CN106434462B - 一株枯草芽孢杆菌及其在防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病方面的应用。所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株JQ‑5，保藏号为CGMCC No.8129。实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌菌株JQ‑5具有菌株新颖、高效、生长速度快、产孢量大，在蓝莓、桑椹根际能够快速大量定殖等特点，防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病效果显著，防治效果达到78.63％、76.98％，且蓝莓、桑椹生长健壮，无药害产生，蓝莓、桑葚的鲜果增重20％以上。同时具有安全高效，无药残，无毒副作用的优势，能减少化学农药的使用。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病方面 的应用

技术领域

本发明属于微生物应用领域。具体而言，本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其用途。

背景技术

蓝莓、桑椹等特色小浆果，含有特殊的营养成分，富含维生素、矿物质、抗氧化物质和花青素，具有较高的营养价值和医疗保健作用，备受关注，身价倍增。吃保健果品提高健康水平，是国民的强烈愿望。市场需求激发了种植积极性，特色浆果已成为新兴的经济林产业。但由于气候的变化和栽培方式的改变、栽培面积的迅速扩大，蓝莓、桑椹等小浆果病虫害(炭疽病、菌核病)已呈现多发、频发、重发的态势，严重危害产业健康发展。目前，防治措施以依赖化学农药为主，易造成病虫抗药性增强、防治效果下降，出现农药越打越多、病虫越防越难，农药残留超标等问题，严重影响果品质量安全和生态环境安全。因此对蓝莓炭疽病、桑椹菌核病进行生物防治是必然趋势。

利用拮抗微生物防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病等病害有望成为代替化学药剂的一种安全、无毒及有效的新方法。拮抗微生物不仅可以防病，而且还能促进植物生长，对改善林地生态系统，保持林间生物多样性，以及维护林田生态平衡实现林业可持续发展将起到重要作用。农业部2015年专门制定了《到2020年农药使用量零增长行动方案》，其目标就是单位防治面积农药使用量控制在近三年平均水平以下，力争实现农药使用总量零增长。主要农作物病虫害绿色防治覆盖率达到30％以上，而且在减少农药使用量的同时，病虫害防治效果不降低。为保证行动方案顺利完成，大力推广利用生物药剂是主要途径。与其他生物农药相比，微生物源生物农药生防因子繁殖速度快、防治效果持久、开发利用途径多、不易产生抗性、发酵工艺简单及生产成本低，成为生物农药领域的研究热点，依然是未来较长一段时间生物农药登记的主要选择。尤其是利用枯草芽孢杆菌防治桑椹菌核病、蓝莓炭疽病还未见报道。

采用枯草芽孢杆菌作为生物农药防治植物病害的报道较多。如ZL201310145531.5公开了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RC-1CGMCC No.7501，该菌株的杀菌谱广，可以防治辣椒炭疽病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病等多种植物病害，防治辣椒炭疽病效果显著。但是室内对峙试验表明：它对蓝莓炭疽病和桑椹菌核病的抑菌率分别为61.35％和49.12％，防治效果较差。因此寻找一种高效防治蓝莓炭疽病和桑椹菌核病的拮抗微生物是当前需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一株能高效防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病的枯草芽孢杆菌菌株JQ-5，该菌株具有生长速度快、产孢量大，在蓝莓、桑椹根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

本发明所提供的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株JQ-5，是从山东省潍坊市潍北地区近海潮间带海泥中，采用稀释分离法分离获得的，已于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.8129。其具有以下微生物学特性：JQ-5菌株杆状、具周生鞭毛，长为6-10μm，宽0.9-1.5μm，革兰氏染色阳性。菌株在NA和NB培养基上28℃培养48h后，菌落圆形，平展，呈乳白色偏黄色，表面不规则，中间有圆环形突起，边缘不整齐，不产色素。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。菌株表现菌株好氧生长。芽孢呈椭圆形或柱状。

枯草芽孢杆菌菌株JQ-5的培养方法或繁殖方法：普通培养采用NA培养基保存。实验室液体培养采用略加修改的NB液体培养基。NB配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。大量发酵培养配方(重量百分含量)：黄豆粉3.5％，玉米粉2.5％，轻质碳酸钙0.25％，氯化钠0.05％，其余为水，pH 7.5。培养条件：培养温度28℃，初始pH7.5，装液量70％，接菌量3.0％，培养时间30h，通风1：0.8。采用此培养基发酵培养，菌数≥85亿/g。

