CN102703354A - 一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种及应用 - Google Patents
一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.6156，保藏日期为2012年05月25日。所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种主要用于草莓炭疽病的生物防治。本发明解淀粉芽孢杆菌植物亚种B203对草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌和多种杨树溃疡病原真菌具有显著抑制作用，该拮抗细菌对其他多种植物病害也有很好的防治效果；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的草莓炭疽病的防治具有重要意义；培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物疾病防治领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种及其在防治草莓炭疽病中的应用。
背景技术
近年来,随着公众对食品和环境中化学农药安全性的普遍关注,以及一些危险性化学农药的禁用，促使人们寻求安全有效的植物病害控制新途径,利用有益微生物防治植物病害日趋受到重视。它是向被打破了的植物自然生态系中引入对植物有益的外源拮抗菌、或通过调节环境促使自然的有益微生物群体增长，并表现出生防活性,通过微生物之间的相互作用达到防病目的。目前，植物病害的生防已成为各国研究重点。
自然界潜在的微生物资源种类丰富，在微生物农药的产品开发方面有明显优势，因此世界各国都投入大量的人力和财力，研究、开发具有自主知识产权的新型微生物农药，并以此带动其他高科技产业的全面发展。我国也把微生物农药的研制和开发列为国家重点科技攻关和高新技术发展计划。
生物农药(biopesticides)，按照Copping和Menn的定义包含了活体微生物（真菌、细菌和病毒），昆虫植病线虫，植物源农药，微生物农药，微生物次生代谢物（抗生素）等，用于防治各种昆虫和病害，生物农药（特别是微生物农药）具有独特的优点是对人类健康威胁小，对环境安全，这正是全社会最关心的问题之一。因此，进入21世纪以来，各国政府和民众更加重视生物农药的开发和应用，已成为研究热点。
微生物农药的特性赋予了农业可持续发展战略，为保护农业生态环境，保障食品安全提供物质基础和技术支撑；同时微生物农药产业也是未来经济中具有发展潜力的新增长点之一。研究微生物农药产业发展对于政府部门科学制定促进微生物农药产业发展的政策体系，实现农药产业结构调整，促进循环经济和可持续社会发展战略，保障我国经济建设和农业生态环境的协调发展，以及建设我国农产品安全体系等都将具有十分重要的理论意义和实践意义。
草莓（Fragaria ananassa Duchesne）是一种集栽培和观赏于一体的宿根性、多年生草本资源植物。在草莓栽培区，炭疽病、灰霉病和黄萎病是阻碍草莓产业发展瓶颈。其中草莓炭疽病（Colletotrichum fragariae A.N.Brooks）的危害最严重，在每年的草莓生长期危害茎、叶柄、叶片，托叶，在后期危害花和果实，直接影响到草莓产量，造成很大经济损失。对该病害的传统防治大多采用化学药剂喷洒植株表面，造成土壤不同程度的农药残留和污染问题，影响产品质量和人们的身体健康。从保护生态环境和食品安全的角度出发，草莓生产需要有低毒、污染少，对人体安全的微生物制剂来控制草莓病害，已达到草莓安全食用的目的。也符合生物农业发展和政府、社会与生物农药产业的发展。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对草莓炭疽菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌植物亚种。
本发明的第二目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种B203在防治草莓炭疽病中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种在抑制微生物生长中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.Plantarum)B203，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为：CGMCC No.6156，保藏日期为2012年05月25日。
解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203的生理活性特征如下：
所述解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203在牛肉膏蛋白胨培养基平板上菌落较大，乳白色，直径一般4-6mm，表面隆起，干燥，有皱褶，边缘较规则，菌体杆状，两端钝圆，大小为1.23-1.87×0.62-0.80μm，平均1.48×0.68μm；芽孢两端生，椭圆形，大小为1.01-1.41×0.62-0.75μm，平均1.14×0.67μm。
革兰氏染色表现为阳性；酪蛋白水解、淀粉水解、明胶液化为阳性，V.P反应可变，吲哚反应阴性；糖类产酸发酵。
所述解淀粉芽孢杆菌植物亚种的16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示。将所测16SrDNA序列通过BLAST比对，鉴定其为解淀粉芽孢杆菌植物亚种。
所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203是在防治草莓炭疽病中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种是在抑制草莓炭疽菌生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种是在抑制草莓灰霉菌生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种是在抑制可可球二孢生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种是在抑制聚生小穴壳生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种是在抑制杨拟茎点霉菌生长中的应用。
所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种是在抑制不高双孢菌生长中的应用。
具体应用为：将解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203接种于发酵培养基中，在28℃-35℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治草莓炭疽菌的菌剂。
本发明中所述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
