han abandonado el pie de injerto MM 106, deseable desde el punto de vista hortfcola, debido a la alta incidencia de podredumbre del pie o la impresion que causa su amenaza. La podredumbre radicular y del tallo de la soja provocada por Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann (tambien denominada Phytophthora megasperma forma specialis glycinea) tambien es un problema ampliamente difundido y muy grave. Debido a que ninguna estrategia individual para controlar la podredumbre del pie de Phytophthora ha demostrado ser fiable, se ha aconsejado a los cultivadores que adopten una estrategia de gestion de la enfermedad integrada o aditiva, que utiliza una combinacion de seleccion del sitio, modificacion del sitio, seleccion de pies de injerto y tratamientos qmmicos cuando resulte apropiado.

Pythium, al igual que otros en la familia Pythiaceae, se caracteriza habitualmente por su produccion de hifas cenodticas, hifas sin septos. Se denominan habitualmente moho de agua. La enfermedad del vivero por Pythium es un problema muy habitual en campos e invernaderos, en donde el organismo mata a las plantulas recien emergidas. Esta compleja enfermedad normalmente implica a otros patogenos, tales como Phytophthora y Rhizoctonia. La marchitez por Pythium es provocada por la infeccion por zoosporas de plantas mas mas maduras, que conduce a infecciones biotroficas que se convierten en necrotroficas en respuesta a las presiones de colonizacion/reinfeccion o al estres ambiental, que conducen a una marchitez leve o grave provocada por la obstaculizacion del funcionamiento de las rafces. Vease Jarvis, W.R., "Managing Diseases in Greenhouse Crops," APS Press, St. Paul, Minn. (1992); Bagnall, R., "Control of Pythium Wilt and Root Rot of Hydroponically Grown Lettuce by Means of Chemical Treatment of the Nutrient Solution," tesis doctoral, University of Pretoria, Pretoria, Sudafrica (2007); Plaats-Niterink A.J. van der, "Monograph of the Genus Pythium," Studies in Mycology, 21:1-242 (1981); Levesque et al., "Molecular Phylogeny and Taxonomy of the Genus Pythium," Mycological Research, 108:1363-1383 (2004); Jarvis, W.R., "Managing Diseases in Greenhouse Crops," APS Press, St. Paul, Minn. (1992); Owen-Going, T.N., "Etiology and Epidemiology of Pythium Root Rot in Bell Pepper (Capsicum annuum L.) en Commercial-Scale and Small-Scale Hydroponic Systems," tesis doctoral, University of Guelph, Guelph, Ontario (2002); Owen-Going et al., "Relationships of Pythium Isolates and Sweet Pepper Plants in Single-Plant Hydroponic Units," Canadian Journal of Plant Pathology, 25:155167 (2003); Owen-Going, T.N., "Quantitative Investigations of Phenolic Compounds Associated With Root Rot of Hydroponic Pepper (Capsicum annuum L. Caused by Pythium aphanidermatum, (Edson) Fitzp., tesis doctoral University of Guelph, Guelph, Ontario (2005).

Muchas especies de Pythium, junto con sus parientes cercanos, las especies de Phytophthora, son patogenos vegetales de importancia economica en la agricultura. Pythium spp. tienden a ser muy generalistas e inespedficos en su gama de hospedantes. Infectan a una amplia gama de hospedantes, mientras que Phytophthora spp. en general son mas espedficos de hospedante. Por esta razon, Pythium spp. son mas devastadores en la podredumbre de la rafz que provocan en los cultivos, porque solo la rotacion de cultivos a menudo no erradica al patogeno (ni tampoco dejar en barbecho el terreno, puesto que Pythium spp. tambien son buenos saprofitos y sobreviven durante mucho tiempo alimentandose de la materia vegetal en descomposicion).

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Fusarium es un enorme genera de hongos filamentosos ampliamente distribuido en el suelo y en asociacion con plantas. La mayona de las especies son saprofitos inofensivos y son miembros relativamente abundantes de la comunidad microbiana del suelo. Algunas especies producen micotoxinas en cultivos de cereales que pueden afectar a la salud humana y animal si entran en la cadena alimentaria. Las principales toxinas producidas por estas especies de Fusarium son las fumonisinas y los tricotecenos. El genero incluye una serie de especies de patogenos vegetales importantes desde el punto de vista economico. Vease Priest y Campbell, "Brewing Microbiology," 3a edicion, ISBN 0-306-47288-0; Walsh et al., "Spectrum of Mycoses," en: Baron's Medical Microbiology (Baron S et al., eds.), 4a ed., Univ of Texas Medical Branch. (a traves de NCBI Bookshelf), ISBN 0-9631172-1-1 (1996); Howard, D.H., "Pathogenic Fungi in Humans and Animals," 2a ed., Marcel Dekker. (a traves de Google Books), ISBN 0-82470683-8 (2003); Van der Walta et al., "Fusarium Populations in the Household Food Gardens of a Peri-Urban Community," South African Journal of Science, 103 (2007); World Health Organization (1999-09-01), "Toxic Effects of Mycotoxins in Humans" (2007); Drug Policy Alliance, "Repeating Mistakes of the Past: Another Mycoherbicide Research Bill," (2006); Yellow rain: Thai bees' Faeces Found. Nature, PMID 6709055 (1984); Imamura et al.,. "Fusarium and Candida albicans Biofilms on Soft Contact Lenses: Model Development, Influence of Lens Type, and Susceptibility to Lens Care Solutions," Antimicrob. Agents Chemother., 52(1):171-182 (2008).

Fusarium graminearum habitualmente infecta a la cebada si se producen lluvias tardfas en la temporada. Tiene un impacto economico en las industrias de la malta y cervecera, asf como en la cebada para piensos. La contaminacion por Fusarium en la cebada puede producir fusariosis y, en contaminaciones extremas, la cebada puede tomar un color rosado. Se ha secuenciado el genoma de este patogeno del trigo y del mafz. Fusarium graminearum tambien puede provocar la podredumbre radicular y la fusariosis de la plantula. Se ha calculado que las perdidas totales en EEUU de cultivos de cebara y trigo entre 1991 y 1996 han sido de tres mil millones de dolares.

Rhizoctonia spp. se encuentran entre los patogenos vegetales mas diversos y provocan enfermedades radiculares, del tallo y foliares de muchas de nuestras plantas herbaceas y ornamentales lenosas mas importantes. Rhizoctonia spp. habitualmente atacan a las plantas en la lrnea del suelo y provocan la perdida de la rafz y la constriccion del tallo que produce estrangulamiento y muerte en las partes altas. Este patogeno puede atacar tambien a las hojas y es especialmente grave cuando las plantas se cultivan muy juntas y se mantienen humedas. Pueden perderse parcelas o lechos de cepas completos debido a Rhizoctonia en periodos muy cortos de tiempo. El patogeno es transmitido por el suelo, lo cual significa que vive en el suelo o en un medio para macetas. Provoca la enfermedad del vivero pre- y postemergencia de muchos cultivos ornamentales, tales como Vinca, Impatiens, cepas, y antirrino (Chase, A. R., "Rhizoctonia Diseases on Ornamentals," Western Connection, Turf and Ornamentals (1998)).

Thielaviopsis basicola (Berk. & Br.) Ferraris es un habitante del suelo que ataca a mas de 100 especies vegetales en 33 familias. Los miembros de las familias Fabaceae, Solanaceae, y Cucurbitaceae se ven especialmente afectados por T. basicola (Shew et al., eds., "Compendium of Tobacco Diseases,".St. Paul, MN: APS Press, pp. 28-29 (1991)). Su nombre comun, 'prodredumbre negra radicular', se basa en las clamidosporas de pigmentacion muy oscura que se forman en las celulas radiculares del hospedante y que confieren un aspecto 'ennegrecido' al apice radicular (Alexopoulos et al., "Introductory Mycology," 4a Ed., pp. 869 (1996)). El hongo de la podredumbre negra radicular es un miembro de los Hyphomycetes, orden Moniliales, familia Dematicaceae (Shew et al., Eds., "Compendium of Tobacco Diseases,".St. Paul, MN: APS Press, pp. 28-29 (1991)). Los srntomas generales son la podredumbre de las raraes y la muerte regresiva de las ramas. Thielaviopsis basicola puede encontrarse en todas las regiones del mundo, en especial en regiones de clima fresco. La podredumbre negra radicular puede afectar a una amplia gama de plantas lenosas y herbaceas, que incluyen el tabaco, acebo, begonia, geranio, poinsettia, y pensamiento (Agrios, G.N., "Plant Pathology," 4a ed., p. 358 (1997); Alexopoulos et al., "Introductory Mycology," 4a ed., pp. 869 (1996); Daughtrey et al., "Compendium of Flowering Potted Plants," pp. 90 (1995); Lambe et al., "Diseases of Woody Ornamental Plants and Their Control in Nurseries," pp. 130 (1986); Shew et al., eds., "Compendium of Tobacco Diseases," pp. 28-29 (1991)).

