KR20230108502A

KR20230108502A - 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료 활성을 지닌 프로바이오틱 락토바실러스 펜토서스 mkjw32-ck 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230108502A
Application number: KR1020220003968A
Authority: KR
Inventors: 김미숙; 김소정; 윤지원; 정윤화; 조원영
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2022-01-11
Filing date: 2022-01-11
Publication date: 2023-07-18

Abstract

본 발명은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK와 이의 용도에 관한 것으로, 알파 글루코시데이즈(α-glucosidase) 억제 활성을 나타내어 혈당 상승을 억제하는 효과를 갖고, 알파 아밀레이즈(α-amylase) 억제 활성을 나타내지 않아 섭취 시 복부팽만감 및 소화 불량의 부작용을 나타내지 않는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK를 기능성 프로바이오틱스 균주로 제공하고, 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방, 치료 또는 개선용 약학 조성물이나 건강기능식품 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

제2형 당뇨병의 예방 또는 치료 활성을 지닌 프로바이오틱 락토바실러스 펜토서스 MKJW32-CK 및 이의 용도{Probiotic Lactobacillius pentosus MKJW32-CK for preventing or treating type II Diabetes mellitus, and uses thereof}

본 발명은 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료 활성을 지닌 프로바이오틱 락토바실러스 펜토서스 MKJW32-CK와 이의 용도에 관한 것이다.

최근 영양상태가 좋아지고 성인병이 늘어감에 따라 전 세계적으로 비만, 당뇨, 고지혈증 등의 대사성 증후군을 갖는 환자가 늘어나는 추세에 있으며, 질병부담감도 높아지고 있는 실정이다. 이중 당뇨병이란 고혈당을 특징으로 하는 일련의 대사질환을 통칭하며, 특히 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성과 인슐린 분비 감소를 특징으로 한다. 섭취한 음식물에 포함된 탄수화물은 알파 아밀레이즈, 글루코아밀레이즈, 슈크라제, 알파 글루코시데이즈 등과 같은 여러 탄수화물 분해효소에 의해 포도당과 같은 단당류로 분해되며, 혈액 내로 흡수되어 혈당을 높인다.

당뇨병의 약물적 치료로는 환자에게 인슐린을 투여하는 방법(제1형 당뇨병)과 경구 혈당강하제(제2형 당뇨병)를 복용하여 혈당을 조절하는 방법이 있으며, 구체적으로 경구 혈당강하제에는 설폰요소제, 비구아니드 및 알파글루코시데이즈 저해제를 주로 사용하고 있다. 이 외에도 당뇨병을 치료하기 위한 다양한 약물이 개발되고 있으며, 최근에는 당뇨병 개선 및 콜레스테롤 저하에 유익한 프로바이오틱스 균주 발굴을 위한 연구가 계속해서 진행되고 있는 실정이다.

1. 한국등록특허 제10-2203500호(2021.01.13. 공개)

본 발명의 목적은 알파 글루코시데이즈(α-glucosidase) 억제 활성을 나타내어 혈당 상승을 억제하는 효과를 갖고, 알파 아밀레이즈(α-amylase) 억제 활성을 나타내지 않아 섭취 시 복부팽만감 및 소화 불량의 부작용을 나타내지 않는 기능성 프로바이오틱스 균주 및 이를 포함하는 당뇨병 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14750BP로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 알파 글루코시데이즈(α-glucosidase) 억제 활성을 갖고, 알파 아밀레이즈(α-amylase) 억제 활성을 나타내지 않아 혈당 상승을 억제하고, 소화 불량의 부작용을 나타내지 않는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK 균주를 기능성 프로바이오틱스 균주로 제공하고, 상기 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 당뇨병 예방, 치료 또는 개선용으로 제공할 수 있다.

도 1은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK 균주의 계통도를 나타낸다.
도 2는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK 균주의 용혈성 활성을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK 균주의 생화학적 특성을 분석한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 기탁번호 KCTC 14750BP로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK 균주를 제공한다.

