WO2010142828A1 - Nueva cepa de lactobacillus plantarum para la producción de carotenoides - Google Patents

Nueva cepa de lactobacillus plantarum para la producción de carotenoides Download PDF

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WO2010142828A1
WO2010142828A1 PCT/ES2010/070375 ES2010070375W WO2010142828A1 WO 2010142828 A1 WO2010142828 A1 WO 2010142828A1 ES 2010070375 W ES2010070375 W ES 2010070375W WO 2010142828 A1 WO2010142828 A1 WO 2010142828A1
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strain
cell population
carotenoids
food
production
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PCT/ES2010/070375
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José Luis RUIZ BARBA
Juan GARRIDO FERNÁNDEZ
Dámaso HORNERO MÉNDEZ
Antonio Maldonado Barragán
Belén CABALLERO GUERRERO
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Definitions

  • the present invention relates to a new bacterial strain, CECT 7531, which belongs to the species Lactobacillus plantarum, or any mutant strain that comes from it.
  • the present invention also relates to the use of said strain for the production of carotenoids, for the manufacture of a probiotic food, of a nutritional, vitamin or mineral supplement, as well as a method for the production of carotenoids by said strain.
  • Carotenoids are a group of colored terpenoid compounds with antioxidant properties that are widespread in the plant and animal kingdoms, as well as in fungi and in photosynthetic and non-photosynthetic microorganisms. In the latter, although they are not essential for their growth as heterotrophic organisms, they perform important biological functions. Thus, in Gram positive bacteria, carotenoids play an important role in protecting against oxidative stress by capturing free radicals with their conjugated double bonds (Clauditz et al., 2006, Infection and Immunitv, 74: 4950-4953).
  • carotenoids are used commercially as food colors, animal food supplements and, more recently, as part of nutraceuticals, functional foods, cosmetics and pharmaceuticals (Lee and Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbioloqy and Biotechnology, 60: 1 -eleven ).
  • Lactic acid bacteria are Gram positive bacilli or cocci, low GC content, microaerophilic, non-sporulated, fermenting sugars to produce mainly lactic acid, and which are associated by common physiological characteristics. These bacteria have historically been associated with food fermentations, and their industrial importance is further evidenced by their consideration of generally safe microorganisms (Generally Regarded As Safe, GRAS) (Holzapfel et al., 1995. International Journal of Food Microbiolo ⁇ v .24: 343-362). Among BALs, selected species of the genus Lactobacillus are widely used as probiotics, especially in dairy products and dietary supplements (Klaenhammer et al., 2005. FEMS Microbiolo ⁇ v Reviews.
  • Lactobacillus plantarum is important industrially, being involved in many vegetable fermentations, while being a natural inhabitant of the human intestinal tract (Johansson et al., 1993. Applied and Environmental Microbioloqy, 59: 15-20).
  • the present invention relates to a new bacterial strain, strain CECT 7531, which belongs to the species Lactobacillus plantarum, or any mutant strain that comes from it.
  • the present invention also relates to use of said strain for the production of carotenoids, for the manufacture of a probiotic food, of a nutritional, vitamin or mineral supplement, as well as a method for the production of carotenoids by means of said strain.
  • the present invention demonstrates the presence of C30 carotenoid biosynthesis in several of the Lactobacillus plantarum (L. plantarum) strains studied, especially in those isolated from olive fermentations.
  • Lactobacillus plantarum L. plantarum
  • strain CECT 7531 isolated from a fermentation of table olives, produced a quantity of carotenoids much higher than the average (46.03 mg / kg dry weight), this production being about two and a half times higher than The second largest producing strain found (LPT49 / 6, 19.18 mg / kg dry weight), which is an unexpected effect.
  • the crtM and crtN genes involved in the biosynthesis of the C30 4,4'-diaponeurosporene carotenoid, are present in all strains tested.
  • the strain CECT 7531 of L. plantarum of the present invention can be used to ferment food or feed for animals.
  • one aspect of the present invention is a bacterial strain, strain CECT 7531, which belongs to the species Lactobacillus plantarum, according to the molecular criteria defined by Torriani et al., (2001). Applied and Environmental Microbioloqy, 67: 3450-3454.
  • the strain CECT 7531 can be cultivated, but not limited, in MRS medium (from Man, Rogosa and Sharpe, (1960). Appl. Bact . , 23: 130-135), at a temperature of 30 0 C under aerobic conditions. Maintenance conditions of said strain are, but not limited, by adding 20% saturated cultures glycerol and freezing at -80 0 C, or by lyophilization.
  • the CECT 7531 strain of Lactobacillus plantarum comes from fermentation of table olives. Said strain is capable of producing a yellow pigmentation of its isolated colonies when grown in a solid, semi-solid or liquid medium. Yellow pigmentation in liquid medium is demonstrated by centrifuging these cultures and collecting the corresponding cell pellets.
  • said strain contains the crtM and crtN genes, genes that code for the enzymes dehydroescualene synthase and dehydrosqualene desaturase respectively, two enzymes involved in the biosynthesis route of triperpenoid carotenoids (with 30 carbon atoms).
  • the strain CECT 7531 can be used to generate a mutant strain (derived mutant strain). Said mutation can be spontaneous or induced. The mutation can be carried out by means of the application of one or several methods of mu ⁇ agenesis. The method is selected, but not limited, from the lysia comprising chemical mutagenesis, radiation mutagenesis or transposable elements mutagenesis.
  • Spontaneous mutations can occur due to the action of natural radiation and even during DNA replication due to errors in the reading of the bases.
  • the frequency of mutation (the proportion of mutants in the population) can be significantly increased with the use of induced mutation methods.
  • Both spontaneous and induced mutations occur as a result of structural changes in the genome such as, but not limited to, change in the number of chromosomes, change in the order of one or more genes within the chromosome or change in the sequence of bases within a gene (point mutation). Punctual mutation can cause the replacement of a nucleotide by another nucleotide or the displacement of the open reading pattern (insertion or deletion of one or more nucleotides).
  • the agent that causes chemical mutagenesis is selected from the list comprising, but not limited to, agents that react with DNA, intercalating agents or base analogs.
  • the agent that reacts with the DNA is capable of reacting directly with it, even if it is not replicating, causing chemical changes in the bases that cause incorrect pairing.
  • the agent that reacts with the DNA is selected from the list comprising, but not limited to, nitrous acid, hydroxylamine, alkylating agent (ethyl methane sulphonate [EMS], methyl methane sulphonate [MMS], diethyl sulfate [DES], diepoxy butane [ DEB], N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine [NTG], N-methyl-N-nitroso urea (mustard gas), intercalating agent (acridine, ethidium bromide or dihydroetidium).
  • alkylating agent ethyl methane sulphonate [EMS], methyl methane sulphonate [MMS], diethyl sulfate [DES], diepoxy butane [ DEB]
  • intercalating agent acridine, ethidium bromide or dihydr
  • Radiation mutagenesis can be produced, but not limited to ultraviolet radiation or ionizing radiation such as X-rays or gamma rays.
  • Mutagenesis by transposable elements can be produced, but not limited to, the insertion of an insertion sequence or a transposon into a sequence of one or several genes of the bacterial strain of the present invention.
  • the strain CECT 7531 can be used to generate a recombinant strain (derived recombinant strain) by introducing genes that code for enzymes that can alter and / or expand the production range of carotenoid compounds of the parental strain, or sequences of Specific DNAs that can perform this function. These genes or DNA sequences can be introduced into the parental strain by various techniques such as, but not limited to, expression vectors based on suitable plasmids, suicide vectors, conjugative plasmids, transposons or phages.
