CN113242694A - 植物生长促进剂组合物、用于制备其的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

公开了一种包含木霉属(Trichoderma)的真菌和木质素级分的组合物以及用于制备所述组合物的方法和所述组合物在农业中作为植物生长和果实生产促进剂的用途。在另外的方面，还公开了包含所述组合物和农业化学添加剂的农业化学产品。

Description

植物生长促进剂组合物、用于制备其的方法及其用途

描述

技术领域

本发明涉及一种包含木霉属(Trichoderma)的真菌和木质素级分的组合物以及用于制备所述组合物的方法和所述组合物在农业中作为植物生长和果实生产促进剂的用途。

背景技术

主要由植物生长所需的各种类型营养组分组成的肥料已经在世界各地被广泛用于改进农产品产量。通常，肥料可以呈纯液体、悬浮液或固体的形式。它们可以通过土壤施用(feed)或通过诸如喷雾、浇灌等应用于植物的叶上而引入植物中。近年来，由于叶面肥料具有对环境较小的负面影响，其已经逐渐取代了农业场地常用的土壤应用肥料。研究表明，通过土壤施用的常规施肥方法已经造成了水表面和地下水污染。这主要是由于肥料中的可溶性营养物质，诸如氮，被淋溶到含水层中。这种情况可能导致营养物质很少向植物细胞运输。因此，人们发现通过植物的叶直接向植物提供营养物质更为理想。叶面肥料显示克服了土壤施用方法的缺点，然而，对植物不恰当地应用这种叶面肥，例如，当高浓度的营养物质直接应用到叶上时，可能导致呈现叶片坏死区域或灼伤的形式的叶损害，并且因此引起作物产量降低。据推测，降低营养物质的量的叶面肥料可以防止叶损害。然而，这是不切实际的，因为需要劳动密集型操作来用低营养物质含量的叶面肥料给植物施肥。例如，美国专利6,475,258公开了一种叶面肥料组合物，用于通过叶面应用来增强植物的生长。所述组合物是由至少一种辅酶以及碳水化合物源、络合剂和防腐剂中的至少一种组成的水溶液，其中所述辅酶优选地是维生素B，并且更优选地是叶酸和/或吡哆醇。尽管该主题肥料可以通过增强植物的代谢活性来实质上改进植物对营养物质的吸收，然而，来自土壤或来自叶面肥料的营养物质被掺入植物细胞中的可利用性尚待解决。

因此，人们感到需要通过向植物提供足够量的营养物质来有效地促进植物生长而不引起对叶的任何损害，并且特别地保护人类和动物的健康、作物和环境。

发明概述

根据权利要求1所述的，以上目的通过包含木霉属的真菌和木质素级分的组合物实现。

在另一方面，本发明涉及所述组合物在农业中作为植物生长和果实生产促进剂的用途。

在另外的方面，本发明涉及包含该组合物和农业化学添加剂的农业化学产品。

在另外的方面，本发明涉及一种用于促进植物生长和果实生产的方法，所述方法包括将所述组合物或所述农业化学产品应用于植物或植物土壤的步骤。

术语“植物”是指可以为盈利或生存而种植和收获的(因此包括作物、谷物、蔬菜、水果和花卉)以及为园艺或个人使用而种植和收获的一种或更多种植物。

术语“植物土壤”是指植物生长或植物被播种或植物将被播种的土壤，因此包括地面、土地和无土基质，诸如水生栽培和水培。

附图简述

从以下详细描述、从为了说明性目的提供的工作实例、以及从所附的附图，本发明的特性和优势将变得清楚，其中：

-图1示出了本发明的组合物对番茄产量的影响。条表示每株植物的平均产量，以每结果枝产生的番茄果实的克数来表示。按照实施例3，根据ANOVA和LSD检验(p≤0.05)，条上的不同字母表示显著差异；

-图2示出了本发明的组合物对番茄产量的影响。条表示每株植物的平均产量，以每株植物生产的番茄果实数目来表示。按照实施例3，根据ANOVA和LSD检验(p≤0.05)，条上的不同字母表示显著差异；

