CN102174430B - 一种冷解糖芽孢杆菌菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明利用筛选到的一株冷解糖芽孢杆菌菌株制备高效的复合微生物海藻肥料，本发明芽孢杆菌菌株的分类命名为冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为C GMCC No.4519。本发明的一株冷解糖芽孢杆菌不仅具有强降解纤维素和淀粉能力而且具有较广抗菌谱；将该菌种与传统菌肥常用菌种进行复配，然后将混合发酵菌液、植物生长因子、免疫调节因子、海藻活性提取物、氨基酸、有机质、微量元素按一定比例制备出一种有效活菌数为2亿/g-10亿/g且有机质含量为20％-40％的高效复合微生物海藻肥料，该肥料抗病虫害和促生长的能力显著，作物增产幅度达30％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种冷解糖芽孢杆菌菌株。
背景技术
我国各地出现的土传病害越来越严重且呈不断上升的情形，枯萎病、线虫病、疫病和病毒病等病害蔓延。大量化肥农药的使用，虽然一方面解决了粮食的供应问题，增加了经济收入；但是另一方面化学农药也带来了更为严重的负面效应：肥料利用率低、环境恶化、土地质量下降、水源污染、农作物抗病力下降等，很大程度上已经威胁到粮食安全和农业的可持续发展。而微生物肥料在解决这方面问题上有其独到的作用，并取得了良好的使用效果，它将是我国农业技术发展的重点和依托所在。微生物肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性能的关键，寻找拮抗致病菌或致病害虫的高活性微生物及其代谢产物来预防和解决土传病害是目前微生物肥料的研究热点和突破口。
发明内容
针对现有技术中传统化学肥料和普通微生物肥料的不足，本发明的目的是提供了一种冷解糖芽孢杆菌菌株，利用筛选到的一种冷解糖芽孢杆菌菌株制备高效的复合微生物海藻肥料，该复合微生物海藻肥料不仅营养齐全而且抗逆性、抗病虫害、促生长能力突出，可在一定程度上替代农药、化肥、激素，改良土壤性状，改善产品品质，使农产品达到绿色或有机标准。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种冷解糖芽孢杆菌菌株，其分类命名为冷解糖芽孢杆菌(Bacilluspsychrosaccharolyticus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC No.4519，它的保藏时间为2010年12月29日。
所述冷解糖芽孢杆菌菌株的菌落大小28-32mm，圆形，白色，边缘较整齐且呈隆起状，菌落表面有膜，膜下较湿润、呈粘稠状、透明，易挑取，显微镜下观察菌体呈杆状，芽孢中生，呈椭圆形。
所述冷解糖芽孢杆菌菌株对黄瓜尖孢镰刀菌、棉花尖孢镰刀菌、禾谷镰孢菌、黄瓜立枯丝核菌、棉田立枯丝核菌、褐根病菌或茄青枯拉尔氏菌有抑菌作用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明从自然发酵的面酱中分离筛选得到一株冷解糖芽孢杆菌菌株，该菌株不仅具有强降解纤维素和淀粉能力而且具有较广抗菌谱，对尖孢镰刀菌的菌丝生长具有很强的抑制作用，抑制率可达80％，对根结线虫的抑杀作用也在70％以上；将该菌种与传统菌肥常用菌种进行复配，通过复配筛选到复配菌株，各菌种之间可共生，且有一定协同作用，通过混合培养与发酵条件优化，使各菌种之间形成稳定的协同作用，增强了菌种抗逆性和生物活性；复合微生物海藻肥料的制备是将混合发酵菌液、植物生长因子、免疫调节因子、海藻活性提取物、氨基酸、有机质和微量元素按一定比例制备出一种有效活菌数为2亿/g-10亿/g且有机质含量为20％-40％的高效复合微生物海藻肥料，该肥料抗病虫害和促生长的能力显著，作物增产幅度达30％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
(一)冷解糖芽孢杆菌的分离筛选
从自然发酵面酱、堆肥、果树土壤、菜园土壤中取样50-100份，分别取1-10g样品悬浮在9-100ml生理盐水中，剧烈震荡。分别取100μL样品悬浮液均匀涂布平板，本发明实施例中以普通营养肉汤培养基作为无菌营养液，以克每升计算，其成分是蛋白胨10.0、牛肉粉3.0、氯化钠5.0、葡萄糖1.0、水1000毫升，pH值7.5，121℃灭菌20分钟，培养温度为37℃，培养时间为18～24小时。平板菌落计数培养基为营养琼脂培养基，即在普通营养肉汤培养基中添加琼脂，培养温度为37℃，培养时间为18～24小时。
将涂布样品悬浮液的营养琼脂培养基平板于25℃-50℃培养箱中倒置培养1-36小时，取出分别在平板中央接种黄瓜尖孢镰刀菌，接种量为100微升，于10℃-40℃培养箱中正置培养1h～100h，从平板上挑取对黄瓜尖孢镰刀菌具有明显抑制作用的菌落，用划线法接种到营养琼脂培养基平板上，通过反复多次划线得到纯菌，共筛选出22株纯菌，采用平板法再次验证22株纯菌对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用，结果有9株纯菌对黄瓜尖孢镰刀菌菌丝生长有明显抑制作用，抑制率在50％以上，其中一株芽孢杆菌对黄瓜尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用最为显著，抑制率在80％以上，经Biolog菌种鉴定此芽孢杆菌为冷解糖芽孢杆菌。
