JP7126688B2

JP7126688B2 - オレンジ色乳酸菌

Info

Publication number: JP7126688B2
Application number: JP2018111814A
Authority: JP
Inventors: 達朗萩; 将野村; 美穂小林
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2022-08-29
Anticipated expiration: 2038-06-12
Also published as: JP2019010091A

Description

本発明は、オレンジ色乳酸菌、その製造方法及び当該乳酸菌を含有する化粧品、飲食品、医薬品または医薬部外品に関する。

乳酸菌はヨーグルトやチーズなどの乳製品や、漬物、味噌、醤油などの発酵食品の製造に用いられており、近年はプロバイオティクスとして消化管内の細菌叢の改善による整腸効果、免疫力向上効果、抗腫瘍効果などの種々の健康保持効果を有することから、人類にとって健康に深く関わる有用な微生物資源として知られている。しかしながら、食品として摂取された乳酸菌は、胃酸や胆汁酸などの様々なストレスに曝されることで、腸内での生存率や乳酸菌が本来有する有用な効果が低減してしまう。そのため、乳酸菌の効率的な利用を目的とし、乳製品の製造過程や宿主共存下（消化管内環境など）での環境ストレスに対する耐性を向上させる検討が行われている。その１つとして、本発明者は、乳酸菌のカロテノイド色素生産を促進させることにより、乳酸菌のマルチストレス耐性が向上することを報告（特許文献１）している。
乳酸菌は通性嫌気性細菌であるため、大腸菌や枯草菌などの好気性細菌に比べて酸素に対する耐性が低いが、この乳酸菌を好気培養することにより黄色カロテノイドが産出されることも、本発明者は既に報告（特許文献２）している。この乳酸菌が生産する黄色カロテノイド色素については、最近、免疫賦活作用や病原菌感染予防効果を有することが解明されつつある。
このように、乳酸菌が生産するカロテノイド色素は、その新たな機能性について関心が持たれているほか、安全性の高い食用色素としても大きく期待されている。

特開２０１４－００３９６９号公報特開２０１５－１１６１６７号公報

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.36, No.1, p.8-12.

上記非特許文献１には、エンテロコッカス属（Enterococcus）乳酸菌（E.mundtiiやE.casseliflavus）は、黄色カロテノイドを生産する乳酸菌として分類されている。このように、乳酸菌が黄色カロテノイドを生産することは知られているものの、黄色以外の色を呈するカロテノイド色素を生産することは知られていない。
そこで、本発明は、これら黄色以外の色を呈するカロテノイド色素を生産する乳酸菌、当該乳酸菌を製造する方法を提供することを課題としている。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、簡便な方法によりオレンジ色の乳酸菌が得られることを見出し、上記課題を解決するに至ったものである。

本発明は、具体的には次の事項を要旨とする。
１．Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における色相ａ^＊が４≦ａ^＊、及び、色相ｂ^＊が２７≦ｂ^＊であるオレンジ色乳酸菌。
２．嫌気培養した乳酸菌を水で懸濁後、空気暴露することを特徴とする１．記載の乳酸菌の製造方法。
３．配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を含む組み換えベクターを導入した乳酸菌を、酸素介在条件下で培養することを特徴とする１．記載の乳酸菌の製造方法。
４．１．記載の乳酸菌を含有する飲食品。
５．１．記載の乳酸菌を含有する化粧品。
６．１．記載の乳酸菌を含有する医薬品または医薬部外品。

本発明の乳酸菌は、Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における色相ａ^＊が４≦ａ^＊及び、色相ｂ^＊が２７≦ｂ^＊であるオレンジ色乳酸菌であり、今まで知られていない鮮やかなオレンジ色を呈する。本発明の乳酸菌は、特定の菌株に限定されるものではなく何れの乳酸菌においても、簡単な処理により得ることができる。また、本発明は、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子が、オレンジ色乳酸菌の発現に関与していることも明らかにした。さらに、本発明の乳酸菌は、飲食品、化粧品、医薬品及び医薬部外品等に対して、安全性の高い天然食用色素として使用することもできる。