-图3示出了本发明的组合物对番茄产量的影响。条表示每株植物的平均产量，以每株植物生产的番茄果实的克数来表示。按照实施例3，根据ANOVA和LSD检验(p≤0.05)，条上的不同字母表示显著差异；以及

-图4示出了本发明的组合物对番茄产量的影响。条表示每株植物的平均产量，以每株植物生产的番茄果实数目来表示。按照实施例3，根据ANOVA和LSD检验(p≤0.05)，条上的不同字母表示显著差异。

发明详述

因此，本发明的主题是包含木霉属的真菌和木质素级分的组合物，其中：

-所述真菌选自木霉属物种、它们的原生质体融合体及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的多达20,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均多达111个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是多达1×10⁷个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是多达基于所述组合物的重量的5wt％。

优选地，该组合物呈水溶液、分散体或悬浮液的形式。

优选地，所述木霉属物种选自侵占木霉(Trichoderma aggressivum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)、奶油木霉(Trichoderma cremeum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿木霉(Trichoderma virens)、绿色木霉(Trichoderma viride)和渐绿木霉(Trichoderma viridescens)。

如以上定义的属于木霉属的真菌能够定殖多种生态位，拮抗和控制植物病原微生物，并且与植物建立直接有益的相互作用，导致对生长、营养物质吸收和对病害的系统抗性的增强。特别地，植物发育的改进通常伴有种子发芽、根系、植物重量和叶片面积、种子、花和/或果实的尺寸和/或数目的增加，以及产量并且通常重要营养因子的含量的随之增加。

已知木质素具有抗真菌和细菌二者的抗微生物活性。因此，预期以发现对已经测试的大多数其他真菌是有毒的木质素浓度对木霉属(一种熟知的土传真菌)的处理将导致直接抑制。因此，木霉属在通常考虑用于农业应用的木质素浓度将受到影响是合理的预期。令人惊讶且出乎意料的是，如下文实施例中示出的，以上列出的木霉属物种不仅未受给定浓度的木质素级分的影响，而且在植物生产力方面以及植物生长方面甚至增加了它们的活性。

特别地，观察到与单组分应用相比，对植物生长促进的效果在一些情况下涉及多达25％的增加。

除了以上所述之外，应该理解木霉属物种和木质素级分以不同的方式工作并且使用不同的机制：这使得所得的组合物的效果在各种条件下更加稳健且合适，同时降低抗性机制的叛乱(insurgence)(用于生物控制)。

此外，该组合物的生产简单且有成本效益，因为各自的浓度有利地非常低。这也意味着该组合物可以制备成浓缩形式，在使用前可以容易地用水稀释至以上浓度。

术语“原生质体融合体”意在包括通过原生质体融合获得的木霉属物种(Trichoderma spp.)的杂交菌株。

原生质体是细胞壁被去除的细胞，并且细胞质膜是这种细胞的最外层。原生质体可以通过去除细胞壁的特异性裂解酶来获得。原生质体融合是一种物理现象，在融合期间，两个或更多个原生质体自发地或在融合诱导剂的存在下彼此接触并粘附。通过原生质体融合，将一些有用的基因从一个物种转移到另一个物种是可能的。原生质体融合是在菌株改进用于使丝状真菌遗传重组和开发杂交菌株中的重要工具。所述改进可以包括例如纤维素酶产生中的更高产量。

用于本发明目的的原生质体融合体可以根据本领域已知的技术(例如，Hassan MM(2014)Influence of protoplast fusionbetweentwo Trichodermaspp.onextracellular enzymes productionand antagonistic activity,Biotechnology&Biotechnological Equipment,28:6,1014-1023)获得。

在本发明组合物的优选的实施方案中，木霉属的真菌选自哈茨木霉(T.Harzianum)、深绿木霉(T.Atroviride)和绿木霉(T.virens)及其混合物。