  • suitable plasmids based on suitable plasmids, suicide vectors, conjugative plasmids, transposons or phages.
  • Another aspect of the present invention relates to a cell population comprising cells of the strain of the invention.
  • the cell population is a set of cells that come from one or more cells belonging to the strain of the present invention.
  • the cell population can constitute a colony.
  • a colony is a cell population that comes from a single cell.
  • a further aspect of the invention refers to the use of the strain of the present invention or the cell population for the production of carotenoids.
  • a preferred embodiment refers to the use of said strain or said cell population where the carotenoid is a triterpenoid.
  • a triterpenoid is a terpenoid of 30 carbon atoms (C 30 ).
  • the term isoprenoid can be used as a synonym for terpenoid.
  • a terpenoid is a lipid molecule formed by isoprene units.
  • Another preferred embodiment refers to the use of the strain of the invention or the cell population, where the triterpenoid is a diapocarotene.
  • the diapocaroteno is selected from the list comprising, but not limited, 4,4'-diapofitoeno, 4,4 '- diapofitoflueno, 4,4' -diapo-zeta-carotene, diapo-7,8,11, 12-tetrahidrolicopeno , 4,4 '- diaponeurosporeno, 4,4'-diapo-7,8,11; 12-tetrahydrolicopene, 4,4'-diapone-rosporene or 4-hydroxy-4,4'-diapo-neurosporene.
  • the diapocaroteno is 4,4' -diaponeusporeno.
  • Another aspect of the present invention is the use of the strain or the cell population of the invention for the manufacture of a probiotic food.
  • probiotic refers to live microorganisms that when supplied in adequate amounts promote health benefits of the host organism.
  • the host organism can be an animal or a human.
  • probiotic food refers to a food to which cells of the strain of the present invention are added.
  • the probiotic food of the present invention contributes to the balance of
  • the probiotic food of the present invention is, but not limited to, a dairy product such as milk, milkshake, yogurt or kefir.
  • the probiotic food can be a fermented vegetable product, such as, but not limited to, olives, cabbage, pickles, capers, capers, carrots or fermented vegetable juices.
  • the strain of the present invention can also be used to produce said fermented foods by being inoculated as an active culture in the starting fermentable material.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the use of the strain or the cell population of the invention for the manufacture of a nutritional supplement.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the strain or cell population of the invention for the manufacture of a vitamin and / or mineral supplement.
  • a “nutritional (or nutritional) supplement” or a “vitamin and / or mineral supplement” is a concentrated source of said nutrients, alone or in combination, or more specifically, of vitamins and / or minerals, alone or in combination, which are ingested by an animal or a human to complete their diet or even to increase the supply of nutrients, vitamins and / or minerals.
  • the nutritional supplement or the vitamin and / or mineral supplement is manufactured by combining the strain of the present invention with the components of said supplements, thus obtaining a complement rich in carotenoids.
  • the probiotic food or nutritional supplement preferably any of the vitamin and / or mineral supplements
  • the form adapted to oral administration refers to a physical state that can allow oral administration.
  • the form adapted to oral administration is selected from the list comprising, but not limited to, drops, syrup, tea, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granulate, seal, pill, tablet, tablet, tablet or lyophilized.
  • the probiotic food or any of the supplements described can be an animal feed.
  • probiotic food or any of the supplements described will be adapted to the type of administration used, therefore, they can be presented in the form of solutions or any other form of administration.
  • Another aspect of the present invention is a method for the production of carotenoids comprising:
  • step (a) for a period between 15 and 35 hours, and c. extract the carotenoids from the cells obtained in step (b).
  • a preferred embodiment relates to the method, wherein the culture medium comprises at least one carbon source, a nitrogen source, a buffer solution and essential trace components.
  • the culture medium of section (a) may further comprise peptone, tryptone, yeast extract, extract of meat (Beef extract), polysorbate (as for example, but not limited to, Tween 80).
  • the carbon source can be, but not limited to, glucose, galactose, maltose, lactose, fructose, sucrose, mannose, starch, molasses, or any combination thereof.
  • the nitrogen source may be, but is not limited to, ammonium citrate, ammonium phosphate, ammonium sulfate, casamino acids, meat peptone, casein peptone, soy peptone, or any combination thereof.
  • the buffer solution may be, but is not limited to, sodium acetate, potassium mono acid phosphate, sodium citrate, or any combination thereof.
  • the essential trace components may be, but are not limited to, magnesium, manganese, zinc, copper, molybdenum, iron or nickel.
  • the nitrogen source is ammonium citrate
  • the solution that helps control the pH is sodium acetate and / or potassium monoacid phosphate
  • the essential trace components are magnesium and / or manganese.
  • the cultivation period of the strain or population according to section (b) is between 20 and 30 hours. More preferably the cultivation period is between 23 and 25 hours.
  • Another more preferred embodiment relates to the method, where the pH of the culture medium, for any duration of the culture period, is maintained between 6 and 7.
  • a measurement thereof is carried out by means of a Serial sampling or by continuous measurement and rectification thereof by the addition of an acid or a base such as, but not limited to, hydrochloric acid or sodium hydroxide, respectively.
  • Another aspect of the present invention is a probiotic composition
  • Said probiotic composition may also contain one or more strains of a bacterium of the same species or of a different species or of any other microorganism such as a fungus or a yeast.
  • the bacteria is selected from the list that includes, but is not limited to, Lactobacillus acidophilus (hereinafter the term "Lactobacillus” shall be abbreviated as "L.”), L. casei, L. casei var. Shirota, L. fermentum, L. crispatus, L. reuteri, L. rhamnosus, L. plantarum, L bulgaricus, L. cellobiosus, L.
  • curvatus L. gasser ⁇ , L. cremoris, Lactococcus lactis, Bifidobacter ⁇ um longum, Bifidobacter ⁇ um adolescentis, Steptococcus salivar ⁇ s, Steptococcus faecium, Steptococcus diacetylactis or Steptococcus intermedius.
  • the probiotic composition can be presented in a form adapted to oral administration, such as, but not limited to, in the form of drops, syrup, tea, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granulate, seal, pill , tablet, pill, trocisco or lyophilisate.
  • a probiotic composition which further comprises a vehicle.
  • the vehicle is selected from the list comprising, but not limited to, nutraceutical, functional food, pharmaceutical composition, dairy food or vegetable food.
  • the vehicle is a dairy food.
  • the dairy food is fermented milk.
  • Fermented milk is selected from the list comprising, but not limited to, cheese, cream, sour cream, yogurt, kefir or koumiss.
  • the vehicle can also be a plant food.
  • the plant food is fermented.
  • the fermented vegetable food is selected from the list comprising, but not limited to, olives, cabbage, pickles, caper, caper, carrot or fermented vegetable juice.
  • a nutraceutical compound as understood in the present invention is a dietary supplement, presented in a non-food matrix such as, but not limited to, pills, capsules or powder, of a concentrated natural bioactive substance present in food and which, taken in a dose higher than that existing in these foods, it has a beneficial effect on health, greater than what the normal food could have.
  • a non-food matrix such as, but not limited to, pills, capsules or powder
  • the word "comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and characteristics of the invention will emerge partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
  • FIG. 1 Shows the typical chromatographic analysis of the carotenoid pigments extracted from the pellets of L. plantarum strain cells.
  • FIG. 2. It shows the biosynthetic route of triterpenoid carotenoid compounds (C 30 ) and tetraterpenoids (C 40 ).
  • C 4 o tetraterpenoids
  • C 30 triperpenoids
  • the biosynthetic route begins with the synthesis of the isoprenoid isopentenyl pyrophosphate (IPP), which, after the elongation of the chain, catalyzed by prenyl transferases, is converted to farnesyl pyrophosphate (FPP) or geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) .
