KR20210004210A - 카로티노이드를 생산하는 락토바실러스 펜토서스 균주 및 이를 포함하는 항산화용 조성물 - Google Patents
카로티노이드를 생산하는 락토바실러스 펜토서스 균주 및 이를 포함하는 항산화용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양 상등액을 포함하는 항산화용 조성물 및 상기 균주를 이용한 카로티노이드 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주는 C30 카로티노이드 4,4'-디아포뉴로스포린을 고생산하며, 상기 카로티노이드의 발현 수준은 H2O2 및 고염 조건에서 더욱 증가하였다. 따라서 본 발명의 L. pentosus KCCP11226 균주에 의한 카로티노이드 생산은 GRAS 유기체인 LAB의 광범위한 적용 가능성과 결합하여 천연 항산화 물질인 카로티노이드의 유용성을 증가시킬 수 있다.
Description
본 발명은 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양 상등액을 포함하는 항산화용 조성물 및 상기 균주를 이용한 카로티노이드 생산 방법에 관한 것이다.
카로티노이드는 식물, 동물, 곰팡이 및 광합성 또는 비광합성 박테리아에 의해 광범위하게 합성되며, 카로티노이드의 항산화 작용은 광범위하게 연구되어 왔다. 특히, 인간의 몸은 카로티노이드를 합성할 수 없다. 그러므로 상기 화합물은 음식으로 섭취해야 한다. 카로티노이드는 산화 방지제, 항암제 및 항-비만 효과를 포함하는 의약적 성질을 지닌 색소이며 식품, 건강 기능 식품 및 사료 업계에서 널리 사용된다.
구조적으로, 카로티노이드는 카로틴(예를 들어 α-/β- 카로틴 및 리코펜) 및 잔토필(예를 들어, 루테인, 제아잔틴, 퓨코잔틴 및 아스타잔틴)으로 나눌 수 있다. 몇 가지 유형의 카로티노이드가 미생물로부터 생산된다. 실제로, 효모 Xanthophyllomyces dendrorhous(Phaffia rhodozyma)는 아스타잔틴을 생산하고 미세조류(microalgae)는 루테인을 생산한다. 또한 Bliskea trispora 균은 β-카로틴과 리코펜을 생산하는 것으로 보고되었다.
카로티노이드는 화학 합성에 의해 생산될 수 있다. 그러나 이 방법은 부산물 발생 및 생산 과정에서 요구되는 까다로운 조건과 다양한 환경 문제와 관련이 있다. 따라서, 카로티노이드를 생산하기 위한 새롭고 환경 친화적인 방법이 요구되며, 여러 연구에서 다양한 천연 물질로 만든 카로티노이드의 생산량을 평가한 바 있다. 이러한 물질들 중에서 산업적 규모에서 카로티노이드 생산의 계절적 및 지리적 변동성으로 인해 채소 및 과일과 같은 다른 천연자원보다 미생물이 선호되고 있다. 초기 연구에서, 미생물에 의한 카로티노이드의 생산은 생물공학적 방법을 통해 카로티노이드 생합성 유전자를 Bacillus subtilis에 재조합하여 카로티노이드 생산을 촉진시켰다. 그러나 최근에는 천연자원으로부터 카로티노이드를 생산하기 위하여 유산균(LAB)을 사용하여 생산되고 있다.
LAB는 일반적으로 안전하다고 인정되는 그람 양성균이며 수년 동안 다양한 식품의 발효에 널리 사용되었다. LAB는 미호기성(microaerophilic) 또는 조건적 혐기성(facultative anaerobic)의 성장 특성을 가지기 때문에 자유 라디칼을 제거하기 위한 카탈라아제 발현의 결여되어 있다. 이 문제를 극복하기 위해 LAB는 슈퍼옥사이드 디스뮤테이스(superoxide dismutase) 및 티오레독신환원효소(thioredoxin reductase)와 같은 다양한 항산화제(antioxidant)를 생산한다. 또한, LAB는 활성 산소 종을 제거하기 위한 몇 가지 전략 중 하나로 카로티노이드를 생산하는 것으로 알려져 있다. LAB 균주에 의해 생성된 노란색 색소는 C30 카로티노이드인 4,4'-디아포뉴로스포렌(4,4'-diaponeurosporene)으로 확인되었다. 실제로 Lactobacillus plantarum과 Enterococcus gilvus는 카로티노이드 생합성 경로의 구성 성분을 발현하고 4,4'-디아포뉴로스포린을 생성한다. 디히드로스콸렌 합성효소(dehydrosqualene synthase; crtM)와 데하이드로스콸렌 불포화효소(dehydrosqualene desaturase; crtN)는 파네실-PP(farnesyl-PP; 3개의 이소프렌 유닛, 15개의 탄소)를 4,4'-디아포뉴로스포렌(6개의 이소프렌 유닛, 30개의 탄소)로 전환시킴으로써 카로티노이드 생합성 경로에서 중요한 역할을 한다.
이전의 연구들은 스트레스 반응 메커니즘이 미생물에서 카로티노이드 생성을 증가시키고 스트레스 내성을 제공한다고 보고했다. 또한, LAB은 엔벨로프(리소자임), 열, 용매, 담즙, 산, 염 및 삼투압과 같은 다중 스트레스에 대한 내성을 나타낸다. Hagi et al.(2013) 및 Hagi et al.(2015)는 LAB에 의한 카로티노이드 생산과 산화 스트레스 내성 간에 상관관계가 있음을 보여 주었다. 또한, Enterococcus gilvus의 crtN 및 crtM 유전자는 다양한 스트레스 조건에서 상향 조절되어 카로티노이드 생산을 유도한다. 따라서, LAB의 스트레스 저항 기작은 성장을 위해 카로티노이드 생산을 향상시킨다. 그러나 LAB가 스트레스 조건하에서 카로티노이드를 생산하는 특정 분자 메카니즘은 완전히 밝혀지지 않았다.