在一些实施方案中，组合物包含木霉属物种的混合物。

在更优选的实施方案中，所述真菌选自哈茨木霉HK2、深绿木霉HK4和绿木霉GV41及其混合物，其中“HK2”、“HK4”和“GV41”是各自优选的菌株。

在一些实施方案中，组合物包含木霉属菌株的混合物。

当混合物存在于组合物中时，每种物种或菌株处于相同或大约相同的浓度。

在优选的实施方案中，组合物包含浓度比例为2:1至1:2，优选地1:1的两种木霉属物种或两种木霉属菌株。

优选地，真菌的浓度是1×10⁶个至8×10⁶个孢子/ml组合物。更优选地，真菌的浓度是2×10⁶个至6×10⁶个孢子/ml组合物。在优选的实施方案中，真菌的浓度是3×10⁶个至5×10⁶个孢子/ml组合物。

木质素是一类复杂的有机聚合物，在一些藻类、维管植物(包括其树皮)和草本植物(诸如木材(即软木和硬木)、所有谷物的秸秆、甘蔗渣、草、亚麻、黄麻、工业大麻(hemp)或棉花)的支持组织中形成重要的结构材料。木质素也可以具有矿物质来源，诸如泥炭、风化褐煤和煤。

化学上，木质素在其天然形式中是一种由许多不同的键连接的非常不规则的、随机交联的苯基丙烷单元聚合物，具有20,000道尔顿或更高的重均分子量。包含最重要结合模式的代表性和说明性木质素片段(I)在本文下文示出：

所述聚合物是三种苯基丙烷类单体前体的酶介导脱氢聚合的结果：

其分别产生以下部分：

松柏醇存在于所有物种中，并且是松柏类(软木)中的主要单体。落叶植物(硬木)物种包含多达40％的芥子醇单元，而草和农作物也可能包含香豆醇单元。

木质素可以根据其原始生物质来源分为软木木质素和硬木木质素。

可以作为获得相关木质素级分的合适起始材料的原始生物质来源是任何木质素，包括基本上纯的木质素以及硫酸盐浆木质素(kraft lignin)、源自生物质的木质素、来自碱性制浆过程(alkaline pulping process)的木质素、来自苏打过程(soda process)的木质素、来自有机溶剂制浆(organosolv pulping)的木质素、来自酶促过程(enzymaticprocesses)的木质素、来自蒸汽爆破过程(explosion processes)的木质素及其任何组合。

表述“基本上纯的木质素”应理解为基于干燥的原始生物质的至少80％纯的木质素，优选地至少90％纯的木质素，更优选地至少95％纯的木质素，剩余为提取物和碳水化合物，诸如半纤维素以及无机物。

表述“硫酸盐浆木质素(kraft lignin)”应被理解为源自硫酸盐浆黑液(kraftblack liquor)的木质素。黑液是硫酸盐法制浆过程(kraft pulping process)中使用的木质素残渣、半纤维素和无机化学品的碱性水溶液。来自制浆过程的黑液包含源自不同比例的不同软木和硬木物种的组分。木质素可以通过不同的技术(包括例如沉淀和过滤)从黑液中分离。木质素通常在低于11-12的pH值开始沉淀。可以使用不同的pH值来沉淀具有不同特性的木质素级分。这些木质素级分可以因分子量分布(例如，M_w和M_n)、多分散性、半纤维素和提取物含量、无机物质含量而彼此不同。沉淀的木质素可以使用酸性洗涤步骤从无机杂质、半纤维素和木材提取物中纯化。进一步的纯化可以通过过滤来实现。

可选地，将木质素从纯的生物质中分离。分离过程可以从用强碱液化生物质开始，随后是中和过程。碱处理后，木质素可以以与上述类似的方式沉淀。

优选地，从生物质中分离木质素包括酶处理的步骤。酶处理改变了要从生物质中提取的木质素。从纯的生物质中分离的木质素基本上不含硫(硫含量低于3％)，并且因此在进一步加工中很有价值。优选地，木材材料被预处理以去除半纤维素，并且此后纤维素被水解。所得不溶性木质素级分包含多达30wt％的纤维素。