（1）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对多种植物病原菌具有抑制作用，在拮抗细菌对植物病害生物防治中起到非常重要的作用，例如种类和数量众多；对病原菌的作用方式多样化；繁殖速度快；能够人工培养，易于操作，便于生产应用；抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的草莓炭疽病的防治具有重要意义；也是控制鲜食水果安全的有效措施。
（2）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1a为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203形态图；
图1b为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203芽孢形态图;
图2a为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对草莓炭疽菌Colletotrichum fragariae A.N.Brooks的抑制作用；
图2b为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对草莓灰霉菌Botrytis cinera Pers.ex Fr.）的抑制作用；
图2c为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对可可球二孢[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon & Maubl.的抑制作用;
图2d为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)的抑制作用；
图2e为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对杨拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)的抑制作用；
图2f为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对不高双孢菌[Apiocarpella macrospore(Speg.)H.& P.Syd.]的抑制作用；
图3a为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对草莓炭疽病的防治作用；
图3b为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203菌液处理过的草莓植株。
具体实施方式
下面结合实验例详细阐述本发明解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum)B203的应用。
实验例1：解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对草莓炭疽菌Colletotrichum fragariae A.N.Brooks、草莓灰霉菌Botrytis cineraPers.ex Fr.）、可可球二孢[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon & Maubl.、聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)、杨拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)和不高双孢菌[Apiocarpellamacrospore(Speg.)H.& P.Syd.]的平板抑菌作用。
将用LB斜面活化的解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203菌株划线接种于直径9cm玻璃培养皿中的PDA平板培养基一侧，再将草莓炭疽菌、草莓灰霉菌、可可球二孢、聚生小穴壳、杨拟茎点霉菌和不高双孢菌的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接于平板另一侧。28±1℃培养30天观察抑菌能力，并记录15天和30天时菌落宽度，见表1，15天时抑菌效果如图2a至图2f所示。试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对6种病原菌均有拮抗作用，以占据培养皿的直径判断抑制效果，用无菌的PDA圆块作为对照。
表1 B203对6种草莓和杨树病原菌15天和30天的抑制作用
1）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对草莓炭疽菌的作用：如图2a所示；
2）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对草莓灰霉菌的作用：如图2b所示；
3）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对可可球二孢的作用：如图2c所示；
4）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对聚生小穴壳的作用：如图2d所示；
5）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对杨拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)的抑制作用；如图2e所示；
6）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对不高双孢菌[Apiocarpella macrospore(Speg.)H.& P.Syd]的抑制作用：如图2f所示。
从上面的图片可以看出，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对草莓炭疽菌、草莓灰霉菌、聚生小穴壳、杨拟茎点霉菌和不高双孢菌的生长均有很好的抑制作用。
实验例2：解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203代谢产物对草莓炭疽菌Colletotrichum fragariae A.N.Brooks、草莓灰霉菌Botrytiscinera Pers.ex Fr.）、可可球二孢[Lasiodiplodia theobromae(Pat.)Griffon & Maubl.、聚生小穴壳(Dothiorella gregaria Sacc.)、杨拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)和不高双孢菌[Apiocarpella macrospore(Speg.)H.& P.Syd.]的平板抑菌作用。
培养3天的解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203的发酵液用细菌滤器过滤（滤膜孔径为0.25μm）；将6种植物病原真菌的PDA平板培养物用直径5mm的打孔器打取同质同量的菌块，接种于直径9cm玻璃培养皿中的PDA平板培养基一侧；再将PDA平板另一侧用直径5mm的打孔器打取同质同量的圆块，并将圆块取出点得一孔洞；将过滤后的解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum)B203无菌滤液100μL置于PDA平板另一侧空洞中，以不接种B203生防菌液的为对照，该B203生防菌液指B203液体发酵液，待对照菌丝长满平板后，观察拮抗活性（见表2）。试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum)B203代谢产物对6种病原菌均有强拮抗作用。