상기 균주는 내산성 및 내담즙성을 갖고 있으며, 알파 글루코시데이즈(α-glucosidase) 억제 활성을 갖고, 알파 아밀레이즈(α-amylase) 억제 활성을 나타내지 않아 당뇨병 예방 또는 치료 효능을 갖는다.

또한, 상기 균주는 항균 활성을 갖고, 바람직하게는 상기 항균 활성은 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) KCTC 1682, 에스케리치아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) KCTC 1682, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCTC 1012 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 3881로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 병원균에 대한 항균 활성이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 균주는 적혈구를 파괴하는 용혈 활성을 나타내지 않는다.

상기 배양액은 액체 배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미하며 액체 상의 배양액으로부터 균주를 제거한 상등액을 일컫는 "배양여액"을 포함하는 개념이다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.

상기 약학 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 전분, 당 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 윤활제, 포비돈 및 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽, 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 약학적 유효량 및 유효 투여량은 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간, 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.

본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

상기 건강기능식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[ 실시예 1] 균주 분리 및 동정

본 발명의 프로바이오틱스 균주를 김치로부터 분리하기 위해, 김치에 멸균된 비드와 0.85% NaCl을 혼합한 후, 이를 시료로 하여 1% 펩신(SigmaAldrich, StLouis, USA)과 0.85% 멸균 NaCl을 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 2시간 배양액에 1M NaHCO₃를 이용하여 pH를 7.0으로 조정 후, 0.3% 담즙산염(SigmaAldrich, StLouis, USA)과 바일솔트버퍼(12.4g/L K₂HPO₄, 11.37g/L Trisodium citrate dehydrate, 7.6g/L KH₂PO₄ 및 6g/L (NH₄)₂SO₄, pH 8.0)를 첨가하여 37℃에서 2시간 배양하였다. 배양액을 희석하여 MRS agar(10g/L proteose peptone No.3, 10g/L beef extract, 5g/L yeast extract, 20g/L dextrose, 1g/L polysorbate, 2g/L ammonium citrate, 5g/L sodium acetate, 0.1g/L magnesium sulfate, 0.05g/L manganese sulfate, 2g/L dipotassium phosphate 및 15g/L agar) 플레이트에 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며 내산성과 내담즙성이 있는 균주를 1차적으로 선별하였다.

선별 균주의 동정은 16S rRNA의 염기서열 분석하고, 상동성을 검색했다(표 1). ^(주)솔젠트(Solgent, Daejeon, Korea)에 염기서열의 분석을 의뢰하였으며 분석결과를 Ezbiocloud(https://www.ezbiocloud.net) Blast를 이용하여 Database에 등록된 염기서열과 상동성을 비교하였다. 확보된 염기서열은 MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms를 이용하여 Neighbor-joining method로 계통도를 작성하였다(도 1).

선별된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석한 결과, 표 1과 같이 분석되었으며, 이를 바탕으로 Ezbiocloud에서 동정한 결과, 락티플랜티바실러스 펜토서스(Lactiplantibacillus pentosus) DSM 20314와 99.79%의 상동성을 나타냈고, 락티플랜티바실러스 플란타럼(Lactiplantibacillus plantarum) ATCC 14917과 99.72%의 상동성을 나타냈다.