実施例１のオレンジ色乳酸菌の製造方法１ａにおける、実施例（右側）と比較例（左側）の結果を示すカラー写真である。実施例２のオレンジ色乳酸菌の製造方法１ｂにおける、試験検体ａ～ｆの結果を示すカラー写真である。実施例３のオレンジ色乳酸菌の製造方法２における、遺伝子１～３を使用した発現ベクター作成の模式図である。実施例３のオレンジ色乳酸菌の製造方法２における、菌体の色を示すカラー写真である。図中の「ｐＲＣ（左端）」はｃｒｔＮ＋ｃｒｔＭ（黄色色素合成遺伝子）のみの菌体の色を、「ｐＲＣＳ（左から２番目）」はｐＲＣ＋遺伝子１の菌体の色を、「ｐＲＣＳＧ（右から２番目）」はｐＲＣ＋遺伝子１＋遺伝子２の菌体の色を、「ｐＲＣＳＧＡ（右端）」はｐＲＣ＋遺伝子１＋遺伝子２＋遺伝子３の菌体の色を示す。実施例４のオレンジ色乳酸菌から抽出したカロテノイド色素を、ＴＬＣシリカゲルプレートを用いて展開したカラー写真である。実施例５のオレンジ色乳酸菌から抽出したカロテノイド色素を、ＴＬＣシリカゲルプレートを用いて展開したカラー写真である。実施例５のオレンジ色素のLC-MSMS解析チャート図である。実施例５の黄色色素２のLC-MSMS解析チャート図である。実施例５の黄色色素１のLC-MSMS解析チャート図である。

本発明は、ＣＩＥ１９７６Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における色相ａ^＊が４≦ａ^＊、及び、色相ｂ^＊が２７≦ｂ^＊であるオレンジ色乳酸菌及びその製造方法に関する。
以下、本発明について詳細に説明する。

本発明の乳酸菌の種類は、特に限定されず乳製品や発酵食品などの食品において一般的に用いられる公知の乳酸菌であればよい。具体的には、例えばラクトコッカス（Lactococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ストレプトコッカス（Streptococcus)属、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）等の乳酸菌が挙げられる。ラクトコッカス属の乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・プランタラム（Lactococcus plantarum）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Lactococcus raffinolactis）等の乳酸菌、ラクトバチルス属の乳酸菌としては、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・デルブルキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）等の乳酸菌、エンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌としては、エンテロコッカス・ギルバス（Enterococcus gilvus）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）等の乳酸菌、ペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌としては、ペディオコッカス・アシディラクティシィ(Pediococcus acidilactici)、ペディオコッカス・ソジェー（Pediococcus sojae）、ペディオコッカス・ハロフィラス（Pediococcus halophilus）等の乳酸菌、ロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌としては、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）等の乳酸菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属の乳酸菌としては、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）等、カルノバクテリウム属（Carnobacterium）の乳酸菌としては、カルノバクテリウム・ビリダンス（Carnobacterium viridans）等の乳酸菌がそれぞれ挙げられる。本発明においては、複数種類の乳酸菌を混合して用いることもできる。

本発明の乳酸菌はオレンジ色を呈する。この色調は、ＣＩＥ１９７６Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における色相ａ^＊が４≦ａ^＊、及び、色相ｂ^＊が２７≦ｂ^＊である。中でも明度Ｌ^＊、色相ａ^＊、色相ｂ^＊（以下、それぞれを単に「Ｌ^＊」、「ａ^＊」、「ｂ^＊」ともいう。）が、明度Ｌ^＊が７０≦Ｌ^＊≦９０、色相ａ^＊が４≦ａ^＊≦３０、及び、色相ｂ^＊が２７≦ｂ^＊≦４５の範囲が好ましい。明度Ｌ^＊値が大きくなると色調は明るくなり、反対にＬ^＊値が小さくなると色調は暗くなる。また、色相ａ^＊は赤から緑の色調を示し、ａ^＊値が大きいほど赤い色調が強くなり、値が小さいほど緑の色調が強くなる。一方、ｂ^＊値は黄色から青の色調を示し、ｂ^＊値が大きいほど黄色の色調が強くなり、ｂ^＊値が小さいほど青の色調が強くなる。

