CN108546664A - 一株枯草芽孢杆菌yl13及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌YL13及其应用。本发明的菌株YL13是首次通过诱变得到的广谱性的拮抗植物病害的菌株，在抑制油茶炭疽病菌、油茶根腐病菌、油茶软腐病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌、番茄早疫病菌、梭孢菌、水稻纹枯病菌上的效果显著，还能进一步促进植物的生长，相关抗菌剂的制备方法简单、成本低、环保、无污染，效果突出，具有很好的应用前景。

Description

一株枯草芽孢杆菌YL13及其应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，涉及一株枯草芽孢杆菌YL13及其拮抗病害和/或促植物生长方面的应用。

背景技术

目前林木病害的控制仍采用以化学防治的方式为主，这种方法不仅导致土壤、大气、水体等生态环境的污染，造成林副产品的农药残留，而且也误杀天敌导致生态平衡的破坏；长期应用农药还造成有害生物的抗性增强；同时化学农药效果的持续性也存在着一定的局限性。因此，寻找一种经济、安全、有效的防治措施是当务之急。生物防治以其安全、高效及无污染等特点已经成为植物病害防治的重要途径，其中拮抗细菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用。有些细菌不仅能防治病害，而且还可以促进植物生长，增加作物产量。

从自然界分离筛选获得对病害具有拮抗作用的生防菌株具有重要意义。但目前相关的技术还很薄弱，筛选的菌株功能比较单一。例如：申请号为200910042461.4的发明中公开了一种高效防治油茶炭疽病的枯草芽孢杆菌Y13，但该菌株的防治效果还有待进一步提高，而且该菌株仅对油茶炭疽病有一定的防治效果，对其他类型的炭疽病，如降香黄檀、檀香炭疽病菌的抑制作用并不显著，大大限制了该菌株的使用范围。目前报道的大部分生防菌株只能针对个别种类或者少数种类的病菌具有防治效果，很少有广谱性的生防菌株出现。如果能够找到一种广谱性的对多种类型病菌均有显著防治作用的新菌株，并据此研发相关的制剂，促进植物生长将有重大意义。

发明内容

本发明的首要目的是针对现有技术的空白，提供一种广谱性的高效防治植物病害的菌株枯草芽孢杆菌YL13，保藏号为CCTCC NO:M 2018008。

本发明的次要目的是提供如下几方面的应用：

所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于抑制油茶炭疽病菌、油茶根腐病菌、油茶软腐病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌、番茄早疫病菌、梭孢菌、水稻纹枯病菌中的一种或多种。

所述的枯草芽孢杆菌YL13尤其应用于抑制油茶炭疽病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌中的一种或多种。

所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于抑制或致畸炭疽病病菌菌丝。

所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于抑制炭疽病病菌分生孢子的萌发。

所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于制备拮抗油茶炭疽病菌、油茶根腐病菌、油茶软腐病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌、番茄早疫病菌、梭孢菌、水稻纹枯病菌中的一种或多种的制剂。

所述的枯草芽孢杆菌YL13尤其应用于制备拮抗油茶炭疽病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌中的一种或多种的制剂。

所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于促进植物的生长。

所述的植物包括：油茶、降香黄檀、檀香、番茄、芒果、水稻。

本发明的新菌株YL13培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH7.0—7.4。

本发明的研发思路是为了解决炭疽病害化学防治存在的缺点和不足，在已有的生防菌株枯草芽孢杆菌Y13基础上进行诱变，期望得到功能进一步强化的新菌株，从而得到经济、安全、有效的防治措施，进而促进植物生长。

(1)采用紫外线对保藏编号为CCTCC NO.M 208264的枯草芽孢杆菌Y13进行诱变，以降香黄檀炭疽菌为病原菌，筛选获得最佳诱变菌株Uv-8，抑菌率在80.75％以上；采用紫外线-亚硝基胍复合诱变，筛选获得最佳诱变菌株NTG1-8，抑菌率达86.47％，较原始菌株Y13提高12.79％，将其重命名为YL13。对诱变YL13进行抗菌谱测定，结果显示该诱变株能够有效抑制油茶炭疽病、油茶根腐病、降香黄檀炭疽病、檀香炭疽病、番茄早疫病菌、梭孢菌、水稻纹枯病菌等多种植物病原菌，且抑菌率菌均在80％以上，相较而言，枯草芽孢杆菌Y13则只对油茶炭疽病有显著的防治作用。