Sclerotium rolfsii, un patogeno fungico omrnvoro transmitido por el suelo, provoca enfermedades en una amplia gama de cultivos agncolas y hortraolas. Aunque no se ha publicado una compilacion a nivel mundial de generos de hospedantes, se han indicado mas de 270 generos hospedantes solo en EEUU. Los hospedantes agncolas susceptibles incluyen la batata (Ipomea batatas), calabaza (Cucurbita pepo L.), mafz (Zea mays), trigo (Triticum vulgare) y cacahuete (Arachis hypogea). Los cultivos hortraolas afectados por el hongo se incluyen en los generos Narcissus, Iris, Lilium, Zinnia, y Chrysanthemum. Vease Aycock, R., "Stem Rot and Other Diseases Caused by Sclerotium rolfsii," N.C. Agr. Expt. St. Tech. Bul., n°. 174 (1966); Garren, K.H., "The Stem Rot of Peanuts and its Control," Virginia Agr. Exp. Sta. Bull., 144 (1959); Paolo, M.A., "A Sclerotium Seed Rot and Seedling Stem Rot of Mango," Philippine Journal of Science, 52:237-261 (1933); Punja, Z.K., "The Biology, Ecology, and Control of Sclerotium rolfsii," Annual Review of Phytopathology, 23:97-127 (1985); Takahashi, T., "A Sclerotium Disease of Larkspur," Phytopathology, 17:239-245 (1927); Townsend et al., "The Development of Sclerotia of Certain Fungi," Ann. Bot., 21:153-166 (1954); Weber, G.F., "Blight of Carrots Caused by Sclerotium rolfsii, With Geographic Distribution and Host Range of the Fungus," Phytopathology, 21:1129-1140 (1931); Zitter et al., "Compendium of Cucurbit Diseases," Amer. Phytopath. Soc., St. Paul, Minnesota (1966).

Aunque se cree que S. rolfsii ha provocado importantes perdidas en cultivos a lo largo de muchos siglos, el primer informe inconfundible del hogo se remonta a 1892 con el descubrimiento del organismo realizado por Peter Henry Rolfs en asociacion con la fusariosis del tomate en Florida. Desde el informe de Rolfs a finales del siglo XIX, mas de

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2.000 publicaciones sobre el patogeno apoyan las pruebas de su distribucion mundial, en particular en regiones tropicales y subtropicales.

La amplia gama de hospedantes, el crecimiento proKfico y la capacidad para producir esclerocio contribuyen a las perdidas economicas mas grandes asociadas con el patogeno. Desde una perspectiva global, y desde la perspectiva local de Carolina del Norte, los cultivos de cacahuete soportan las mayores perdidas frente a cualquier otro cultivo agncola. En 1959, el Departamento de Agricultura de EeUU ha calculado unas perdidas desde diez millones a veinte millones de dolares asociadas con S. rolfsii en la region meridional cultivadora de cacahuetes, con unas mermas en el rendimiento que vanan de 1-60% en terrenos en la region de los llanos costeros de Carolina del Norte.

Existen pruebas correlativas de que ciertos Trichoderma spp. pueden estar implicados en el control biologico de varias enfermedades provocadas por Phytophthora spp., por ejemplo, T. viride frente a la podredumbre del corazon de la pina provocada por P. parasitica (Papazivas, Ann. Rev. Phytopathol., 23:23-54 (1985)). Unas pruebas correlativas mas convincentes son suministradas por la capacidad bien documentada de la corteza de maderas duras compostada (CHB) para proporcionar un control de la enfermedad de Phytophthora en plantas lenosas cuando se incorporan en su rizosfera (Hoitink et al., Ann. Rev. Phytopathol., 24:93-114 (1986)), que incluye el control de la podredumbre del pie del manzano bajo condiciones de campo (Ellis et al., Plant Dis., 70:24-26 (1986)), y la documentacion relacionada, ya que la adicion de CHB a un recipiente de mezcla para macetas produjo un aumento de 100 a 100.000 veces en los niveles poblacionales de T. harzianum en este medio de enraizado (Nelson et al., Phytopathology, 3:1457-1462 (1983)).

El control biologico (biocontrol) de patogenos vegetales se esta convirtiendo en un componente fundamental para la gestion de enfermedades de plantas. La dependencia excesiva de plaguicidas qmmicos, los sistemas agncolas no sostenibles, la mala seleccion del sitio y los recursos limitados son ejemplos de los problemas agncolas a los que se enfrentan los cultivadores. El biocontrol ofrece una alternativa a estos problemas recurrentes/persistentes en la agricultura. Por tanto, se esta poniendo mucho enfasis en la aplicacion de estas tecnicas en la agricultura.

Se sabe que muchos hongos y otros microorganismos controlan diversos patogenos vegetales. Estos agentes de biocontrol son particularmente atractivos, porque pueden ser capaces de proteger y colonizar porciones de la planta que son particularmente inaccesibles a los tratamientos agncolas convencionales (Harman et al., Seed Sci. and Technol., 11:893-906 (1983)). Trichoderma spp, un genero de hongo filamentoso, ha demostrado proporcionar niveles variables de control biologico frente a patogenos vegetales transmitidos por el suelo. Se sabe que cinco especies de Trichoderma son las mas importantes para el biocontrol. Son T. hamatum, T. harzianum, T. konigii, T. polysporum, y T. viride. Se atribuyen rasgos deseables y fundamentales para la capacidad de biocontrol a cepas espedficas y no a la especie. Por ejemplo, se han implicado a cepas de T. harzianum en el tratamiento del pepino. Aunque se han producido muchos avances en el uso de Trichoderma como agente de biocontrol, no fue hasta 1992 que este hongo se indico en el tratamiento de enfermedades provocadas por Phytophthora spp. transmitido por el suelo (Papavizas, Ann. Rev. Phytopathol., 23:23-54 (1985)). Se han empleado tres cepas de Gliocladium virens (031, 035, y 041), ahora denominado Trichoderma virens, como agentes biologicos (patente de EEUU n.° 5.165.928 de Smith et al.) para controlar enfermedades de plantas suscitadas por Phytophthora spp, tales como la podredumbre radicular y la podredumbre del pie y el cuello (Jeffers et al., Phytopathology, 2:533-538 (1982)). Sin embargo, esta invencion se limita al tratamiento de enfermedades de plantas provocadas por Phytophthora sojae. Ademas, existe la cepa GL-21, que se describe en la patente de EEUU 5.068.105 de Lewis et al. y comercializada como SoilGard™.

Se han empleado combinaciones de diferentes agentes de biocontrol para controlar enfermedades. Por ejemplo, Lewis et al., "A Formulation of Trichoderma and Gliocladium to Reduce Damping-off Caused by Rhizoctonia solani and Saprophytic Growth of the Pathogen in Soiless Mix," Plant Disease, 82:501-06 (1998) emplean una formulacion de Gliocladium virens TRI-4 y Trichoderma hamatum GL-3, GL-21, o GL-32 para el biocontrol. Una formulacion con una base de talco denominada NUTRI-LIFE TRICHOSHIELD™ ha sido comercializada por Nutri-Tech Solutions Pty Ltd. como estimulante del crecimiento radicular en plantas. Esta formulacion contiene una mezcla de especies fungicas beneficiosas, que incluyen Trichoderma harzianum, Trichoderma lignorum, y Gliocladium virens (ahora Trichoderma virens), junto con Bacillus subtilis, que proporciona bioequilibrio. Papavizas, et al., "Effect of Gliocladium and Trichoderma on Damping-off and Blight of Snapbean Caused by Sclerotium rolfsii in the Greenhouse," Plant Pathology, 38: 277-86 (1989) describen el uso de 285 cepas de tipo salvaje y mutantes de Gliocladium virens, Trichoderma hamatum, Trichoderma harzianum, y Trichoderma viride contra Scelerotium rolfisii en invernaderos. Diez cepas de Gliocladium virens y cuatro cepas de Trichoderma harzianum suprimieron la enfermedad del vivero de la judfa verde en 30-50% y la fusariosis en 36-74%. Las cepas individuales fueron tan o mas eficaces que las mezclas de cepas. Por ejemplo, la mezcla de Gl-3 y Th-84 a 3 x 105 conidios por g de suelo para cada cepa fue menos eficaz que Gl-3 o Th-84 empleadas por sf solas, y la mezcla triple fue la menos eficaz. Estos resultados sugieren a los expertos en la tecnica que Trichoderma harzianum y Gliocladium virens deben utilizarse por separado para tratar plantas, en lugar de hacerlo en combinacion. En cualquier caso, ninguna de las combinaciones descritas anteriormente de agentes de biocontrol implica la utilizacion de una especie de Trichoderma harzianum competente en la rizosfera.