  • IPP isoprenoid isopentenyl pyrophosphate
  • FPP farnesyl pyrophosphate
  • GGPP geranylgeranyl pyrophosphate
  • FPP (C 15 ) and GGPP (C 20 ) are the immediate precursors of the C30 and C40 carotenoids, respectively (Lee and Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbioloqy and Biotechnoloqy, 60: 1-11).
  • ATCC10241 fermented cabbage A 6.33 1 ATCC
  • EXAMPLE 3 Analysis of the presence of the crtN-crtM operon in the L. plantarum strains studied.
  • Bacterial strains media and culture conditions.
  • MRS broths from different sources were used, including manufactured by Oxoid, Difco, Biokar and Merck.
  • DM1 containing, per liter, glucose (Panreac, 20 g), peptone (Difco, 10 g), meat extract (Oxoid, 8 g), yeast extract (Oxoid, 4 g), K2HPO4 (Fluka, 2 g), sodium acetate-3H 2 O (Fluka, 5 g), triamonic citrate (Merck, 2 g), MgSO 4 -TH 2 O (Merck, 0.2 g), MnSO 4 -4H 2 O (Merck, 0.05 g), and Tween 80 (Sigma, 1 mi); and DM2, containing, per liter, glucose (Panreac, 22 g), yeast extract (Oxoid, 10 g), (NhU) 2 HPO 4 (Fluka, 2.5 g), MgSO 4 7H 2 O (Merck, 0.05 g) , MnSO 4 H 2 O (Merck, 0.005
  • the precipitate resulting from centrifuging the bacterial culture (1 gram) was introduced into a 15 ml test tube, with a screw cap, and extracted with 10 ml of N 1 N-dimethylformamide for 15 min at 65 ° C. they were separated and removed by centrifugation at 5,000 rpm, and the upper phase, containing the carotenoid pigments, was transferred to a separatory funnel. The operation was repeated until complete color extraction (normally 4 extractions were sufficient). All extracts were combined and mixed with 100 ml of diethyl ether, then adding about 50 to 100 ml of 10% NaCl solution (w / v) to help phase separation.
  • the injection volume was 5 ⁇ l and the pigment detection is performed spectrophotometrically at 440 nm. Quantification was performed using a calibration line prepared with ⁇ -carotene (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO).
  • the HPLC analysis system consisted of a Waters 600E quaternary pump equipped with a photodiode detector (PDA 996, Waters), controlled with the Empower2 software (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, USA). Isolation and identification of pigments.
  • WCFS1 (Access No. 0 GeneBank AL935261; Kleerebezem et al., 2003.
  • the primer pair SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 was used for amplification of a fragment (2,379 base pairs [bp]) of DNA that included coding sequences for both genes.
  • the pair of primers SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO was used:
  • the amplification of the DNA fragments was performed in 100 ⁇ l reaction mixtures, containing 2.5 mM MgCI, 1x reaction buffer, 100 ⁇ M of each triphosphates deoxynucleoside, 100 pmol of each primer, 5 U of Taq DNA polymerase (Promega), and 5 ⁇ l of total colony DNA as a substrate.
  • a GeneAmp PCR system 2400 thermocycler system (Perkin-Elmer) was used using the following conditions: denaturation at 94 0 C for 2 min, followed by 30 denaturation cycles at 94 0 C for 15 sec, banding at 60 0 C for 30 sec, and polymerization at 72 0 C for 2 min, plus a final polymerization stage at 72 0 C for 4 min.
  • 58 0 C was used as annealing temperature.
  • the DNA fragments amplified by PCR were finally analyzed by agarose gel electrophoresis. Homology searches of DNA and protein sequences were performed using the WU-Blast2 program developed by EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk).

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Abstract

La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana, CECT 7531, que pertenece a la especie Lactobacillus plantarum, o cualquier cepa mutante que proceda de la misma. La presente invención se refiere también al uso de dicha cepa para la producción de carotenoides, para la fabricación de un alimento probiótico, de un complemento nutricional, vitamínico o mineral, así como un método para la producción de carotenoides mediante dicha cepa.

Description

NUEVA CEPA DE LACTOBACILLUS PLANTARUM PARA LA PRODUCCIÓN DE CAROTENOIDES.
La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana, CECT 7531 , que pertenece a Ia especie Lactobacillus plantarum, o cualquier cepa muíante que proceda de Ia misma. La presente invención se refiere también al uso de dicha cepa para Ia producción de carotenoides, para Ia fabricación de un alimento probiótico, de un complemento nutricional, vitamínico o mineral, así como un método para Ia producción de carotenoides mediante dicha cepa.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Los carotenoides son un grupo de compuestos terpenoides coloreados y con propiedades antioxidantes que están muy extendidos en los reinos vegetal y animal, así como en hongos y en microorganismos fotosintéticos y no fotosintéticos. En estos últimos, aunque no son esenciales para su crecimiento como organismos heterótrofos, desempeñan importantes funciones biológicas. Así, en bacterias Gram positivas, los carotenoides juegan un papel importante protegiendo del estrés oxidativo al capturar radicales libres con sus dobles enlaces conjugados (Clauditz et al., 2006, Infection and Immunitv, 74: 4950- 4953). También ha sido demostrada una correlación entre Ia producción de carotenoides y una disminución de Ia fluidez de Ia membrana plasmática, Io que proporciona, por ejemplo, resistencia al ácido oléico en Staphylococcus aureus. Además, los carotenoides son usados comercialmente como colorantes alimentarios, suplementos de comida de animales y, más recientemente, como parte de nutracéuticos, alimentos funcionales, cosméticos y productos farmacéuticos (Lee y Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbioloqy and Biotechnology, 60: 1-11 ).
En Ia actualidad, Ia ingeniería metabólica de diversos microorganismos, incluyendo los no carotenogénicos, está siendo explotada para Ia producción biotecnológica de grandes cantidades de carotenoides razonablemente puros así como para sintetizar estructuras carotenoides novedosas usando estrategias combinatorias y de evolución in vitro (Lee y Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbiology and Biotechnology, 60: 1-11 ; Umeno et al., 2005. Journal of Bacterioloαv 184: 6690-6699).
Las bacterias del ácido láctico (BAL) son bacilos o cocos Gram positivos, de bajo contenido GC, microaerófilos, no esporulados, que fermentan azúcares para producir principalmente ácido láctico, y que están asociados por características fisiológicas comunes. Estas bacterias han sido históricamente asociadas con las fermentaciones de alimentos, y su importancia industrial está además evidenciada por su consideración de microorganismos generalmente seguros (Generally Regarded As Safe, GRAS, en inglés) (Holzapfel et al., 1995. International Journal of Food Microbioloαv. 24: 343-362). Entre las BAL, las especies seleccionadas del género Lactobacillus son ampliamente usadas como probióticos, especialmente en productos lácteos y suplementos dietéticos (Klaenhammer et al., 2005. FEMS Microbioloαv Reviews. 29: 393-409). Una de estas especies, Lactobacillus plantarum, es importante industrialmente, estando implicada en muchas fermentaciones de vegetales, al tiempo que es habitante natural del tracto intestinal humano (Johansson et al., 1993. Applied and Environmental Microbioloqy, 59: 15-20).
El uso de una cepa bacteriana que tenga Ia capacidad de producir cantidades de carotenoides superiores a las que son obtenidas por cepas silvestres conocidas es de especial interés para su aplicación biotecnológica.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una nueva cepa bacteriana, Ia cepa CECT 7531 , que pertenece a Ia especie Lactobacillus plantarum, o cualquier cepa muíante que proceda de Ia misma. La presente invención se refiere también al uso de dicha cepa para Ia producción de carotenoides, para Ia fabricación de un alimento probiótico, de un complemento nutricional, vitamínico o mineral, así como un método para Ia producción de carotenoides mediante dicha cepa.