따라서 본 연구에서는 다양한 스트레스 성장 조건하에서 LAB에 의한 카로티노이드 생산을 평가하고 특성화하였다. 또한, crtN 및 crtM 유전자의 발현은 상이한 스트레스 조건하에서 검사되었다. 마지막으로 우리는 LAB에서 생산된 카로티노이드의 항산화 능력을 확인했다.
본 발명은 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양 상등액을 포함하는 항산화용 조성물 및 상기 균주를 이용한 카로티노이드 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주를 제공하며, 상기 균주는 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하지 않는 L. plantarum KCCP11031 균주에 비하여 높은 카로티노이드를 생산하는 것을 특징으로 하고, 상기 카로티노이드는 C30 카로티노이드인 4,4'-디아포뉴로스포렌(4,4'-diaponeurosporene)인 것을 특징으로 한다.
또한 카로티노이드는 BHT(10 μg/mL)과 β-카로틴(10μM) 보다 높은 DPPH 자유라디칼 소거능을 나타내며, A470에서의 흡광도 값이 높아짐에 따라 DPPH 자유라디칼 소거능의 증가를 나타낸다.
상기 균주 및 상기 균주 배양 상등액은 DPPH 자유라디칼 소거능을 나타내며, 산성 조건(pH 1.5 내지 2.0), 고온 조건(55 내지 60℃) 또는 산화 스트레스 조건(16 내지 32 mM H2O2)에서, 상기 균주는 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하지 않는 L. plantarum KCCP11031 균주에 비하여 높은 생존율을 나타내고, 리소자임 또는 담즙산 존재 하에서, 상기 균주는 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하지 않는 L. plantarum KCCP11031 균주에 비하여 높은 생존율을 나타내는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 균주는 H2O2 또는 NaCl을 처리하는 경우 카로티노이드의 생산량과 카로티노이드 생합성 유전자의 발현량이 증가하는 것을 특징으로 한다.
다른 실시 예에서, 본 발명은 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 또는 이의 배양물, 농축물 또는 건조물을 유효성분으로 함유하는 기능성 제제, 특히 프로바이오틱스 제제를 제공한다. 예를 들어, 상기 프로바이오틱스 제제는 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다.
또 다른 실시 예에서, 본 발명은 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 또는 이의 배양물, 농축물 또는 건조물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물을 제공하며, 상기 항산화용 조성물은 건강 기능 식품에 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 산화적 스트레스와 관련된 각종 질환의 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 드링크제, 카라멜, 다이어트바 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 건강식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명은 식품이나 발효제품(식품)으로 활용될 수 있으며, 발효제품의 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있다. 상기 발효제품은 햄 및 소시지와 같은 발효육제품, 발효생식제품, 발효유제품, 김치 등을 포함한다. 본 발명의 균주를 이용한 발효제품은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대 상기 발효생식제품은 현미와 율무 등의 곡류 분말, 과채류 분말, 버섯류 분말에 본 발명에 따른 균주 원말을 혼합하여 제조될 수도 있다. 또한 상기 곡류 분말은 본 발명에 따른 균주 또는 이를 포함하는 2-3종의 혼합 균주로 적정 온도에서 발효시킨 후 과채류, 버섯류 분말을 영양적인 균형과 기호성이 우수하도록 적절히 배합하여 제조할 수 있다.
또 다른 실시 예에서, 본 발명은 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주를 H2O2 또는 NaCl를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 카로티노이드 생산 방법을 제공한다. 상기 배지는 균주를 배양하기 위한 통상의 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 de Man Rogosa and Sharpe(MRS) 배지인 것이 바람직하다.
본 발명의 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주는 C30 카로티노이드인 4,4'-디아포뉴로스포린을 생산하며, 상기 카로티노이드의 발현 수준은 H2O2 및 고염 조건에서 더욱 증가하였다. 따라서 본 발명의 L. pentosus KCCP11226 균주에 의한 카로티노이드 생산은 GRAS 유기체인 LAB의 광범위한 적용 가능성과 결합하여 천연 항산화 물질인 카로티노이드의 유용성을 증가시킬 수 있다.
도 1. 16S rRNA 서열에 기초한 Neighbor-joining 계통수. 상기 계통수는 crtNM 유전자를 보유하고 있는 6개의 균주와 16S rRNA 유전자 서열과 밀접한 관계가 있는 다른 박테리아 사이의 관계를 보여준다.
도 2. 흡광도에 따른 카로티노이드 착색 수준의 비교. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다. 유의미한 의미는 ANOVA 분석 후 Tukey-Kramer 다중 비교 검사(P <0.01)로 얻어졌다.
도 3. 분리된 LAB로부터 추출된 카로티노이드의 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼.
도 4. 30℃에서 24시간 동안 배양한 LAB에 의한 DPPH 자유 라디칼 소거 효과.
도 5. (A) 낮은 pH, (B) 열충격, (C) H2O2, (D)리소자임 및 (E) 담즙산에 노출된 후의 생존율. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다. 유의미한 결과는 ANOVA 분석 후 Tukey-Kramer 다중 비교 검사(P <0.01)로 얻어졌다.
도 6. 과산화수소 스트레스 조건(A와 B) 및 고염 스트레스 조건(C와 D)에서 배양 후 카로티노이드 색소 수준 측정. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 닫힌 원과 사각형은 각각 OD600과 A470을 표시한다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다. 유의미한 결과는 ANOVA 분석 후 Bonferroni 다중 비교 검사(P <0.01)로 얻어졌다.
도 7. (A) KCCP11226 에서 추출한 카로티노이드의 라디칼 소거 활성 및 (B) 카로티노이드 색소의 라디칼 소거 활성 측정. BHT의 농도는 10 μg/mL이며 β-카로틴의 농도는 10μM이다. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다. 유의미한 결과는 ANOVA 분석 후 Bonferroni 다중 비교 검사(P <0.01)로 얻어졌다.