La presente invencion se dirige a solucionar estas y otras deficiencias en la tecnica.

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Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para controlar enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora, Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, y/o Thielaviopsis. El metodo incluye proporcionar una especie de Trichoderma harzianum T22 competente en la rizosfera y proporcionar una especie de Trichoderma virens G41. La especie de Trichoderma harzianum y la especie de T. virens se aplican a las plantas bajo condiciones eficaces para tratar enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora, Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, y/o Thielaviopsis.

Debido a los multiples defectos observados con agentes de biocontrol individuales o espedficos, es muy necesario un agente variado capaz de tratar diversas Phytophthora spp. Esto no solo aumentara la productividad de las plantas diana, sino que tambien disminuira potencialmente el coste de tener que comprar multiples agentes de biocontrol.

La combinacion de T. harzianum T22 competente en la rizosfera y T. virens G41 evita que las plantas enfermen y tiene una mejor actuacion que cualquiera de los organismos por sf solos; se produce un efecto potenciado en la proteccion frente a enfermedades cuando los dos son combinados. Ademas, la combinacion tiene una actuacion tan buena como los fungicidas qmmicos. En particular, las plantas tratadas con esta combinacion no mostraron smtomas o mostraron smtomas menos graves de infeccion por patogenos y tienen una mayor masa radicular, crecen mas altas, y son mas comercializables que las plantas tratadas con cualquiera de los agentes biologicos por sf solos. Las plantas enfermas generalmente muestran multiples smtomas, en general asociados con la falta de crecimiento radicular y, en ultimo termino, la muerte de las rames.

Los cultivadores y los consumidores estan interesados en reducir el uso de plaguicidas qmmicos en cultivos agncolas y buscan materiales alternativos para la gestion de plagas. Pueden emplearse materiales de control biologico eficaces que tengan un bajo impacto sobre el entorno y organismos no diana como alternativas a los plaguicidas qmmicos tradicionales o en un programa junto con los plaguicidas qmmicos tradicionales. La presente invencion proporciona un control de amplio espectro de multiples enfermedades en cultivos agronomicos y es una alternativa segura a los plaguicidas qmmicos.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 es una grafica de la poblacion de T22 frente a G41 en la rizosfera del mafz.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para controlar enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora, Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium y/o Thielaviopsis. El metodo incluye proporcionar una especie de Trichoderma harzianum T22 competente en la rizosfera (ATCC n°. de registro 20847) y proporcionar una especie de Trichoderma virens G41, anteriormente conocida como Gliocladium virens (ATCC n.° de registro 20906). La especie de Trichoderma harzianum y la especie de T. virens se aplican a las plantas bajo condiciones eficaces para tratar enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora, Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, y/o Thielaviopsis.

T22 se analiza a fondo en la patente de EEUU n.° 5.260.213 de Harman et al. G41 se analiza a fondo en la patente de EEUU n.° 5.165.928 de Smith et al..

La rizosfera es la estrecha region de suelo que se ve directamente influida por las secreciones radiculares y los microorganismo del suelo asociados. Esta plagada de bacterias que se alimentan de celulas vegetales desprendidas, denominadas rizodeposito, y de las protemas y azucares liberados por las rafces. Los protozoos y los nematodos que se alimentan de las bacterias tambien se concentran cerca de las rames. Asf, gran parte del ciclo de los nutrientes y de la represion de enfermedades, necesarios para la planta, se produce en el lugar inmediatamente adyacente a las rames. El rizoplano es la superficie externa de las rames y de las partmulas de suelo y los desechos adheridos a ellas. La "competencia en la rizosfera" es una medida de la capacidad de un microorganismo para colonizar la rizosfera.

Los organismos competentes en la rizosfera tienen la capacidad fisiologica y genetica de proliferar a lo largo de la rafz a medida que esta se desarrolla. Esta capacidad es distintivamente diferente de los organismos capaces de colonizar solo puntos espedficos a lo largo de la rafz (Harman, J. Plant Nutr., 15:835-843 (1992)). Trichoderma spp. son uno de los pocos agentes de biocontrol en los que se ha demostrado competencia en la rizosfera. De hecho, la mayona de las cepas de Trichoderma no son competentes en la rizosfera (Bailey et al., Trichoderma and Gliocladium, pp. 185-204 (1998)). Una caractenstica importante de T. harzianum cepa T22 es su competencia en la rizosfera (Sivan et al., "Improved Rhizosphere Competence in a Protoplast Fusion Progeny of Trichoderma harzianum," J. Gen. Microbiol., 137:23-29 (1991)).

La presente invencion puede incluir un vehmulo. Los vehmulos adecuados incluyen agua, disolucion acuosa, suspensiones, granulos o polvos.

Otros aditivos adecuados para su inclusion en las composiciones son fertilizantes, insecticidas, fungicidas,

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nematicidas o sus mezclas.

Las enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora que pueden ser tratadas segun la presente invencion pueden surgir de una infeccion por Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drecshsleri, Phytophthora infestans y/o Phytophthora nicotianae.

Las enfermedades de plantas mediadas por especies de Pythium pueden surgir de una infeccion por Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, y/o Pythium ultimum.

Las enfermedades de plantas mediadas por especies de Rhizoctonia pueden surgir de una infeccion por Rhizoctonia solani.

Las enfermedades de plantas mediadas por especies de Thielaviopsis pueden surgir de una infeccion por Thielaviopsis basicola.

Las enfermedades de plantas mediadas por especies de Fusarium pueden surgir de una infeccion por especies de Fusarium oxysporum y subespecies relacionadas.

Las enfermedades de plantas que surgen de especies de Sclerotium pueden ser mediadas por Sclerotium rolfsii.

Las plantas tratadas segun la presente invencion incluyen cultivos en hilera agronomicos u otros cultivos de campo: trigo sarraceno, judfas (soja, verdes, secas), mafz (grano, semilla, mafz dulce, de ensilaje, para palomitas de mafz, con alto contenido en aceite), algodon, canola, guisantes (secos, suculentos), cacahuetes, cartamo, girasol, heno de alfalfa, cultivos forrajeros (alfalfa, trebol, arvejas y trifoliadas), bayas y frutos pequenos (moras, arandanos, grosellas, bayas de sauco, grosella espinosa, bayas de mirto, frambuesa norteamericana, frambuesas, fresas y uvas), cultivos de bulbos (ajos, puerros, cebollas, chalotas y bulbos ornamentales), frutas cftricas (hforidos de cftricos, toronjas, kumquat, limas, naranjas y pomelos), verduras cucurbitaceas (pepinos, melones, calabazas y calabacines), flores, plantas de semillero, plantas ornamentales, verduras de fruto (berenjena, pimientos dulces y picantes, tomatillos, y tomates), hierbas, especias, mentas, cultivos hidroponicos (pepinos, tomates, lechugas, hierbas y especias), verduras de hoja y cultivos de coles (rucula, apios, perifollo, endivia, hinojo, lechuga (cogollo y hoja), perejil, achicoria roja, ruibarbo, espinaca, acelga, brecol, coles de Bruselas, repollo, coliflor, berzas, col kale, kohlrabi, y mostaza de hoja), esparragos, legumbres y cultivos de campo (judfas verdes y secas, lentejas, guisantes suculentos y secos, y cacahuetes), frutas de pomo (peras y membrillos), cultivos de rafces (remolachas, remolacha azucarera, zanahorias, apio-nabo, achicoria, rabano picante, chirivfa, rutabaga, salsifi y nabos), arboles de hoja caduca (arce y roble), pinos, granos pequenos (centeno, trigo, sorgo, mijo), frutos con hueso (albaricoques, cerezas, nectarinas, melocotones, ciruelas y ciruelas pasas), nueces (almendras, hayuco, nueces de Brasil, semillas de calabaza, anacardo, castanas, avellanas, nuez del nogal americano, nueces de macadamia, pecanes, pistachos y nueces), cultivos de tuberculos (patatas, batatas, names, alcachofa, mandioca y jengibre), y cespedes (grama, campos de deporte, parques, campos de golf establecidos y en preparacion, pistas, calles y zonas de matorrales, produccion de semillas y produccion de cespedes).