En Ia presente invención se demuestra Ia presencia de biosíntesis de carotenoides C30 en varias de las cepas de Lactobacillus plantarum (L. plantarum) estudiadas, especialmente en aquellas aisladas de fermentaciones de aceitunas. Una de estas cepas, Ia cepa CECT 7531 , aislada de una fermentación de aceitunas de mesa, produjo una cantidad de carotenoides muy superior a Ia media (46,03 mg/kg peso seco), siendo esta producción unas dos veces y media superior a Ia segunda cepa mayor productora encontrada (LPT49/6, 19,18 mg/kg peso seco), Io cual supone un efecto inesperado. Además, los genes crtM y crtN, implicados en Ia biosíntesis del carotenoide C30 4,4'-diaponeurosporeno, están presentes en todas las cepas ensayadas.
La cepa CECT 7531 de L. plantarum de Ia presente invención puede ser usada para fermentar alimentos o piensos para animales. El uso de cepas seleccionadas super-productoras de carotenoides, como es el caso de Ia cepa de Ia presente invención, mejora su rendimiento en estas fermentaciones a través de un incremento de su resistencia a diferentes condiciones de estrés. Además, todo ello contribuye a incrementar Ia cantidad total de antioxidantes aportados en Ia dieta, tanto humana como animal. Debido a que L. plantarum es un reconocido habitante del tracto gastrointestinal, su uso en Ia dieta es de extraordinario interés ya que el microorganismo aporta una cantidad continua de moléculas antioxidantes en un lugar donde su acción protectora es muy bien recibida.
En este sentido, un aspecto de Ia presente invención es una cepa bacteriana, Ia cepa CECT 7531 , que pertenece a Ia especie Lactobacillus plantarum, de acuerdo con los criterios moleculares definidos por Torriani et al., (2001 ). Applied and Environmental Microbioloqy, 67: 3450-3454. La cepa CECT 7531 puede ser cultivada, pero sin limitarse, en medio MRS (de Man, Rogosa y Sharpe, (1960). Appl. Bact., 23: 130-135), a una temperatura de 30 0C en condiciones aerobias. Las condiciones de mantenimiento de dicha cepa son, pero sin limitarse, mediante cultivos saturados añadiendo 20 % glicerol y congelando a -80 0C, o mediante liofilización.
La cepa CECT 7531 de Lactobacillus plantarum procede de fermentaciones de aceitunas de mesa. Dicha cepa es capaz de producir una pigmentación amarilla de sus colonias aisladas cuando son crecidas en un medio sólido, semisólido o líquido. La pigmentación amarilla en medio líquido se demuestra al centrifugar estos cultivos y recoger los pellets de células correspondientes. Además, dicha cepa contiene los genes crtM y crtN, genes que codifican para las enzimas dehidroescualeno sintasa y dehidroescualeno desaturasa respectivamente, dos enzimas implicadas en Ia ruta de biosíntesis de carotenoides triperpenoides (con 30 átomos de carbono).
La cepa CECT 7531 puede ser utilizada para generar una cepa muíante (cepa muíante derivada). Dicha mutación puede ser esponíánea o inducida. La muíación puede llevarse a cabo por medio de Ia aplicación de uno o varios méíodos de muíagénesis. El méíodo se selecciona, pero sin limiíarse, de Ia lisia que comprende mutagénesis química, mutagénesis por radiaciones o mutagénesis por elementos transponibles.
Las mutaciones espontáneas pueden ocurrir debido a Ia acción de las radiaciones naturales e incluso durante Ia replicación del ADN debido a errores en Ia lectura de las bases. La frecuencia de mutación (Ia proporción de mutantes en Ia población) puede aumentarse significativamente con el uso de métodos de mutación inducida.
Tanto las mutaciones espontáneas como las inducidas se producen como resultado de cambios estructurales en el genoma como por ejemplo, pero sin limitarse, cambio en el número de cromosomas, cambio en el orden de uno o varios genes dentro del cromosoma o cambio en Ia secuencia de bases dentro de un gen (mutación puntual). La mutación puntual puede provocar Ia sustitución de un nucleótido por otro nucleótido o el desplazamiento de Ia pauta abierta de lectura (inserción o delección de uno o más nucleótidos).
El agente que provoca mutagénesis química se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, agentes que reaccionan con el ADN, agentes intercalantes o análogos de bases. El agente que reacciona con el ADN es capaz de reaccionar directamente con éste, aunque no se esté replicando, ocasionando cambios químicos en las bases que provocan un apareamiento incorrecto. El agente que reacciona con el ADN se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, ácido nitroso, hidroxilamina, agente alquilante (etil metano sulfonato [EMS], metil metano sulfonato [MMS], dietil sulfato [DES], diepoxi butano [DEB], N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina [NTG], N-metil-N- nitroso urea (gas mostaza), agente intercalante (acridina, bromuro de etidio o dihidroetidio).
La mutagénesis por radiaciones puede ser producida, pero sin limitarse, a radiaciones ultravioleta o radiaciones ionizantes como los rayos X o los rayos gamma.
La mutagénesis por elementos transponibles puede ser producida, pero sin limitarse, a Ia inserción de una secuencia de inserción o de un transposón en una secuencia de uno o varios genes de Ia cepa bacteriana de Ia presente invención.
La cepa CECT 7531 puede ser utilizada para generar una cepa recombinante (cepa recombinante derivada) mediante Ia introducción de genes que codifican para enzimas que puedan alterar y/o ampliar el rango de producción de compuestos carotenoides de Ia cepa parental, o bien de secuencias de ADN específicas que puedan ejercer esta función. Estos genes o secuencias de ADN pueden ser introducidos en Ia cepa parental mediante diversas técnicas como por ejemplo, pero sin limitarse, vectores de expresión basados en plásmidos adecuados, vectores suicidas, plásmidos conjugativos, transposones o fagos. En adelante se podrá hacer referencia a Ia cepa CECT 7531 o a cualquier cepa muíante o recombinante derivada con el término "cepa/s de Ia presente invención" o "cepa/s de Ia invención".
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a una población celular que comprende células de Ia cepa de Ia invención. La población celular es un conjunto de células que proceden de una o más células que pertenecen a Ia cepa de Ia presente invención. La población celular puede constituir una colonia. Una colonia es una población celular que procede de una sola célula.
En adelante se podrá hacer referencia a Ia población celular descrita en el párrafo anterior con el término "población celular de Ia presente invención" o "población celular de Ia invención".
Un aspecto más de Ia invención se refiere al uso de Ia cepa de Ia presente invención o de Ia población celular para Ia producción de carotenoides. Una realización preferida se refiere al uso de dicha cepa o de dicha población celular donde el carotenoide es un triterpenoide.
Un triterpenoide es un terpenoide de 30 átomos de carbono (C30). El término isoprenoide se puede utilizar como sinónimo de terpenoide. Un terpenoide es una molécula lipídica formada por unidades de isopreno.
Otra realización preferida se refiere al uso de Ia cepa de Ia invención o de Ia población celular, donde el triterpenoide es un diapocaroteno. El diapocaroteno se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, 4,4'-diapofitoeno, 4,4'- diapofitoflueno, 4,4'-diapo-zeta-caroteno, diapo-7,8,11 ,12-tetrahidrolicopeno, 4,4'- diaponeurosporeno, 4,4'-diapo-7,8,11 ;12-tetrahidrolicopeno, 4,4'-diaponeu- rosporeno o 4-hidroxi-4,4'-diapo-neurosporeno. En una realización más preferida, el diapocaroteno es 4,4'-diaponeusporeno. Otro aspecto de Ia presente invención es el uso de Ia cepa o de Ia población celular de Ia invención para Ia fabricación de un alimento probiótico.
