IT201800020869A1

IT201800020869A1 - A plant growth promoter composition, processes for preparing the same and uses thereof / composizione promotrice di crescita vegetale, processi per la sua preparazione e suoi usi

Info

Publication number: IT201800020869A1
Application number: IT102018000020869A
Authority: IT
Inventors: Christian Hübsch; Suvi Pietarinen; Giuliano Leonardi
Original assignee: Green Innovation Gmbh; Upm Kymmene Corp
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-06-21
Also published as: JP2022513859A; CN113242694A; WO2020126567A1; EP3897157A1; CA3122037A1; US20220039394A1; BR112021012275A2

Description

Deposito della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: “COMPOSIZIONE PROMOTRICE DI CRESCITA VEGETALE, PROCESSI PER LA SUA PREPARAZIONE E SUOI USI”

DESCRIZIONE CAMPO DELL'INVENZIONE

La presente invenzione riguarda una composizione comprendente un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, così come processi per la sua preparazione ed usi quale promotrice di crescita vegetale e di produzione di frutti in agricoltura.

TECNICA NOTA

Il fertilizzante, che è essenzialmente composto da diversi tipi di componenti nutritivi per la crescita vegetale, è stato ampiamente impiegato in tutto il mondo allo scopo di aumentare i rendimenti dei prodotti agricoli. In generale, i fertilizzanti possono presentare le forme di liquido puro, sospensioni o solido. Essi possono essere introdotti nei vegetali attraverso la fertilizzazione del terreno o tramite applicazione al fogliame dei vegetali, come ad esempio tramite nebulizzazione, irrigazione e simili. In questi ultimi anni, i fertilizzanti fogliari hanno gradualmente sostituito l'uso comune dei fertilizzanti applicati al terreno nelle aree agricole, in quanto essi presentano impatti negativi minori sull'ambiente. Ricerche hanno dimostrato che il procedimento di fertilizzazione tradizionale tramite fertilizzazione del terreno ha contribuito alla contaminazione delle acque di superficie e delle acque freatiche. Ciò è principalmente dovuto alla lisciviazione dei nutrienti solubili del fertilizzante, come ad esempio l'azoto, nelle falde acquifere. Tali circostanze possono determinare un trasporto insufficiente di nutrienti alle cellule vegetali. Pertanto, si è rivelata maggiormente desiderabile l'erogazione dei nutrienti ad un vegetale direttamente attraverso il fogliame dei vegetali stessi. I fertilizzanti fogliari sembrano superare gli svantaggi del procedimento di fertilizzazione del terreno, tuttavia, l'applicazione non corretta di tali fertilizzanti fogliari ai vegetali, ad esempio quando un'elevata concentrazione di nutrienti è applicata direttamente sul fogliame, può determinare un danneggiamento del fogliame in forma di aree necrotiche o bruciature delle foglie, causando, quindi, la riduzione dei rendimenti dei raccolti. Si ipotizza che il fertilizzante fogliare con una quantità ridotta di nutrienti possa impedire il danneggiamento del fogliame. Tuttavia, ciò risulta poco funzionale, in quanto è necessaria un'attività ad alta intensità di manodopera per la fertilizzazione dei vegetali con il fertilizzante fogliare a basso contenuto di nutrienti. A titolo esemplificativo, il brevetto US 6,475,258 ha divulgato una composizione di fertilizzante fogliare per aumentare la crescita dei vegetali mediante applicazione fogliare. Detta composizione è una soluzione acquosa composta da almeno un coenzima, in cui detto coenzima è preferibilmente una vitamina B, e più preferibilmente acido folico e/o piridossina, e da almeno uno fra una fonte di carboidrati, un agente complessante ed un conservante. Nonostante il fertilizzante oggetto dell'invenzione possa sostanzialmente migliorare l'assunzione dei nutrienti da parte dei vegetali, aumentando le loro attività metaboliche, tuttavia, deve essere ancora affrontata la disponibilità di nutrienti, dai fertilizzanti per terreni o fogliari da incorporare nelle cellule dei vegetali.

Risulta pertanto sentita la necessità di promuovere in modo efficace la crescita vegetale, fornendo una quantità sufficiente di nutrienti ad un vegetale senza provocare danni al fogliame, ed in particolare preservando la salute umana ed animale, i raccolti e l'ambiente.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Lo scopo di cui sopra è stato conseguito tramite una composizione comprendente un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, secondo la rivendicazione 1. In un altro aspetto, la presente invenzione riguarda l'uso di detta composizione quale promotrice di crescita vegetale e di produzione di frutti in agricoltura.

In un aspetto aggiuntivo, la presente invenzione riguarda un prodotto agro-chimico comprendente la composizione ed additivi agro-chimici.

In un ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda un procedimento promotore della crescita vegetale e della produzione di frutti, detto procedimento comprendendo la fase di applicazione della composizione o del prodotto agro-chimico ad un vegetale o ad un terreno per vegetali.

Il termine “vegetale” indica una pianta o piante che possono essere coltivate e raccolte per finalità di profitto o di sussistenza, in tal modo comprendendo colture, cereali, verdura, frutta e fiori, così come coltivate e raccolte per finalità di giardinaggio o uso personale.