(二)冷解糖芽孢杆菌活性检测
1.抑菌活性
采用平板对峙法测试冷解糖芽孢杆菌对指示菌的抑菌活性，平板中央接种指示菌菌块，平板接种量为100微升，在距离指示菌菌块2.5cm处接种冷解糖芽孢杆菌单菌落，另一侧不接种冷解糖芽孢杆菌，以供测量空白指示菌半径，10℃-40℃恒温培养1-60d，观察指示菌菌丝生长情况，测量抑菌结果。
抑制率的计算方法：
抑菌宽度(mm)＝空白侧指示菌半径-接种冷解糖芽孢杆菌侧指示菌半径
抑菌结果如下表：
结果表明，本发明的冷解糖芽孢杆菌对上述指示菌都有不同程度的抑菌作用。
2.对根结线虫的抑制作用
采用温室盆钵法测试冷解糖芽孢杆菌对番茄根结线虫的抑制作用。
a.冷解糖芽孢杆菌菌悬液的制备
将冷解糖芽孢杆菌划线平板，取单菌落接种到营养液中，培养1-100h得冷解糖发酵液，平板菌落计数，无菌水将发酵液配制成含有108cfu/ml的菌悬液。
b.番茄根结线虫卵和二龄幼虫悬浮液的制备
从番茄病株根部挑取新鲜卵块，置于贝曼漏斗中孵化，10-30h后采用0.5％NaClO法开始收集二龄幼虫，每天收集1次，共收集4次，显微镜下计数，将线虫悬浮液稀释为100个/ml(包括线虫卵)，4℃保存待用。
c.温室盆钵试验
采用番茄做供试品种，将供试番茄播种于灭菌土中，出苗2周后，选取长势一致的植株移栽于装有灭菌土(腐殖酸和砂土1∶1混合)的营养杯中。移栽2d后，分别浇注菌悬液100ml，对照浇注100ml自来水。2d后以每株100条根结线虫量(含卵)滴注番茄根部。平行3株对照株，5株处理株。25℃培养50d后取出植株，解剖镜下记录根结数、卵块数(0.05％薯红溶液染色3～4min)和每个卵块平均卵量(以随机抽取的5个卵块的平均卵量计算)。实验结果表明：用冷解糖芽孢杆菌菌悬液处理的植株根结数和卵块数明显减少，较对照降低72.8％，平均每卵块卵量较对照组降低32.5％。
(三)冷解糖芽孢杆菌与传统菌种的复配
将冷解糖芽孢杆菌和传统菌肥常用菌种分别接种于无菌营养液中，10-50℃培养1-60h后，等比例将冷解糖芽孢杆菌与其余各菌株混合后按1∶10的接种量接种于无菌营养液中，10-50℃继续培养10-100h，平板计数法检测单菌发酵菌液和混合发酵菌液的菌落总数，并鉴别菌落种类。根据菌落总数和种类得到与冷解糖芽孢杆菌共生效果良好的菌种，通过多次混合发酵得到与冷解糖芽孢杆菌具有稳定协同作用的复配菌株，本发明以枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌等菌种作为复配菌种，因它们分别具有解磷解钾抗病的功能，可以进一步增强肥效。
(四)冷解糖芽孢杆菌与复配菌株的混合培养与发酵条件优化
将冷解糖芽孢杆菌与复配菌株分别制备种子液，然后按比例接种到发酵培养基中，通过调整发酵培养基配方、PH值、发酵温度、接种比例优化混合发酵条件，使混合发酵液的菌落总数达到1×109cfu/ml-5×109cfu/ml。
(五)复合微生物海藻肥料的制备
将混合发酵菌液与植物生长因子、免疫调节因子、海藻活性提取物、氨基酸、有机质和微量元素按一定比例制备出一种有效活菌数为2亿/g-10亿/g且有机质含量为20％-40％的高效复合微生物海藻肥料。
综上可知，本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果：
本发明采用的主要菌种冷解糖芽孢杆菌对土传病病原菌具有很广泛的抗菌谱和很显著的效果，并且对根结线虫也有很强的抑杀作用，目前冷解糖芽孢杆菌在菌肥中应用尚未见任何报道。
本发明所用菌种是由冷解糖芽孢杆菌和传统菌肥常用菌种复配而成，通过复配筛选各菌种之间共生效果好且有一定协同作用的菌株，再通过混合培养与发酵条件优化，使各菌种之间形成稳定的协同作用，增加了菌种抗逆性和生物活性。
本发明所生产的复合微生物海藻肥料将高活性复配菌种和冷解糖芽孢杆菌混合发酵液、植物生长因子、免疫调节因子、海藻活性提取物、氨基酸、有机质和微量元素有机结合，不仅营养齐全而且抗逆性、抗病虫害、促生长能力非常突出，可一定程度上替代农药、化肥、激素，避免化学污染，改良土壤性状，改善产品品质，使产品达到绿色或有机标准。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.一种冷解糖芽孢杆菌菌株，其特征在于：其分类命名为冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.4519。
2.根据权利要求1所述的一种冷解糖芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述冷解糖芽孢杆菌菌株的菌落大小28-32mm，圆形，白色，边缘较整齐且呈隆起状，菌落表面有膜，膜下较湿润、呈粘稠状、透明，易挑取，显微镜下观察菌体呈杆状，芽孢中生，呈椭圆形。
3.根据权利要求1所述的一种冷解糖芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述冷解糖芽孢杆菌菌株对黄瓜尖孢镰刀菌、棉花尖孢镰刀菌、禾谷镰孢菌、黄瓜立枯丝核菌、棉田立枯丝核菌、褐根病菌或茄青枯拉尔氏菌有抑菌作用。
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