Para controlar los patogenos diana, las plantas deben cultivarse dentro del area eficaz del agente de biocontrol. Las semillas pueden plantarse en tierra mezclado con agentes de biocontrol. Varios otros metodos de introduccion del agente de biocontrol en la planta senan igualmente eficaces. Por ejemplo, el agente de biocontrol puede fermentarse, formularse o envasarse. Despues, el agente de biocontrol puede aplicarse a la semilla de la planta por medio de una formulacion seca o humeda y la aplicacion a la semilla. Como alternativa, el agente de biocontrol puede producirse en una formulacion dentro de surco, en humedo o en seco, que puede aplicarse a la tierra en la que va a crecer la planta. El agente de biocontrol incluso puede aplicarse como un pulverizado, previsto para utilizar dentro de surco durante la plantacion o a la superficie del suelo despues de la plantacion. El agente tambien puede aplicarse como una pocion a plantas en maceta y puede incorporarse en el medio de crecimiento. Lo que se requiere es que el agente de biocontrol se coloque, por algun medio, en el entorno del suelo adyacente a la planta en crecimiento. Un "patogeno diana" es el patogeno o patogenos, conocidos o desconocidos, que amenazan a la planta de cultivo.

Una especie de Trichoderma harzianum competente en la rizosfera y una especie de Trichoderma virens tambien pueden ser adecuadas en un metodo para potenciar el crecimiento de la planta. La especie de Trichoderma harzianum competente en la rizosfera y la especie de Trichoderma virens se aplican a las plantas bajo condiciones eficaces para potenciar el crecimiento de la planta.

Este metodo se realiza sustancialmente con los mismos materiales y procedimientos descritos anteriormente con referencia al metodo de controlar enfermedades. Se dirige a afectar a cualquier forma de estimulacion o potenciacion del crecimiento de la planta. Esto puede producirse tan pronto comienza el crecimiento de la planta desde la semilla o mas tarde en la vida de una planta. Por ejemplo, el crecimiento de la planta incluye un mayor rendimiento, una mayor cantidad de semillas producidas, un mayor porcentaje de semillas germinadas, un mayor tamano de la planta, mayor biomasa, mas frutas y mas grandes, coloracion mas temprana de la fruta y maduracion mas temprana de la fruta y la planta. Como resultado, proporciona significativos beneficios economicos a los cultivadores. Por ejemplo, una germinacion temprana y una maduracion temprana permiten cultivar en areas en las

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que una corta temporada de cultivo impedina su cultivo en esa localizacion. Un mayor porcentaje de germinacion de las semillas produce unos mejores puestos de cultivo y un uso mas eficaz de las semillas. Un mayor rendimiento, un tamano mayor y una mayor produccion de biomasa permiten una mayor generacion de ingresos de una parcela de tierra concreta. Asf, es evidente que la presente invencion constituye un avance significativo en la eficacia agncola.

Ejemplos

Los ejemplos que aparecen a continuacion se ofrecen con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invencion descrita en la presente. Se ofrecen estos ejemplos para demostrar la sinergia observada cuando se emplea Trichoderma harzianum T22 competente en la rizosfera junto con Trichoderma virens G41. Esta sinergia se manifiesta como un notable aumento en el control de enfermedades de plantas provocadas por una amplia diversidad de patogenos. Por ultimo, se ofrece un ejemplo para demostrar la importancia de la competencia en la rizosfera en la interaccion y la forma en que afecta la sinergia entre las cepas de Trichoderma.

Las cepas microbianas se mantuvieron como sigue:

• T22: se mantuvo en gel de sflice en la nevera del laboratorio y se cultivo en placas de PDA segun fuera necesario. Se utilizaron las placas para inocular un medio de crecimiento y este se dejo en incubacion durante un periodo de 2 semanas. Las esporas se recolectaron por medio de un tamiz despues de la incubacion y se emplearon para formular un polvo humectable.

• G41: se mantuvo en gel de sflice en la nevera del laboratorio y se cultivo en placas de PDA segun fuera necesario. Se utilizaron las placas para inocular arroz esteril y este se dejo en incubacion durante un periodo de 2 semanas. Las esporas se recolectaron por medio de un tamiz despues de la incubacion y se emplearon para formular un polvo humectable.

• G21: se aislo a partir de un producto disponible en el mercado y se cultivo en placas de PDA segun fuera necesario. Se utilizaron las placas para inocular arroz esteril y este se dejo en incubacion durante un periodo de 2 semanas. Las esporas se recolectaron por medio de un tamiz despues de la incubacion y se emplearon para formular un polvo humectable.

• T12: se mantuvo en gel de sflice en la nevera del laboratorio y se cultivo en placas de PDA segun fuera necesario. Se utilizaron las placas para inocular arroz esteril y este se dejo en incubacion durante un periodo de 2 semanas. Las esporas se recolectaron por medio de un tamiz despues de la incubacion y se emplearon para formular un polvo humectable.

• Patogenos vegetales: se mantuvieron en placas de agar de PDA a 30°C.

Las esporas de Trichoderma se formularon con un vehfculo humectable que contema al menos 107 unidades formadoras de colonias por gramo. Las plantas se trataron con el material formulado en agua a una concentracion de 113 o 226 g/379 l (4 u 8 oz/100 gal).

Ejemplo 1 - Tratamiento de boj infectado por P. cinnamomi

Este ejemplo ilustra la eficacia y sinergia de una composicion segun la presente invencion para controlar a Phytophthora cinnamomi en plantas de boj.

Se sometieron bojes, Buxus microphylla asiaticum, var. 'Winter Gem' a los tratamientos de empapado de suelo indicados en la tabla 1. Excepto por los controles no inoculados, cada planta se trato con un inoculo de P. cinnamomi para inducir la enfermedad. Las plantas de boj se obtuvieron de un vivero local y se colocaron en una maceta con un diametro de 15,24 cm (6 pulgadas) que contema medio para macetas de corteza de pino:turba (3:1 en volumen:volumen). El medio se enmendo con 6,35 kg (14 libras) de fertilizante 17-7-12 Osmocote por yarda cubica (0,76 metros cubicos) de mezcla.

El inoculo de P. cinnamomi se cultivo sobre granos de arroz esterilizados durante 14 dfas a 24-26 °C antes de la inoculacion. Para tratar las plantas con el inoculo del patogeno, se perforaron cuatro orificios a una distancia equidistante alrededor de la bola de la rafz y se insertaron cuatro granos de arroz colonizado en cada orificio. Cada uno de los materiales de ensayo se aplico en la tasa especificada a la superficie del suelo empleando un pulverizador de mano de 1,18 litros (2,5 pintas). El patron qmmico, mefenoxamo (Subdue®), se aplico a la superficie del suelo 24 horas despues de que las rafces de la planta fueran inoculadas con el inoculo de P. cinnamomi. Se aplicaron T22 y G41 a la superficie del 72 horas antes de la inoculacion de las rafces con P. cinnamomi.

Se determino una puntuacion de comercializacion para cada planta en el dfa uno despues de la inoculacion (DAI) con P. cinnamomi, 22 dfas DAI, y 54 dfas DAI. Empleando la siguiente escala, cada planta fue puntuada por tres investigadores y se determino el valor promedio para cada planta:

1: Plantas muertas

2: Poco vendible (clorosis grave y poco crecimiento en la parte superior)

3: Moderadamente vendible (ligera clorosis y/o atrofia; crecimiento de la planta entre 2 y 4)

4: Vendible (pocas hojas individuales con clorosis, follaje verde; crecimiento de la planta entre 3 y 5)

5: Salud excelente, vendible (sin clorosis; optimo crecimiento en la parte superior)

En 1,22, y 54 DAI, se midio la altura de la planta desde el pie hasta el punto mas alto de la planta. Se determino el 5 peso seco de las rafces y el peso fresco de los brotes en 22 y 54 DAI.