도 2. 흡광도에 따른 카로티노이드 착색 수준의 비교. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다. 유의미한 의미는 ANOVA 분석 후 Tukey-Kramer 다중 비교 검사(P <0.01)로 얻어졌다.
도 3. 분리된 LAB로부터 추출된 카로티노이드의 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼.
도 4. 30℃에서 24시간 동안 배양한 LAB에 의한 DPPH 자유 라디칼 소거 효과.
도 5. (A) 낮은 pH, (B) 열충격, (C) H2O2, (D)리소자임 및 (E) 담즙산에 노출된 후의 생존율. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다. 유의미한 결과는 ANOVA 분석 후 Tukey-Kramer 다중 비교 검사(P <0.01)로 얻어졌다.
도 6. 과산화수소 스트레스 조건(A와 B) 및 고염 스트레스 조건(C와 D)에서 배양 후 카로티노이드 색소 수준 측정. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 닫힌 원과 사각형은 각각 OD600과 A470을 표시한다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다. 유의미한 결과는 ANOVA 분석 후 Bonferroni 다중 비교 검사(P <0.01)로 얻어졌다.
도 7. (A) KCCP11226 에서 추출한 카로티노이드의 라디칼 소거 활성 및 (B) 카로티노이드 색소의 라디칼 소거 활성 측정. BHT의 농도는 10 μg/mL이며 β-카로틴의 농도는 10μM이다. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차에 해당한다. 유의미한 결과는 ANOVA 분석 후 Bonferroni 다중 비교 검사(P <0.01)로 얻어졌다.
이하, 실시 예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 박테리아 균주, 배지 및 성장 조건
LAB 균주는 가천 대학교(KCCP; Seongnam, South Korea)와 한국 미생물 센터(KCCM, Seoul, Korea)에서 공급받았으며, 30℃로 de Man Rogosa and Sharpe(MRS; Kisanbio, Seoul, South Korea) agar에서 배양하였다. 카로티노이드를 생산하는 것으로 보여지는 황색 색소를 갖는 콜로니를 1차로 선별하였다. 음성 대조군은 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하지 않는 L. plantarum KCCP11031이다. 전배양(preculture) 준비를 위해, LAB 균주를 MRS 배지에서 밤새 30℃에서 배양하였다. 이 전배양물을 삼각 플라스크(500 mL) 에 담긴 200 mL MRS 액체 배지에 접종하였다. 상기 플라스크를 30℃에서 24시간 동안 교반하지 않고 배양하였다. 클로닝 벡터 pGEM-T Easy(Promega, Madison, WI, USA)를 TA 클로닝에 사용하였다. 형질 전환에 사용된 숙주 균주는 Escherichia coli DH5α였다. Hit-DH5α Value 108(RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)을 Luria Bertani(LB, Difco, BD) 액체 배지에서 교반하면서 배양하였다. 재조합 Escherichia coli를 37℃로 100μg/mL 암피실린(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 첨가한 LB 배지에서 배양하였다.
2. 유전자 분석
게놈 DNA는 비드(bead)를 사용하여 박테리아 펠렛에서 추출하였으며, 페놀-클로로포름-이소아밀 알코올(Biosesang, Seongnam, South Korea)과 클로로포름을 사용하여 정제하였다. Solg 2X EF-Taq PCR Smart Mix 2(Solgent, Seoul, Korea)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 16S rRNA 유전자는 박테리아 범용 프라이머 27F 및 1492R로 증폭시켰다(Lane, 1991). crtNM-for (5'-CGCGGAATTCATGAAGCAAGTATCGATTATTGGC-3') 및 crtNM-rev (5'-GATCGAATTCTTAAGCCTCCTTAAGGGCTAGTTC-3')에 대한 올리고 뉴클레오타이드 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 이용하여 1차로 선별된 황색 색소를 갖는 균주에서의 오페론 crtNM의 존재를 확인하였다. PCR은 Turpin et al.(2016)에서 언급된, 95℃에서 5분, 1사이클; 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 120초 40 사이클; 그 다음 72℃에서 5분, 1사이클로 T100 thermal cycler(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 상기 PCR 산물은 Macrogen Co.(Seoul, Korea)에 의해 서열 분석되었다. 16S rRNA 유전자와 crtNM 유전자는 BLASTN 알고리즘을 사용하여 GenBank(NCBI)에서 동정되었다. 염기 서열은 CLUSTALW 프로그램을 사용하여 정렬하였다(Thompson et al., 1994). 계통 발생 분석은 MEGA6 프로그램으로 수행되었다.
3. 카로티노이드 추출 및 특성 분석
카로티노이드의 추출은 Hagi et al.(2013)에 기술된 바와 같이 수행되었으며, 약간의 수정을 통해 진행되었다. 세포 펠렛을 15mL 튜브에 넣고 총 부피 5mL의 메탄올로 추출하였다. 튜브를 궤도 진탕기(obital shaker)로 실온에서 밤새 진탕시켰다. 진탕 후, 황색 색소를 함유하는 메탄올 추출물에 헥산 5mL 및 증류수 2.5mL를 첨가하였다. 2000Хg에서 10분간 원심 분리한 후, 카로티노이드를 함유하는 유기 상(organic phase)을 수집하였다. 상기 유기 상을 증발시키고, 카로티노이드를 1mL의 석유 에테르(petroleum ether)에 재현탁시켰다. 추출된 색소의 양은 분광 광도계(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 A470nm에서 측정하였다. 밀봉된 유리 챔버에서 실리카 겔(Merck, Darmstadt, Germany) 및 석유 에테르와 아세톤(9:1, v/v)의 혼합물을 이용한 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 황색 색소의 분리를 수행하였다. 색소를 긁어 내고 석유 에테르로 용리하여 색소를 회수한 후, UV-VIS 분광 광도계(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 정제된 색소의 흡광도 스펙트럼을 확인하였다. 카로티노이드의 정량은 세포 당(OD600) 카로티노이드의 최대 흡광도 값(A470)으로 나누어 계산하였다.