表2 B203对6种草莓和杨树病原菌15天和30天的抑制作用
由此可见，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203的代谢产物对草莓炭疽菌、草莓灰霉菌、聚生小穴壳、杨拟茎点霉菌和不高双孢菌的生长均有很好的抑制作用。
实验例3：验证解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203对草莓炭疽病菌是否有抑制作用的试验。
1、实验设备：培养箱、摇床、超净工作台；
2、实验原理：
在草莓栽培之前，将草莓根放在解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefacienssubsp.plantarum)B203的培养液中，取出，沥干，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum)B203可以粘附在草莓根上的继续生长，产生代谢产物，从而抑制草莓炭疽菌的生长。
3、实验方法：
1）解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203菌液的培养：将解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203接种到含有50mL的LB培养基的三角瓶中，120转，35℃培养60小时。
2）带菌草莓根的制备：将要栽培的草莓苗放入培养好的解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203菌液中浸泡约2分钟取出晾干（不滴水），进行栽培。
3）对照草莓根的制备：将要栽培的草莓苗放入无菌水中浸泡约2分钟取出晾干（不滴水），进行栽培。
4）B203液体发酵菌剂的喷洒：在草莓苗栽培成活后1周内,用生防菌剂(原液加水10倍)喷洒草莓植株。
5)拮抗实验：将步骤2）与步骤3）中浸泡好的草莓苗晾干（不滴水），分别进行大棚地栽，4周进行观察结果（如图3a至图3b所示）。
4、实验结果
解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203能够很好的防治草莓炭疽病，见图3a及3b。其中，3a图中两边的4株草莓为带菌草莓株；中间4株是对照草莓株，由图3可知，带菌草莓株生长良好，未感染草莓炭疽病，而对照草莓株因感染炭疽病生长缓慢；图3b中显示草莓生长较好，未感染草莓炭疽病。由此可见，解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203能够很好的防治草莓炭疽病。
下面是本发明的具体实施例：
:实施例1
解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203菌剂的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203接种于发酵培养基中，pH6.5，250ml三角瓶中装液量为150ml，28℃-35℃，摇床转速120转/分，48小时，得到的发酵液即为防治草莓炭疽菌的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2g，蛋白胨5g，氯化钠4g，pH6.5。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203菌剂的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203接种于发酵培养基中，pH7.5，250ml三角瓶中装液量为150ml，28℃-35℃，摇床转速160转/分，72小时，得到的发酵液即为防治草莓炭疽菌的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，pH7.5。
实施例3
解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203菌剂的制备方法：将解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203接种于发酵培养基中，pH 7，250ml三角瓶中装液量为150ml，28℃-35℃，摇床转速150转/分，55小时，得到的发酵液即为防治草莓炭疽菌的菌剂。
其中发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏3g，蛋白胨8g，氯化钠5g，pH7。
Claims (10)
1.一种解淀粉芽孢杆菌植物亚种，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillusamyloliquefaciens subsp.plantarum)B203，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.6156，保藏日期为2012年05月25日。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种在防治草莓炭疽病中的应用。
3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种在抑制草莓炭疽菌生长中的应用。
4.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种在抑制草莓灰霉菌生长中的应用。
5.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种在抑制可可球二孢生长中的应用。
6.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种在抑制聚生小穴壳生长中的应用。
7.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种在抑制杨拟茎点霉菌生长中的应用。
8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌植物亚种在抑制不高双孢菌生长中的应用。
9.根据权利要求2至8任一项所述的应用，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌植物亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum)B203接种于发酵培养基中，在28℃-35℃下发酵培养48-72小时，得到的发酵液作为防治草莓炭疽菌的菌剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：1000mL蒸馏水，牛肉膏2-5g，蛋白胨5-10g，氯化钠4-5g，pH6.5-7.5。
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