优选地，分离的木质素还经历解聚过程以进一步降低片段的重均分子量。

在一些实施方案中，分离的木质素还经历解聚过程以进一步降低片段的重均分子量和数均分子量。

合适的解聚过程包括碱催化解聚、酸催化解聚、金属催化解聚、离子液体辅助解聚和超临界流体辅助木质素解聚。

在优选的实施方案中，所述木质素级分通过碱催化解聚获得。

优选地，所述木质素级分通过将分离的木质素在低于300℃的温度和低于30MPa的压力进行碱催化解聚获得。

通过添加碱诸如NaOH、KOH、Ca(OH)₂、LiOH、K₂CO₃或其混合物，将pH设定在11与14之间。

木质素级分中片段的重均分子量(M_w)通过尺寸排阻层析(或“SEC”)测量。SEC采用存在于珠孔中的停滞液体作为固定相，并且流动液体作为流动相。因此，流动相可以在珠之间流动，并且也可以流入和流出珠的孔。分离机制基于溶液中聚合物分子的尺寸。较大分子将首先洗脱。可以进入珠的许多孔的小分子需要很长时间才能通过柱，并且因此缓慢地离开柱。为了确定聚合物样品组分的分子量，必须用已知重量的标准聚合物进行校准。然后将来自未知样品的值与校准图进行比较。保留时间取决于所使用的柱材料、洗脱液以及所使用的标准品与样品相比的相似程度。优选地，洗脱液优选地是0.1M NaOH。

优选地，所述木质素级分包含具有2,000-20,000道尔顿的重均分子量的片段。

更优选地，所述木质素级分包含具有3,000-20,000道尔顿的重均分子量的片段。

甚至更优选地，所述木质素级分包含具有4,000-15,000道尔顿的重均分子量的片段。

在一些优选的实施方案中，所述木质素级分包含具有4,000-6,000道尔顿的重均分子量的片段。

在其他优选的实施方案中，所述木质素级分包含具有9,000-11,000道尔顿的重均分子量的片段。

优选地，在这些实施方案中，所述片段包含重均11-111个苯基丙烷单元，更优选地包含重均22-111个苯基丙烷单元。

三种苯基丙烷类单体前体的分子量在150Da的香豆醇、180Da松柏醇与210Da芥子醇之间变化。因此，平均重量是180Da，并且该值被用作“苯基丙烷单元”。M_w值除以180Da，从而获得重均苯基丙烷单元数目。

在另外的实施方案中，木质素级分具有1.25至12的多分散性指数(PDI)。

多分散性指数(PDI)或不均匀性指数，或简称为分散性，是给定聚合物样品中分子质量分布的量度。PDI是重均分子量(M_w)除以数均分子量(M_n)。它表示一批聚合物中个体分子质量的分布。

优选地，所述木质素级分还包含基于木质素级分的重量的高达30wt％的纤维素，更优选地10wt％-30wt％的纤维素。木霉属的真菌产生纤维素降解酶，诸如外切葡聚糖酶(EXG)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BGL)。纤维素酶是将纤维素底物完全水解成其单体葡萄糖(一种可发酵的糖)的最有效的酶系统。由于糖有助于植物细胞呼吸和细胞生长，因此本发明组合物中纤维素的存在有利于进一步改进促进植物生长的整体效率。

在优选的实施方案中，本发明的组合物包含木霉属的真菌和木质素级分，其中：

-所述真菌选自哈茨木霉、深绿木霉、绿木霉及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的3,000-20,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均16-111个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是1×10⁶个至8×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的0.1wt％至4wt％。

更优选地，本发明的组合物包含木霉属的真菌和木质素级分，其中：

-所述真菌选自哈茨木霉、深绿木霉、绿木霉及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的3,000-20,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均16-111个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是2×10⁶个至6×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的0.5wt％至3wt％。

在一些优选的实施方案中，本发明的组合物包含木霉属的真菌和木质素级分，其中：

-所述真菌选自哈茨木霉HK2、深绿木霉HK4、绿木霉GV41及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的4,000-6,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均22-33个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是3×10⁶个至5×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的1wt％至2wt％。

在其他优选的实施方案中，本发明的组合物包含木霉属的真菌和木质素级分，其中：

-所述真菌选自哈茨木霉HK2、深绿木霉HK4、绿木霉GV41及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的9,000-11,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均50-61个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是3×10⁶个至5×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的1wt％至2wt％。