El término "probiótico" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a microorganismos vivos que cuando son suministrados en cantidades adecuadas promueven beneficios en Ia salud del organismo huésped. El organismo huésped puede ser un animal o un humano.
El término "alimento probiótico" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a un alimento al que se adicionan células de Ia cepa de Ia presente invención. El alimento probiótico de Ia presente invención contribuye al equilibrio de
Ia flora bacteriana intestinal del huésped y, al constituir una fuente importante de carotenoides, aumenta las defensas antioxidantes del organismo huésped. El alimento probiótico de Ia presente invención es, pero sin limitarse, un producto lácteo como leche, batido, yogur o kéfir. El alimento probiótico puede ser un producto vegetal fermentado, como por ejemplo, pero sin limitarse, aceitunas, col, pepinillos, alcaparras, alcaparrones, zanahorias o jugos vegetales fermentados.
Por otra parte, Ia cepa de Ia presente invención también puede ser utilizada para producir los citados alimentos fermentados al ser inoculada como cultivo activo en el material fermentable de partida.
Otra realización preferida de Ia presente invención se refiere al uso de Ia cepa o de Ia población celular de Ia invención para Ia fabricación de un complemento nutricional. Una realización más preferida se refiere al uso de Ia cepa o Ia población celular de Ia invención para Ia fabricación de un complemento vitamínico y/o mineral.
Un "complemento nutricional (o nutritivo)" o un "complemento vitamínico y/o mineral" es una fuente concentrada de dichos nutrientes, solos o combinados, o más concretamente, de vitaminas y/o minerales, solos o combinados, que son ingeridos por un animal o un humano para completar su alimentación o incluso para aumentar el aporte de nutrientes, vitaminas y/o minerales. En Ia presente invención, el complemento nutricional o el complemento vitamínico y/o mineral se fabrica combinando Ia cepa de Ia presente invención con los componentes de dichos complementos, obteniendo de esta manera un complemento rico en carotenoides.
Según otra realización preferida, el alimento probiótico o el complemento nutricional, preferiblemente cualquiera de los complementos vitamínico y/o mineral, se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral. La forma adaptada a Ia administración oral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. La forma adaptada a Ia administración oral se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado. El alimento probiótico o cualquiera de los complementos descritos puede ser un pienso para animales.
En cada caso el alimento probiótico o cualquiera de los complementos descritos se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, se pueden presentar bajo Ia forma de soluciones o cualquier otra forma de administración.
Otro aspecto de Ia presente invención es un método para Ia producción de carotenoides que comprende:
a. Inocular Ia cepa o Ia población celular de Ia invención en un medio de cultivo, b. cultivar dicha cepa o población en el medio de cultivo del apartado
(a) durante un periodo de entre 15 y 35 horas, y c. extraer los carotenoides de las células obtenidas en el paso (b).
Una realización preferida se refiere al método, donde el medio de cultivo comprende al menos una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una solución tampón y componentes traza esenciales. El medio de cultivo del apartado (a) puede comprender además, peptona, triptona, extracto de levadura, extracto de carne (Beef extract), polisorbato (como por ejemplo, pero sin limitarse, Tween 80). La fuente de carbono puede ser, pero sin limitarse, glucosa, galactosa, maltosa, lactosa, fructosa, sacarosa, mañosa, almidón, melaza, o cualquiera de sus combinaciones. La fuente de nitrógeno puede ser, pero sin limitarse, citrato amónico, fosfato amónico, sulfato amónico, casaminoácidos, peptona de carne, peptona de caseína, peptona de soja, o cualquiera de sus combinaciones. La solución tampón puede ser, pero sin limitarse, acetato sódico, fosfato monoácido de potasio, citrato sódico, o cualquiera de sus combinaciones. Los componentes traza esenciales pueden ser, pero sin limitarse, magnesio, manganeso, zinc, cobre, molibdeno, hierro o níquel.
Según una realización preferida del método, Ia fuente de nitrógeno es citrato amónico, Ia solución que ayuda a controlar el pH es acetato sódico y/o fosfato monoácido de potasio y los componentes traza esenciales son magnesio y/o manganeso.
Según otra realización preferida del método, el periodo de cultivo de Ia cepa o población según el apartado (b) es de entre 20 y 30 horas. Más preferiblemente el periodo de cultivo es de entre 23 y 25 horas.
Otra realización más preferida se refiere al método, donde el pH del medio de cultivo, durante cualquier duración del periodo de cultivo, se mantiene entre 6 y 7. Para mantener el pH del medio de cultivo se lleva a cabo una medida del mismo mediante una toma de muestras serial o mediante una medida continua y Ia rectificación del mismo mediante Ia adición de un ácido o una base como por ejemplo, pero sin limitarse, ácido clorhídrico o hidróxido sódico, respectivamente.
Otro aspecto de Ia presente invención es una composición probiótica que comprende Ia cepa o el cultivo celular de Ia presente invención. Dicha composición probiótica puede contener, además, una o más cepas de una bacteria de Ia misma especie o de una especie diferente o de cualquier otro microorganismo como por ejemplo un hongo o una levadura. La bacteria se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, Lactobacillus acidophilus (en adelante el término "Lactobacillus" se abreviará como "L."), L. casei, L. casei var. Shirota, L. fermentum, L. crispatus, L. reuteri, L. rhamnosus, L. plantarum, L bulgaricus, L. cellobiosus, L. curvatus, L. gasserí, L. cremoris, Lactococcus lactis, Bifidobacteríum longum, Bifidobacteríum adolescentis, Steptococcus salivarís, Steptococcus faecium, Steptococcus diacetylactis o Steptococcus intermedius.
La composición probiótica puede presentarse en una forma adaptada a Ia administración oral, como por ejemplo, pero sin limitarse, en forma de gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado.
Otra realización preferida de Ia presente invención se refiere a una composición probiótica, que además comprende un vehículo. El vehículo se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, nutracéutico, alimento funcional, composición farmacéutica, alimento lácteo o alimento vegetal. Según una realización más preferida, el vehículo es un alimento lácteo. Preferiblemente el alimento lácteo es leche fermentada. La leche fermentada se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, queso, crema de leche, crema agria, yogurt, kéfir o koumiss. Según otra realización preferida, el vehículo también puede ser un alimento vegetal. Preferiblemente el alimento vegetal es fermentado. El alimento vegetal fermentado se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, aceitunas, col, pepinillos, alcaparra, alcaparrón, zanahoria o jugo vegetal fermentado.
Un compuesto nutracéutico tal como se entiende en Ia presente invención es un suplemento dietético, presentado en una matriz no alimenticia como por ejemplo, pero sin limitarse, pildoras, cápsulas o polvo, de una sustancia natural bioactiva concentrada presente en los alimentos y que, tomada en dosis superior a Ia existente en esos alimentos, tiene un efecto beneficioso sobre Ia salud, mayor que el que podría tener el alimento normal. A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Muestra el análisis cromatográfico típico de los pigmentos carotenoides extraídos de los pellets de células de cepas de L. plantarum.
En los paneles de Ia derecha se muestran los espectros de absorción de los picos cromatográficos correspondientes a 4,4'-diaponeurosporeno (1 ), 4,4'- diapo-zeta-caroteno (2) y 4,4'-diapofitoflueno (3), con indicación de sus máximos expresados en nanómetros (nm).