（オレンジ色乳酸菌の製造方法１）
本発明のオレンジ色乳酸菌は、嫌気培養した乳酸菌を水で懸濁後、空気暴露することにより得ることができる。この製造方法は、室温（２５℃）で行うことができ、空気暴露してすぐにオレンジ色が観察され、概略数十分後にはオレンジ色乳酸菌を得ることができる。
本発明において乳酸菌の培養は、嫌気条件で行う通常の乳酸菌培養で用いられる培養条件に従って行えばよい。嫌気条件とは、培養系に酸素が供給されない環境下をいい、例えば、嫌気条件下での静置培養や撹拌培養などが挙げられる。
培養に用いる培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、乳酸菌が生育できる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば使用する菌株に適切な公知の培地を適宜選ぶことができる。炭素源としてはグルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、トレハロース、スクロース、マンノース、廃糖蜜などを使用することができ、窒素源としては肉エキス、ペプトン、イーストエキストラクト、カゼイン加水分解物、ホエータンパク質加水分解物、大豆タンパク質加水分解物などを使用することができる。また無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウムなどを用いることができる。乳酸菌の培養に適した培地としては、例えばＭ１７培地（グルコース添加）、ＭＲＳ液体培地、ＧＹＰ培地、ＴＹＧ培地、ＢＬ培地、ＧＡＭ培地、Ｂｒｏｔｈ培地、ＢｒｉｇｇｓＬｉｖｅｒＢｒｏｔｈ、獣乳、脱脂乳、乳性ホエーなどが挙げられる。
培養条件は、乳酸菌が生育し得る条件であれば特に制限はないが、例えば、ｐＨは５．０～８．０、好ましくは５．０～７．０、温度が２０～４５℃、好ましくは３０～４０℃で、時間は１０～３０時間、好ましくは１８～２４時間である。培養の形式は、静置培養、振とう培養、タンク培養などが挙げられる。

嫌気培養した乳酸菌を水で懸濁させる方法としては、特に限定されないが、例えば、遠心して沈殿を回収し、ボルテックス等で撹拌し懸濁する方法や、メンブレン等により菌体をトラップして培地を除去し、水で洗浄して放置あるいは水に懸濁する方法が挙げられる。使用する水の種類は、特に限定されず、精製水、蒸留水、ミネラル水、アルカリイオン水、水道水等を使用することができる。また、リン酸バッファー等の洗浄バッファーも、水で懸濁させる方法の１つとして使用できる。

（オレンジ色乳酸菌の製造方法２）
本発明のオレンジ色乳酸菌は、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子を含む組み換えベクターを導入した乳酸菌を、酸素介在条件下で培養することにより、製造することができる。後述する実施例において詳しく説明するが、黄色カロテノイドを生産する乳酸菌として公知のエンテロコッカス属（Enterococcus）乳酸菌（E.mundtii）から、３つの遺伝子からなると予想されたオペロンを単離してからベクターに連結し、ラクトコッカス（Lactococcus）属乳酸菌（L.lactis）で発現したところ、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子（以下、遺伝子１ともいう。）により、オレンジ色乳酸菌が得られることが明らかとなった。すなわち、本発明のオレンジ色乳酸菌の生成には、この遺伝子１が関与しているものと考えられる。

オレンジ色乳酸菌の製造方法２に用いる組換えベクターは、適当なベクターに上記遺伝子１を挿入することにより得ることができる。遺伝子１を挿入するためのベクターは、乳酸菌に導入された場合に、上記遺伝子１の発現に適した発現ベクターであれば特に制限されず、乳酸菌において自立複製可能なベクター、または、乳酸菌の染色体中へ組込み可能であるベクターのいずれでもよい。乳酸菌で自立複製可能なベクターとしては、例えば、ｐＷＶ０１、ｐＡＭβ１、ｐＳＨ７１等のプラスミドベクターまたはこれらを改変したプラスミドベクター、φＦＳＶなどのファージベクターが挙げられる。ベクターは入手可能な市販品を使用することができ、例えば、ＮＩＣＥタンパク質発現システム（モビテック）に含まれるｐＺ８１４８、ｐＺ８１４９、ｐＺ８１５０等が挙げられる。