最优选的实施方案是其中本发明的组合物包含木霉属的真菌和木质素级分的那些，其中：

-所述真菌是绿木霉GV41，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的9,000-11,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均50-61个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是3×10⁶个至5×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的1wt％至2wt％。

在其他实施方案中，组合物主要由木霉属的真菌和木质素级分组成，其中：

-所述真菌选自侵占木霉、棘孢木霉、深绿木霉、桔绿木霉、奶油木霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿木霉、绿色木霉、渐绿木霉、其原生质体融合体及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的多达10,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均多达55个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是多达1×10⁷个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是多达基于所述组合物的重量的5wt％。为了本发明的目的，表述“基本上由...组成”意指所述真菌和所述木质素级分是组合物中存在的充当植物生长和果实生产促进剂的仅有的活性成分，可能存在的其他组分具有不同的活性或是简单的共配方。

在另外的实施方案中，如以上描述的，组合物由木霉属的真菌和木质素级分组成。

在另一方面，本发明涉及所述组合物在农业中作为植物生长和果实生产促进剂的用途。

优选地，组合物可以以每5-15天、每株植物100-300ml的量应用。

在另外的方面，本发明涉及包含该组合物和农业化学添加剂的农业化学产品。

合适的添加剂是pH调节剂、酸度调节剂、水硬度调节剂、矿物油、植物油、肥料、叶肥(leaf manures)及其组合。

示例性添加剂包括2-乙基己醇EO-PO、烷氧基化醇、烷氧基化脂肪胺、烷氧基化甘油三酯、烷基糖苷(alkyl polyglycoside)、烷基醚硫酸钠盐、烷基酚环氧乙烷缩合物、烷基苯基羟基聚氧乙烯、烯丙基聚乙二醇甲醚、两性二丙酸酯表面活性剂、二-1-对-薄荷烯、二甲基聚硅氧烷、酯化植物油、环氧乙烷缩合物、脂肪酸酯、脂肪醇环氧乙烷缩合物、脂肪醇聚烷氧基化物、卵磷脂(大豆)、甲基化菜籽油、n-十二烷基吡咯烷酮、n-甲基吡咯烷酮、n-辛基吡咯烷酮、非离子表面活性剂、壬基酚环氧乙烷缩合物、石蜡油、聚(乙烯吡咯烷酮/1-十六碳烯、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚环氧烷(polyalkyleneoxide)、聚醚改性三硅氧烷、聚乙烯聚丙二醇、聚氧乙烯单月桂酸酯、丙酸、苯乙烯-丁二烯共聚物、合成胶乳(syntheticlatex)、牛油脂肪胺乙氧基化物、植物油及其混合物。

鉴于组合物甚至在真菌和木质素级分的浓度非常低的情况下也是有效的这一事实，农业化学产品有利地且优选地包含浓度为1-500克/kg农业化学产品的所述组合物。

农业化学产品可以呈固体或液体形式。

当农业化学产品呈固体形式时，所述固体形式可以是片剂、迷你片剂、微型片剂、颗粒剂、微型颗粒、丸剂、多颗粒、微粉化颗粒或粉末。

当农业化学产品呈液体形式时，所述液体形式可以是溶液、悬浮液、乳液、分散体、滴剂或可喷雾流体，并且可以是水基或油基液体形式。所述液体形式可以包含溶剂。合适的溶剂是水、乙二醇、醇、多元醇、有机酸及其组合。

优选的溶剂是水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、烯丙醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-乙二醇、聚乙二醇(PEG)、甘油、乳酸、聚乳酸及其混合物。更优选的溶剂是水、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、1,2-乙二醇、聚乙二醇(PEG)及其混合物。

优选地，当农业化学产品呈液体形式时，所述液体形式具有5-9、更优选地6-8的pH。

当农业化学产品呈液体形式时，所述液体形式包含1wt％-50wt％的组合物。这意味着农业化学产品是一种浓缩物，如果需要，该浓缩物可以在使用前适当稀释或直接与其他化学品混合。