4. 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(DPPH)-소거활성의 측정
Li et al.(2012)에 기술된 방법을 일부 수정하여 L. pentosus KCCP11226의 배양 상등액 또는 추출된 카로티노이드의 DPPH-소거 활성을 측정하였다. 간단히 말하면, 1mL의 DPPH 용액(에탄올에 0.2 mM 농도로 희석; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 카로티노이드 추출 용액 1mL 또는 배양 상등액 1 mL와 혼합하였다. 혼합물을 어둡게 하여 실온에서 30분 동안 반응시켰다. BHT(butylated hydroxytoluene; 50 또는 10μg/mL)과 β-카로틴(10μM)을 양성 대조군으로 사용하였다. 대조군은 샘플을 처리하는 대신 식염수로 대체하여 진행하였다. 블랭크(Blank)는 배양 상등액과 에탄올 또는 추출된 카로티노이드와 에탄올을 반응시켰다. 이어서, 마이크로 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도의 값을 측정함으로써 DPPH 라디칼 소거능을 모니터링하였다. 소거능은 다음과 같이 계산하였다.: 소거 활성(%) = (1 - [A샘플 - A블랭크] / A대조군) Х 100.
5. 스트레스 처리 후 균주의 생존율 측정
스트레스 환경에 노출 후 균주의 생존율은 Hagi et al.(2013)에 기재된 방법에 의하여 측정되었다. 세포를 30℃에서 24시간 동안 MRS 배지에서 배양하고, 8000Хg에서 10분 동안 원심 분리하고, 식염수로 2회 세척하였다. 열충격 스트레스 조건에 대한 내성의 정도를 확인하기 위해, 상기 세척된 박테리아 펠릿을 500μL 식염수에 재현탁하고 55 또는 60℃에서 20분 동안 배양했다. 열 스트레스에 노출되기 전후의 균주의 생존율은 박테리아 현탁액을 희석하여 MRS 한천 플레이트에 도말하여 측정하였다. H2O-, 낮은 pH, 담즙 및 리소자임 스트레스 조건에 대한 내성의 정도를 확인하기 위해, 상기 세척된 박테리아 펠렛을 H2O2(16 또는 32mM), 낮은-pH 식염수(pH 1.5 또는 2.0, HCl로 조정)), oxgall(10% 또는 20%, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 또는 리소자임(8 또는 12mg/mL; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 함유한 500 μL 식염수에 재현탁시켰다. 각 스트레스 조건하에서 상기 박테리아 현탁액을 30℃에서 90분간(H2O2, 낮은 pH, 담즙 스트레스) 또는 180분(리소자임) 배양 하였다. 상기 박테리아 현탁액을 원심 분리하고 식염수로 2회 세척한 후, 500㎕의 식염수를 박테리아 펠릿에 첨가하였다. 희석 후, 박테리아 현탁액을 MRS 한천 플레이트 상에 도말하고, 생존한 박테리아의 수를 확인하였다. 생존율은 다음 방정식을 사용하여 계산되었다.
생존율(%)=(log cfu N1 / log cfu N0) Х 100
여기서 N1은 스트레스 조건에 노출된 후의 LAB 균주의 전체 생존 수를 나타내고 N0는 스트레스 조건에 노출되기 전의 LAB 균주의 전체 생존 수를 나타낸다. 결과는 세 가지 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 평균 차이의 유의성은 Tukey-Kramer 다중 비교 테스트로 분산 분석을 사용하여 평가되었다. p-value 값이 0.05 이하인 경우, 결과는 유의한 것으로 간주되었다.
6. 스트레스 조건하에서 균주 배양 후 카로티노이드의 추출
H2O2, 글리세롤, NaCl 및 열 스트레스 조건하에서 카로티노이드 수준을 분석하기 위해, L. pentosus KCCP11226의 세포를 상이한 농도(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 mM)의 H2O2, 상이한 농도(1.8 또는 2.0 M)의 glycerol, 상이한 농도(4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 및 9%, w/v)의 NaCl을 포함하는 MRS 액체 배지에서 30℃로 배양하였다. 열 스트레스 실험을 위해, 배양 배지(MRS)의 세포를 서로 다른 온도(40℃ 또는 45℃에서 배양하였다. H2O2, 글리세롤 및 NaCl 스트레스 조건의 경우, 삼각 플라스크에서 세포를 30℃에서 24시간 동안 배양했다. 배양 후, 카로티노이드를 전술한 바와 같이 추출하였다.