FIG. 2. Muestra Ia ruta biosintética de compuestos carotenoides triterpenoides (C30) y tetraterpenoides (C40).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos no pretenden limitar el campo de aplicación de Ia misma. EJEMPLO 1. Producción del triterpenoide 4,4'-diaponeurosporeno por varias cepas de L. plantarum.
Se realizó un cultivo de las cepas de L. plantarum (Tabla 1 ) en las condiciones propuestas en Ia presente invención. Alícuotas del cultivo se centrifugaron, y se obtuvieron pellets que fueron sometidos a extracción y análisis cromatografía). En todos los casos en los que hubo producción de carotenoides, se observó un pico cromatografía) principal a 14.8 minutos (FIG. 1 ). El espectro de absorción mostró máximos a 416, 438 y 468 nm (%lll/ll=95), Io cual es consistente con Ia presencia de un cromóforo conteniendo nueve dobles enlaces conjugados. En un principio, estas propiedades sugirieron Ia presencia de neurosporeno en las muestras analizadas, sin embargo Ia movilidad cromatográfica para este pico fue diferente, fluyendo a tiempos de retención menores (cerca de 1 minuto) que para neurosporeno (menor polaridad). El espectro de masas mostró un ion quasimolecular [M+H]+ a m/z 403, Io cual está en consonancia con Ia formula molecular C30H42 correspondiente a 4,4'-diaponeurosporeno (FIG 2, pico 1 ). Estos datos corroboran los descritos por Breithaupt et al., (2001). European Food Research and Technoloαv. 213: 231-233) para L plantarum LTH4936. Otros dos picos minoritarios se encontraron a 15.3 y 15.6 minutos (FIG. 2, picos 2 y 3), mostrando espectro de absorción UV-visible con máximos a 380, 402, 426nm (%lll/ll=93) y 333, 349, 368 nm (%lll/ll=81 ), respectivamente. El espectro de masas de estos picos mostró fragmentos [M+H]+ a m/z 405 y 407 respectivamente, los cuales están en concordancia con las fórmulas moleculares C30H44 y C3oH46, correspondientes a 4,4'-diapo-zeta-caroteno y 4,4'-diapofitoflueno (también denominado como 4,4'-diapo-7,8,11 ,12-tetrahidrolicopeno) respectivamente, y correspondientes a los intermediarios biosintéticos de Ia ruta de formación de 4,4'- diaponeurosporeno (FIG. 1 ) (Wieland et al., (1994). Journal of Bacterioloqy, 176: 7719-7726). Aunque Ia mayoría de los pigmentos carotenoides encontrados en bacterias son tetraterpenoides (C4o), algunos triperpenoides (C30) han sido descritos en tres especies de bacterias no-fotosintéticas, tales como S. aureus, Streptococcus faecium y Methylobacteríum rhodinum, así como en las especies fotosintéticas analizadas de heliobacterias. Tanto en el caso de los carotenoides C30 como los C40, Ia ruta biosintética comienza con Ia síntesis del isoprenoide isopentenil pirofosfato (IPP), el cual, después de Ia elongación de Ia cadena, catalizado por prenyl transferasas, es convertido en farnesyl pirofosfato (FPP) o geranylgeranyl pirofosfato (GGPP). FPP (C15) y GGPP (C20) son los precursores inmediatos de los carotenoides C30 y C40, respectivamente (Lee y Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbioloqy and Biotechnoloqy, 60: 1-11). La condensación cola- con-cola de dos moléculas de GGPP, catalizado por Ia enzima fitoeno sintetasa, da lugar al primer carotenoide, fitoeno. Del mismo modo, Ia condensación de dos moléculas de FPP, catalizada por Ia enzima dehydrosqualeno sintetasa, da lugar a dehidrosqualeno (también denominado diapofitoeno), el primer carotenoide C30. Seguidamente, varias reacciones sucesivas de desnaturalización incrementan el número de dobles enlaces conjugados inicialmente presentes en fitoeno o dehidroesqualeno para producir carotenoides coloreados (Lee y Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbioloqy and Biotechnoloqy, 60: 1-11 ). Aunque las desaturasas son especificas de las rutas C30 o C40, alguna intercambiabilidad, natural o inducida a través de ingeniería molecular, ha sido descrita en diversos estudios (Raisig y Sandmann, 2001. Biochimica and Biophvsica Acta, 1533: 164-170; Umeno et al. 2005. Microbioloqy and Molecular Bioloqy Reviews, 69: 51-78). En los pocos microorganismos productores de carotenoides C30, el producto final acumulado es 4,4'-diaponeurosporeno o un compuesto derivado de éste por oxidación o incluso glicosilación, como es el caso de staphyloxanthin en S. aureus (PeIz et al., 2005. Journal of Bioloqical Chemistrv, 280: 32493-32498). La naturaleza triterpenoide de estos compuestos evita Ia ciclación de los extremos terminales como en el caso de los carotenoides C40, y por Io tanto Ia diversidad estructural de los derivados de esta ruta es menor (Lee y Schmidt-Dannert, 2002. Applied Microbioloqy and Biotechnoloqy, 60: 1-11; Umeno et al. 2005. Microbioloqy and Molecular Bioloqy Reviews. 69: 51-78). EJEMPLO 2. Estimación cualitativa y cuantitativa de Ia producción de 4,4'- diaponeurosporeno por cepas de L. plantarum.
Como se muestra en Ia Tabla 1, Ia mitad de los pellets celulares de las cepas de L. plantarum descritas en el Ejemplo 1, aparecieron amarillos a simple vista (debido a Ia producción de carotenoides). Cultivos líquidos de cepas seleccionadas que se incubaron durante 24, 48, 72 y 96 horas mostraron que después de las primeras 24 horas de incubación, el contenido de carotenoides disminuía progresivamente. Por otra parte, en ensayos preliminares con algunas cepas seleccionadas se comprobó que el medio de cultivo donde más carotenoides se producían era el denominado DM1. Por Io tanto, las condiciones estándar para el estudio comparativo de producción de carotenoides en cepas de L. plantarum se establecieron como cultivos líquidos de 500 mi de medio DM1, inoculados con una colonia aislada e incubados estáticamente a 300C durante 24 h.
Tabla 1. Cepas de Lactobacillus plantarum estudiadas y producción de 4,4'- diaponeurosporeno.
Cepa Origen Color1 4,4'-diaponeurosporeno PCR2 Fuente3
(mg/kg peso seco)
CECT 7531 Fermentac. de aceitunas A 46,03 1 IG
LPT49/6 Fermentac. de aceitunas A 19,18 1 IG
LPT44/1 Fermentac. de aceitunas A 18,97 1 IG
LPJ 10 Fermentac. de aceitunas A 14,78 1 IG
LPT57/2 Fermentac. de aceitunas A 9,19 1 IG
NC8 ensilado de hierba A 8,83 1 Matforsk
ATCC10241 col fermentada A 6,33 1 ATCC
RP1 inoculo comercial A 4,95 1 RP
ATCC14431 ensilado de hierba B 2,30 1 ATCC
CECT 748T col fermentada B 1 ,78 1 CECT
ATCC8014 ensilado de maíz B trazas 1 ATCC
BE5 queso B trazas 2 IPLA
CA2A3 queso B trazas 1 IPLA
CECT 220 ensilado de maíz B trazas 1 CECT
LL441 queso B trazas 1 IPLA
VM queso B trazas 2 IPLA
1 Color a simple vista de los pellets de células obtenidos tras centrifugación de los cultivos: A = amarillo; B = blanco.
2 Pareja de cebadores que amplificó el operón crtN-crtM en esa cepa en particular: 1 = SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2; 2= SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 2;.