所述农业化学产品可以是谷物诱饵、气溶胶罐、液体(不稀释)、散装诱饵、基质、浓缩诱饵、可混溶于油的液体浓缩物、封装颗粒、胶囊悬浮液、可分散浓缩物、粉末、用于干法鞣制种子的粉末、可乳化浓缩物、电学上可带电液体、油包水乳液、用于鞣制种子的乳液、水包油乳液、烟熏罐、细颗粒、烟熏蜡烛、烟熏筒、烟熏条(smoky slat)、用于鞣制的浓缩悬浮液、烟熏片剂、吸烟剂(熏蒸剂)、烟熏颗粒(或丸剂)、气体(在压力下)、颗粒状诱饵、可气化产品、微粒、滑动粉末(sliding powder)、颗粒、油基糊状物、热烟排放浓缩物、固体/液体组合包装、液体/液体组合包装、冷烟排放浓缩物、固体/固体组合包装、漆、用于鞣制种子的溶液、微乳液、微粒、可分散的油、可混溶于油的浓缩悬浮液、可混溶于油的液体、油悬浮液、糊状物、扁平诱饵、浓缩糊状物或凝胶、浇泼剂(pour-on)、植物用棒(stick for plants)、处理过的或包衣的种子、准备使用的诱饵、滴剂(spot-on)、碎片诱饵、浓缩悬浮液、悬浮液-乳液、可溶于水的颗粒、可溶性浓缩物、成膜油、可溶于水的粉末、用于鞣制种子的可溶性粉末、悬浮液、片剂、技术材料(technical material)、技术浓缩物(technicalconcentrate)、痕量粉末(powder for traces)、超低容量液体、水可分散微粒、水可分散颗粒、可湿性粉末、用于鞣制种子的可湿性粉末、自粘贴剂及其组合。

有利地，农业化学产品还可以包括包含氮、磷、钾化合物或其混合物的肥料。

在另外的方面，本发明涉及一种用于促进植物生长和果实生产的方法，所述方法包括将组合物或农业化学产品应用于植物或植物土壤的步骤。

农业化学产品可以通过以下一种或更多种程序应用：

-将农业化学产品与种子在播种机的料斗中混合，

-将农业化学产品喷洒在播种沟旁边，

-在最后一次土壤耕作前或后，在整个田地喷洒农用化学产品。

当农业化学产品呈液体形式时，它也可通过以下一种或更多种程序应用：

-将农业化学产品喷雾在块茎、球茎和种子上，

-将农业化学产品喷雾在植物的地上部分、叶片、茎上，

-将植物根浸入包含农业化学产品的水溶液中。

农业化学产品可以以达到以下的量应用：1,000g-10,000kg组合物/每公顷(ha)，优选地1,000g–1,000kg/ha，更优选地1,000g–10,000g/ha。

还应该理解的是，如以上报道的，本发明组合物的优选方面的所有组合，以及其制备方法和用途都应被认为在此公开。

以上公开的本发明组合物、制备方法和用途的优选方面的所有组合应理解为在本文描述。

以下是为了说明性目的而提供的本发明的工作实施例。

实施例

这些实施例中的M_w和M_n已经根据以下程序通过尺寸排阻层析测量。

除非另有说明，“wt％”意指基于有机-无机混杂材料重量的重量百分比。

试剂和材料

-洗脱液：0.1M NaOH，流量0.5ml/min

-RI探测器的校准：普鲁兰多糖标准品，M_p：100,000–1,080(六种标准品)，其中M_p是峰最大分子量

-UV探测器的校准(280nm)：PSS标准品，聚苯乙烯磺酸钠盐，M_p65,400–891(六种标准品)。将标准品溶解在超纯水中，浓度应该是大约5mg/ml。注射体积是20μl。

-质量控制样品：使用已知M_w分布的木质素。

设备和仪器

-Dionex Ultimate 3000自动进样器、柱室和泵

-Dionex Ultimate 3000二极管阵列探测器

-反射指数探测器:Shodex RI-101

-柱：PSS MCX柱：预柱和两个分析柱：

和

柱材料是磺化二乙烯基苯共聚物基质。

-用于STD样品的0.45μm注射器过滤器和玻璃样品瓶。样品过滤：迷你Uniprep非注射器式(syringeless)过滤装置，PTFE或尼龙，0.45μm。如果需要，5μm注射器过滤器用于预过滤。

