CN113151092A

CN113151092A - 一株具有草莓炭疽病抑制活性的芽胞杆菌新种及其应用

Info

Publication number: CN113151092A
Application number: CN202110450244.XA
Authority: CN
Inventors: 张妙宜; 王尉; 谢江辉; 周登博; 起登凤; 李凯; 赵炎坤; 陈宇丰
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113151092B

Abstract

本发明提供了一种芽胞杆菌，为芽胞杆菌属的一个新种，命名为Bacillus sp.Nov.QN1NO‑4，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021306。该菌株具有稳定广谱拮抗活性，对小麦赤霉病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌、草莓炭疽病菌、胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、辣椒炭疽病菌、菜心炭疽病菌和芒果炭疽病菌等常见作物病原真菌有较强的抑菌作用，且其发酵提取物可有效抑制病原菌丝对离体果实等的侵染，降低果实的失重率，较好地保留可溶性固形物，增加生防制剂有效成分安全来源，为草莓炭疽病等多种植物病害的防治拓展新领域，具有良好的开发应用前景。

Description

一株具有草莓炭疽病抑制活性的芽胞杆菌新种及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有草莓炭疽病抑制活性的芽胞杆菌新种及其应用。

背景技术

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是最受欢迎的水果之一，自2010年以来，其年产量超过610万吨，总生产价值超过123亿美元(Zhimo et al.，2021)。但因草莓果实质地柔软，易受机械损伤及病菌侵染而腐烂，限制了采后贮藏期和货架期(Rico et al.，2019)。草莓炭疽病是由草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariae)引起的，是栽培草莓最严重的病害之一(Miller-Butler et al.，2018)，使用噻苯达唑或抑霉唑等化学杀菌剂是过去30年来主要的草莓采后病害防治手段(Dukare等，2019)，虽然能显著减少草莓果实采后损失，但广泛和过度使用会造成严重的环境污染，也会导致病原体产生耐药性，威胁食品安全和人类健康(Wang et al.,2021；Li et al.,2021)。鉴于此，杀菌剂的使用已受限制，一些欧洲国家在采后阶段甚至完全禁止杀菌剂(Wang et al.,2018；Wisniewski et al.,2016)。因此，开发安全环保的产品以控制草莓采后病害是一种可行的生态替代策略。

生物防治剂被认为是当前较为有效和具应用前景的一种果实采后病害防控策略(Ye et al.,2021；Feliziani et al.,2016)，在过去的几十年里，多有关于微生物对果实采后病害有效抑制的报道面世(Ye et al.，2021)，如Zhang等(2020)发现膜醭毕赤酵母对桃根霉软腐病有显著的生防效果，拮抗酵母季式毕赤酵母对枇杷采后炭疽病有较好的防治效果(Zhao et al.,2019)，类黄假单胞菌对桃褐腐病菌和果生链核盘菌具有拮抗作用(Aiello et al.,2019)，以及荧光假单胞菌和季也蒙毕赤酵母均能有效抑制苹果采后灰霉病((Wallace et al.,2018；Zhang et al.,2011)。此外，一些芽胞杆菌被认为是防治真菌病原菌的优势生物防治剂(Ye et al.,2021)，包括抗草莓灰霉病的耐盐芽胞杆菌(Wang etal.,2021)，防治柑橘采后绿霉病的芽胞杆菌w176(Tian et al.,2020)，抑制刺果番荔枝和鳄梨炭疽病的深褐芽胞杆菌(Guardado-Valdivia et al.,2018)，对多种枇杷病原菌有拮抗作用的解淀粉芽胞杆菌(Ye et al.,2021)、可拮抗枇杷炭疽病的解淀粉芽胞杆菌HG01(Wang et al.,2020b)、对柑橘和苹果青霉菌有拮抗作用的解淀粉芽胞杆菌(Calvo etal.,2017；Gotor-Vila et al.,2017)。目前国内外对草莓采后果实的生防研究较多，但对草莓果实贮藏的广谱抗真菌芽胞杆菌及其生防机理的研究较少。因此，广谱拮抗芽胞杆菌的分离筛选对草莓果实采后病害的防治具有重要意义。