本发明的另一个目的是提供一种含有该菌株的微生物菌剂，其制备方法包括以下步骤：

(1)将保存的枯草芽孢杆菌JQ-5转移至NA试管斜面中，置于培养箱28℃恒温培养36-48h；

(2)在无菌条件下，将培养好的枯草芽孢杆菌JQ-5用无菌水按体积比1：10稀释，吸取1mL，置于装有NB液体培养基的摇瓶中，28℃摇床振荡培养12h得到种子液；

(3)按体积比3.0％将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28℃，培养时间30h，通风1：0.8。发酵完成后，菌数≥85亿/g。

上述微生物菌剂优选为水分散粒剂，所述水分散粒剂通过包括以下步骤的方法制得：

(4)将枯草芽孢杆菌JQ-5发酵液加入基质进行混匀，然后进行干燥，得到原粉；所述基质选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种；所述基质与发酵液的质量比为0.5～1.5：1，优选1：1；

(5)按重量份，干燥好的枯草芽孢杆菌JQ-5原粉1-30、轻质碳酸钙1-60、葡萄糖0.5-60、羧甲基纤维素0.02-10、湿润剂1004 0.5-30、动物蛋白0.2-30，将上述原料混合均匀，使混合料的枯草芽孢杆菌JQ-5含量为0.1-100亿活菌/g；

(6)控制加工温度0-50℃，在气流粉碎机或其它高目粉碎机中粉碎到150筛目以上，然后进行沸腾造粒或挤压造粒，水分控制在6-8％，pH控制在7-7.5。

该微生物菌剂可以用作生物农药，用于防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病。因此，又一方面，本发明提供枯草芽孢杆菌菌株JQ-5或者本发明的微生物菌剂用于防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病中的用途以及提高蓝莓、桑葚的鲜果重方面的用途。

本发明还提供一种用于防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的蓝莓、具有菌核病的桑椹施用枯草芽孢杆菌菌株JQ-5或者上述的微生物菌剂。

实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌菌株JQ-5具有菌株新颖、高效、生长速度快、产孢量大，在蓝莓、桑椹根际能够快速大量定殖等特点，其15亿/g水分散粒剂400倍防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病效果显著，防治效果达到78.63％、76.98％，且蓝莓、桑椹生长健壮，无药害产生，且蓝莓、桑葚的鲜果增重20％以上。同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少化学农药的使用，因而在生物防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病中具有重要应用前景。

附图说明

图1为以16SrDNA序列为基础的JQ-5菌系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1枯草芽孢杆菌菌株JQ-5的分离与鉴定

1.分离：

本发明的枯草芽孢杆菌是从山东省潍坊市潍北地区近海潮间带海泥中采用土壤稀释分离法分离获得的，分离方法为：

(1)土样采集：从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，实验室阴干，混合过粗筛，取25g作分离用；

(2)培养基平板制备：将NA培养基(营养琼脂培养基)和PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板；

(3)称取1g土样于灭菌试管中，加100mL无菌水，振荡，制成10^-2土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10^-7；

(4)取上述土壤悬浮液0.5mL，加到培养基平板上，用弯玻棒涂匀。置于培养箱28℃恒温培养5-7d；

(5)将单个菌落在NA培养基上划线，得到单菌落，转移至NA试管斜面培养基中，至28℃恒温培养；

(6)以蓝莓炭疽病菌为靶标菌，采用对峙培养法，筛选到一株对蓝莓炭疽病菌具有较强抑制活性的菌株，编号JQ-5。

所述NA培养基配方为：蛋白胨10g、牛肉膏3g、琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.3；所述PDA培养基配方为马铃薯(去皮切块)200g，葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000mL。

2.菌株鉴定

(1)微生物学特性：JQ-5菌株杆状、具周生鞭毛，长为6-10μm，宽0.9-1.5μm，革兰氏染色阳性。菌株在NA和NB培养基上28℃培养48h后，菌落圆形，平展，呈乳白色偏黄色，表面不规则，中间有圆环形突起，边缘不整齐，不产色素。液体培养形成菌膜，液体颜色棕黄色，浑浊，有沉淀。菌株表现菌株好氧生长。芽孢呈椭圆形或柱状。其它特性见下表1：