Il termine “terreno per vegetali” indica il suolo in cui il vegetale è coltivato o in cui il vegetale è seminato o in cui il vegetale sarà seminato, in tal modo comprendendo terreni, terre e mezzi privi di terriccio, fra cui l'idrocoltura e la coltura idroponica.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione diventeranno evidenti dalla descrizione dettagliata che segue, dagli esempi operativi riportati per finalità illustrative, e dalle allegate figure, in cui:

- la Figura 1 mostra l'effetto della composizione dell'invenzione sul rendimento dei pomodori. Le barre indicano la media del rendimento per pianta in termini di grammi di frutti di pomodoro prodotti per ramo fruttifero. Le diverse lettere sulle barre indicano le differenze significative conformemente al test ANOVA ed LSD (p ≤0,05), come da Esempio 3;

- la Figura 2 mostra l'effetto della composizione dell'invenzione sul rendimento dei pomodori. Le barre indicano la media del rendimento per pianta in termini di numero di frutti di pomodoro prodotti per pianta. Le diverse lettere sulle barre indicano le differenze significative conformemente al test ANOVA ed LSD (p ≤0,05), come da Esempio 3;

- la Figura 3 mostra l'effetto della composizione dell'invenzione sul rendimento dei pomodori. Le barre indicano la media del rendimento per pianta in termini di grammi di frutti di pomodoro prodotti per pianta. Le diverse lettere sulle barre indicano le differenze significative conformemente al test ANOVA ed LSD (p ≤0,05), come da Esempio 3; e

- la Figura 4 mostra l'effetto della composizione dell'invenzione sul rendimento dei pomodori. Le barre indicano la media del rendimento per pianta in termini di numero di frutti di pomodoro prodotti per pianta. Le diverse lettere sulle barre indicano le differenze significative conformemente al test ANOVA ed LSD (p ≤0,05), come da Esempio 3.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE

Pertanto, l'oggetto dell'invenzione è una composizione comprendente un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, in cui:

- detto fungo è selezionato dalle specie di Trichoderma, da loro fusanti di protoplasti e loro miscele,

- detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale fino a 20.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo fino a 111 unità fenilpropaniche su media ponderale,

ed in cui il fungo è in una concentrazione fino a 1x10<7 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in una concentrazione fino a 5% in peso, sul peso della composizione.

Preferibilmente, la composizione è in forma di soluzione, dispersione o sospensione acquosa.

Preferibilmente, detta specie di Trichoderma è selezionata da Trichoderma aggressivum, Trichoderma asperellum, Trichoderma atroviride, Trichoderma citrinoviride, Trichoderma cremeum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma virens, Trichoderma viride e Trichoderma viridescens.

Un fungo appartenente al genere Trichoderma così come definito in precedenza è in grado di colonizzare una serie di nicchie, di antagonizzare e controllare i microorganismi patogeni delle piante e di stabilire un'interazione diretta vantaggiosa con i vegetali, determinando l'aumento della crescita, dell'assunzione dei nutrienti e della resistenza sistemica alle patologie. In particolare, l'aumento dello sviluppo vegetale è generalmente associato all'aumento del germogliamento dei semi, del sistema radicale, del peso della pianta e dell'area fogliare, della dimensione e/o del numero di semi, fiori e/o frutti, con un conseguente aumento dei rendimenti e spesso del contenuto di fattori nutritivi importanti.

La lignina è nota per la sua attività antimicrobica nei confronti sia di funghi, sia di batteri. Pertanto, era atteso che il trattamento del Trichoderma, un fungo del terreno piuttosto noto, determinasse un'inibizione diretta a concentrazioni di lignina rilevate quali tossiche per la maggior parte degli altri funghi già testati. Di conseguenza, l’attesa razionale era che il Trichoderma sarebbe stato danneggiato a concentrazioni di lignina tipicamente considerate per usi nelle applicazioni agricole. In modo sorprendente ed inaspettato, così come mostrato negli Esempi che seguono, le specie di Trichoderma elencate in precedenza non solamente non sono state danneggiate dalla frazione di lignina alle date concentrazioni, ma hanno addirittura aumentato la loro attività in termini di produttività vegetale, così come in termini di crescita vegetale.

In particolare, si è osservato che l'effetto promotore sulla crescita vegetale riguarda un aumento, in alcuni casi, fino al 25% rispetto all'applicazione di un singolo componente. In aggiunta a quanto precede, occorre apprezzare che le specie di Trichoderma e la frazione di lignina agiscono in modi diversi ed usano diversi meccanismi: ciò rende l'effetto della composizione risultante più robusto ed adatto a diverse condizioni, riducendo, al contempo, l'insorgenza di meccanismi di resistenza (per finalità di biocontrollo).

Inoltre, la produzione della composizione è semplice ed economica, dato che le rispettive concentrazioni sono vantaggiosamente molto basse. Ciò significa anche che la composizione può essere preparata in forma concentrata, la quale può essere facilmente diluita con acqua alle concentrazioni di cui sopra, prima dell'uso.

Con il termine “fusanti di protoplasti” si includono ceppi ibridi di Trichoderma spp. ottenuti mediante fusione di protoplasti.

I protoplasti sono le cellule a cui sono rimosse le pareti cellulari e la cui membrana citoplasmatica rappresenta lo strato più esterno di tali cellule. Il protoplasto può essere ottenuto tramite enzimi litici specifici che rimuovono la parete cellulare. La fusione di protoplasti è un fenomeno fisico, durante la fusione due o più protoplasti entrano in contatto ed aderiscono fra di loro, spontaneamente o in presenza di agenti che inducono la fusione. Mediante la fusione di protoplasti, è possibile trasferire alcuni geni utili da una specie all'altra. La fusione di protoplasti è uno strumento importante del miglioramento dei ceppi, per l'ottenimento di ricombinazioni genetiche e lo sviluppo di ceppi ibridi nei funghi filamentosi. Detto miglioramento può riguardare, ad esempio, rendimenti superiori nella produzione delle cellulasi.