越来越多的研究表明，芽胞杆菌可以产生多种代谢物，因此作为潜在的植物病原生防制剂发挥有重要作用(Wang et al.,2021)。这些代谢物在进化过程中高度优化，与生物靶点相互作用，进而表现出多种生物学功能，如抗真菌、抗菌和免疫抑制活性(Wang etal.,2020a)，包括表面活性素、伊枯草菌素和丰原素(Lv et al.,2020)。Ambrico和Trupo(2017)报道从枯草芽胞杆菌et-1的游离上清液中提取的伊枯草菌素A能有效抑制柑桔绿霉菌，并利用解淀粉芽胞杆菌h-4的代谢产物柑橘绿化进行管理(Chen et al.,2018a)。然而，如果这种方法要用于管理不同的植物病害，就有必要发现更多新的次生代谢产物(Jing etal.,2020)。因此，利用全基因组测序技术鉴定重要抗菌化合物，筛选高效次生代谢产物，对草莓采后病害的防治具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种芽胞杆菌新种Bacillussp.Nov.QN1NO-4，具有稳定广谱拮抗活性，对草莓炭疽病等多种常见作物病原真菌有较强的抑菌作用。

本发明的第一个方面是提供一种芽胞杆菌，其为芽胞杆菌属的一个新种，命名为：Bacillus sp.Nov.QN1NO-4(下文简称“QN1NO-4”)，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021306。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的芽胞杆菌在拮抗小麦赤霉病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或芒果炭疽病菌中的应用。

本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的芽胞杆菌在制备防治小麦赤霉病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或芒果炭疽病菌所致病害的生防制剂中的应用。

本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的芽胞杆菌的发酵液、或发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白、或发酵液离心后的发酵上清液的乙酸乙酯萃取物。

本发明的第五个方面是提供本发明第四个方面所述的发酵液、或发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白、或发酵液离心后的发酵上清液的乙酸乙酯萃取物在拮抗小麦赤霉病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或芒果炭疽病菌中的应用。

本发明的第六个方面是提供本发明第四个方面所述的发酵液、或发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白、或发酵液离心后的发酵上清液的乙酸乙酯萃取物在制备防治小麦赤霉病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或芒果炭疽病菌所致病害的生防制剂中的应用。

本发明的QN1NO-4为芽胞杆菌属新种，具有稳定广谱拮抗活性，对小麦赤霉病菌、香蕉大灰斑病菌、荔枝炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌、草莓炭疽病菌、胶孢炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、辣椒炭疽病菌、菜心炭疽病菌和芒果炭疽病菌等10种常见作物病原真菌有较强的抑菌作用，而且其发酵提取物可有效抑制病原菌丝对离体果实等的侵染，降低果实的失重率，较好地保留可溶性固形物，增加生防制剂有效成分安全来源，为草莓炭疽病等多种植物病害的防治拓展新领域，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1为菌株QN1NO-4、菌株QN1NO-4发酵上清液的粗蛋白、菌株QN1NO-4发酵提取物对草莓炭疽病菌的平板抑菌试验结果。

图2为不同浓度菌株QN1NO-4发酵提取物对草莓炭疽病菌菌丝生长和抑菌率影响。

图3为不同浓度菌株QN1NO-4发酵提取物对草莓果实腐烂及品质参数的控制作用。

图4为不同浓度菌株QN1NO-4发酵提取物对草莓炭疽菌孢子萌发、孢子形态和细胞超微结构的影响。

图5为不同浓度菌株QN1NO-4发酵提取物对真核细胞的毒性试验结果。

图6为菌株QN1NO-4发酵提取物的广谱抗真菌活性测定结果。

图7为菌株QN1NO-4抗生素的敏感性测定结果。

图8为菌株QN1NO-4的系统发育树。

图9为菌株QN1NO-4的基因组测序结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

本发明提供了一种芽胞杆菌，其为芽胞杆菌属的一个新种，命名为：Bacillussp.Nov.QN1NO-4，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2021306。本发明的芽胞杆菌Bacillus sp.Nov.QN1NO-4(下文简称“QN1NO-4”)从诺尼果实中分离、筛选得到。