En 22 DAI, se retiro un subconjunto de plantas de cada tratamiento y se examino. Las plantas se retiraron de las macetas y el exceso de tierra se cepillo cuidadosamente de las rafces. Las partes aereas (brotes) se cortaron de las partes subterraneas y se secaron en una estufa. Se registro el peso seco de las rafces y el peso fresco de los brotes. En 54 DAI, el experimento termino; el resto de las plantas se trato como se indico anteriormente para 10 determinar el peso seco de las rafces y los brotes. Los datos se sometieron a un analisis de la varianza, y los medios de tratamiento se separaron mediante un ensayo de Student-Newman-Keuls a P = 0,05.

Tabla 1

Tratamiento: Tasa

1. Control no inoculado: —

2. Control inoculado: —

3. T22 (Trichoderma harzianum): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

4. G41 (Trichoderma virens): 226 gr/379 l (8 oz/100 gal)

5. T22 + G41: 113 gr + 226 gr/379 l (4 oz + 8 oz/100 gal)

6. Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal)

Los resultados de comercializacion se indican en la tabla 2, que demuestra que las plantas tratadas con los agentes de biocontrol combinados T22 y G41 resultaron protegidas frente a los smtomas de enfermedad en desarrollo, en 15 particular comparadas con las plantas tratadas con un unico organismo por separado.

Tabla 2

Tratamiento Tasa: Comercializacion: escala de 1 (muerta) - 5 (excelente) 5/26 6/21 7/10

Control no inoculado: -- 5 a 4,3 a 4,7 a

Control inoculado: -- 5 a 2,1 d 2,0 d

T22: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 5 a 3,6 bc 3,6 bc

G41: 226 gr/379 l (8 oz/100 gal) 5 a 3,4 c 3,4 c

T22 + G41: 113 gr + 226 gr/379 l (4 oz + 8 oz/100 gal) 5 a 4,4 a 4,5 a

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 5 a 4,4 a 4,7 a

LSD (P = 0,05) Desviacion estandar CV: 0,0 0,51 0,54 0,0 0,57 0,60 0,0 15,18 15,34

Los valores promedio seguidos de diferentes letras son significativamente diferentes (P = 0,05, Student-Newman- Keuls). Cada valor es un promedio de 10 duplicados.

Los resultados de la altura de las plantas se muestran en la tabla 3, siendo los bojes sometidos a un tratamiento combinado de T22 y G41 sustancialmente mas altos que las otras plantas inoculadas, en particular comparadas con las plantas en las que se emplearon estos agentes por separado.

Tabla 3

Tratamiento: Tasa Altura (cm) 5/26 6/21 7/10

Control no inoculado: -- 12,8 a 36,4 ab 38,0 a

Control inoculado: -- 13,0 a 26,6 b 22,5 c

T22: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 13,0 a 23,3 c 30,41 b

G41: 226 gr/379 l (8 oz/100 gal) 13,7 a 31,9 b 32,61 b

T22 + G41: 113 gr + 226 gr/379 l (4 oz + 8 oz/100 gal) 13,4 a 36,2 ab 41,6 a

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 13,8 a 39,7 a 39,8 a

LSD (P = 0,05): 1,97 2,74 2,19

Desviacion estandar: 2,20 3,05 2,46

CV: 16,1 27,5 c

Los valores promedio seguidos de diferentes letras son significativamente diferentes (P = 0,05, Student- Newman-Keuls). Cada valor es un promedio de 10 duplicados.

Tal como se indica en la tabla 4, los pesos de las rafces y los brotes de los bojes mejoraron significativamente cuando se trataron con la combinacion de T22 y G41, en particular comparado con las plantas en las que se emplearon estos agentes por separado.

5 Tabla 4

Tratamiento: Tasa Peso fresco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g) 6/21 7/10 6/21 7/10

Control no inoculado: -- 71,6 a 99,5 a 13,5 a 31,8 a

Control inoculado: -- 29,7 b 35,3 d 2,4 c 9,1 d

T22: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 39,1 b 69,8 c 8,1 b 14,3 c

G41: 226 gr/379 l (8 oz/100 gal) 34,7 b 75,5 bc 9,3 b 15,5 c

T22 + G41: 113 gr + 226 gr/379 l (4 oz + 8 oz/100 gal) 84,0 a 93,9 ab 13,6 a 29,4 a

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 86,2 a 108,3 a 16,7 a 30,1 a

LSD (P = 0,05) Desviacion estandar CV: 12,4 16,5 2,7 3,6 9,6 12,7 2,2 2,8 17,8 15,5 19,8 12,8

Los valores promedio seguidos de diferentes letras son significativamente diferentes (P = 0,05, Student-Newman- Keuls). Para cada fecha de evaluacion, cada valor es un promedio de 5 duplicados.

Ejemplo 2 - Tratamiento de boj expuesto a Phytophthora cinnamomi

Los bojes se sometieron a los tratamientos de pulverizacion indicados en la tabla 5. Excepto por los controles no 10 inoculados, cada planta se trato con un inoculo de P. cinnamomi para inducir la enfermedad. La metodologfa de este ensayo es identica a la descrita en el ejemplo 1.

Tabla 5

Tratamiento: Tasa

1. Control no inoculado: —

2. Control inoculado: —

3. G41 (Trichoderma virens): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

4. G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal)

5. Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal)

Los resultados de comercializacion se indican en la tabla 6. El tratamiento combinado de T22 y G41 evita que las plantas desarrollen los smtomas de la enfermedad y la comercializacion siguio siendo alta a lo largo del tiempo, en particular cuando se compara con estos tratamientos administrados por separado.

5 Tabla 6

Tratamiento: Tasa Comercializacion: escala de 1 (muerta) - 5 (excelente) 11/21/04 12/12/04 01/13/05

Control no inoculado: -- 5,0 a 4,8 a 4,9 a

Control inoculado: -- 5,0 a 2,3 d 1,8 e

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 5,0 a 3,2 c 3,0 d

G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 5,0 a 4,5 a 4,5 ab

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 5,0 a 4,6 a 4,7 ab

LSD (P = 0,05) Desviacion estandar CV: 0,0 0,46 0,56 0,0 0,52 0,63 0,0 12,94 16,24

Los resultados de la altura de la plantas se muestran en la tabla 7. Los bojes que se sometieron al tratamiento combinado de T22 y G41 fueron sustancialmente mas altos que las otras plantas, en particular comparados con las plantas en las que se emplearon estos agentes por separado. grandal

Tabla 7

Tratamiento: Tasa Altura (cm) 11/21/04 12/12/04 01/13/05

Control no inoculado: -- 12,9 ab 37,4a 40,5 a

Control inoculado: -- 14,5 a 28,2 d 23,9 e

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 12,9 ab 30,1 cd 29,5 d

G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 11,6 b 34,2 ab 37,7 ab

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 13,3 ab 34,6 ab 36,7 ab

LSD (P = 0,05) Desviacion estandar CV: 1,39 3,61 3,26 I, 56 4,03 3,64 II, 7 12,2 10,7

Los valores promedio seguidos de diferentes letras son significativamente diferentes (P = 0,05, Student- Newman-Keuls). Cada valor es un promedio de 10 duplicados.

10 Tal como se indica en la tabla 8, los pesos de las rafces y los brotes de los bojes mejoraron significativamente

cuando se trataron con la combinacion de T22 y G41. Las plantas tratadas solo con G41 presentaban unos pesos de las rafces y de los brotes significativamente menores.

Tabla 8

Tratamiento: Tasa Peso fresco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g) 12/12 1/13 12/12 1/13

Control no inoculado: -- 65,8 a 87,2 a 78,9 a 104,2 a

Control inoculado: -- 30,9 c 33,7 c 28,7 d 28,1 d

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 34,4 c 39,6 c 26,4 d 33,5 cd

G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 59,8 ab 76,5 a 70,7ab 91,1 ab

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 64,8 a 81,6 a 76,4 a 96,0 ab

LSD (P = 0,05) Desviacion estandar CV: 13,6 14,6 13,1 15,3 10,5 11,3 10,1 11,8 20,9 17,4 17,3 16,4

Ejemplo 3 - Tratamiento de azaleas expuestas a Phytophthora nicotianae

5 Este ejemplo ilustra la eficacia y sinergia de una composicion segun la presente invencion para controlar a Phytophthora nicotianae en plantas de azalea.