-测量瓶

程序

-洗脱液的制备

理想地，用于制备洗脱液的水应该是低电阻率(18MΩ·cm或更好)的高质量去离子水，其中包含尽可能少的溶解二氧化碳。水必须没有生物污染(例如，细菌和霉菌)和颗粒物质。

-将针用10％MeOH-水清洗

-液体样品

强碱性溶液样品以1:100稀释，并且用PTFE注射器过滤器(0.45μm)过滤至小瓶。将固体木质素样品稀释并溶解在0.1M NaOH中，并且用PTFE，0.45μm注射器过滤器过滤。将准备好的样品装载到自动进样器中。注射体积是20μl。在样品之后，注入1M NaOH作为样品来清洁柱。

仪器参数：

-流量0.5ml/min

-洗脱液0.1M NaOH

-柱烘箱温度30℃

-等度运行

-运行时间48分钟

-固体样品

如果需要，固体样品(木质素)在60℃的烘箱中干燥过夜。将大约10mg称量到10-ml的测量瓶中。将样品溶解并稀释到0.1M NaOH溶液中，并且填充到标记(mark)中。将样品用PTFE，0.45μm过滤器过滤。如果样品不能正确溶解，可以将其放入超声波水浴中，或者样品可以通过5μm注射器过滤器过滤。

-用于校准的标准样品

将大约50mg的每种标准品称量到10-ml的测量瓶中，并且添加超纯水并填充到标记中。将标准品用PTFE 0.45μm注射器过滤器过滤。运行校准样品后，校准结果将在处理方法中进行整合和处理并保存。校准是线性一阶校准。

-质量控制样品

对于木质素样品，具有已知M_w分布的木质素被用作质量控制样品。将木质素溶解在0.1M NaOH中，并且浓度是大约1mg/ml。

实施例1.

将从山毛榉木(Beech wood)(欧洲山毛榉(Fagus sylvatica))获得的有机溶剂木质素经历酶促预处理以去除半纤维素，并且此后将纤维素水解。由此从纯的生物质中分离的木质素级分具有以下特征：

>95％的总固体

单个物种：山毛榉木

M_w 9,000-11,000Da(50-61个苯基丙烷单元)

基本上不含硫(硫含量低于3％)

包含23wt％-29wt％的纤维素。

该固体木质素级分简称为“EOS”。

实施例2.

从硫酸盐浆黑液中提取了以下木质素级分，所述木质素级分具有以下特征：

>95％的总固体

单个物种：南方松(Southern Pine)

M_w 4400-5000Da(24-28个苯基丙烷单元)

M_n 1200-1300Da(6-7个苯基丙烷单元)

OH基团的结构：

该固体木质素级分简称为“OXO”。

实施例3.

材料与方法

在聚苯乙烯箱中播种10天后，将发芽的幼苗移植到塑料隧道下的土壤中，并且用50ml下表1的组合物浇水(即处理)。十天后，用50ml相同的组合物进行随后应用。随后的应用每十天进行一次，持续两个月，在每株植物上应用150-200ml含水组合物(表1)。

在处理涉及真菌聚生体时，菌株以1:1或1:1:1的比例混合，最终浓度为4×10⁶个孢子ml^–1。

参考(即阴性对照)通过仅用水浇灌土壤获得。

表1的每组处理由21株植物组成(在随机选择的土壤区域中，7株植物进行三次生物重复)。

表1.

处理	缩写	浓度
			哈茨木霉HK2	HK2	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>
深绿木霉HK4	HK4	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>
			绿木霉GV41	GV41	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>
木质素级分Ex.1	EOS 2％	2wt％
			木质素级分Ex.1	EOS 1％	1wt％
木质素级分Ex.2	OXO 2％	2wt％
			木质素级分Ex.2	OXO 1％	1wt％
			对照	H<sub>2</sub>O
	HK2+OXO 1％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+OXO 1％
				GV41+OXO 2％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+OXO 2％
	GV41+OXO 1％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+OXO 1％
				HK4+EOS 1％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+EOS 1％
	HK2+HK4+OXO 1％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+OXO 2％
				HK2+GV41+OXO 1％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+OXO 2％
	HK2+HK4+EOS 2％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+EOS 2％
				HK4+GV41+EOS 2％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+EOS 2％
	HK2+HK4+GV41+EOS 1％	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>+EOS 1％
				HK2+HK4	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>
	HK2+GV41	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>
				HK4+GV41	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>
	HK2+HK4+GV41	4×10<sup>6</sup>个孢子ml<sup>–1</sup>