7. 스트레스 조건하에서 qRT-PCR에 의한 crtNM 발현 수준 분석
스트레스 조건하에서 crtNM 유전자의 발현 수준을 분석하기 위해, L. pentosus KCCP11226 세포를 7mM H2O2 또는 7%(w/v) NaCl을 포함하는 MRS 배지에서 30℃로 24시간 동안 배양하였다. 대조군 는 30℃에서 24시간 동안 MRS 배지에 배양하였다. RNeasy Protect Bacteria Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany) 및 Proteinase K 용액(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 위의 조건에서 배양된 L. pentosus 세포에서 총 박테리아 RNA를 추출하였다. 총 RNA는 각 배양 조건에서 L. pentosus의 세 가지 독립적인 세포 배양물로부터 추출되었다. RNA 농도는 Nanodrop(Thermo Scientific, MA, USA)을 사용하여 260nm에서 측정하였다. 순도는 260/280 nm 비율을 결정함으로써 확인되었다. cDNA를 합성하기 위해 0.1 μg total RNA를 사용하였다. Diastar RT Kit(Solgent, Seoul, Korea)와 random hexamers(Neoprobe, Daejeon, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. qRT-PCR은 SYBR Green real-time PCR Master Mix(TOYOBO, Osaka, Japan)와 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. crtN 유전자를 증폭하기 위해 프라이머 세트 RT-crtN-for (5'-ACCGAAGCATTACACACGATCC-3') 및 RT-crtN-rev (5'-TCAGGAACTGGTACTAAAACAT-3')를 사용하여 179bp의 amplicon을 생성시켰다. crtM 유전자를 증폭하기 위해 프라이머 세트 RT-crtM-for (5'-GCATTGCGCCAATCATTGAC-3') 및 RT-crtM-rev (5'-GCGGGTTAGTTGCTAGCATT-3')를 사용하여 247bp의 amplicon을 생성시켰다. L. pentosus 16S rRNA housekeeping 유전자는 다음의 범용 프라이머로 증폭시켰으며 194bp의 amplicon을 생성시켰다; 341F (5'-CCTACGGGAGGCAGCAG3') 및 518R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'). 사용된 PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 15분; 이어서 95℃에서 20초, 55℃에서 40초, 72℃에서 30초의 30 사이클을 수행하였다. 용융 프로그램은 95℃에서 15초, 55℃에서 1분, 및 95℃에서 15초 수행하였다. 클로닝은 증폭된 카로티노이드 생합성 유전자의 수를 정량화하기 위하여 수행되었다. DNA 추출 후 Solg 2x EF-Taq PCR Smart Mix 2(Solgent, Seoul, Korea)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 Solg 2X EF-Taq PCR Smart Mix 2(Solgent, Seoul, Korea) 10 μL, 각 primer(10 pmol) 1μL, 멸균 증류수 7μL 및 총 DNA 1μL를 포함하는 20μL 부피로 수행되었다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 5분; 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초의 30 사이클; 이어서 72℃에서 5분. PCR 산물을 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하고 pGEM-T easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝 하였다. Hit-DH5α Value 108(RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)을 형질 전환을 위한 숙주 균주로 선택하고 실험에 사용했다. 재조합된 Escherichia coli를 100 μg/mL 암피실린(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 37℃에서 LB 배지에서 배양하였다. 복제된 플라스미드를 제조자의 지시에 따라 QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였다. 정량화를 위해 16S rRNA 유전자, L. pentosus KCCP11226의 crtN 유전자 및 crtM 유전자를 포함하는 pGEM-T Easy 벡터를 희석하여 표준 곡선을 구성하였다. Quanti-iT PicoGreen dsDNA 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 플라스미드의 농도를 확인하였다. 준비된 표준 곡선을 사용하여 qRT-PCR에 의해 crtN 및 crtM을 정량화하였다. 복제 수는 다음 방정식을 사용하여 결정되었다:
DNA(copy) = (6.0221 Х 1023 [copies/mol] Х DNA amount [g]) / (DNA length [bp] Х 660 [g/mol/bp])
L. pentosus KCCP11226의 표적 유전자 발현 수준을 StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 분석하였다. qRT-PCR은 각 샘플에 대해 3개의 웰에서 수행되었다.
8. 통계 분석
실험 결과는 세 가지 독립적 측정의 평균 ± 표준 편차로 표시되었다. 결과는 Tukey-Kramer 다중 비교 테스트 또는 Bonferroni의 다중 비교 테스트를 사용하여 ANOVA 테스트로 분석되었다.
실험결과
1. 카로티노이드를 생산하는 LAB의 분리
발효 식품에서 분리한 LAB 균주와 KCCM과 KCCP에서 분양받은 균주 총 456종에서 노란색 콜로니를 형성하는 79종의 균주를 선별하였다. 이후, PCR에 의해 카로티노이드 생합성 유전자(crtN 및 crtM)를 포함하는 6개의 균주를 상기 79 균주 중에서 선별하였다. 상기 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하는 6개의 균주는 16S rDNA sequencing에 의해 L. pentosus 및 L. plantarum subsp. plantarum로 확인되었다(도 1). 따라서, 6개의 균주를 배양하고 황색 색소를 세포로부터 추출하였다.
2. LAB로부터 추출된 카로티노이드의 측정 및 확인
도 2는 MRS 배지에서 교반하지 않고 30℃에서 24시간 동안 배양한 상기 6개의 균주에서 추출한 카로티노이드 색소 수치를 보여준다. L. penososus KCCP11226 균주는 가장 높은 카로티노이드 수준을 나타내었고, 음성 대조군보다 10배 더 높았다. TLC 분석을 수행하여 황색 색소를 분리하고, 단일 황색 스팟을 정제하였다(데이터 미첨부). 정제된 황색 색소의 UV-VIS 흡수 스펙트럼을 측정하였고(도 3) 측정된 스펙트럼은 412, 433 및 465 nm에서 피크를 나타내었으며, 이는 4,4'-디아포뉴로스포렌(또한 4,4'-디아포-7,8,11,12-테트라히드로리코펜)에서 얻어진 피크와 거의 동일하다. L. plantarum subsp. plantarum KCCP11354 를 제외한 다른 5개 균주로부터 정제된 황색 색소의 흡수 스펙트럼은 카로티노이드와 일치하였다. 또한, 흡수 스펙트럼의 흡광도 값은 카로티노이드 수준에 직접적으로 비례한다.