本发明实施方式中所有数据利用SPSS version 22(SPSS Inc.，Chicago,IL,USA)进行单因素方差分析(ANOVA)。利用LSD多重比较数据，分析其显著性差异(P<0.05)。三个重复性实验获得的数据用标准差±表示。

1实验材料

草莓(Fragaria×ananassa Duch.var.Zhang Ji)，选取无明显损伤和无病原菌侵染，成熟度一致和大小均匀的果实作为试验材料，表面用75％乙醇(v/v)消毒2min，用无菌蒸馏水冲洗3次。将表面消毒过的草莓在室温(25℃)下置于干净的工作台上风干2h。

诺尼(Morinda citrifolia L.)，收集自中国海南省澄迈县种植基地(19°58'35"N,109°55'35"E)。浸泡于75％乙醇中(v/v)5min，然后用2％次氯酸钠消毒20min，其次以10％碳酸氢钠浸泡10min并使用无菌蒸馏水清洗5次。草莓表面消毒后置于干净的工作台上室温(25℃)风干2h。

2菌株的分离

诺尼样品(10g)置于无菌研钵中研磨至糊状，将1mL果汁放入含有4mL LB培养基的50mL烧瓶中，在180rpm的旋转摇床上室温培养1h。用无菌蒸馏水稀释至10^-1、10^-2、10^-3，然后于LB培养基上进行无菌涂布。28℃培养2d后，在LB平板上反复划线纯化至单菌落。

3草莓生防菌的筛选

本研究草莓炭疽病原真菌(ATCC 58718)由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。35株细菌的筛选采用先前Li等(2021)报道过的抗草莓炭疽病真菌活性的分离方法。简言之，将直径5mm的草莓炭疽病菌饼放在土豆葡萄糖琼脂(PDA)平板的中心，将分离纯化的细菌分别接种于距病原菌2.5cm的4个对称点上，28℃条件下培养7d。以未接种的病原菌平板为对照。以草莓炭疽病菌生长直径为指标计算细菌的抑菌活性，每个设置三个重复。

从诺尼果中分离到35株细菌。根据不同的生长状况和菌落形态等筛选出29株进行抑菌活性测定。初步实验表明，其中10株细菌对草莓炭疽病具有较强的体外拮抗活性，菌株QN1NO-4的拮抗活性最强。当对照板上的草莓炭疽病菌饼生长直径为85.50mm±1.43时，接种QN1NO-4的平板中病原菌菌饼为25.50mm±0.79，差异显著(P<0.05，图1A)，抑制率为70.17％。因此，我们选择菌株QN1NO-4进行进一步研究。

4有效成分测定

菌株QN1NO-4在含1L LB液体培养基的5L锥形瓶中培养。28℃180rpm转摇床培养3d，室温下8000rpm离心10min收集上清液，分成两份(500mL/份)。其中一部分用硫酸铵分级沉淀法处理，另一部分用乙酸乙酯萃取。

4.1硫酸铵分级沉淀

将500mL上清液均匀分成5等份，缓和加入固体硫酸铵将饱和浓度调节为20％、30％、50％、70％和80％，4℃培养过夜。置于4℃离心机中8000rpm离心30min，重悬于含0.1MNaCl的0.05M Tris-HCl(pH 7.0)中，在相同的缓冲液中透析24h得到粗蛋白。将5份粗蛋白溶液用真空旋转蒸发仪(N-1300,EYELA,Ailang Instrument Co.,Ltd.,Shanghai,China)浓缩后分别溶解在无菌蒸馏水中配制10mg/mL的母液。将150mL锥形瓶内含60mL的PDA固体培养基提前溶解，待降温至45°时分别加入0.3mL各浓度粗提蛋白液，混匀倒板，凝固后在其中心点接种直径为5mm草莓炭疽病病原菌菌饼，28℃培养7d后，以添加无菌水的培养基为对照，用游标卡尺记录草莓炭疽病菌生长直径为指标，测定其抑菌活性。每组实验重复三次。