ベクターに遺伝子１を挿入するには、遺伝子１を上記ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などの周知の方法（例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照)により行うことができる。組換えベクターは、乳酸菌の複製起点、プロモーター、選択マーカーを含み、必要に応じてエンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。プロモーターは、オレンジ色乳酸菌の持つ遺伝子１の上流にあるオリジナルプロモーター、あるいは、その下流に制御可能に連結した遺伝子１を乳酸菌内で発現させることのできるプロモーターであれば特に限定はされないが、乳酸菌由来のプロモーターを用いることが好ましく、そのようなプロモーター配列は、通常、乳酸菌の遺伝子の転写開始点(＋１)から２０～３０塩基対上流にあって、正確な位置からＲＮＡポリメラーゼに転写を開始させる機能を担っているＴＡＴＡボックスまたはＴＡＴＡボックス類似の領域の配列をいう。乳酸菌由来のプロモーターとしては、ラクトコッカス・ラクチスＭＧ１６１４、ラクトコッカス・クレモリスＷｇ２、ストレプトコッカス・サーモフィラスＡ０５４のゲノム由来の構成的発現プロモーター、ラクトコッカス・ラクチスＮＩＺＯＲ５由来ｎｉｓＡ誘導発現プロモーターなどが挙げられる。また、選択マーカーとしては、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などを用いることができる。

本発明のオレンジ色乳酸菌は、上記遺伝子１を挿入した組換えベクターを乳酸菌に導入することにより得られる。組換えベクターを乳酸菌に導入する方法としては、公知の方法、例えば、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、菌のコンピテンスを利用した方法、接合伝達（コンジュゲーション）法等により行うことができるが、エレクトロポレーション法が好ましい。組換えベクターを導入した乳酸菌は、酸素介在条件下で培養する。本発明における酸素介在条件下とは、好気培養のほか、好気培養とみられない静置培養でも、培地に微量の酸素が含まれている(微好気)場合や、過酸化水素等の分解により酸素供給源となる物質を放出する微生物と共培養の場合も含むものである。これらの酸素介在条件下以外は、通常の乳酸菌培養で用いられる培養条件や培地条件に従って行えばよい。

本発明のオレンジ色乳酸菌は、培養終了後の培地を遠心分離、ろ過などの方法により集菌したもの（生菌）や、さらに凍結乾燥や加熱処理などの処理を行ったものから、抽出溶媒を使用してオレンジ色のカロテノイド色素を抽出することもできる。使用する抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、ヘキサン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。また、抽出されたカロテノイド色素の定量は、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより行うことが好ましい。

本発明のオレンジ色乳酸菌は、乳酸菌が本来有する性能に加えオレンジ色の色調を利用するために飲食品、化粧品、医薬品や医薬部外品等への添加物として使用することができる。
本発明における飲食品としては、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳飲料など飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）、加工乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、チーズ等の乳製品、パン類、麺類、菓子類、水産・畜産加工食品、豆腐等の大豆加工食品、油脂及び油脂加工食品などが挙げられる。化粧品としては、例えば、化粧水、クリーム、ゲル剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、口紅、軟膏等の皮膚に適用される皮膚外用剤とすることができる。また、医薬品または医薬部外品としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、液剤、乳剤、注射液等の製剤として使用することができる。本発明のオレンジ色乳酸菌を飲食品、化粧品、医薬品や医薬部外品に用いる場合には、それぞれの製造原料に配合してもよく、あるいは製造後の製品に配合してもよい。
さらに、本発明のオレンジ色乳酸菌をポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル等の樹脂に練り込んで、オレンジ色の色調を利用した飲食品用、化粧品用または医薬品用等の樹脂フィルムとすることも可能である。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の技術範囲はこれらにより限定されるものではない。
＜実施例１：オレンジ色乳酸菌の製造方法１ａ＞
ＪＣＭ８７３１（E.mundtii）を０．５％含有するＭ１７液体培地を、３０℃で４８時間静置培養後（嫌気培養）、菌体を遠心機で分離した。培地を除去した後、水を加えてボルテックスで撹拌し、再度遠心機で菌体を沈殿させて水を除去した。得られた菌体ペレットをそのまま、あるいは水に懸濁して放置した。
図１に、水洗浄後菌体ペレットをそのまま空気暴露した実施例（右）と、嫌気静置培養（嫌気培養）を継続した比較例（左）の菌体の写真を示す。