Per le finalità della presente invenzione, i fusanti di protoplasti possono essere ottenuti conformemente a tecniche note nel settore (ad es. Hassan MM (2014) Influence of protoplast fusion between two Trichoderma spp. on extracellular enzymes production and antagonistic activity, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 28:6, 1014-1023)

Nelle realizzazioni preferite della composizione dell'invenzione, il fungo del genere Trichoderma è selezionato da T. Harzianum, T. Atroviride e T. virens e loro miscele. In alcune realizzazioni, la composizione comprende una miscela di specie di Trichoderma.

Nelle realizzazioni maggiormente preferite, detto fungo è selezionato da T. Harzianum HK2, T. Atroviride HK4 e T. virens GV41 e loro miscele, in cui “HK2”, “HK4” e “GV41” sono i rispettivi ceppi preferiti.

In alcune realizzazioni, la composizione comprende una miscela di ceppi di Trichoderma.

Quando una miscela è presente nella composizione, ogni specie o ceppo è alla stessa o pressoché alla stessa concentrazione.

Nelle realizzazioni preferite, la composizione comprende due specie di Trichoderma o due ceppi di Trichoderma in un rapporto di concentrazione da 2:1 a 1:2, preferibilmente di 1:1.

Preferibilmente, il fungo è in concentrazione da 1x10<6 >a 8x10<6 >spore/ml di composizione. Più preferibilmente, il fungo è in concentrazione da 2x10<6 >a 6x10<6 >spore/ml di composizione. Nelle realizzazioni preferite, il fungo è in concentrazione da 3x10<6 >a 5x10<6 >spore/ml di composizione.

La lignina rappresenta una classe di polimeri organici complessi che formano materiali strutturali importanti nei tessuti di supporto di alcune alghe, nei vegetali vascolari, corteccia inclusa, e nei vegetali erbacei, come ad esempio il legno (ovvero il legno dolce ed il legno duro), la paglia di tutti i cereali, la bagassa della canna, l'erba, il lino, la iuta, la canapa o il cotone. La lignina può avere anche origine minerale, come ad esempio la torba, la leonardite ed il carbone.

Chimicamente, nella sua forma nativa, la lignina è un polimero molto irregolare, reticolato in modo casuale, di unità fenilpropaniche unite tramite molte diverse associazioni, con un peso molecolare medio ponderale di 20.000 Dalton o superiore. Di seguito è mostrato un frammento di lignina (I) rappresentativo ed illustrativo, contenente i modelli di legame maggiormente importanti:

Detto polimero è il risultato di una polimerizzazione deidrogenativa mediata da enzimi di tre precursori di monomeri fenilpropanoidi:

alcol cumarilico alcol coniferilico alcol sinapilico

i quali risultano rispettivamente nelle seguenti frazioni:

L'alcol coniferilico è presente in tutte le specie e rappresenta il monomero dominante nelle conifere (legni dolci). Le specie caducifoglie (legno duro) contengono fino a 40% di unità di alcol sinapilico, mentre le erbe e le colture agricole possono contenere anche unità di alcol cumarilico.

La lignina può essere classificata in lignina di legno dolce e di legno duro, a seconda delle sue fonti di biomassa grezza.

Le fonti di biomassa grezza che possono rappresentare idonei materiali di partenza per l'ottenimento della relativa frazione di lignina sono date da qualsiasi lignina comprendente lignina essenzialmente pura così come lignina kraft, lignina originata da biomassa, lignina derivante da un processo di produzione di pasta di legno alcalina, lignina derivante da un processo con soda, lignina derivante da produzione di pasta di legno organosolv, lignina derivante da processi enzimatici, lignina derivante da processi di esplosione di vapore, e qualsiasi loro combinazione.

Con l'espressione “lignina essenzialmente pura”, si intende almeno 80% di lignina pura su una base di biomassa grezza secca, preferibilmente almeno 90% di lignina pura, più preferibilmente almeno 95% lignina pura, la parte restante essendo composta da estrattivi e carboidrati, come ad esempio emicellulose così come sostanze inorganiche. Con l'espressione “lignina kraft”, si intende lignina originata da liquor nero kraft. Il liquor nero è una soluzione acquosa alcalina di residui di lignina, emicellulosa e sostanze chimiche inorganiche usata nel processo di produzione di pasta di legno kraft. Il liquor nero derivante dal processo di produzione di pasta di legno comprende componenti originati da diverse specie di legno dolce e legno duro in diverse proporzioni. La lignina può essere separata dal liquor nero tramite diverse tecniche, incluse, ad es., precipitazione e filtrazione. Solitamente, la lignina inizia a precipitare a valori di pH inferiori a 11 - 12. Possono essere usati diversi valori di pH allo scopo di precipitare frazioni di lignina con proprietà diverse. Tali frazioni di lignina possono differire fra loro per la distribuzione del peso molecolare, ad es. M<w >e M<n>, polidispersità, contenuto di emicellulosa e di estrattivi, contenuto di materia inorganica. La lignina precipitata può essere depurata dalle impurità inorganiche, dall'emicellulosa e dagli estrattivi del legno tramite l'utilizzo di fasi di lavaggio acido. Un'ulteriore depurazione può essere ottenuta tramite filtrazione.

In alternativa, la lignina è separata dalla biomassa pura. Il processo di separazione può iniziare con la liquefazione della biomassa mediante alcali forti, seguita da un processo di neutralizzazione. Successivamente al trattamento alcalino, la lignina può essere precipitata secondo una modalità simile a quanto riportato in precedenza.