结果见图1B，5份粗蛋白的抑菌活性差异不大，抑制率在2％-24％之间，硫酸铵饱和度为20％时分离的粗蛋白对草莓炭疽病的抑制能力最低，为2.83％，硫酸铵饱和度为50％时分离的粗蛋白抑制率最高，为23.14％，而硫酸铵饱和度为70％和80％时分离的粗蛋白抑菌活性差异不大。

4.2乙酸乙酯萃取

用等体积的乙酸乙酯提取上清液，超声1h后注入分离漏斗。然后用真空旋转蒸发仪对收集到的有机溶剂提取物进行浓缩，置于100％甲醇中溶解配置成10mg/mL的母液，将150mL锥形瓶内含60mL的PDA固体培养基提前溶解，待降温至45°时分别加入0.06mL、0.15mL、0.3mL母液，混匀倒板，接种草莓炭疽病病原菌，以添加等量甲醇的培养基为对照，测定其对抑菌活性(方法同4.1)，所有实验设3个生物重复。

结果见图1C，菌株QN1NO-4用乙酸乙酯分离，其抗真菌活性与剂量多寡呈正相关，10μg/mL提取物对草莓炭疽病菌的抑制能力为20.83％。50μg/mL提取物的抑制率为51.39％，显著高于相同浓度的粗蛋白。因此，抑制物质为胞外非蛋白性物质。

5菌株QN1NO-4提取物对草莓炭疽病菌丝生长的影响

QN1NO-4提取物(QN1NO-4发酵液离心后的发酵上清液的乙酸乙酯萃取物)对草莓炭疽病菌丝生长的影响按照之前的方法稍作修改(Li et al.，2020b)。在无菌PDA培养基中分别添加100μL不同浓度(1.563、3.125、6.25、12.5、25、50、100和200mg/L)的提取物，以等体积无菌甲醇为对照。风干后，将直径为5mm的病原菌菌饼放在每个培养皿的中心位置，28℃培养7d后，用游标卡尺记录草莓炭疽病菌菌丝直径(mm)。选取对照板的板缘和经200μg/mL提取液处理过的草莓炭疽病菌丝，在光学显微镜(Nikon，E200MV，Japan)下观察菌丝形态，重复三次。参照Vanewijk和Hoekstra(1993的方法)用最小二乘法求毒性回归方程，计算半最大效应浓度(EC50)。

结果见图2。提取物对草莓炭疽病菌丝生长有显著抑制作用，且抑制效果与剂量相关(图2A)。28℃共培养7d后，对照板中草莓炭疽病菌饼的生长直径为68.00mm±0.1。经菌株QN1NO-4选定的7个浓度(1.563mg/L、3.125mg/L、6.25mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L)处理，病原菌生长均受显著抑制。抑制率分别为15.69％、22.55％、27.94％、40.69％、55.39％、68.63％、83.33％(图2B)。在对照板中，草莓炭疽病菌丝外观稀疏纤细，而经200mg/L提取物处理的菌落边缘密集而短小，且分枝较多(图2C)。经测定，菌株QN1NO-4提取物对草莓炭疽病菌的半最大效应浓度(EC50)为33.81±0.46μg/mL，确定为1×EC50，供后续研究用。

6菌株QN1NO-4对对草莓果实腐烂及品质参数的控制作用

将前期消毒完善的草莓用一次性针头在赤道处针刺2mm宽和1mm深的伤口，风干备用。然后分别加入10μL不同浓度(1×EC50、2×EC50、4×EC50和8×EC50)的提取物。风干后，将10μL(1.0×10⁶CFU/mL)的草莓炭疽病孢子悬浮液注射到同一损伤部位，设计等体积甲醇为对照。将处理草莓置于28℃人工气候培养箱(Ever Scientific Instrument Ltd.，Shanghai，China)，相对湿度85％，光照12h/12h，培养7d后病情指数(DI)以及草莓失重率和总可溶性固形物(TSS)等质量参数。