MKJW32-CK 16S rRNA 염기서열

TGCAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTG
GCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAAC
AGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGG
CTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCAT
GGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCC
CAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAG
CAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACA
TATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC
GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAA
GCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGC
ATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGA
AATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGAC
GCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTA
AACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA
GCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG
CACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG
ACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTG
CATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACC
CTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCG
GAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGC
TACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCAT
TCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGC
GGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT
GAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTA

[ 실시예 2] 항균 활성 측정

에스케리치아 콜리(Escherichia coli) KCTC 1682, 에스케리치아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) KCTC 1682, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCTC 1012 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 3881을 지시균주로 사용하였다. 지시균주(5.5 ~ 7.5log)를 TSB(pancreatic digest of casein 17g/L, papaic digest of soybean 3g/L, dextrose 2.5g/L, sodium chloride 5.0g/L 및 dipotassium phosphate 2.5g/L) 1mL에 10㎕ 접종한 뒤 MKJW32-CK 균주를 100μL 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 0시간 및 24시간에서의 흡광도(Abs 600nm)를 측정하여 병원균에 대한 항균 활성을 다음 식에 대입해 계산하였다.

[수학식 1]

항균 활성(Inhibition, % )={(ABS 24h control-ABS 0h control)-(ABS 24h sample-ABS 0h sample)}/ (ABS 24h control-ABS 0h control)*100

항균 활성을 측정한 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, MKJW32-CK 균주는 에스케리치아 콜리(Escherichia coli) KCTC 1682, 에스케리치아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7) KCTC 1682, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCTC 1012 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 3881에 대하여 항균 활성을 나타냈다.

Strain	Inhibition (%)
Escherichia coli	84.45 ± 2.34
Escherichia coli O157:H7	67.93 ± 11.23
Bacillus cereus	90.87 ± 13.42
Staphylococcus aureus	94.50 ± 2.28

[ 실시예 3] 용혈성 측정

MKJW32-CK 균주의 용혈성 확인을 위해, 5% sheep blood를 함유하는 TSA(Tryptic soy agar) 배지를 제조하였다. MRS 액체배지에 24시간 동안 배양한 균주는 획선 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였고, 균체 주위에 생기는 환의 형태로 α, β 및 γ 용혈성을 확인하였으며, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCTC 1012는 용혈의 양성 대조군으로 사용하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCTC 1012는 균 주변부에 적혈구가 파괴되어 용혈 활성(β-헤몰리시스)이 나타난 반면, MKJW32-CK 균주는 용혈 활성을 거의 나타내지 않아 α-헤몰리시스를 갖는 것을 확인하였다.

[ 실시예 4] 생화학적 특성 측정

선별 균주의 생화학적 특성 분석을 위해, API 50 CHL kit(BioMerieux, Lyon, France)를 통해 49개 탄소원에 대한 이용성을 확인하였다. MRS agar에 배양한 균주의 콜로니를 API 50 CHL medium에 접종하여 혼합한 뒤 API 50CHL 스트립에 분주한 후, 미네랄 오일(mineral oil)을 튜브에 첨가하여 공기를 차단하고 30℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양하여 당 발효 양상을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, MKJW32-CK 균주는 그람 양성 단간균으로 카탈레이즈 음성이며, 점질물을 생성하는 것으로 나타났다.

또한, MKJW32-CK 균주는 표 3과 같은 탄소원을 이용하는 것으로 나타났고, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 1과 99.9% 동정율을 나타냈다.


0	control	-	25	esculin ferric citrate	+
1	Glycerol	-	26	salicin	+
2	Erythritol	-	27	D-celiobiose	+
3	D-arabinose	-	28	D-maltose	+
4	L-arabinose	+	29	D-lactose(bobine origin)	+
5	D-ribose	+	30	D-melibiose	+
6	D-xylose	-	31	D-saccharose(sucrose)	+
7	L-xylose	-	32	D-trehalose	+
8	D-adonitol	-	33	inulin	-
9	Methyl-p D-xylopyranoside	-	34	d-melezitose	+
10	D-galactose	+	35	D-rafinose	+
11	D-glucose	+	36	amidon(starch)	-
12	D-fructose	+	37	glycogen	-
13	D-mannose	+	38	xylitol	-
14	L-sorbose	-	39	gentiobiose	+
15	L-rhamnose	+	40	D-turanose	+
16	dulcitol	-	41	D-lyxose	-
17	inositol	-	42	D-tagatose	-
18	D-mannitol	+	43	D-fucose	-
19	D-sorbitol	-	44	l-fucose	-
20	methyl-a d-mannopyranoside	+	45	D-arabitol	+
21	methyl-a D-glucopyranoside	-	46	l-arabitol	-
22	n-acetylglucosamine	+	47	potassium gluconate	+
23	amygdalin	+	48	potassium 2-ketogluconate	-
24	arbutin	+	49	potassium 5-ketogluconate	-
동정결과	Lactobacillus plantarum 1 99.9%
차순위 동정결과	Lactobacillus pentosus 0.1%