Preferibilmente, la separazione della lignina dalla biomassa comprende una fase di trattamento enzimatico. Il trattamento enzimatico modifica la lignina da estrarre dalla biomassa. La lignina separata dalla biomassa pura è essenzialmente priva di zolfo (contenuto di zolfo inferiore al 3%) e quindi idonea per la lavorazione successiva. Preferibilmente, un materiale legnoso è pre-trattato per rimuovere le emicellulose e, in seguito, la cellulosa è idrolizzata. La frazione di lignina insolubile risultante comprende fino a 30% in peso di cellulosa.

Preferibilmente, la lignina separata è anche sottoposta ad un processo di depolimerizzazione, allo scopo di ridurre ulteriormente il peso molecolare medio ponderale dei frammenti.

In alcune realizzazioni, la lignina separata è anche sottoposta ad un processo di depolimerizzazione, allo scopo di ridurre ulteriormente i pesi molecolari medi ponderale e numerale dei frammenti.

Adatti processi di depolimerizzazione includono la depolimerizzazione catalitica basica, la depolimerizzazione catalitica acida, la depolimerizzazione catalitica metallica, la depolimerizzazione assistita da liquidi ionici e la depolimerizzazione della lignina assistita da fluidi supercritici.

Nelle realizzazioni preferite, detta frazione di lignina è ottenuta mediante depolimerizzazione catalitica basica.

Preferibilmente, detta frazione di lignina è ottenuta sottoponendo la lignina separata ad una depolimerizzazione catalitica basica ad una temperatura inferiore a 300°C e ad una pressione inferiore a 30 MPa.

Il pH è impostato fra 11 e 14, aggiungendo una base come ad esempio NaOH, KOH, Ca(OH)<2>, LiOH, K<2>CO<3>, o loro miscela.

Il peso molecolare medio ponderale (Mw) dei frammenti nella frazione di lignina è misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare (o ‘SEC’). La SEC impiega un liquido stagnante presente nei pori di granuli quale fase fissa, ed un liquido che fluisce quale fase mobile. Pertanto, la fase mobile può fluire fra i granuli ed anche all'interno ed all'esterno dei pori dei granuli. Il meccanismo di separazione si basa sulla dimensione delle molecole di polimero in soluzione. Le molecole più grandi eluiscono per prime. Le molecole piccole, le quali possono entrare in diversi pori dei granuli, impiegano un tempo prolungato per passare attraverso la colonna e, quindi, escono dalla colonna lentamente. Allo scopo di determinare i pesi molecolari dei componenti di un campione polimerico, deve essere eseguita una taratura con polimeri standard di peso noto. I valori derivanti dal campione sconosciuto sono poi confrontati con il grafico di taratura. I tempi di ritenzione dipendono dal materiale della colonna usato, dall'eluente e dal grado di similitudine degli standard usati rispetto ai campioni. Preferibilmente, l'eluente è 0,1 M di NaOH.

Preferibilmente, detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 2.000-20.000 Dalton.

Più preferibilmente, detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 3.000-20.000 Dalton.

Ancora più preferibilmente, detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 4.000-15.000 Dalton.

In alcune realizzazioni preferite, detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 4.000-6.000 Dalton.

In altre realizzazioni preferite, detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 9.000-11.000 Dalton.

Preferibilmente in tali realizzazioni, detti frammenti comprendono 11-111 unità fenilpropaniche su media ponderale, più preferibilmente 22-111 unità fenilpropaniche su media ponderale.

Il peso molecolare dei tre precursori di monomeri fenilpropanoidi varia da 150 Da di alcol cumarilico, 180 Da di alcol coniferilico, e 210 Da di alcol sinapilico. Il peso medio è pertanto pari a 180 Da e tale valore è stato usato quale “unità fenilpropanica”. I valori di Mw sono stati divisi per 180 Da, in tal modo ottenendo i numeri di unità fenilpropaniche su media ponderale.

In ulteriori realizzazioni, la frazione di lignina presenta un indice di polidispersità (PDI) da 1,25 a 12.

L'indice di polidispersità (PDI) o indice di eterogeneità, o semplicemente dispersità, è una misura della distribuzione della massa molecolare in un dato campione polimerico. Il PDI è dato dal peso molecolare medio ponderale (Mw) diviso per il peso molecolare medio numerale (Mn). Esso indica la distribuzione delle singole masse molecolari in un lotto di polimeri.

Preferibilmente, detta frazione di lignina ulteriormente comprende fino a 30% in peso di cellulosa, più preferibilmente 10-30 % in peso di cellulosa, sul peso della frazione di lignina. Il fungo del genere Trichoderma produce enzimi di degradazione della cellulosa come ad esempio esoglucanasi (EXG), endoglucanasi (EG) e β-glucosidasi (BGL). Le cellulasi rappresentano il sistema enzimatico maggiormente efficiente per l'idrolisi completa dei substrati cellulosici nel proprio glucosio monomerico, il quale è uno zucchero fermentabile. Dato che lo zucchero aiuta la respirazione cellulare vegetale e la crescita cellulare, ne consegue che la presenza di cellulosa nella composizione dell'invenzione è vantaggiosa in termini di ulteriore miglioramento dell'efficacia complessiva nella promozione della crescita vegetale.