DI的计算方法为：DI(％)＝(腐烂果实数/总果实数)×100％。每个处理设3个重复，每个重复24颗草莓。结果见图3。QN1NO-4不同浓度(1×EC50、2×EC50、4×EC50和8×EC50)提取物可降低人工接种草莓炭疽病(1.0×10⁶CFU/mL)草莓的果实腐烂程度。如图3A所示，菌株QN1NO-4提取物对果实腐烂的抑制作用与剂量呈正相关，与对照组相比，第7天各处理组均能显著降低草莓果实的腐烂程度(p<0.05)。经QN1NO-4提取物浓度1×EC50、2×EC50、4×EC50和8×EC50处理的草莓发病率分别为66.67％、45.83％、29.17％和12.5％，均显著低于对照组(100％)(图3B)。结果表明，菌株QN1NO-4提取物对草莓炭疽病具有显著的生防效果。

失重率按贮藏后果实重量与贮藏前果实重量的百分比计算。用手持式折射仪(PAL-1，Atago，Japan)测定果汁折光率，测定TSS(％)含量。结果见图3。随着提取物剂量的增加，草莓果实的失重率持续下降(图3C)，对照组以及菌株QN1NO-4提取物浓度1×EC50、2×EC50、4×EC50和8×EC50处理后的草莓的失重率分别为5.93％、5.17％、4.56％、3.84％和2.59％，与对照组5.93％的失重率相比，4×EC50和8×EC50处理后的草莓减重显著(p<0.05)，1×EC50与2×EC50无显著差异。在第7天时，提取物处理能较好地保留可溶性固形物(TSS)，能显著抑制TSS的下降，当对照组TSS为3.43％，经菌株QN1NO-4提取物浓度1×EC50、2×EC50、4×EC50和8×EC50处理后的草莓可溶性固形物(TSS)显著提高，分别为4.90％、5.20％、5.90％和6.17％(图3D)。

7菌株QN1NO-4提取物对草莓炭疽病孢子萌发的影响

采用Pei等人(2020)的方法，对菌株QN1NO-4提取物抑制草莓炭疽病孢子萌发的作用进行了较小修改。将20μL病原菌孢子悬浮液(1.0×10⁶CFU/mL)分别和20μL不同浓度的提取物(1×EC50、2×EC50、4×EC50和8×EC50)完全混合，分别加入凹面载玻片中，以等体积甲醇为对照。每个处理进行3个重复。在28℃相对湿度85％的人工气候培养箱中培养12h，每个处理随机选取200个以上的孢子在光学显微镜下(Nikon，E200MV，Japan)镜检。以芽管长度大于孢子直径的状态为“孢子萌发”，统计孢子萌发数量。

结果如图4A所示。菌株QN1NO-4提取物对草莓果实孢子萌发有显著抑制作用，且抑制效果与剂量相关，1×EC50和2×EC50提取物处理12h后，草莓炭疽菌孢子萌发率分别为36.38％和18.42％，而对照组孢子萌发率为95.03％，当提取物浓度大于4×EC50时，抑制率为100％。

8菌株QN1NO-4提取物对真菌孢子形态的影响

采用扫描电镜(Sigma 500/VP，Zeiss，Germany，SEM)观察菌株QN1NO-4提取物4×EC50处理对草莓炭疽病孢子形态影响。将等体积的孢子(1.0×10⁶CFU/mL)与提取液充分混合，28℃培养6h，10000rpm离心5min，2.5％戊二醛固定于玻片上过夜，以甲醇处理为对照。用磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1mol/L，pH 7.2)洗涤3次15min后，在分级乙醇(30％、50％、70％、80％、90％、95％和100％)中脱水15min/次，风干。在3kv的加速电压下，用扫描电镜对涂有金粉的干燥样品进行观察。

通过形态特征对比，经100％甲醇处理(对照组)的草莓炭疽菌孢子饱满，表面规则光滑，菌丝均匀。4×EC50浸膏处理12h后，草莓炭疽菌孢子表面呈现干瘪变形(图4B)。