[ 실시예 5] 내산성 및 내담즙성 측정

선별 균주를 MRS 액체배지에서 30℃ 조건으로 24시간 동안 배양한 후 실험을 진행하였다. 내산성 실험을 위해 0.1% 펩신을 포함하는 0.85% 멸균 NaCl 용액(pH 2.5)에 균 배양액을 접종하여 37℃에서 1, 2 및 3시간 동안 배양하였다. 내담즙성 실험을 위해 0.3% 담즙산염(SigmaAldrich, StLouis, USA)을 함유한 용액(12.4g/L of K₂HPO₄, 11.37g/L Trisodium citrate dehydrate, 7.6g/L KH₂PO₄ 및 6g/L (NH₄)₂SO₄, pH 6.9)에 균 배양액을 접종하여 37℃에서 1, 2 및 3시간 동안 배양하였다. 각 시간별 배양액을 희석하여 MRS agar 플레이트에 도말 후 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 펩신과 담즙산염 용액에 첨가 전 선별균주의 생균수를 대조군으로 사용하여 다음 식에 대입해 생존율을 계산하였다.

[수학식 2]

생존율(Relative survival rate, % )=(Log CFU /ml 반응 후/Log CFU /mL 반응 전)*100

표 4에 나타난 바와 같이, MKJW32-CK 균주를 0.1% 펩신 용액에서 3시간 배양하여 내산성을 측정한 결과, MKJW32-CK 균주는 58.17%의 생존율을 나타냈고, 0.3%의 담즙산염 용액에서 3시간 배양하여 내담즙성을 측정한 결과, MKJW32-CK 균주는 52.27%의 생존율을 나타냈다.

Treatment		MKJW32-CK
Treatment		균수(logCFU/ml)	생존력 (%)
0.1% 펩신	0h	9.89
	1h	7.08±0.13	71.60±1.30
	2h	5.78±0.78	58.39±7.89
	3h	5.75±0.47	58.17±4.74
0.3% 담즙산염	0h	9.50
	1h	6.15±0.07	64.72±0.76
	2h	5.24±0.07	55.20±0.70
	3h	5.00±0.25	52.27±2.66

[ 실시예 6] 소화효소 억제활성 측정

균주의 배양액을 1mL MRS 액체배지에 1% 접종하고 24시간 동안 30℃에서 배양하였다. 배양 상등액을 조효소 샘플로서 사용하였다. 알파 아밀레이즈(α-amylase) 억제활성 실험과 알파 글루코시데이즈(α-glucosidase) 억제활성 실험은 Dilna, S. V 등(2015), Sarom Lee 등(2019) 방법을 변형하여 실험하였다.

알파 아밀레이즈(α-amylase) 억제 활성을 측정하기 위해, 0.02M sodium phosphate buffer(pH 7.0) 50㎕, 1% starch solution 100㎕, porcine α-amylase enzyme solution(SigmaAldrich, StLouis, USA) 50㎕ 및 균 상등액 50㎕를 혼합하여 37℃에서 20분간 반응 후 2mL의 DNS(3,5-dinitrosalicylic acid) 용액을 첨가하여 95℃에서 5분간 반응하였다. 그 후 2mL의 증류수를 넣어 540nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식에 대입하여 계산하였다. 당뇨병 치료제로써 소화효소 억제능이 있는 아카보스(Acarbose)를 양성 대조군으로 실험하였다.