Nelle realizzazioni preferite, la composizione dell'invenzione comprende un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, in cui:

- detto fungo è selezionato da Trichoderma harzianum, Trichoderma atroviride Trichoderma virens e loro miscele,

- detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 3.000-20.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 11-111 unità fenilpropaniche su media ponderale,

ed in cui il fungo è in concentrazione da 1x10<6 >a 8x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 0,1% a 4% in peso, sul peso della composizione.

Più preferibilmente, la composizione dell'invenzione comprende un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, in cui:

- detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 3.000-20.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 16-111 unità fenilpropaniche su media ponderale,

ed in cui il fungo è in concentrazione da 2x10<6 >a 6x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 0,5% a 3% in peso, sul peso della composizione.

In alcune realizzazioni preferite, la composizione dell'invenzione comprende un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, in cui:

- detto fungo è selezionato da Trichoderma harzianum HK2, Trichoderma atroviride HK4, Trichoderma virens GV41 e loro miscele,

- detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 4.000-6.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 22-33 unità fenilpropaniche su media ponderale,

ed in cui il fungo è in concentrazione da 3x10<6 >a 5x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 1% a 2% in peso, sul peso della composizione. In altre realizzazioni preferite, la composizione dell'invenzione comprende un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, in cui:

- detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 9.000-11.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 50-61 unità fenilpropaniche su media ponderale,

ed in cui il fungo è in concentrazione da 3x10<6 >a 5x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 1% a 2% in peso, sul peso della composizione. Le realizzazioni maggiormente preferite sono quelle in cui la composizione dell'invenzione comprende a fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, in cui:

- detto fungo è Trichoderma virens GV41,

ed in cui il fungo è in concentrazione da 3x10<6 >a 5x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 1% a 2% in peso, sul peso della composizione. In altre realizzazioni, la composizione consiste essenzialmente in un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, in cui:

- detto fungo è selezionato da Trichoderma aggressivum, Trichoderma asperellum, Trichoderma atroviride, Trichoderma citrinoviride, Trichoderma cremeum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma virens, Trichoderma viride, Trichoderma viridescens, dai loro fusanti di protoplasti e loro miscele,

- detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale fino a 10.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo fino a 55 unità fenilpropaniche su media ponderale,

ed in cui il fungo è in concentrazione fino a 1x10<7 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione fino a 5% in peso, sul peso della composizione. Per gli scopi della presente invenzione, l'espressione “consiste essenzialmente in” indica che detto fungo e detta frazione di lignina sono gli unici ingredienti attivi che agiscono quali promotori di crescita vegetale e di produzione di frutti presenti nelle composizioni, i possibili altri componenti presentando diverse attività o essendo semplici coformulanti.

In ulteriori realizzazioni, la composizione consiste in un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, così come descritto in precedenza.

In un altro aspetto, la presente invenzione riguardo un uso di detta composizione quale promotrice di crescita vegetale e di produzione di frutti in agricoltura.

Preferibilmente, la composizione può essere applicata in una quantità di 100-300 ml per pianta, ogni 5-15 giorni.

Adatti additivi sono regolatori del pH, regolatori di acidità, regolatori della durezza dell'acqua, oli minerali, oli vegetali, fertilizzanti, concimi naturali per foglie e loro combinazioni.

Additivi esemplificativi includono 2-etilesanolo EO-PO, alcol alcossilati, ammina grassa alcossilata, trigliceridi alcossilati, alchil poliglicoside, sale di sodio alchiletersolfato, condensato di ossido di alchilfenoletilene, alchilfenilidrossipoliossietilene, allil polietilenglicole metil etere, tensioattivo dipropionato anfoterico, di-l-p-mentene, dimetil polisilossano, olio vegetale esterificato, condensato di ossido di etilene, esteri di acidi grassi, condensato di ossido di etilene di alcol grassi, polialcossilato di alcol grassi, lecitina (soia), olio di semi di colza metilato, n-dodecilpirrolidone, n-metilpirrolidone, n-ottilpirrolidone, tensioattivo non ionico, condensato di ossido di nonil fenol etilene, oli di paraffina, poli(vinilpirrolidione/1-esadecene, poliacrilammide, polialchilenglicole, polialchilene ossido, trisilossano modificato con polietere, polietilene polipropilene glicole, monolaurato di poliossietilene, acido propionico, co-polimero stirene-butadiene, lattice sintetico, ammina di sego etossilata, olio vegetale e loro miscele.

Alla luce del fatto che la composizione è efficace anche a concentrazioni molto ridotte del fungo e della frazione di lignina, il prodotto agro-chimico vantaggiosamente e preferibilmente comprende detta composizione in concentrazione di 1-500 grammi per kg di prodotto agro-chimico.

Il prodotto agro-chimico può essere in forma solida o liquida.

Quando il prodotto agro-chimico è in forma solida, detta forma solida può essere una compressa, una mini-compressa, una micro-compressa, un granulo, un micro-granulo, un pellet, un multiparticolato, un particolato micronizzato o una polvere.

Quando il prodotto agro-chimico è in forma liquida, detta forma liquida può essere una soluzione, una sospensione, un'emulsione, una dispersione, gocce o fluido atomizzabile, e può essere una forma liquida a base acquosa o oleosa. Detta forma liquida può comprendere un solvente. Idonei solventi sono acqua, glicoli, alcol, polialcoli, acidi organici e loro combinazioni.

Solventi preferiti sono acqua, metanolo, etanolo, n-propanolo, iso-propanolo, nbutanolo, isobutanolo, alcol allilico, 1,2-propilenglicole, 1,3-propilenglicole, 1,2-etilenglicole, polietilenglicole (PEG), glicerolo, acido lattico, acido polilattico e loro miscele. Solventi maggiormente preferiti sono acqua, 1,2-propilenglicole, 1,3-propilenglicole, 1,2-etilenglicole, polietilenglicole (PEG) e loro miscele.