从移植后3个月开始，在2个月内(8月和9月)收获3次成熟果实。

番茄的生产率通过测量以每种处理的植物的番茄果实的克数(从底部开始，考虑前两个结果枝)和植物的果实数计的产量来评估。

结果

在本实施例中，将组合物应用于番茄幼苗以评估它们对植物生长和产量的影响。

从田间试验获得并如图1-4中所示的结果表明，与组合物的单一组分相比，组合物在促进生长和产量方面表现更好，导致以每株番茄果实的数目和千克数计的产量增加。

Claims (16)

1.一种组合物，所述组合物包含木霉属(Trichoderma)的真菌和木质素级分，其中：

-所述真菌选自木霉属物种、它们的原生质体融合体及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的多达20,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均多达111个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是多达1×10⁷个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是多达基于所述组合物的重量的5wt％。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述木霉属物种选自侵占木霉(Trichodermaaggressivum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、深绿木霉(Trichodermaatroviride)、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)、奶油木霉(Trichodermacremeum)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿木霉(Trichoderma virens)、绿色木霉(Trichoderma viride)和渐绿木霉(Trichodermaviridescens)。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述真菌选自哈茨木霉(T.Harzianum)、深绿木霉(T.Atroviride)和绿木霉(T.virens)及其混合物。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述真菌选自哈茨木霉HK2、深绿木霉HK4和绿木霉GV41及其混合物。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述真菌的浓度为1×10⁶个至8×10⁶个孢子/ml组合物，优选地2×10⁶个至6×10⁶个孢子/ml组合物，更优选地3×10⁶个至5×10⁶个孢子/ml组合物。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述木质素级分包含具有2,000-20,000道尔顿、优选地3,000-20,000道尔顿、更优选地4,000-15,000道尔顿的重均分子量的片段。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述木质素级分包含具有4,000-6,000道尔顿或9,000-11,000道尔顿的重均分子量的片段。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，所述组合物还包含基于所述木质素级分的重量的多达30wt％的纤维素、更优选地20wt％-30wt％的纤维素。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中：

-所述真菌选自哈茨木霉、深绿木霉、绿木霉及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的3,000-20,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均16-111个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是1×10⁶个至8×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的0.1wt％至4wt％。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中：

-所述真菌选自哈茨木霉、深绿木霉、绿木霉及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的3,000-20,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均16-111个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是2×10⁶个至6×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的0.5wt％至3wt％。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中：

-所述真菌选自哈茨木霉HK2、深绿木霉HK4、绿木霉GV41及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的4,000-6,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均22-33个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是3×10⁶个至5×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的1wt％至2wt％。

12.根据权利要求10所述的组合物，其中：

-所述真菌选自哈茨木霉HK2、深绿木霉HK4、绿木霉GV41及其混合物，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的9,000-11,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均50-61个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是3×10⁶个至5×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的1wt％至2wt％。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中：

-所述真菌是绿木霉GV41，

-所述木质素级分包含具有通过尺寸排阻层析测量的9,000-11,000道尔顿的重均分子量的片段，所述片段包含重均50-61个苯基丙烷单元，

并且其中所述真菌的浓度是3×10⁶个至5×10⁶个孢子/ml组合物，并且所述木质素级分的浓度是基于所述组合物的重量的1wt％至2wt％。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物在农业中作为植物生长和果实生产促进剂的用途。

15.一种农业化学产品，所述农业化学产品包含权利要求1-13中任一项所述的组合物和农业化学添加剂。

16.用于促进植物生长和果实生产的方法，所述方法包括将权利要求1-13中任一项所述的组合物或权利要求15所述的农业化学产品应用于植物或植物土壤的步骤。

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