3Fuentes: IG: José Luis Ruiz Barba, Instituto de Ia Grasa-CSIC, Sevilla; Matforsk: Lars Axelsson, Norwegian Food Research Institute, Osloveien, Noruega; ATCC: American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA; RP: Rhóne-Poulenc Industries SA, Courbevoie, Francia; CECT: Colección Española de Cultivos Tipo, Burjassot, Valencia; IPLA: Baltasar Mayo, Instituto de Productos Lácteos de Asturias-CSIC, Asturias. τCepa tipo.
En todas las cepas estudiadas, Ia producción de diaponeurosporeno estuvo comprendida entre niveles de trazas, apenas distinguibles como picos cromatográficos en los análisis por HPLC, y los 46,03 mg/kg de peso seco producidos por Ia cepa CECT 7531 de L. plantarum (Tabla 1 ). El color amarillo de los pellets fue evidente a simple vista para aquellas cepas que producían al menos 4,95 mg de diaponeurosporeno por kg de peso seco (Tabla 1). Se encontró una cierta correlación entre Ia producción de pigmentos carotenoides y el origen de las diferentes cepas estudiadas. Así, las cepas aisladas de fermentaciones de aceitunas de mesa fueron las más productoras, mientras que en las aisladas de queso o ensilados de maíz sólo se encontraron trazas de compuestos carotenoides. La producción de carotenoides por microorganismos es muy diversa en Io que respecta a niveles de producción, Io cual unido a los diferentes métodos de cuantificación empleados, hace difícil Ia comparación entre especies y cepas distintas. A todo ello hay que añadir que diversos autores han descrito diversos modos de estimular Ia síntesis de carotenoides en microorganismos a través de las condiciones y medios de cultivo (Bhosale, 2004. Applied Microbioloqy and Biotechnology, 63: 351-361 ). De este modo, aumentos de dos a mil veces en Ia producción de carotenoides han sido conseguidos mediante cambios en irradiación lumínica, temperatura de cultivo, y Ia adición de diversos compuestos químicos. Resultados preliminares obtenidos por los inventores han mostrado diferencias amplias en Ia producción y contenido final de diaponeurosporeno en función de Ia marca y composición del medio de cultivo empleado, a pesar de que en todos los casos Ia densidad celular a las 24 horas de incubación a 30 0C, antes de Ia extracción de carotenoides, fuera virtualmente Ia misma. Este resultado ilustra Ia importancia e influencia de Ia composición del medio de cultivo en relación a Ia biosíntesis de carotenoides. En Ia presente invención se selecciona el medio definido DM1 , tal como se ha mencionado anteriormente, como el más rentable a este respecto.
EJEMPLO 3. Análisis de Ia presencia del operón crtN-crtM en las cepas de L. plantarum estudiadas.
Los análisis genéticos a través de PCR mostraron que todas las cepas de L. plantarum estudiadas contenían los genes crtN y crtM dispuestos como un operón, tal y como había sido descrito en Ia secuencia anotada del genoma completo de L. plantarum WCFS1 (Kleerebezem et al., 2003. Proceedinqs of the National Academy of Sciences, 100: 1990-1995). Un fragmento de ADN amplificado de 2.379 pb pudo ser obtenido de casi todas las cepas cuando se usaron los cebadores SEQ ID NO: 1/SEQ ID NO: 2 (Ver notas al pie de Tabla 1 ), con 58 ó 60 0C como Ia temperatura de anillamiento. Sin embargo, con dos cepas con las que no se obtuvo amplificación de esta forma, pudo obtenerse un fragmento de ADN amplificado de 2.396 pb cuando los cebadores SEQ ID NO: 3/SEQ ID NO: 2 fueron usados (Ver notas al pie de Tabla 1), con 58 0C como Ia temperatura de anillamiento. Estos resultados sugieren que pueden aparecer pequeñas variaciones en Ia secuencia de ADN de los genes estudiados en todas las cepas. Las dos cepas de las que sólo se pudo amplificar ADN específico con Ia segunda pareja de cebadores fueron aisladas de quesos, no produciendo cantidades apreciables de carotenoides ninguna de ellas. La funcionalidad del operón crtN- crtM, por tanto, aunque retenida en Ia mitad de las cepas estudiadas, puede perderse debido a ligeras variaciones en Ia secuencia de ADN tal y como denotan los resultados obtenidos con los ensayos de PCR específicos. Además, estas variaciones podrían ser Ia causa de las grandes diferencias en producción de carotenoides observadas entre las distintas cepas ensayadas. Por otra parte, el hecho de que incluso en aquellas cepas donde sólo se encontraron trazas de producción de diaponeurosporeno contenían el operón crtN-crtM, en cualquiera de sus "variantes PCR" encontradas, sugiere que estos genes están bastante conservados entre las distintas cepas de L plantarum, muy probablemente debido a que, debido a su función, merecen ser preservados. Experimentos de optimización con estas cepas que sólo producen trazas de carotenoides serían necesarios para saber si su baja producción es debida a albergar genes crtNo crtM defectuosos o bien a que otras características metabólicas específicas están involucradas. Materiales y métodos
Cepas bacterianas, medios y condiciones de cultivo.
Las cepas de L. plantarum usadas en este estudio, y que se describen en Ia Tabla 1, fueron propagadas en agar MRS (Oxoid) a 30 0C. Para los experimentos de optimización preliminares, fueron usados caldos MRS de distintas procedencias, incluyendo los fabricados por Oxoid, Difco, Biokar y Merck. También para este propósito, se usaron dos caldos de cultivo definidos distintos: DM1 , conteniendo, por litro, glucosa (Panreac, 20 g), peptona (Difco, 10 g), extracto de carne (Oxoid, 8 g), extracto de levadura (Oxoid, 4 g), K2HPO4 (Fluka, 2 g), acetato sódico-3H2O (Fluka, 5 g), citrato triamónico (Merck, 2 g), MgSO4-TH2O (Merck, 0.2 g), MnSO4-4H2O (Merck, 0.05 g), y Tween 80 (Sigma, 1 mi); y DM2, conteniendo, por litro, glucosa (Panreac, 22 g), extracto de levadura (Oxoid, 10 g), (NhU)2HPO4 (Fluka, 2.5 g), MgSO47H2O (Merck, 0.05 g), MnSO4 H2O (Merck, 0.005 g), y Tween 80 (Sigma, 0.2 mi). En todos los casos, el pH se ajustó a 6,5 con HCI (10N) y los caldos de cultivo se esterilizaron a 121 0C, 1 atm, durante 15 min.
Cultivos de L. plantarum para Ia producción de carotenoides.
Para Ia producción de carotenoides en condiciones estándar, alícuotas de 500 mi de caldo DM1 se inocularon con una colonia aislada de Ia cepa de L. plantarum a testar. Los cultivos se incubaron a 30 0C, sin aireación, durante 24, 48, 72 ó 96 h. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 12.000 x g, a 4 0C durante 15 min, se lavaron con agua destilada estéril y se centrifugaron de nuevo para obtener un pellet que fue posteriormente liofilizado. Estas muestras se conservaron a -2O0C hasta Ia extracción de los carotenoides y el análisis cromatográfico de los mismos. Los datos obtenidos fueron expresados en términos de peso seco. Extracción de carotenoides y su análisis mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
El precipitado resultante de centrifugar el cultivo bacteriano (1 gramo) se introdujo en un tubo de ensayo de 15 mi, con tapón de rosca, y se extrajo con 10 mi de N1N- dimetilformamida durante 15 min a 650C. Las células se separaron y retiraron mediante centrifugación a 5.000 rpm, y Ia fase superior, conteniendo los pigmentos carotenoides, se transfirió a un embudo de decantación. La operación se repitió hasta Ia extracción completa del color (normalmente 4 extracciones fueron suficiente). Todos los extractos se reunieron y se mezclaron con 100 mi de éter dietílico, añadiendo seguidamente unos 50 a 100 mi de solución de NaCI al 10% (p/v) para ayudar a Ia separación de las fases. Seguidamente Ia fase orgánica se secó haciéndola pasar por un lecho de Na2SO4 anhidro y se evaporó con Ia ayuda de un evaporador rotatorio a vacío. La muestra se disolvió en 1 mi de acetona, se centrifugó a 12.000 rpm, y se almacenó a -30 0C hasta su análisis.