카로티노이드 생산 LAB의 배양 상등액을 이용한 DPPH 소거 결과를 도 4에 나타내었다. 6개의 LAB 균주는 1 mg/mL BHT (양성 대조군) 및 카로티노이드를 생산하지 않는 LAB 균주(음성 대조군) 보다 높은 소거 능력을 나타내었다. 실제로, BHT는 82.1%의 소거 활성을 나타내지만, L. pentosus KCCP11226은 92.7%의 라디칼 소거능을 나타냈다. 또한, 카로티노이드 생합성 유전자를 가진 6개의 균주 중 5개의 균주가 카로티노이드를 생산하였으며, L. pentosus KCCP11226은 LAB 중에서 가장 높은 카로티노이드 수준을 나타내었다.
3. 다양한 스트레스 조건하에서 카로티노이드를 생산하는 LAB의 생존율
가혹한 조건하에서 미생물의 생존율은 감소하지만, 카로티노이드를 합성하는 미생물은 열 및 산화 스트레스와 같은 스트레스 조건하에서 증가된 카로티노이드 생산을 나타낸다.
따라서, 본 발명자는 스트레스 조건하에서 LAB(낮은 카로티노이드 수치를 나타낸 L. plantarum subsp. plantarum KCCP11349 제외)의 4개 균주의 생존율을 평가했다(도 5). 흥미롭게도 L. pentosus KCCP11226은 모든 스트레스 조건에서 가장 높은 생존율을 보였다. 구체적으로, 산성 조건(pH 2.0) 하에서, L. pentosus KCCP11226은 음성 대조군보다 384배 더 큰 생존율을 보였다(도 5A). 산성 조건은 세포질 구성 요소의 합성을 방해하고 외부 막 및 세포질 pH 항상성의 파괴에 의한 세포 사멸 세포 사멸을 유도한다; 그러나 가장 높은 카로티노이드 생산성을 보인 L. pentosus KCCP11226은 높은 생존율을 보였다. 이러한 결과는 낮은 pH 조건에서 카로티노이드의 세포질 및 막 변화의 억제와 관련이 있을 수 있다. L. pentosus KCCP11226의 생존율은 55 및 60℃에서 각각 17.8% 및 6.7%이고, 음성 대조군에서는 55 및 60℃에서 각각 1.1% 및 0.3%이었다(도 5b). 열 스트레스에 노출된 후 카로티노이드 생산 균주와 음성 대조군 균주 간의 생존율에는 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 고온에 노출된 유기체에 의한 열 충격 단백질의 합성 및 분자 디펜서 groESL의 발현과 같은 열 충격 보호 메커니즘과 관련이 있을 수 있다.
L. pentosus KCCP11226은 또한 산화 스트레스 조건(16 및 32 mM H2O2) 하에서 가장 높은 생존율을 보였다(도 5C). H2O2의 존재 하에서 카로티노이드를 생성하지 않는 음성 대조군 역시 비교적 높은 생존율을 보였다. 이러한 결과는 LAB가 카탈라아제 음성이지만 NADH-peroxidase를 생성하고 H2O2를 분해한다는 이전 연구결과와 일치했다. 리소자임은 미생물의 세포벽에서 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 분해하고 세포를 용해시킨다. L. pentosus KCCP11226은 리소자임 처리 후 카로티노이드 생산 균주 중 가장 높은 생존율을 보였다(8 및 12 mg/mL의 리소자임 도 5D).
특히, 카로티노이드에 의한 세포막 유동성의 변화는 세포막 손상 및 세포 사멸을 예방할 수 있다. 카로티노이드는 세균성 멤브레인에 통합되어 LAB에서 막 유동성의 변화를 유도하고 담즙산 내성을 개선할 수 있는 지방 친화성(lipophilic) 물질이다. 또한, 카로티노이드 생성 및 세포막 안정성은 세포 생존과 직접적인 상관 관계가 있다. 이것과 일치하여, 4개의 카로티노이드 생산 균주는 20% 담즙산 존재 하에서 대조 균주보다 높은 생존율을 보였다(도 5E). 모든 카로티노이드 생산 균주는 담즙 산에서 상대적으로 높은 생존율을 보였으며, 이는 세포막 지질의 변화와 관련이 있을 수 있다.
스트레스 조건하에서 카로티노이드를 생산하는 LAB의 생존율은 산업 수준의 생산에 중요한 고려 사항이다. L. pentosus KCCP11226은 다양한 스트레스 조건하에서 가장 높은 카로티노이드 생산과 생존율을 보였다. 따라서, L. pentosus KCCP11226은 카로티노이드 생산을 위한 산업적 응용 가능성이 있다. 또한, 이 미생물은 위장관에서 이용 가능하거나 발효 식품의 유망한 잠재적인 프로바이오틱 균주 또는 스타터로서 식품 제조 공정 중에 첨가될 수 있다.
4. 스트레스 조건하에서
L. pentosus
KCCP11226에 의한 카로티노이드 생산
Rhodotorula glutinis에 의한 카로티노이드 생산은 외부 스트레스에 의해 유의하게 증가한다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 스트레스 조건하에서의 L. pentosus KCCP11226에 의한 카로티노이드 생산은 정상 조건에서 보다 높았다. 더욱이, L. pentosus KCCP11226을 H2O2가 포함된 배지에서 배양하였을 때, 카로티노이드 수준은 H2O2가 미처리된 배지에서 배양된 세포와 비교하여 증가하였다(도 6A). 카로티노이드 수치는 7mM 이상의 H2O2로 처리된 배지에서 배양했을 때 유의하게 증가했다. 세포 질량은 H2O2의 농도가 6mM에 도달할 때까지 유의적으로 감소하지 않았으며, 7mM 이상의 H2O2의 존재시에는 극적인 감소가 관찰되었다(도 6B). 카로티노이드 수치는 세포 질량에 비례하여 카로티노이드 함량으로 나타낼 수 있으며, 고농도의 H2O2로 처리하는 동안 세포 질량 감소로 인해 유의하게 증가했다. 실제로, KCCP11226 균주의 세포 질량은 정상 조건에 비해 20.5% 감소했지만 카로티노이드 생산은 7mM H2O2 처리 후 117% 증가했다. 따라서, 7 mM H2O2로 처리한 KCCP11226 균주의 세포 질량 당 카로티노이드 생산은 정상 조건에서 보다 5.9배 증가하였다. 이전의 연구에 의하면 Blakeslea trispora에 의한 β-carotene 생산이 H2O2에 의해 유의하게 자극되었고 카로티노이드가 활성 산소 종을 소멸시킴으로써 세포 손상을 방지하는 항산화제 역할을 한다는 것이 확인되었다. 이 카로티노이드 합성은 산화 스트레스에 의해 증가될 수 있다. 또한, 재조합된 Saccharomyces cerevisiae에 의한 카로티노이드 생산은 주기적인 H2O2 충격을 이용한 단기 진화 실험에서 급격히 증가했다. 연구팀은 진화된 돌연변이에서 증가된 카로티노이드 생산이 부분적으로 세포에서 관찰되는 산화 스트레스를 완화시킨다는 것을 보여주었다. 또한, H2O2에 의한 지질 생합성에 관여하는 여러 유전자의 발현 수준이 증가하였다. 따라서, H2O2는 L. pentosus KCCP11226에 의한 지질 생합성 관련 유전자의 발현을 촉진하여 카로티노이드 생산을 향상시킬 수 있다.