9菌株QN1NO-4提取物对真菌细胞超微结构的影响

采用透射电镜(TEM，HT7700，Hitachi，Japan)检测提取液对草莓炭疽菌细胞超微结构的影响。根据第8节的方法制备样品，然后将样品嵌入环氧树脂Epon-812中，再用超薄切片机(EM UC6,Leica,Germany)将样品制成80nm厚度的切片。用柠檬酸铅(3％，v/v)和饱和醋酸铀(3％，v/v)分别染色10min和30min后，在80kV工作电压下用透射电镜观察切片。

用透射电镜(TEM)检测了菌株QN1NO-4 4×EC50提取物处理的草莓炭疽病菌丝超微结构，对照组细胞膜、细胞壁完整，观察清晰，还发现了一些完整的细胞器，如液泡和线粒体(图4C(a))。菌株4×EC50提取液处理的细胞壁厚度明显增加(图4C(b))，细胞质不均一，液泡变大最终破裂(图4C(c))，细胞器的完整性也逐渐破裂瓦解(图4C(d))。

10溶血活性测定

提取液对人红血细胞的溶血活性是通过吸光光度计(540nm)测定血红蛋白的释放量来确定(Li et al.，2021)。将2mL健康人新鲜血液置于1000rpm离心机中离心5min以收集人红血细胞，用0.85％的生理盐水(NS)洗涤3次后重悬于最终浓度为2％的NS中。在450μL2％红血细胞中分别均匀混加50μL 1×EC50，2×EC50，4×EC50和8×EC50提取液，于1.5mL离心管中37℃培养1h。阴性对照和阳性对照分别用NS(无溶血)和0.1％Triton X-100(100％溶血)。上清液1000rpm离心5min后移到96孔板上。用微孔板分光光度计(PackardSpectra Count，IL，美国)测定吸光度。以提取液的溶血活性与0.1％Triton X-100培养后释放的血红蛋白的百分比为计算方式(Wang et al.，2018)。

测定菌株QN1NO-4提取物对真核细胞的毒性，以540nm吸光度测定不同浓度(1×EC50，2×EC50，4×EC50和8×EC50)提取物在37℃处理1h后对人红细胞的溶血活性，监测其血红蛋白的释放(图5)。0.1％的Triton X-100具有100％的溶血活性，而各处理组的溶血活性分别仅为0.14％、0.92％、1.22％和1.71％。结果表明，该提取物具有很低的非特异性细胞溶解活性和毒性。

11菌株QN1NO-4提取物的广谱抗真菌活性测定

为了测试菌株QN1NO-4提取物是否具备广谱抗真菌活性，在这项研究中选取了中国海口市热带农业科学院环境与植物保护研究所提供的10种植物病原真菌，包括：

小麦赤霉病菌Fusarium graminearum(ATCC MYA-4620)，

香蕉大灰斑病菌Curvularia lunata(ATCC 42011)，

荔枝炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides(ATCC 16330)，

黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumebrium(ATCC 204378)，

草莓炭疽病菌Colletotrichum fragariae(ATCC 58718)，

胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides penz.(ATCC 58222)，

水稻稻瘟病菌Pyricularia oryzae(ATCC 52352)，

辣椒炭疽病菌Colletotrichum capsici(ATCC 48574)，

菜心炭疽病菌Alternaria sp.(ATCC 20492)，

芒果炭疽病菌Colletotrichum acutatum(ATCC 56815)。

根据Li et al.(2021)的描述，采用菌丝生长法在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上测定提取物对各种植物病原真菌的抗真菌活性。

结果见图6。菌株QN1NO-4提取物具有较强的抗真菌活性，对供试的10种病原真菌均表现出良好的抑菌活性。菌株对不同病原菌菌丝径向生长的抑制率差异较大，为35.42％～55.93％，其中对菜心炭疽病菌抑制率最高，为55.93％，说明提取物对其抑菌活性最强。其次是香蕉大灰斑病菌54.04％和小麦赤霉病菌50.31％，与抑制率无显著差异(P<0.05)。对荔枝炭疽病菌的抑制率最低为35.42％，表明在实验中该病源菌对提取物的耐受程度最高。