[수학식 3]

억제 활성(Inhibition, % )=(ABS control-ABS sample)/ABS control*100

표 5에 나타난 바와 같이, 아카보스는 31.42%의 억제 활성을 나타냈고, MKJW32-CK 균주는 25.31%의 억제 활성을 나타냈다. 이는 아카보스의 부작용인 알파 아밀라아제 억제 활성으로 인한 소화불량이 MKJW32-CK 균주를 프로바이오틱스로 섭취했을 때에 나타나지 않을 것임을 입증한다.

α-amylase inhibition(%)
MKJW32-CK	Acarbose
25.31±0.25	31.42±1.27

알파 글루코시데이즈(α-glucosidase) 억제 활성을 측정하기 위해, 0.02M sodium phosphate buffer(pH 6.8) 50㎕, 2mM pNPG(4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside) 용액 및 α-glucosidase 효소 50㎕에 균 상등액 50㎕를 첨가 후 37℃에서 40분간 반응하였다. 그 후 0.1M Na₂CO₃ 1.5mL를 첨가하여 405nm에서 흡광도를 측정하여 다음 식에 대입하여 계산하였다. 아카보스(Acarbose)를 양성 대조군으로 실험하였다.

[수학식 4]

억제 활성(Inhibition, % )={1-(ABS sample-ABS sample blank)/(ABS control-ABS blank)}*100

표 6에 나타난 바와 같이, 아카보스는 99.71%의 억제 활성을 나타냈고, MKJW32-CK 균주는 100%의 억제 활성을 나타냈다. 이는 MKJW32-CK 균주를 프로바이오틱스로 섭취했을 때에 아카보스와 유사한 혈당 상승 억제 효과가 있음을 입증한다.

α-glucosidase inhibition(%)
MKJW32-CK	Acarbose
100.18±0.08	99.71±0.00

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국생명공학연구원

KCTC14750BP

20211101

<110> Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation <120> Probiotic Lactobacillius pentosus MKJW32-CK for preventing or treating type II Diabetes mellitus, and uses thereof <130> ADP-2021-0697 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1437 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> 16S rRNA of Lactobacillius pentosus MKJW32-CK <400> 1 tgcagtcgaa cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag 60 tggcgaactg gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata acacctggaa 120 acagatgcta ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagtttgaa agatggcttc 180 ggctatcact tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta acggctcacc 240 atggcaatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 300 cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg 360 agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt taaagaagaa 420 catatctgag agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact 480 acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta 540 aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt 600 gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 660 gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 720 acgctgaggc tcgaaagtat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccataccg 780 taaacgatga atgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 840 aagcattccg cctggggagt acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900 cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 960 tgacatacta tgcaaatcta agagattaga cgttcccttc ggggacatgg atacaggtgg 1020 tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080 cccttattat cagttgccag cattaagttg ggcactctgg tgagactgcc ggtgacaaac 1140 cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200 gctacaatgg atggtacaac gagttgcgaa ctcgcgagag taagctaatc tcttaaagcc 1260 attctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agtcggaatc gctagtaatc 1320 gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380 atgagagttt gtaacaccca aagtcggtgg ggtaaccttt taggaaccag ccgccta 1437

Claims

기탁번호 KCTC 14750BP로 기탁된 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillius pentosus) MKJW32-CK 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 내산성 및 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 알파 아밀레이즈(α-amylase)의 억제 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 알파 글루코시데이즈(α-glucosidase) 억제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 당뇨병 예방 또는 치료 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
청구항 6에 있어서, 상기 항균 활성은 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 에스케리치아 콜리 O157:H7(Escherichia coli O157:H7), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 병원균에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 하는 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 적혈구를 파괴하는 용혈 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 균주.
청구항 1의 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1의 균주, 이의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.