表1JQ-5菌株的生理生化特性

注：“+”表示生长或反应阳性；“-”表示不生长或反应阴性。

(2)分子生物学特性：

16S rRNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：

TAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTGTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGGGGACCG

将JQ-5菌株的16S rRNA扩增序列在NCBI数据库中比对，与B.subtilis HAZ2(AY162127)同源性为99.79％，结合JQ-5菌株的形态特征、生理生化特性，确定JQ-5属于枯草芽孢杆菌B.subtilis。

此菌株已于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.8129。

实施例2枯草芽孢杆菌菌株JQ-5对蓝莓炭疽病、桑椹菌核病室内效果验证

1.实验方法

采用平板对峙培养法，将供试的蓝莓炭疽病、桑椹菌核病菌菌饼(9mm)移至平板中央，四周2cm处接种JQ-5菌株，置27℃生化培养箱培养，每个处理重复3次。待对照菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径、抑菌带直径，计算平均值和相对抑制率。

2.结果

由表2可以看出，JQ-5对蓝莓炭疽病菌、桑椹菌核病菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，抑菌带直径分别为11.16mm、9.23mm，菌丝生长抑制率分别为85.26％、83.44％。

表2.JQ-5对蓝莓炭疽病、桑椹菌核病菌室内抑菌活性测定

实施例3枯草芽孢杆菌菌株JQ-5水分散粒剂的制备

NB液体培养基配方：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3。

大量发酵培养配方(重量百分含量)：黄豆粉3.5％，玉米粉2.5％，轻质碳酸钙0.25％，氯化钠0.05％，其余为水，pH 7.5。

(1)将保存的枯草芽孢杆菌JQ-5转移至NA试管斜面中，置于培养箱28℃恒温培养36h；

(2)在无菌条件下，将培养好的枯草芽孢杆菌JQ-5用无菌水按体积比1：10稀释，吸取1mL，置于装有NB液体培养基(100mL)的250mL摇瓶中，28℃摇床振荡培养12h得到种子液；

(3)按体积比3.0％将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28℃，培养时间30h，通风1：0.8。发酵完成后，菌数≥85亿/g；

(4)将枯草芽孢杆菌JQ-5发酵液加入等质量的膨润土进行混匀，然后进行干燥，得到原粉；

(5)按重量份，干燥好的枯草芽孢杆菌JQ-5原粉30、轻质碳酸钙8、葡萄糖45、羧甲基纤维素1、湿润剂1004 6、动物蛋白10，将上述原料混合均匀，使混合料的枯草芽孢杆菌JQ-5含量为15亿活菌/g；

(6)控制加工温度20-30℃，在气流粉碎机中粉碎到200目，然后进行沸腾造粒，水分控制在6-8％，pH控制在7-7.5。

实施例4枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂的作用验证

本实施例提供了枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂针对蓝莓炭疽病、桑椹菌核病的相关实验。

1.1供试药剂

本发明实施例3制备的枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂；75％代森锰锌水分散粒剂(市售)。

1.2供试作物与防治对象：

供试作物为蓝莓，品种为伯克利；防治对象：炭疽病；

供试作物为桑椹，品种为白椹；防治对象：菌核病。

1.3试验地情况

于2013年分别在山东省青岛市胶南蓝莓种植园、夏津桑椹种植园中，进行林间防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病试验。树势中等偏弱，病害发生严重。所有试验小区栽培条件及管理措施一致，开花后3周用药1次，6月15日起，每隔15d施药1次，连用3次，共计4次。

1.4试验设计及安排

本试验设计了15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂400倍、600倍、800倍，75％代森锰锌水分散粒剂400倍液及不施药清水作对照共5个处理，重复4次，共20个小区，各小区随机排列，每个小区10棵蓝莓树、果桑树。

1.5试验调查及计算方法

1.5.1药效调查、调查时间和次数

采收前10d调查，每个处理随机调查300个果实，计算病果率、防治效果，整个试验调查1次。

1.5.4药效计算方法

药效按式(1)、(2)计算：

1.6对作物的直接影响

观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对作物的其他有益影响(例如促进成熟、刺激生长等)。

用下列方式记录药害：

(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。

(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：

(1)按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。

药害分级方法：

—：无药害；

+：轻度药害，不影响作物生长；

++：中度药害，可复原，不会造成作物减产；

+++：中度药害，影响作物正常生长，对作产量和质量造成一定程度的损失；

++++：严重药害，作物生长受阻，产量和质量损失严重。

(2)将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。

同时，要准确描述作物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。

2.结果

2.1供试药剂对蓝莓炭疽病、桑椹菌核病的防治效果

表3结果显示，15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂对蓝莓炭疽病具有较好的防治效果，其中15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂400倍、600倍防治效果最好，防治效果分别达78.63％、77.10％，在P<0.05水平上无显著性差异，明显高于800倍和75％代森锰锌的防治效果。