12菌株QN1NO-4的鉴定

12.1形态学、生理和生化研究

菌株在LB培养基中37℃培养3～4d后，观察QN1NO-4单菌落的形态特征(形状和颜色)。测试其生理生化特性，包括1)对不同pH、温度和NaCl的抗性，2)酶促特性，3)碳氮源利用，4)对多种抗生素的敏感性(Kumar等，2014)。

菌株QN1NO-4在LB培养基上为圆形、淡黄色菌落。随着培养时间增长，菌落边缘变得粗糙和不规则。生理生化特性表明，菌株QN1NO-4能产生尿素酶、过氧化氢酶和硝酸还原酶，但不能产生硫化氢。明胶液化试验、淀粉水解试验和V-P试验均为阳性。它能在盐浓度高达13％的培养基中存活，适宜生长温度为30～65℃、pH值5～10。除L-谷氨酸和L-酪氨酸外，该菌株对碳源和氮源均能利用。对18种抗生素敏感，对青霉素和哌拉西林不敏感(表S1-S3；图7)。

表S1菌株QN1NO-4的生理生化特性

+：阳性反应；–：阴性反应.

表S2菌株QN1NO-4的碳氮源利用情况

特征	结果
		碳源利用
D-半乳糖	+++
		D-甘露糖	++
D-果糖	++
		葡萄糖	+++
甘露醇	+++
		松三糖	++
D-核糖	+
		阿拉伯糖	++
鼠李糖	++
		麦芽糖	+++
肌醇	+++
		蜜三糖	+++
蔗糖	+++
		可溶性淀粉	++
山梨醇	+++
		D-木糖	++
α-乳糖	+++
		D-纤维二糖	+
木聚糖	++
		海藻糖	+++
氮源利用
		乙酸铵	+
硫酸铵	++
		肌酸	++
甘氨酸	+
		L-精氨酸	++
L-天冬酰胺	++
		L-半胱氨酸	+
L-谷氨酸	-
		L-组氨酸	++
L-蛋氨酸	+
		L-苯基丙氨酸	++
L-色氨酸	+
		L-酪氨酸	-
L-缬氨酸	+++

+++：生长迅速；++：轻微增长；+：长势缓慢；-：不生长。

表S3 QN1NO-4菌株对抗生素的敏感性。

抗生素	结果
		丁胺卡那	S
氨苄西林	S
		羧苄西林	S
头孢唑林	S
		头孢哌酮	S
头孢他啶	S
		头孢曲松	S
头孢呋辛	S
		头孢氨苄	S
头孢拉定	S
		多四环素	S
红霉素	S
		庆大霉素	S
卡那霉素	S
		米诺环素	S
新霉素	S
		苯唑西林	S
青霉素	R
		哌拉西林	R
四环素	S

S：敏感；R：不敏感

12.2 16S rRNA序列分析

采用快速基因组DNA提取试剂盒提取菌株QN1NO-4的基因组DNA(DP1301,BeijingBioTek Biotech Co.,Ltd.,China)。采用细菌通用引物27F和1492R扩增16S rRNA基因。方法如Li等(2020b)所述。PCR产物经华大基因技术有限公司(中国深圳)纯化并测序后，扩增的16S rRNA序列与EzBiocloud server1进行比对，使用BioEdit 7.0.5.3的Clustal W程序获得相似的序列。最后，利用MEGA 7.0的Neighbor-Joining(邻接法)构建系统发育树，并基于1000个重复进行bootstrap分析，生成进化距离。

通过PCR扩增出菌株QN1NO-4的16S rRNA基因序列(1418bp)。经Ezbiocloud数据库比对，菌株QN1NO-4与标准菌株暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensi，KCTC 13613)的相似性为100％。基于16S rRNA基因序列采用MEGA version 7.0.14的邻接法构建了系统发育树(图8)，菌株QN1NO-4与B.siamensis落在同一个分支中，形成一个轮廓清晰的分支，bootstrap值为94。结合培养、形态、生理生化特性，将菌株QN1NO-4归属于芽胞杆菌属。