Plantas de azalea, Rhododendron obtusum, var. 'Pink Happy Days' se sometieron a los tratamientos de pulverizacion indicados en la tabla 9. Excepto por los controles no inoculados, cada planta se trato con un inoculo de P. nicotianae para inducir la enfermedad. La metodologfa de este ensayo es identica a la descrita en el ejemplo 1.

10 Tabla 9

Tratamiento: Tasa

1. Control no inoculado: —

2. Control inoculado: —

3. G41 (Trichoderma virens): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

4. G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal)

5. Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal)

Los resultados de comercializacion se indican en la tabla 10. La comercializacion se mantuvo a lo largo del desarrollo del experimento en las plantas tratadas con la combinacion de los agentes de biocontrol T22 y G41; la proteccion frente a los smtomas de la enfermedad fue identica a la del patron qmmico.

Tabla 10

Tratamiento: Tasa Comercializacion: escala de 1 (muerta) - 5 (excelente) 11/25/04 12/17/04 1/6/05

Control no inoculado: -- 5 a 4,9 a 4,8 a

Control inoculado: -- 5 a 2,6 c 1,7 d

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 5 a 3,0 c 2,6 c

G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 5 a 4,4 ab 4,2 ab

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 5 a 4,4 ab 4,4 ab

LSD (P = 0,05) Desviacion estandar CV: 0,0 0,63 0,60 0,0 0 0,70 0,67 0,0 17,7 18,1

Los resultados de las evaluaciones de la altura se indican en la tabla 11. Las plantas tratadas con la combinacion de T22 y G41 fueron significativamente mas altas que las plantas tratadas solo con G41, e iguales en altura que las plantas tratadas con el patron qmmico.

Tabla 11

Tratamiento: Tasa Altura (cm) 11/25/04 12/17/04 1/6/05

Control no inoculado: -- 13,8 a 29,4 a 38,7 a

Control inoculado: -- 14,1 a 13,5 e 11,5 c

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 14,2 a 20,5 d 25,8 d

G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 11,7 a 24,1 bcd 32,9 bc

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 13,7 a 27,5 ab 35,5 ab

LSD (P = 0,05) Desviacion estandar CV: 1,18 2,89 4,07 1,32 3,23 4,55 9,61 13,7 15,2

5 Los resultados del peso fresco de los brotes y del peso seco de las rafces se indican en la tabla 12. Los pesos de las rafces y los brotes fueron significativamente mayores en plantas tratadas con la combinacion de G41 y T22, que en las plantas tratadas solo con G41.

Tabla 12

Control no inoculado: -- 52,8 a 78,2 a 45,5 a 60,7 a

Control inoculado: -- 21,9 d 23,5 f 21,3 d 12,1 e

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 33,8 c 41,2 e 25,2 cd 33,1 d

G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 45,2 ab 54,2 d 31,3 bc 44,8 c

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 49,0 ab 70,3 ab 44,2 a 55,5 ab

LSD (P = 0,05) Desviacion estandar CV: 6,9 8,62 6,31 7,73 5,34 6,67 4,88 5,99 12,7 12,6 14,6 14,0

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Ejemplo 4 - Tratamiento de tomates expuestos a Fusarium oxysporum

Este ejemplo ilustra la eficacia y sinergia de una composicion segun la presente invencion para controlar a Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici en plantas de tomate.

Plantulas de tomate, Lycopersicon esculentum, var esculentum 'Beefsteak', se sometieron a los tratamientos de empapado de suelo indicados en la tabla 13. Excepto por los controles no inoculados, cada planta se trato con un inoculo del patogeno F. oxysporum f. sp. lycopersici para inducir la enfermedad.

Los tomates comenzaron en parcelas de 128 celulas a partir de semillas en un medio de crecimiento con una base de turba generalista. Las plantas se regaron con una disolucion de 100 ppm de 20-20-20 alimento para plantas hidrosoluble (Jack's Classic). A los 4-5 dfas despues de plantar, las plantulas se empaparon con los materiales biologicos mezclados en agua. Las plantulas que no recibieron tratamiento en este momento fueron tratadas solo con la formulacion en blanco (sin Trichoderma).

Se cultivo un inoculo de F. oxysporum sobre granos de arroz esterilizados durante 7 dfas a 24-26 °C. El arroz se mezclo de modo uniforme con el medio de crecimiento a una tasa de 5% (en peso:peso). Se trasplantaron plantulas de tomate de siete dfas a macetas de 10 cm (4 pulgadas) que conteman el inoculo del patogeno sobre arroz. Se trasplanto un conjunto de plantulas control no tratadas a macetas que conteman el medio de crecimiento mas arroz no inoculado. Un conjunto de plantulas se empapo con la tasa indicada en la etiqueta de mefenoxamo para actuar como patron de fungicida qmmico, y un conjunto de plantulas control tratadas se trasplanto a un medio que contema el patogeno.

Las plantas se mantuvieron en una camara de crecimiento a 20-24 °C con un ciclo de 12 horas de luz:oscuridad. Las plantas se regaron con una disolucion nutriente, tal como se describio anteriormente. En 28 DAI, el experimento termino, y cada planta se corto en dos porciones: rafces (subterraneas) y brotes (aereos). El material se seco en una estufa a 60° C hasta que estuvo completamente seco (aproximadamente 24 horas) y se registraron los pesos. Los datos se sometieron a un ANOVA de una via tras una correccion de Bonferroni. Las diferencias significativas entre los medios de tratamiento se determinaron empleando un ensayo HSD de Tukey a P = 0,05.

Tabla 13

Tratamiento: Concentracion

1. Control no inoculado: —

2. Control inoculado: —

3. T22 (Trichoderma harzianum): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

4. G41 (Trichoderma virens): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

5. T22 + G41: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal)

6. Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal)

Tal como se indica en la tabla 14, los pesos de las rafces y los brotes de los tomates mejoraron significativamente cuando se trataron con la combinacion de T22 y G41, en particular comparado con el caso en que estos agentes se emplearon por separado y en comparacion con el patron qmmico.

Tabla 14

Tratamiento: Tasa Peso seco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g)

Control no inoculado: -- 1,33 ab 0,17 b

Control inoculado: -- 0,60 c 0,06 c

T22: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,91 bc 0,16 b

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,87 c 0,12 bc

G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 1,50 a 0,30 a

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 0,90 bc 0,12 bc

5

10

15

20

25

Tratamiento: Tasa Peso seco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g)

HSD de Tukey (P = 0,05): 0,44 0,10

Los valores promedio en cada columna seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes segun

HSD de Tukey HSD (P = 0,05). Para cada tratamiento, cada valor es un promedio de 28 duplicados (plantas).

Ejemplo 5 - Tratamiento de tomates expuestos a Pythium irregulare

Este ejemplo ilustra la eficacia y sinergia de una composicion segun la presente invencion para controlar a Pythium irregulare en plantas de tomate.

Plantulas de tomate, Lycopersicon esculentum, var esculentum 'Beefsteak', se sometieron a los tratamientos de empapado de suelo indicados en la tabla 13. Excepto por los controles no inoculados, cada planta se trato con un inoculo del patogeno Pythium irregulare para inducir la enfermedad.

Las plantulas de tomate se cultivaron y se trataron como se describio anteriormente en el ejemplo 2. Se inoculo arroz esteril con una suspension de P. irregulare a la tasa de 1 placa Petri de PDA colonizada/1 litro de agua esteril. Se incubo arroz durante 24 horas a 24-26 °C. El arroz infestado se mezclo de modo uniforme con el medio de crecimiento a una tasa de 5% (en peso:peso).

Las plantulas de tomate se trasplantaron a macetas de 10 cm (4 pulgadas) que conteman el inoculo del patogeno sobre arroz. Se trasplanto un conjunto de plantulas control no tratadas a macetas que conteman el medio de crecimiento mas arroz, pero no patogeno. Un conjunto de plantulas se empapo con la tasa indicada en la etiqueta de mefenoxamo para actuar como patron de fungicida qmmico, y un conjunto de plantulas control tratadas se trasplanto a un medio que contema el patogeno.