고염(high-salt) 조건하에서 박테리아의 성장은 삼투압에 의해 억제되고 생존율은 더욱 감소된다. 염의 농도가 증가함에 따라, KCCP11226 균주에 의해 생성된 카로티노이드 수준 또한 점진적으로 증가하였다(도 6C). 카로티노이드 수치는 8% 이상의 염의 농도에 노출된 후에 가장 높았지만 이 결과는 세포 질량의 급격한 감소로 설명될 수 있다. 흥미롭게도 KCCP11226 균주의 세포 질량은 5 ~ 7%의 염에서 유의미한 차이를 나타내지 않았다. 그러나 KCCP11226 균주의 카로티노이드 함량은 염이 증가함에 따라 유의미하게 증가하였다(도 6D). 따라서 7% NaCl이 첨가된 MRS 배지에서 L. pentosus KCCP11226 배양에 의한 카로티노이드 생성은 정상 배양 배지에서 배양한 것과 비교하여 2.8배 증가하였다.
5. 스트레스 조건하에서 배양된
L. pentosus
KCCP11226의 카로티노이드 생합성 유전자의 발현 수준
카로티노이드는 젖산균에서 crtN과 crtM 유전자의 발현을 통해 생산된다. 정상적인 조건에서 crtN의 mRNA 발현은 1.23 Х 103 이었지만, 이 값은 7% NaCl과 7mM H2O2의 존재 하에서 각각 2.98 Х 103과 1.16 Х 104로 증가하였다(표 1).
| 설명 | qRT-PCR 결과 | |
| 표적 유전자* | 배양 조건 | cDNA의 유전자 발현량 (± SD) μL-1 |
| crtN | 정상 | 1.23 ± 0.06 Х 103 |
| 7% NaCl | 2.98 ± 2.13 Х 103 | |
| 7mM H2O2 | 1.16 ± 0.59 Х 104 | |
| crtM | 정상 | 3.56 ± 0.97 Х 105 |
| 7% NaCl | 5.12 ± 3.25 Х 105 | |
| 7mM H2O2 | 2.09 ± 0.97 Х 106 | |
| 16S rRNA 유전자 (참고 유전자) |
정상 | 1.81 ± 0.67 Х 108 |
| 7% NaCl | 1.24 ± 1.00 Х 108 | |
| 7mM H2O2 | 1.44 ± 0.30 Х 107 | |
| 16S rRNA 유전자에 대한 표준화 | ||
| 표적 유전자 | 배양 조건 | 16S rRNA 유전자의 발현량으로 표준화된 유전자 발현량 (± SD) |
| crtN/16S rRNA 유전자 |
정상 | 7.52 ± 2.92 Х 10-6 |
| 7% NaCl | 4.85 ± 4.55 Х 10-5 | |
| 7mM H2O2 | 8.02 ± 3.24 Х 10-4 | |
| crtM/16S rRNA 유전자 |
정상 | 2.03 ± 0.2 Х 10-3 |
| 7% NaCl | 8.68 ± 8.45 Х 10-3 | |
| 7mM H2O2 | 1.49 ± 0.68 Х 10-1 | |
| 비율 | crtN 및 crtM 발현 수준의 상대적 비율 (± SD) | |
| 고염/정상 비율 | crtN | 5.73 ± 3.38 |
| crtM | 4.03 ± 3.49 | |
| 과산화수소/정상 비율 | crtN | 1.24 ± 0.71 Х 102 |
| crtM | 7.64 ± 4.03 Х 101 | |
처리된 조건하에서의 crtM(7% NaCl의 존재하에 5.12 x 105 및 7mM H2O2의 존재하에 2.09 x 106)의 mRNA 발현은 또한 정상 조건(3.56 Х 105)에서의 mRNA 발현보다 높았다. 그러나 이들 값은 세포 수 및 성장 상태에 따라 보정되지 않았다; 실제로, mRNA 발현 값은 일반적으로 세포 수 및 성장 상태의 변화를 설명하기 위해 16s rRNA 유전자와 같은 하우스 키핑 유전자를 사용하여 보정된다. 카로티노이드 생합성 유전자 수준을 16S rRNA 유전자 수준으로 표준화한 후, 7% NaCl 노출 후 crtN 및 crtM의 발현 수준은 각각 4.85 x 10-5 및 8.68 x 10-3이었고, 7mM H2O2 노출 후 각각 8.02 x 10-4 및 1.49 x 10-1이었다. 따라서, 카로티노이드 생합성 유전자의 발현 수준은 정상 조건보다 스트레스 조건에서 더 높았다.