El seguimiento y cuantificación de los pigmentos carotenoides bacterianos se llevó a cabo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase reversa, usando un método cromatográfico previamente desarrollado en nuestro laboratorio (Mínguez-Mosquera y Hornero-Méndez, (1993). Journal of Aqriculture and Food Chemistrv, 41: 1616-1620). En este método se emplea una columna de fase reversa C18 (Waters Spherisorb ODS2 column; 250x4.6 mm I. D., tamaño de partícula 5 μm) (Waters Ltd., Hertsfordshire, United Kingdom) y un gradiente de elución binario acetona-agua a un flujo de 1.5 ml/min. El volumen de inyección fue de 5 μl y Ia detección de los pigmentos se realiza espectrofotométricamente a 440 nm. La cuantificación se realizó mediante una recta de calibrado preparada con β- caroteno (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO). El sistema de análisis mediante HPLC consistió en una bomba cuaternaria Waters 600E equipada con un detector de fotodiodos (PDA 996, Waters), controlados con el software Empower2 (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, USA). Aislamiento e identificación de pigmentos.
Se utilizaron procedimientos rutinarios para el aislamiento e identificación de pigmentos carotenoides, descritos en detalle en publicaciones previas de nuestro grupo de investigación (Mínguez-Mosquera y Hornero-Méndez, (1993). Journal of Aqriculture and Food Chemistrv, 41 : 1616-1620), y que brevemente consisten en: separación y aislamiento de los pigmentos mediante cromatografía en capa fina (TLC) sobre placas de silicagel 60GF, y co-cromatografía con patrones de pigmentos; adquisición de los espectros UV-visible en diferentes disolventes y comparación con los valores descritos en Ia literatura (Britton, (1995). UVΛ/isible Spectroscopy. En: Britton G, Liaaen-Jensen S, Pfander H, editores. Carotenoids. Volume 1 B: Spectroscopy. Basel, Switzerland: Birkháuser), así como Ia realización de pruebas químicas para determinar Ia presencia de grupos 5,6-epoxido (adición de 2% HCI en etanol), de grupos hidroxilo mediante acetilación con Ac2θ/Py, y de grupos carbonilos mediante Ia reducción con NaBH4 en etanol.
Análisis genético.
La presencia del operón crtN-crtM en las diferentes cepas de L. plantarum fue detectada mediante PCR, usando cebadores oligonucleotídicos diseñados a partir de las secuencias de nucleótidos publicadas para estos genes en L. plantarum
WCFS1 (N0 de acceso GeneBank AL935261 ; Kleerebezem et al., 2003.
Proceedinqs of the National Academy of Sciences, 100: 1990-1995). El par de cebadores SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 se utilizó para Ia amplificación de un fragmento (2.379 pares de bases [pb]) de ADN que incluía secuencias codificantes para ambos genes. Alternativamente, en aquellos casos en los que el primer par de cebadores no funcionó, se utilizó el par de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO:
2 para amplificar un fragmento de ADN de 2.396 pb que incluía parte del promotor del operón crtN-crtM. Se introdujeron sitios de restricción para EcoR\ en el extremo 5' terminal de los cebadores SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 2, y un sitio de restricción para Kpn\ en el extremo 5' del cebador SEQ ID NO: 3 a fin de facilitar futuras estrategias de clonación (letras en negrilla en Ia secuencia anteriormente descrita). Además, se introdujeron secuencias de anclaje ("clamps") en el extremo 5' para asegurar una digestión correcta por las enzimas de restricción (letras en itálica en Ia secuencia del cebador anteriormente descrita). El ADN total de colonias de L. plantarum fue extraído según el protocolo descrito por Ruiz-Barba et al. (Ruiz- Barba et al., 2005. Analvtical Biochemistrv 347, 333-335). La amplificación de los fragmentos de ADN fue realizada en mezclas de reacción de 100 μl, conteniendo 2.5 mM MgCI, 1x buffer de reacción, 100 μM de cada deoxynucleoside triphosphates, 100 pmol de cada cebador, 5 U de Taq ADN polimerasa (Promega), y 5 μl de ADN total de colonias como sustrato. Para Ia amplificación se utilizó un sistema termociclador GeneAmp PCR system 2400 (Perkin-Elmer) usando las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 0C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 0C durante 15 seg, anillamiento a 60 0C durante 30 seg, y polimerización a 72 0C durante 2 min, más una etapa final de polimerización a 72 0C durante 4 min. Alternativamente, cuando no se obtuvo amplificación en las condiciones anteriores, se utilizó 58 0C como temperatura de anillamiento. Los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR fueron finalmente analizados mediante electroforesis en gel de agarosa. Búsquedas de homología de secuencias de ADN y proteínas fueron realizadas usando el programa WU-Blast2 desarrollado por EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Cepa bacteriana CECT 7531 de Lactobacillus plantarum.
2. Población celular que comprende células de Ia cepa según Ia reivindicación
1.
3. Uso de Ia cepa o de Ia población celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para Ia producción de carotenoides.
4. Uso de Ia cepa o de Ia población celular según Ia reivindicación 3 donde el carotenoide es un triterpenoide.
5. Uso de Ia cepa o de Ia población celular según Ia reivindicación 4 donde el triterpenoide es un diapocaroteno.
6. Uso de Ia cepa o de Ia población celular según Ia reivindicación 5 donde el diapocaroteno es 4,4'-diaponeusporeno.
7. Uso de Ia cepa o de Ia población celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para Ia fabricación de un alimento probiótico.
8. Uso de Ia cepa o de Ia población según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para Ia fabricación de un complemento nutricional.
9. Uso de Ia cepa o de Ia población según Ia reivindicación 8, donde el complemento nutricional es un complemento vitamínico y/o mineral.
10. Uso de Ia cepa o de Ia población celular según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde el alimento probiótico o el complemento nutricional se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral.
11. Método para Ia producción de carotenoides que comprende:
a. Inocular Ia cepa o Ia población celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en un medio de cultivo, b. cultivar dicha cepa o población celular en el medio de cultivo del apartado (a) durante un periodo de entre 15 y 35 horas, y c. extraer los carotenoides de las células obtenidas en el paso (b).
12. Método según Ia reivindicación 11 , donde el medio de cultivo comprende al menos una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una solución tampón y componentes traza esenciales.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde Ia fuente de nitrógeno es citrato amónico, Ia solución tampón es acetato sódico y/o fosfato monoácido de potasio y los componentes traza esenciales son magnesio y/o manganeso.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde el periodo de cultivo de Ia cepa o población celular según el apartado (b) es de entre 20 y 30 horas.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde el pH del medio de cultivo durante el periodo de cultivo del apartado (b) se mantiene entre 6 y 7.
16. Composición probiótica que comprende Ia cepa o el cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
17. Composición probiótica según Ia reivindicación 16, que además comprende un vehículo.
18. Composición probiótica según Ia reivindicación 17 donde el vehículo es un alimento lácteo.
19. Composición probiótica según Ia reivindicación 17 donde el vehículo es un alimento vegetal.
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