図１中の右に示すように、嫌気培養した乳酸菌（E.mundtii）を水で懸濁後、空気暴露することによりオレンジ色乳酸菌が得られることが明らかとなった。
一方、嫌気培養を続け、水による処理や空気暴露を行わなかった比較例の乳酸菌は、本発明のオレンジ色乳酸菌と相違することが確認された。

＜実施例２：オレンジ色乳酸菌の製造方法１ｂ＞
上記「実施例１：オレンジ色乳酸菌の製造方法１ａ」の方法に従い、乳酸菌株の種類や条件を変更し、得られるオレンジ色乳酸菌の色の変化を確認した。
試験検体ａ～ｃは漬物より分離した１６１株（E.mundtii）を、試験検体ｄ～ｆはＪＣＭ８７３１（E.mundtii）を使用し、それぞれ４８時間静置培養後（嫌気培養）、以下の条件に従い製造した。
試験検体ａ：水洗浄後、３７℃２４時間空気暴露した。
試験検体ｂ：水洗浄後、３０℃２４時間空気暴露した。
試験検体ｃ：Ｍ１７培地で洗浄後、３０℃２４時間空気暴露した。
試験検体ｄ：水洗浄後、３７℃２４時間空気暴露した。
試験検体ｅ：水洗浄後、３０℃２４時間空気暴露した。
試験検体ｆ：Ｍ１７培地で洗浄後、３０℃２４時間空気暴露した。
図２に、試験検体ａ～ｆの６菌体の写真を示す。

図２に示すように、乳酸菌は菌株の種類や製造条件により、得られるオレンジ色乳酸菌が呈するオレンジ色に変化が認められた。詳しくは、その他の条件が同じであれば１６１株（E.mundtii）の方が、ＪＣＭ８７３１（E.mundtii）に比べ、濃いオレンジ色の乳酸菌が得られることが明らかとなった。
（オレンジ色乳酸菌の色の検定）
製造方法１ｂにより得られた試験検体ａ、ｂ、ｄ、ｅの乳酸菌の色は、発明者３名それぞれが色見本（http://www.color-sample.com/)に基づき、目視による対比評価を行うことにより決定し、Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における平均値を下記に示す。
試験検体ａ：Ｌ^＊≒７８、ａ^＊≒２７、ｂ^＊≒２７
試験検体ｂ：Ｌ^＊≒８３、ａ^＊≒１５、ｂ^＊≒３６
試験検体ｄ：Ｌ^＊≒８５、ａ^＊≒ ９、ｂ^＊≒３４
試験検体ｅ：Ｌ^＊≒８１、ａ^＊≒１６、ｂ^＊≒４４
また、試験検体ｂとｃ、試験検体ｅとｆの結果より、水洗浄時に培地成分が存在すると得られるオレンジ色乳酸菌が呈する色が、薄くなる傾向にあることも確認された。

＜実施例３：オレンジ色乳酸菌の製造方法２＞
図３に、この製造方法２における遺伝子１～３を使用した発現ベクター作成の模式図を示す。詳しくは、ＮＣＢＩデータベースにあるEnterococcus mundtii QU25のゲノム情報（NC_022878）より、カロテノイド生合成経路（squalene synthase）として推定される遺伝子を３つピックアップし、配列を基にプライマーを作製した。そのプライマーを用いて、ＪＣＭ８７３１（E.mundtii）株のゲノムに対してＰＣＲを行い、プロモーターを含む推定カロテノイド遺伝子のＰＣＲ産物を得、それを乳酸菌・大腸菌シャトルベクターであるｐＲＨ１００に連結した。この時、黄色色素ジアポニューロスポレンを合成する遺伝子群ｃｒｔＮＭ (Enterococcus gilvus由来)も同時に連結した。上記ベクターに連結した遺伝子断片をシークエンサーで解析し、配列を決定した。下記配列番号１～３に示す塩基配列からなる遺伝子を、それぞれ遺伝子１（配列番号１）、遺伝子２（配列番号２）、遺伝子３（配列番号２）という。
図３に示すように、ｐＲＣＳは、ＪＣＭ８７３１由来推定カロテノイド遺伝子１を１つ含むものを、ｐＲＣＳＧは遺伝子１と遺伝子２の２つを含むもの、ｐＲＣＳＧＡは遺伝子１と遺伝子２と遺伝子３の３つを含むものを意味する。