Preferibilmente, quando il prodotto agro-chimico è in forma liquida, detta forma liquida presenta un pH di 5-9, più preferibilmente di 6-8.

Quando il prodotto agro-chimico è in forma liquida, detta forma liquida comprende 1-50% in peso della composizione. Ciò significa che il prodotto agro-chimico è un concentrato che può essere idoneamente diluito o direttamente miscelato con altre sostanze chimiche prima dell'uso, qualora lo si desideri.

Detto prodotto agro-chimico può essere un'esca in grani, bombolette spray, un liquido (senza diluizione), un'esca sfusa, matrici, un'esca concentrata, un concentrato fluido miscibile in oli, granuli incapsulati, una sospensione di capsule, un concentrato dispersibile, una polvere, una polvere per la concia a secco dei semi, un concentrato emulsionabile, un liquido caricabile elettricamente, un'emulsione acqua in olio, un'emulsione per la concia dei semi, un'emulsione olio in acqua, un barattolo fumogeno, granuli fini, una candela fumogena, una cartuccia fumogena, una stecca fumogena, una sospensione concentrata per concia, una compressa fumogena, un agente fumogeno (fumigante), granuli (o pellet) fumogeni, un gas (in pressione), un'esca granulare, un prodotto gassificabile, un prodotto microgranulare, una polvere scorrevole, un prodotto granulare, una pasta a base oleosa, un concentrato di scarico di fumi caldi, una confezione combinata solido / liquido, una confezione combinata liquido / liquido, un concentrato di scarico di fumi freddi, una confezione combinata solido / solido, una lacca, una soluzione per la concia dei semi, una microemulsione, un prodotto microgranulare, un olio dispersibile, una sospensione concentrata miscibile in olio, un liquido miscibile in olio, una sospensione oleosa, una pasta, un'esca piatta, una pasta o un gel concentrati, un prodotto da versare, uno stick per vegetali, semi trattati o rivestiti, un'esca pronta per l'uso, un prodotto da applicare a punti, un'esca frammentata, una sospensione concentrata, una sospensione-emulsione, un prodotto granulare idrosolubile, un concentrato solubile, un olio per la formazione di film, una polvere idrosolubile, una polvere solubile per la concia dei semi, una sospensione, compresse, un materiale tecnico, un concentrato tecnico, una polvere per tracce, un liquido a volume ultraridotto, un prodotto microgranulare idrodispersibile, un prodotto granulare idrodispersibile, una polvere bagnabile, una polvere bagnabile per la concia dei semi, un cerotto autoadesivo e loro combinazioni.

Vantaggiosamente, il prodotto agro-chimico può ulteriormente comprendere un fertilizzante comprendente composti di azoto, fosforo, potassio o loro miscele.

In un ulteriore aspetto, la presente invenzione riguarda un metodo per promuovere la crescita vegetale e la produzione di frutti, detto metodo comprendendo la fase di applicazione della composizione o del prodotto agro-chimico ad un vegetale o ad un terreno per vegetali.

Il prodotto agro-chimico può essere applicato tramite una o più delle procedure seguenti:

- miscelazione del prodotto agro-chimico con i semi in una tramoggia di una seminatrice,

- spargimento del prodotto agro-chimico in prossimità dei solchi di semina,

- spargimento del prodotto agro-chimico sull'intero campo prima o dopo l'ultimo dissodamento del terreno.

Quando il prodotto agro-chimico è in forma liquida, esso può essere applicato anche tramite una o più delle procedure seguenti:

- nebulizzazione del prodotto agro-chimico su tuberi, bulbi e semi,

- nebulizzazione del prodotto agro-chimico sulla parte aerea della pianta, foglie, steli, - immersione delle radici delle piante in una soluzione acquosa comprendente il prodotto agro-chimico.

Il prodotto agro-chimico può essere applicato in una quantità tale da ottenere 1.000 g -10.000 kg di composizione per ettaro (ha), preferibilmente 1.000 g – 1.000 kg per ha, più preferibilmente 1.000 g – 10.000 g per ha.

Resta anche inteso che tutte le combinazioni degli aspetti preferiti della composizione dell'invenzione, così come dei processi di preparazione e dei rispettivi usi, così come sopra riportato, sono da intendersi ivi divulgati.

È da intendersi che risultano ivi descritte anche tutte le combinazioni degli aspetti preferiti della composizione dell'invenzione, dei processi di preparazione e degli usi divulgati in precedenza.

Di seguito sono riportati esempi operativi della presente invenzione, forniti per finalità illustrative.

ESEMPI

In tali Esempi, M<w >e M<n >sono stati misurati tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare conformemente alla procedura che segue.

“wt%” indica la percentuale in peso basata sul peso della composizione, salvo quanto diversamente specificato.

Reagenti e materiali

- Eluente: 0,1 M di NaOH, flusso 0,5 ml/min

- Taratura per rilevatore RI: standard Pullulan, Mp: 100.000 – 1.080 (sei standard), ove Mp è il peso molecolare massimo di picco

- Taratura per rilevatore UV (280 nm): standard PSS, sale di sodio polistirensolfonato, Mp 65.400 – 891 (sei standard). Gli standard sono sciolti in acqua ultra-pura, la concentrazione dovrebbe essere circa pari a 5 mg/ml. Il volume di iniezione è di 20 µl. - Campioni di controllo qualità: si è usata lignina con distribuzione Mw nota.