고염 조건하에서 L. pentosus KCCP11226의 crtN 및 crtM 발현 수준은 정상 조건에 비해 각각 6.45 및 4.27배 증가했다. 또한, H2O2 처리 후 crtN 및 crtM의 발현 수준은 정상 조건보다 높았다(각각 crtN 및 crtM에 대해 106.8 및 73.1배). 카로티노이드 생합성 유전자의 발현 수준은 L. pentosus KCCP11226가 고염 및 H2O2 조건에서 배양될 때 유의미하게 더 컸다(p <0.05).
C30 카로티노이드 4,4'-디아포뉴로스포린은 crtN 및 crtM 유전자에 의해 생성된다. L. plantarum에서 crtN 및 crtM 오페론의 존재는 이들 균주의 생존에 중요한 역할을 하며, 이들 유전자는 항산화 특성 또는 카로티노이드 생성을 통한 박테리아 세포막 안정화 능력과 관련되어 있는 것으로 나타났다. L. pentosus KCCP11226 균주의 crtN (dehydrosqualene desaturase)의 아미노산 서열은 L. plantarum subsp. plantarum LPL-1, L. plantarum WCFS1, 및 L. plantarum CECT 7531과 각각 99.8%, 99.8% 및 99.7%의 상동성을 나타내었다. 또한, L. pentosus KCCP11226 균주의 crtM (dehydrosqualene synthase)의 아미노산 서열은 L. plantarum subsp. plantarum LPL-1, L. plantarum WCFS1, 및 L. plantarum CECT 7531과 각각 99.0%, 98.3% 및 99.5%의 상동성을 나타내었다. 따라서 L. pentosus KCCP11226의 crtN 및 crtM은 카로티노이드를 생산하는 L. plantarum 균주에서 보고된 상동성 유전자와 거의 동일하였다.
6.
L. pentosus
KCCP11226에서 추출된 카로티노이드의 DPPH 라디칼 소거 활성
DPPH 라디칼 소거 분석은 자유 라디칼 소거 활성을 평가하는 비교적 신속한 방법이다. DPPH 라디칼 소거에 항산화제가 미치는 영향은 수소 공급 능력과 관련이 있다. 도 7A에 나타낸 바와 같이 L. pentosus KCCP11226에서 추출한 카로티노이드의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정하였다. 추출된 카로티노이드의 소거 능력은 14.1%이고 양성 대조군 BHT의 소거 능력은 3.4%이었다(p <0.05). 도 7B에 나타낸 바와 같이, L. pentosus KCCP11226에서 추출한 카로티노이드의 DPPH 소거 능력은 카로테노이드 흡광도(A470)가 증가함에 따라 증가하였다. 이러한 결과는 L. pentosus KCCP11226에서 추출한 C30 카로티노이드가 항산화 작용을 한다는 것을 확인시켜 주었다. BHT, 아스코빅산, β-카로틴과 같은 상업적 합성 항산화제가 일반적으로 사용되지만, 여러 가지 부작용이 있다. 따라서, 본 발명자는 L. pentosus가 C30 카로티노이드 생산을 통한 항산화제 활성을 가진 안전하고 효과적인 프로 바이오틱으로 응용될 수 있음을 제안한다.
결론적으로, C30 카로티노이드 4,4'-디아포뉴로스포린은 L. pentosus KCCP11226으로부터 분리되었으며 상기 균주의 생존에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 이 카로티노이드의 수준은 H2O2 및 고염 조건하에서 증가했다. 그러므로, L. pentosus KCCP11226의 조절 가능한 카로티노이드 생산은 GRAS 유기체인 LAB의 광범위한 적용 가능성과 함께 천연 항산화 물질인 카로티노이드의 유용성을 증가시킬 수 있다.
Claims (16)
- 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 카로티노이드를 생산하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하지 않는 L. plantarum KCCP11031 균주에 비하여 높은 카로티노이드 생산을 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제2항에 있어서,
상기 카로티노이드는 4,4'-디아포뉴로스포렌(4,4'-diaponeurosporene)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주 및 상기 균주 배양 상등액은 DPPH 자유라디칼 소거능을 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제1항에 있어서,
산성 조건(pH 1.5 내지 2.0), 고온 조건(55 내지 60℃) 또는 산화 스트레스 조건(16 내지 32 mM H2O2)에서, 상기 균주는 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하지 않는 L. plantarum KCCP11031 균주에 비하여 높은 생존율을 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제1항에 있어서,
리소자임 또는 담즙산 존재 하에서, 상기 균주는 카로티노이드 생합성 유전자를 포함하지 않는 L. plantarum KCCP11031 균주에 비하여 높은 생존율을 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는 H2O2 또는 NaCl을 처리하는 경우 카로티노이드의 생산량과 카로티노이드 생합성 유전자의 발현량이 증가하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제4항에 있어서,
상기 카로티노이드는 BHT(10 μg/mL)과 β-카로틴(10μM) 보다 높은 DPPH 자유라디칼 소거능을 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 제4항에 있어서,
상기 카로티노이드는 A470에서의 흡광도 값이 높아짐에 따라 DPPH 자유라디칼 소거능의 증가를 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주.
- 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 또는 이의 배양물, 농축물 또는 건조물을 유효성분으로 함유하는 기능성 제제.
-
제11항에 있어서,
상기 기능성 제제는 프로바이오틱스인 것을 특징으로 하는 기능성 제제.
- 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 또는 이의 배양물, 농축물 또는 건조물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.
- 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 또는 이의 배양물, 농축물 또는 건조물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물.
- 기탁번호 KCCM12536P로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KCCP11226 균주, 또는 이의 배양물, 농축물 또는 건조물을 유효성분으로 함유하는 발효식품.
- 제1항의 균주를 H2O2 또는 NaCl를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 카로티노이드 생산 방법.
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