Las plantas se mantuvieron en una camara de crecimiento a 20-24 °C con un ciclo de 12 horas de luz:oscuridad. Las plantas se regaron con una disolucion nutriente, tal como se describio anteriormente. En 21 DAI, el experimento termino, y cada planta se separo en dos porciones: rafces (subterraneas) y brotes (aereos). El material se seco en una estufa hasta que estuvo completamente seco (aproximadamente 24 horas) y se registraron los pesos.

Tal como se indica en la tabla 15, los pesos de las rafces y los brotes de las plantas de tomate mejoraron significativamente cuando se trataron con la combinacion de T22 y G41, en particular comparado con el caso en que estos agentes se emplearon por separado y en comparacion con el patron qmmico.

Tabla 15

Tratamiento: Tasa Peso seco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g)

Control no inoculado: -- 0,52 a 0,07 a

Control inoculado: -- 0,37 bcd 0,06 ab

T22: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,32 cd 0,05 b

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,39 bc 0,06 ab

G41 + T22: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 0,43 ab 0,07 a

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 0,28 d 0,04 c

HSD de Tukey (P = 0,05): 0,10 0,02

Los valores promedio en cada columna seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes segun HSD de Tukey HSD (P = 0,05). Para cada tratamiento, cada valor es un promedio de 28 duplicados (plantas).

Ejemplo 6 - Tratamiento de semillas de pepino para protegerlas frente a Pythium aphanidermatum

Este ejemplo ilustra la eficacia y sinergia de una composicion segun la presente invencion aplicada como revestimiento de semillas para controlar a Pythium aphanidermatum en plantulas de pepino.

Semillas de pepino, Cucumis sativus, var Marketmore 76 fueron revestidas con T. harzianum y/o T. virens, o mefenoxamo segun se describe en Pill et al. (Pill et al., Scientia Horticulture, 121:54-62 (2009)). Las semillas se plantaron en parcelas con o sin inoculo de P. aphanidermatum. El experimento se realizo en un invernadero con luz

5

10

15

20

25

30

natural y ajustando la temperatura a 25/22 °C (dfa/noche). El numero de plantulas que emergieron se registro a diario hasta que no se produjeron mas incrementos durante dos dfas consecutivos. Las plantas enfermas se registraron como preemergentes (no emergieron plantulas) o postemergentes (inclinacion de los brotes). Estos datos se sometieron a un analisis de la varianza, y los medios se separaron mediante un ensayo de LSD a P = 0,05.

Tal como se indica en la tabla 16, el porcentaje de enfermedad del vivero (preemergencia y total) se redujo significativamente cuando las semillas fueron tratadas con la combinacion de T22 y G41, en particular comparado con el caso en que estos agentes se emplearon por separado y en comparacion con el patron qmmico.

Tabla 16

Tratamiento de las semillas: Porcentaje de enfermedad del vivero

Preemergencia: Total

Ninguno: 19,4 a 33,3 a

T22: 7,0 b 15,9 b

G41: 2,3 bc 9,8 c

G41 + T22: 0 c 0 d

Mefenoxamo: 4,6 bc 9,3 c

Los valores promedio en cada columna seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes segun LSD (P = 0,05).

Ejemplo 7 - Tratamiento de tomates expuestos a Rhizoctonia solani

Este ejemplo ilustra la eficacia y sinergia de una composicion segun la presente invencion para controlar a Rhizoctonia solani en plantas de tomate.

Plantulas de tomate, Lycopersicon esculentum, var esculentum 'Beefsteak', se sometieron a los tratamientos de empapado de suelo indicados en la tabla 13, excepto que no se introdujeron plantas control no tratadas. Excepto por los controles no inoculados, cada planta se trato con un inoculo del patogeno R. solani para inducir la enfermedad.

Las plantulas de tomate se cultivaron y se trataron como se describio anteriormente en el ejemplo 2. Se inoculo arroz esteril con lechos cortos de agar procedentes de placas Petri de PDA que conteman colonias en crecimiento de R. solani a una tasa de un placa de PDA colonizada/500 g de arroz. Se incubo arroz durante 10 dfas a 24-26 °C. El arroz infestado se mezclo de modo uniforme con el medio de crecimiento a una tasa de 5% (en peso:peso).

Las plantulas de tomate se trasplantaron a macetas de aproximadamente 10 cm (4 pulgadas) que conteman el inoculo del patogeno sobre arroz. Las plantas de comprobacion no tratadas se contaminaron con una enfermedad desconocida y no fueron incluidas en el analisis. Un conjunto de plantulas se empapo con la tasa indicada en la etiqueta de mefenoxamo para actuar como patron de fungicida qmmico, y un conjunto de plantulas control tratadas se trasplanto a un medio que contema el patogeno.

Las plantas se mantuvieron en una camara de crecimiento a 20-24 °C con un ciclo de 12 horas de luz:oscuridad. Las plantas se regaron con una disolucion nutriente, tal como se describio anteriormente. En 23 DAI, el experimento termino, y cada planta se separo en dos porciones: rafces (subterraneas) y brotes (aereos). El material se seco en una estufa a 60° C hasta que estuvo completamente seco (aproximadamente 24 horas) y se registraron los pesos. Los datos se analizaron como se describio en el anterior ejemplo 2.

Tal como se indica en la tabla 17, los pesos de las rafces y los brotes de las plantas de tomate mejoraron significativamente cuando se trataron con la combinacion de T22 y G41, en particular comparado con el caso en que estos agentes se emplearon por separado y en comparacion con el patron qmmico.

Tabla 17

Tratamiento: Tasa Peso seco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g)

Control inoculado: -- 0,52 bc 0,06 b

T22: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,67 b 0,09 ab

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,61 b 0,08 ab

T22 + G41: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 0,86 a 0,11 a

5

10

15

20

25

30

35

40

Tratamiento: Tasa Peso seco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g)

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 0,42 c 0,06 b

HSD de Tukey (P = 0,05): 0,10 0,02

Ejemplo 8 - Demostracion de la importancia de la competencia en la rizosfera para la sinergia Parte I. Evaluacion de la competencia relativa en la rizosfera Evaluacion de la competencia relativa en la rizosfera de T22 y G41

La competencia en la rizosfera se midio en plantulas de mafz empleando la metodologfa descrita (Chao et al., Phytopathology, 76:60-65 (1986)). Se plantaron plantulas de mafz tratadas con T22 y G41 en tubos de laminas de aluminio que conteman tierra esteril. Despues de 10 dfas, los tubos se desenrollaron cuidadosamente; las rafces de las plantas se cortaron en segmentos de 2,54 cm (1 pulgada) desde el apice hasta el pie de la planta. Cada segmento se ensayo para la cantidad relativa de cada cepa de Trichoderma.

La figura 1 muestra las poblaciones relativas de T22 y G41 (como porcentajes de la poblacion total de Trichoderma) encontradas en los segmentos de rafces de aproximadamente 2,5 cm (1 pulgada) de mafz tratado. Se descubrio que G41 habitaba principalmente en los aproximadamente 10-13 cm (4-5 pulgadas) superiores directamente por debajo de la lmea del suelo, mientras que se descubrio que T22 habitaba las rafces de los aproximadamente 15-20 cm (6-8 pulgadas) inferiores. Esto indica que las poblaciones de T22 crecen a lo largo del apice radicular, mientras que las poblaciones de G41 principalmente habitan las porciones superiores de la rafz. Segun Sivan y Harman (Sivan y Harman, J. Gen. Microbiol., 137: 23-29 (1991)), la capacidad de T22 para crecer a lo largo del apice radicular hace que sea competente en la rizosfera, comparado con G41, que no crece a lo largo de las porciones inferiores de la rafz y el apice radicular. Mediante la inhibicion de las diferentes porciones de la rafz, las poblaciones de T22 y G41 evitan la competencia directa por el espacio y los nutrientes.

Parte II. Importancia de la competencia en la rizosfera para el biocontrol

Para demostrar la importancia de la competencia en la rizosfera para la sinergia y una actividad de biocontrol potenciada cuando se combinan dos cepas de Trichoderma, se realizaron ensayos in vivo en plantas expuestas a patogenos. En el experimento 1, se evaluo la eficacia de una combinacion de T22 con una cepa alternativa de T. virens, cepa G21. En el experimento 2, se evaluo la eficacia de una combinacion de una cepa no competente en la rizosfera de T. harzianum, cepa T12, y G41,.

Experimento 1. Demostracion de la sinergia con una combinacion de T22 y G21

Plantulas de pepino, Cucumis sativus var Marketmore 76, se sometieron a los tratamientos de empapado de suelo indicados en la tabla 18. Excepto por los controles no inoculados, cada planta se trato con un inoculo del patogeno Pythium irregulare para inducir la enfermedad.