Attrezzature e strumenti

- Autocampionatore Dionex Ultimate 3000, vano colonne e pompa

- Rivelatore a Serie di Diodi Dionex Ultimate 3000

- Rivelatore a Indice Riflettente: Shodex RI-101

- Colonne: colonne PSS MCX: precolonna e due colonne analitiche: 1000 Å e 100000 Å, il materiale della colonna è una matrice di copolimero solfonato divinilbenzene. - Filtri a siringa 0,45 µm e bottiglie in vetro per campioni relativamente ai campioni STD. Filtrazione campioni:

Dispositivo filtrante senza siringa Mini-Uniprep in PTFE o Nylon, da 0,45 µm. Relativamente alla prefiltrazione è necessario un filtro a siringa da 5 µm.

- Bottiglie graduate

Procedura

- Preparazione dell'eluente

Idealmente, l'acqua usata per preparare gli eluenti dovrebbe essere acqua deionizzata di alta qualità a bassa resistività (18 MΩ�cm o meglio), che contenga la quantità minima possibile di biossido di carbonio disciolto. L'acqua deve essere priva di contaminazione biologica (ad es., batteri e muffe) e di particolato.

- Lavaggio aghi con 10 % di MeOH-acqua

- Campioni liquidi

Campioni di liquor alcalino forte sono diluiti 1:100 e filtrati con filtri a siringa in PTFE (0,45 µm) in fiale. I campioni di lignina solida sono diluiti e sciolti in 0,1 M di NaOH e filtrati con filtri a siringa in PTFE da 0,45 µm. I campioni pronti sono caricati nell'autocampionatore. Il volume di iniezione è di 20 µl. Dopo i campioni, 1 M di NaOH è iniettata come un campione per pulire la colonna.

Parametri degli strumenti:

- Portata 0,5 ml/min

- Eluente 0,1 M di NaOH

- Temperatura forno colonna 30°C

- Esecuzione isocratica

- Tempo di esecuzione 48 minuti

- Campioni solidi

I campioni solidi (lignina) sono essiccati nottetempo in un forno a 60°C, qualora necessario. Circa 10 mg sono pesati in una bottiglia graduata da 10 ml. Il campione è sciolto e diluito in 0,1 M di soluzione di NaOH ed inserito in una fiala. Il campione è filtrato con filtri in PTFE da 0,45 µm. Se il campione non si scioglie correttamente, esso può essere posto in un bagno d'acqua a ultrasuoni o il campione può essere filtrato con un filtro a siringa da 5 µm.

- Campioni standard per la taratura

Circa 50 mg di ogni standard sono pesati in una bottiglia graduata da 10 ml ed è aggiunta acqua ultrapura; il campione è inserito in una fiala. Gli standard sono filtrati con filtri a siringa in PTFE da 0,45 µm. Dopo l'esecuzione dei campioni di taratura, i risultati di taratura sono integrati ed elaborati nel procedimento di elaborazione, nonché salvati. La taratura è una taratura lineare di primo grado.

- Campioni di controllo qualità

Relativamente ai campioni di lignina, si è utilizzata, quale campione di controllo qualità, lignina con una distribuzione di Mw nota. La lignina è sciolta in 0,1 M di NaOH e la concentrazione è pari a circa 1 mg/ml.

ESEMPIO 1.

Lignina organosolv ottenuta da legno di faggio (Fagus sylvatica) è stata sottoposta ad un pre-trattamento enzimatico per rimuovere le emicellulose e, in seguito, la cellulosa è stata idrolizzata. La frazione di lignina in tal modo separata dalla biomassa pura presenta le caratteristiche seguenti:

> 95% di solidi totali

Singola specie: Legno di faggio

Mw 9.000-11.000 Da (50-61 unità fenilpropaniche)

essenzialmente senza zolfo (contenuto di zolfo inferiore al 3%)

comprende 23-29 wt% di cellulosa.

Tale frazione di lignina solida è denominata sinteticamente “EOS”.

ESEMPIO 2.

La frazione di lignina seguente è stata estratta da liquor nero Kraft, detta frazione di lignina presentando le caratteristiche seguenti:

> 95% di solidi totali

Singola specie: Pino giallo del sud

Mw 4400-5000 Da (24-28 unità fenilpropaniche)

Mn 1200-1300 Da (6-7 unità fenilpropaniche)

Strutture dei gruppi OH:

alifatico 2,1 mmol/g

carbossilico 0,5 mmol/g

condensato e siringile 1,7 mmol/g

guaiacile 2,0 mmol/g

catecolico e p-OH-fenile 4,0 mmol/g

Tale frazione di lignina solida è denominata sinteticamente “OXO”.

ESEMPIO 3.

Materiali e procedimenti

Piantine germogliate, dieci giorni dopo la semina in scatole di polistirolo, sono state trapiantate nel terreno al di sotto di tunnel in plastica e sono state bagnate con 50 ml di una composizione di cui alla Tabella 1 che segue (ovvero il Trattamento). Una successiva applicazione con 50 ml della stessa composizione è stata effettuata dopo dieci giorni. Applicazioni successive sono state effettuate ogni dieci giorni per due mesi su ogni pianta, con 150-200 ml di composizione acquosa (Tabella 1).

Ove il trattamento riguarda una combinazione con un fungo, i ceppi sono stati miscelati ad un rapporto di 1:1 o 1:1:1, con una concentrazione finale di 4 x 10<6 >spore ml<–1>.

Il riferimento (ovvero il controllo negativo) è stato ottenuto bagnando il terreno unicamente con acqua.