図４に示すように、上記製造方法２により本発明のオレンジ色乳酸菌が得られることが明らかとなった。
上記「オレンジ色乳酸菌の色の検定」と同様にして、製造方法２により得られた「ｐＲＣＳ」「ｐＲＣＳＧ」「ｐＲＣＳＧＡ」由来の乳酸菌の色を検定した。Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における平均値は以下のとおりである。
「ｐＲＣＳ」：Ｌ^＊≒７３、ａ^＊≒３５、ｂ^＊≒４０
「ｐＲＣＳＧ」：Ｌ^＊≒７６、ａ^＊≒２７、ｂ^＊≒４１
「ｐＲＣＳＧＡ」：Ｌ^＊≒８８、ａ^＊≒ ５、ｂ^＊≒４３

＜実施例４：オレンジ色乳酸菌からのカロテノイド色素の抽出１＞
（１）試験検体
実施例１、２の製造方法で得られた本発明のオレンジ色乳酸菌を試験検体として使用した。
試験検体１：実施例３の「ｐＲＣ」
試験検体２：実施例３の「ｐＲＣＳ」
試験検体３：実施例３の「ｐＲＣＳＧ」
試験検体４：実施例３の「ｐＲＣＳＧＡ」
試験検体５：実施例１の空気暴露した「ＪＣＭ８７３１（E.mundtii）」
試験検体６：実施例２の試験検体ｂ
（２）カロテノイド色素の抽出
各試験検体を遠心分離後、菌体沈殿物を生理食塩水で２回洗浄した。これらの洗浄した菌体をメタノールで抽出した。色素を含むメタノール抽出物に、等量の酢酸エチルと半量の水を加えた。遠心分離（１５００ｇ、５分）後、カロテノイド色素を含む有機層を回収した。この有機層を窒素ガス下で乾燥した後、カロテノイド色素を１ｍｌの酢酸エチルに再懸濁した。この懸濁液をＴＬＣシリカゲル６０プレート（メルク（株）製）上で、ヘキサン：アセトン（容量比９：１）で展開した。図５は、この展開後のＴＬＣの写真である。
上記ＴＬＣ展開したオレンジ色スポットを回収してヘキサン：アセトン（１：１）で抽出、窒素ガスで乾燥後、メタノールに溶解して、分光光度計（ＵＶ－ＶＩＳ：バイオスペクトロメーター、エッペンドルフ社製）を用いて最大吸光度を測定した。その結果、本発明のオレンジ色乳酸菌から得られた主要なカロテノイド色素の最大吸収波長は、４６０～４８０ｎｍの範囲内であることが明らかとなった。

＜実施例５：オレンジ色乳酸菌からのカロテノイド色素の抽出２＞
（１）試験検体
実施例４の試験検体１～５を使用した。
（２）カロテノイド色素の抽出
実施例４の「カロテノイド色素の抽出」と同じ処理により得られた懸濁液をＴＬＣシリカゲル６０プレート（メルク（株）製）上で、石油エーテル：アセトン（容量比１３：７）で展開した。図６は、この展開後のＴＬＣの写真である。
上記ＴＬＣ展開したオレンジ色素のスポットを回収してヘキサン：アセトン（１：１）で抽出、窒素ガスで乾燥後、石油エーテルに溶解して、分光光度計（ＵＶ－ＶＩＳ：バイオスペクトロメーター、エッペンドルフ社製）を用いて吸光度を測定した結果、吸収波長は４４３ｎｍ、４６７ｎｍ、４９７ｎｍであった。「ｐＲＣＳ」は、黄色色素ジアポニューロスポレンを合成する遺伝子群ｃｒｔＮＭを保有することから、ＴＬＣ上のオレンジ色素はジアポニューロスポレナールであると考えられる（参考：Journal of Bacteriology, 1981, 900-913. Table2）。
一方、黄色色素１、２は、それぞれジアポニューロスポレンと吸収スペクトルが類似している。さらに、「ｐＲＣＳＧ」はGlycosyltransferaseをコードする遺伝子を、「ｐＲＣＳＧＡ」はGlycosyltransferaseにacyltransferaseをコードする遺伝子を有しており、公知技術（参考：Arch Microbiol, 2003, 179, 95-100. Fig.2）を考慮すると、黄色色素２はジアポニューロスポレングリコシドであり、黄色色素１はジアポニューロスポレングリコシド、アシルエステルであると考えられる。
これらの黄色色素１、２は、上記酵素をコードする遺伝子を有する乳酸菌を、好気培養することにより生産されることも、今回新たに確認された。