表3枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂防治蓝莓炭疽病田间药效试验

注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著(P<0.05)。

表4枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂防治桑椹菌核病田间药效试验

注：表中数据后不同的小写字母表示经Duncan多重比较后差异显著(P<0.05)。

表4结果显示，15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂对桑椹菌核病具有较好的防治效果，其中15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂400倍、600倍处理后，防治效果最好，病果率为10.67％和12.00％，防治效果分别达76.98％、74.10％，在P<0.05水平上无显著性差异，明显高于800倍和75％代森锰锌的防治效果。

2.2安全性调查：经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，蓝莓、果桑生长正常，无药害产生，说明15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂在供试浓度对蓝莓、果桑安全。

2.3枯草芽孢杆菌JQ-05水分散粒剂对蓝莓、桑椹增产效果

表5枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂对蓝莓鲜果重试验结果

表5结果显示，15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂不同浓度处理后，蓝莓鲜果增产率分别为25.96％、22.09％、16.57％，其中400倍处理后，增产率最高。15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂400倍-800倍，均具有较好的增产效果，800倍处理后，增产率仍在15％以上。

表6枯草芽孢杆菌菌株JQ-5水分散粒剂对桑椹鲜果重试验结果

表6结果显示，15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5水分散粒剂不同浓度处理后，与清水对照相比，桑椹鲜果重分别为2.56g、2.39g、2.26g，清水对照鲜果重为2.09g，不同处理均有增产效果，其中300倍处理后，增产率达22.48％，效果明显。随着稀释浓度的增大，增产效果减弱。

3.小结

从蓝莓病果率和防治效果来看，15亿/g枯草芽孢杆菌JQ-5对蓝莓炭疽病、桑椹菌核病具有较好的防治效果，稀释400倍后防治效果可达78.63％、76.98％，明显好于对照药剂，差异显著。

从对蓝莓、果桑安全性调查来看，枯草芽孢杆菌JQ-5对蓝莓、桑椹具有明显的促生增产效果，400倍处理后，蓝莓、桑椹增产率在20％以上，没有药害，安全可靠。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株JQ-5，所述菌株的保藏号为CGMCCNo.8129。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株JQ-5在防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病中的用途。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株JQ-5在提高蓝莓、桑葚的鲜果重方面的用途。

4.一种含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株JQ-5的微生物菌剂。

5.如权利要求4所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂为水分散粒剂。

6.一种制备权利要求4所述的微生物菌剂的方法，具体包括以下步骤：

(1)将保存的枯草芽孢杆菌菌株JQ-5转移至NA试管斜面中，置于培养箱28℃恒温培养36-48h；

(2)在无菌条件下，将培养好的枯草芽孢杆菌JQ-5用无菌水按体积比1：10稀释，吸取1mL，置于装有NB液体培养基的摇瓶中，28℃摇床振荡培养12h得到种子液；

(3)按体积比3.0％将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28℃，培养时间30h，通风1：0.8；

NB液体培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000mL，pH 7.3；

大量发酵培养基：按重量比，黄豆粉3.5％，玉米粉2.5％，轻质碳酸钙0.25％，氯化钠0.05％，其余为水，pH 7.5。

7.权利要求4或5所述的微生物菌剂在防治蓝莓炭疽病、桑椹菌核病中的用途。

8.权利要求4或5所述的微生物菌剂在提高蓝莓、桑葚的鲜果重方面的用途。

9.一种用于防治蓝莓炭疽病的方法，所述方法包括向具有炭疽病的蓝莓施用权利要求1的枯草芽孢杆菌菌株JQ-5或者权利要求4或5的微生物菌剂。

10.一种用于防治桑椹菌核病的方法，所述方法包括向具有菌核病的桑椹施用权利要求1的枯草芽孢杆菌菌株JQ-5或者权利要求4或5的微生物菌剂。