12.3菌株QN1NO-4的基因组测序

菌株QN1NO-4在37℃LB液体培养基中摇瓶培养24～48h，使用BioTeke细菌基因组DNA快速提取试剂盒(DP1301,Beijing Biotech Co.,Ltd.,China)，根据制造商提供的说明提取基因组DNA。使用TBS-380荧光仪(Turner BioSystems Inc.,Sunnyvale,CA,UnitedStates)定量纯化的基因组DNA，然后运用Illumina高通量测序平台(HiSeq)测序。全基因组的组装由中国上海美吉生物制药科技有限公司完成。基于生物信息云i-sanger 2平台开展生物信息学分，使用在线平台OrthoANI(Yoon et al.，2017)分析平均核苷酸同义度平均核苷酸相似度(ANI)，根据菌株QN1NO-4的全基因组序列计算G+C含量。运用Glimmer v3.02预测蛋白编码基因(Delcher et al.，2007)。通过查询基因本体公共数据库(GO；http://www.geneontology.org/)，蛋白质同源群簇(COG；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG)，京都基因和基因组百科全书(KEGG；http://www.genome.jp/kegg/)((Zhang et al.,2020)。采用显示KEGG预测基因参与的生物途径。利用在线软件antiSMASH v4.2.0预测次生代谢物合成的基因聚类分析(Huang et al.,2019)。

菌株QN1NO-4的全基因组为3923715bp，G+C含量为46.49％。基因组中检测到3个rRNA基因、52个tRNA基因和3917个蛋白编码基因(图9和表S4)。进一步计算了菌株QN1NO-4的基因组ANI。简单地说，同源性最高的标准菌株(暹罗芽胞杆菌KCTC 13613和枯草芽胞杆菌NCIB 3610)的基因组数据是从EzBioCloud公共基因组数据库(https://www.ezbiocloud.net/search？Tn＝Nocardioides)中下载，然后提交给ANI计算平台(https://www.ezbiocloud.net/tools/ANI)计算平均核苷酸一致性(ANI)。结果表明，菌株QN1NO-4与标准菌株暹罗芽胞杆菌KCTC 13613和枯草芽胞杆菌NCIB 3610的ANI值分别为94.38％和77.07％(表S5)，低于物种圈定阈值95-96％(Richter和Rosselló-Móra,2009)。因此，菌株QN1NO-4被鉴定为芽胞杆菌属的一个新种，命名为Bacillus sp.Nov.QN1NO-4。

表S4 Bacillus sp.QN1NO-4全基因组测序

表S5平均核苷酸一致性(ANI)结果

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种芽胞杆菌，其特征在于，其为芽胞杆菌属的一个新种，命名为：Bacillussp.Nov.QN1NO-4，于2021年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2021306。

2.如权利要求1所述的芽胞杆菌在拮抗小麦赤霉病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或芒果炭疽病菌中的应用。

3.如权利要求1所述的芽胞杆菌在制备防治小麦赤霉病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或芒果炭疽病菌所致病害的生防制剂中的应用。

4.权利要求1所述的芽胞杆菌的发酵液、或发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白、或发酵液离心后的发酵上清液的乙酸乙酯萃取物。

5.如权利要求4所述的发酵液、或发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白、或发酵液离心后的发酵上清液的乙酸乙酯萃取物在拮抗小麦赤霉病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或芒果炭疽病菌中的应用。

6.如权利要求4所述的发酵液、或发酵液离心后的发酵上清液、或发酵液离心后的发酵上清液经硫酸铵沉淀法得到的粗提蛋白、或发酵液离心后的发酵上清液的乙酸乙酯萃取物在制备防治小麦赤霉病菌、和/或香蕉大灰斑病菌、和/或荔枝炭疽病菌、和/或黄瓜枯萎病菌、和/或草莓炭疽病菌、和/或胶孢炭疽病菌、和/或水稻稻瘟病菌、和/或辣椒炭疽病菌、和/或菜心炭疽病菌、和/或芒果炭疽病菌所致病害的生防制剂中的应用。