次いで、上記の回収したオレンジ色素、黄色色素１、２について、LC-MSMSを用いて分子イオンピーク（m/z）解析を行った。オレンジ色素、黄色色素２、黄色色素１の解析チャート図を、それぞれ図７、８、９に示す。
装置：4000QTRAP LC/MS/MS system (Heated Nebulizer (APCI))
カラム：Zorbax XDBC18 2x150 mm
溶媒：acetonitrile/methanol/isopropyl alcohol=80:15:5（容量比）
＜オレンジ色素について＞
図７の解析チャート図における、４１７．３（m/z）のピークは、公知技術（参考：J. BIOL. CHEM., 2012, 287, 21575-21583, Table2）を考慮すると、下記化学式で表される4,4'-Diaponeurosporen-4-alであると考えられる。

また、図７の解析チャート図から、公知技術（参考：Arch Microbiol., 2003, 179,95-100）を考慮すると、下記化学式で表される4-Hydroxy-4,4'-diaponeurosporeneの存在も示唆された。

＜黄色色素２について＞
図８の解析チャート図における、５８１．５（m/z）のピークは、下記化学式で表される4-(D-Glucopyranosyloxy)-4,4'-diaponeurosporeneであると考えられる。

図８の解析チャート図における、６３７．４（m/z）のピークについては、化学構造を特定することはできなかった。
＜黄色色素１について＞
図９の解析チャート図における、８３４．６（m/z）のピークは、Hexadecanoyl-glucosyl-4,4-diaponeurosporenoic acidと推定される。これは、Acyltransferaseによって、上記化学式で表される4-(D-Glucopyranosyloxy)-4,4'-diaponeurosporeneに、脂肪酸(Hexadecane)が付加した化合物であると考えられる。公知技術（参考：Arch Microbiol., 2003, 179,95-100）を考慮すると、CH₂が１つ外れた820m/zとされる化合物も存在すると考えられる。ピークには観察されないが、公知技術（参考：J. BIOL. CHEM., 2012, 287, 21575-21583, Fig. 7）を考慮すると、異なる脂肪酸が付加された化合物が複数種存在すると予想される。

以上のことから、図４において「ｐＲＣＳ」「ｐＲＣＳＧ」「ｐＲＣＳＧＡ」の順で、菌体の色がオレンジ色から黄色に近くなっていくのは、オレンジ色素にGlycosyltransferaseで糖が付加されて黄色になり（OH-diaponeurosporene glucoside）、さらにAcyltransferaseによってアシル基が付加されて黄色になるためと、考えられる。
以上のとおり、本発明のオレンジ色乳酸菌は、これら複数のカロテノイドを含む乳酸菌である。

本発明の乳酸菌は、Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における特定のオレンジ色を呈する乳酸菌である。特定のオレンジ色を呈する乳酸菌はこれまで知られておらず、乳酸菌の種類を問わず簡単な処理により得ることができる。また、本発明の乳酸菌は、飲食品、化粧品、医薬品及び医薬部外品等に対して、安全性の高い天然食用色素として使用することもできる。

Claims

Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における、色相ａ^＊が４≦ａ^＊、及び、色相ｂ^＊が２７≦ｂ^＊であるオレンジ色乳酸菌の製造方法であって、
配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子とｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子を含む組み換えベクターを導入した乳酸菌を、酸素介在条件下で培養することを特徴とする乳酸菌の製造方法。
配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子とｃｒｔＭ遺伝子、ｃｒｔＮ遺伝子を含む組み換えベクターを導入した
Ｌ^＊ａ^＊ｂ^＊表色系における、色相ａ^＊が４≦ａ^＊、及び、色相ｂ^＊が２７≦ｂ^＊であるオレンジ色乳酸菌。
請求項２記載の乳酸菌を含有する飲食品。
請求項２記載の乳酸菌を含有する化粧品。
請求項２記載の乳酸菌を含有する医薬品または医薬部外品。