Las plantulas se cultivaron y se trataron como se describio anteriormente en el ejemplo 4. Se inoculo arroz esteril con una suspension de P. irregulare a la tasa de una placa Petri de PDA colonizada/1 litro de agua esteril. Se incubo arroz durante 24 horas a 24-26 °C. El arroz infestado se mezclo de modo uniforme con el medio de crecimiento a una tasa de 5% (en peso:peso).

Las plantulas de pepino se trasplantaron a macetas de 10 cm (4 pulgadas) que conteman el inoculo del patogeno sobre arroz. Se trasplanto un conjunto de plantulas control no tratadas a macetas que conteman el medio de crecimiento mas arroz, pero no patogeno. Un conjunto de plantulas se empapo con la tasa indicada en la etiqueta de mefenoxamo para actuar como patron de fungicida qmmico, y un conjunto de plantulas control tratadas se trasplanto a un medio que contema el patogeno.

Las plantas se mantuvieron en una camara de crecimiento a 20-24 °C con un ciclo de 12 horas de luz:oscuridad. En 28 DAI, el experimento termino, y cada planta se separo en dos porciones: rafces (subterraneas) y brotes (aereos). El material se seco en una estufa a 60° C hasta que estuvo completamente seco (aproximadamente 24 horas) y se registraron los pesos. Los datos se analizaron como se describio en el ejemplo 4.

Tabla 18

Tratamiento: Tasa

1. Control no inoculado: —

Tratamiento: Tasa

2. Control inoculado: —

3. T22 (Trichoderma harzianum): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

4. G41 (Trichoderma virens): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

5. T22 + G41: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal)

6. Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal)

Tal como se indica en la tabla 19, los pesos de las rafces y los brotes de las plantas de pepino mejoraron significativamente cuando se trataron con la combinacion de T22 y G21, en particular comparado con el caso en que estos agentes se emplearon por separado y en comparacion con el patron qmmico. Estos datos demuestran que cuando se combina T22, una cepa competente en la rizosfera de Trichoderma harzianum, con una cepa alternativa 5 de T. virens, aun se observa un efecto sinergico y la eficacia resulta potenciada.

Tabla 19

Tratamiento: Tasa Peso seco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g)

Control no inoculado: -- 0,84 a 0,14 a

Control inoculado: -- 0,37 c 0,07 c

T22: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,58 b 0,10 abc

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,48 bc 0,08 c

T22 + G41: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 0,88 a 0,13 ab

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 0,66 ab 0,10 abc

HSD de Tukey (P = 0,05): 0,19 0,05

Los valores promedio en cada columna seguidos de la misma letra no son significativamente diferentes segun HSD de Tukey HSD (P = 0,05). Para cada tratamiento, cada valor es un promedio de 14 duplicados (plantas).

Experimento 2. Demostracion de la perdida de sinergia con una combinacion de T12 y G41

Se ha demostrado que la cepa T12 de Trichoderma harzianum (ATCC 20737) no posee la capacidad de crecer a lo largo del apice radicular. Asf, no es una cepa competente en la rizosfera (Chao et al., "Colonization of the 10 Rhizosphere by Biological Control Agents Applied to Seeds," Phytopathology, 76:60-65 (1986)). Este experimento se realizo para demostrar la perdida de sinergia cuando se emplea una cepa no competente en la rizosfera de T. harzianum para el control de la enfermedad.

Plantulas de tomate, Lycopersicon esculentum, var esculentum 'Beefsteak', se sometieron a los tratamientos de empapado de suelo indicados en la tabla 20. Excepto por los controles no inoculados, cada planta se trato con un 15 inoculo del patogeno Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici para inducir la enfermedad. Los procedimientos experimentales y el analisis de los datos fueron identicos a los descritos en el ejemplo 4.

Tabla 20

Tratamiento: Tasa

1. Control no inoculado: —

2. Control inoculado: —

3. T12 (Trichoderma harzianum): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

4. G41 (Trichoderma virens): 113 g/379 l (4 oz/100 gal)

5. T12 + G41: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal)

6. Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal)

Tal como se indica en la tabla 21, los pesos de las rafces y los brotes de las plantas de tomate no fueron

significativamente diferentes en el tratamiento con la combinacion de T12+G41, comparado con el caso en que estos agentes se emplearon por separado y en comparacion con el patron qmmico. Estos datos demuestran que cuando se combina T12, una cepa no competente en la rizosfera de Trichoderma harzianum, con una cepa de Trichoderma virens no se observa efecto sinergico. Esto puede ser debido a la incapacidad de T12 de crecer a lo largo de las 5 rafces en avance y de proteger a los apices radiculares vulnerables frente al ataque de patogenos. Ademas, T12 puede competir por los nutrientes y el espacio con G41 en las porciones superiores de la zona radicular.

Tabla 21

Tratamiento: Tasa Peso seco de los brotes (g) Peso seco de las rafees (g)

Control no inoculado: -- 0,70 a 0,05 a

Control inoculado: -- 0,39 bc 0,03 b

T12: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,52 ab 0,05 a

G41: 113 g/379 l (4 oz/100 gal) 0,54 ab 0,05 a

T12+ G41: 113 gr + 113 gr/379 l (4 oz + 4 oz/100 gal) 0,50 ab 0,05 a

Mefenoxamo: 28 gr/379 l (1 oz/100 gal) 0,17 c 0,03 b

HSD de Tukey (P = 0,05): 0,23 0,02

Aunque se han mostrado las realizaciones preferidas y estas se han descrito en detalle en la presente, el alcance de la invencion se define en las siguientes reivindicaciones.

10

Claims

5

10

15

20

25

30

REIVINDICACIONES

1. - Un metodo para controlar enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora, Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Thielaviopsis, y/o Sclerotium, comprendiendo dicho metodo:

proporcionar una especie competente en la rizosfera de Trichoderma harzianum T22;

proporcionar una especie de Trichoderma virens G41; y

aplicar la especie de Trichoderma harzianum y la especie de Trichoderma virens a plantas en crecimiento bajo condiciones eficaces para tratar las enfermedades de plantas mediadas por especies de Phytophthora, Pythium, Fusarium, Rhizoctonia, Sclerotium, y/o Thielaviopsis.
2. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la enfermedad de la planta esta mediada por una especie de Phytophthora seleccionada del grupo que consiste en Phytophthora cactorum, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora citricola, Phytophthora citrophthora, Phytophthora cryptogea, Phytophthora drecshsleri, Phytophthora infestans y Phytophthora nicotiana.
3. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la enfermedad de la planta esta mediada por una especie de Pythium seleccionada del grupo que consiste en Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, y Pythium ultimum.
4. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la enfermedad de la planta esta mediada por Fusarium oxysporum.
5. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la enfermedad de la planta esta mediada por Rhizoctonia solani.
6. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la enfermedad de la planta esta mediada por Thielaviopsis basicola.
7. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la enfermedad de la planta esta mediada por Sclerotium rolfsii.
8. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la planta en crecimiento se selecciona del grupo que consiste en flores, plantas de semillero, plantas ornamentales, verduras de fruto, cultivos hidroponicos, verduras de hoja y cultivos de coles, frutas de pomo, arboles de hoja caduca, uvas, dtricos, pinos, frutas de hueso, nueces de arboles, granos y hierbas.
9. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha aplicacion se realiza mediante aplicacion de emision, aplicacion dentro de surco lfquida o seca, empapado de plantas en maceta, incorporacion directa al suelo o a mezclas de plantacion de invernadero, o formulaciones granulares o granulos.
10. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la especie competente en la rizosfera de Trichoderma harzianum y la especie de Trichoderma virens se proporcionan en forma de una composicion de biocontrol, y dicha aplicacion se realiza aplicando la composicion de biocontrol.
11. - El metodo de la reivindicacion 10, en el que la composicion de biocontrol comprende ademas un vehfculo.
12. - El metodo de la reivindicacion 11, en el que el vehfculo se selecciona del grupo que consiste en agua, disoluciones acuosas, suspensiones, granulos y polvos.
13. - El metodo de la reivindicacion 10, en el que la composicion de biocontrol comprende ademas un aditivo seleccionado del grupo que consiste en fertilizantes, insecticidas, fungicidas, nematicidas y sus mezclas.