Ogni insieme di trattamenti di cui alla Tabella 1 era composto da 21 piante (7 piante per tre esperimenti biologici ripetuti in aree di terreno selezionate casualmente).

Tabella 1.

I frutti maturi sono stati raccolti 3 volte in 2 mesi (agosto e settembre), iniziando dopo 3 mesi dal trapianto.

La produttività dei pomodori è stata valutata misurando il rendimento in termini di grammi di frutti di pomodoro per pianta (considerando i primi due rami fruttiferi, iniziando dal basso), e di numero di frutti per pianta di ogni trattamento.

Risultati

Nei presenti esempi, le composizioni sono state applicate alle piantine di pomodori per valutare il loro effetto sulla crescita vegetale e sul rendimento.

I risultati ottenuti dagli esperimenti sul campo e mostrati nelle Figure 1-4 hanno evidenziato che le composizioni sono state maggiormente performanti in termini di promozione della crescita e di rendimento, determinando un aumento della produzione in termini di numero e di kg di frutti di pomodoro per pianta, rispetto ai singoli costituenti delle composizioni.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizione comprendente un fungo del genere Trichoderma ed una frazione di lignina, in cui: - detto fungo è selezionato dalle specie di Trichoderma, da loro fusanti di protoplasti e loro miscele, - detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale fino a 20.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo fino a 111 unità fenilpropaniche su media ponderale, ed in cui il fungo è in una concentrazione fino a 1x10<7 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in una concentrazione fino a 5% in peso, sul peso della composizione.
2. La composizione di rivendicazione 1, in cui detta specie di Trichoderma è selezionata da Trichoderma aggressivum, Trichoderma asperellum, Trichoderma atroviride, Trichoderma citrinoviride, Trichoderma cremeum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma virens, Trichoderma viride e Trichoderma viridescens.
3. La composizione di rivendicazione 1 o 2, in cui detto fungo è selezionato da T. Harzianum, T. Atroviride e T. virens, e loro miscele.
4. La composizione di rivendicazione 3, in cui detto fungo è selezionato da T. Harzianum HK2, T. Atroviride HK4 e T. virens GV41, e loro miscele.
5. La composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui detto fungo è in concentrazione da 1x10<6 >a 8x10<6 >spore/ml di composizione, preferibilmente da 2x10<6 >a 6x10<6 >spore/ml di composizione, più preferibilmente da 3x10<6 >a 5x10<6 >spore/ml di composizione.
6. La composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 2.000-20.000 Dalton, preferibilmente di 3.000-20.000 Dalton, più preferibilmente di 4.000-15.000 Dalton.
7. La composizione di rivendicazione 6, in cui detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 4.000-6.000 Dalton o di 9.000-11.000 Dalton.
8. La composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, ulteriormente comprendente fino a 30% in peso di cellulosa, più preferibilmente 20-30 % in peso di cellulosa, sul peso della frazione di lignina.
9. La composizione di rivendicazione 1, in cui: - detto fungo è selezionato da Trichoderma harzianum, Trichoderma atroviride Trichoderma virens e loro miscele, - detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 3.000-20.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 11-111 unità fenilpropaniche su media ponderale, ed in cui il fungo è in concentrazione da 1x10<6 >a 8x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 0,1% a 4% in peso, sul peso della composizione.
10. La composizione di rivendicazione 9, in cui: - detto fungo è selezionato da Trichoderma harzianum, Trichoderma atroviride Trichoderma virens e loro miscele, - detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 3.000-20.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 16-111 unità fenilpropaniche su media ponderale, ed in cui the fungo è in concentrazione da 2x10<6 >a 6x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 0,5% a 3% in peso, sul peso della composizione.
11. La composizione di rivendicazione 10, in cui: - detto fungo è selezionato da Trichoderma harzianum HK2, Trichoderma atroviride HK4, Trichoderma virens GV41 e loro miscele, - detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 4.000-6.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 22-33 unità fenilpropaniche su media ponderale, ed in cui il fungo è in concentrazione da 3x10<6 >a 5x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 1% a 2% in peso, sul peso della composizione.
12. La composizione di rivendicazione 10, in cui: - detto fungo è selezionato da Trichoderma harzianum HK2, Trichoderma atroviride HK4, Trichoderma virens GV41 e loro miscele, - detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 9.000-11.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 50-61 unità fenilpropaniche su media ponderale, ed in cui il fungo è in concentrazione da 3x10<6 >a 5x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 1% a 2% in peso, sul peso della composizione.
13. La composizione di rivendicazione 12, in cui: - detto fungo è Trichoderma virens GV41, - detta frazione di lignina comprende frammenti aventi un peso molecolare medio ponderale di 9.000-11.000 Dalton, come misurato tramite Cromatografia di Esclusione Molecolare, detti frammenti comprendendo 50-61 unità fenilpropaniche su media ponderale, ed in cui il fungo è in concentrazione da 3x10<6 >a 5x10<6 >spore/ml di composizione, e la frazione di lignina in concentrazione da 1% a 2% in peso, sul peso della composizione.
14. Uso della composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13, quale promotrice di crescita vegetale e di produzione di frutti in agricoltura.
15. Prodotto agro-chimico comprendente la composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13 ed additivi agro-chimici.
16. Metodo per promuovere la crescita vegetale e la produzione di frutti, detto metodo comprendendo la fase di applicazione della composizione di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-13 o del prodotto agro-chimico di rivendicazione 15 ad un vegetale o ad un terreno per vegetali.