(2)采用单因素试验及响应面分析的方法，分析了诱变株YL13发酵培养过程中的基础培养基、C\N源，最适pH值、接种量、培养温度、摇床转速及培养时间等因素对其生长量的影响，获得了菌株YL13的最佳发酵培养基及培养条件；获得菌株YL13的最佳基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，最佳碳源是牛肉膏，最佳氮源是蛋白胨，最适pH7.0—7.4，最佳接种量是6％，最适培养温度是30℃，最佳摇床转速为170r/min，最适培养时间是36h；通过响应面分析设计实验，确定了YL13最佳培养基配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，pH7.0—7.4。

最佳接种量确定：在最佳培养基中按3％、4％、5％、6％、7％、8％的接种量接入种子液，发酵36h后测定OD₆₀₀值。结果见图5。

最适培养温度的筛选：将YL13菌种接种至最佳培养液中后，置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃下，振荡培养36h后测定OD₆₀₀值。结果见图6。

最佳摇床转速的筛选：种子培养基中接入适量的种子液之后，将三角瓶置于130r/min、150r/min、170r/min、190r/min、210r/min、230r/min的摇床转速下振荡培养，发酵36h后测定OD₆₀₀值。结果见图7。

最佳培养时间的筛选：将种子液接种至最优培养液后，在最佳培养条件下培养6h、12h、24h、36h、48h、60h后测定OD₆₀₀值。结果见图8。

(3)研制了诱变株YL13的新型水分散粒剂，同时研究新型水分散剂的货架期及林间防效，该剂型在林间应用时能以极少量达到最佳效果。确定诱变株新型水分散粒剂配方为：皂土与1.0×10¹⁰--1.0×10¹¹cfu/mL菌株发酵液按6:1—8:1的料液质量比混合，添加4-6％木质素磺酸钠、2-3％萘磺酸甲醛缩合物钠盐、3-5％丁基萘磺酸钠、3-5％硫酸铵、以及18-22％的水。此菌剂能够在常温环境下密封贮存12个月以上。对YL13新型水分散粒剂进行毒性测试，说明YL13菌剂属于安全无污染的生物菌剂。将其应用于实验林，林间防治效果达80％以上，能与化学药剂百菌灵等相媲美。

本发明的菌株YL13是首次通过诱变得到的广谱性的拮抗植物病害的拮抗菌株。其在抑制油茶炭疽病菌、油茶根腐病菌、油茶软腐病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌、番茄早疫病菌、梭孢菌、水稻纹枯病菌上的效果显著，还能进一步促进植物的生长，相关抗菌剂的制备方法简单、成本低、环保、无污染，效果突出，具有很好的应用前景。

本发明菌株Y13保藏信息：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

命名：Bacillus subtilis YL13

编号：CCTCC NO:M 2018008

时间：2018年1月4日

地点：中国，武汉，武汉大学。

附图说明

图1紫外线诱变初筛平板对峙实验结果；

图2为复合诱变初筛平板对峙实验结果；

图3为枯草芽孢杆菌YL13致畸炭疽病病菌菌丝的实验结果；

图4为枯草芽孢杆菌YL13抑制炭疽病病菌分生孢子的萌发的实验结果；

图5为枯草芽孢杆菌YL13发酵培养时的最佳接种量；

图6为枯草芽孢杆菌YL13发酵培养时的最适培养温度；

图7为枯草芽孢杆菌YL13发酵培养时的最佳转速；

图8为枯草芽孢杆菌YL13发酵培养时的最佳培养时间；

图9为新型水分散粒剂的润湿剂添加比例筛选试验结果；

图10为新型水分散粒剂的崩解剂添加比例筛选试验结果；

图11为新型水分散粒剂的水分添加比例筛选试验结果；

图12为枯草芽孢杆菌YL13应用于促进植物生长的实验结果。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1，本发明菌株YL13的获得过程

采用紫外线对保藏编号为CCTCC NO:M 208264的枯草芽孢杆菌Y13进行诱变，以降香黄檀炭疽菌为病原菌，筛选获得最佳诱变菌株Uv-8，抑菌率在80.75％以上；采用紫外线-亚硝基胍复合诱变，筛选获得最佳诱变菌株NTG1-8，抑菌率达86.47％，较原始菌株Y13提高12.79％，将其重命名为YL13。

抑菌率即防治效果

表1紫外线诱变摇瓶复筛结果

表2复合诱变复筛结果

实施例2：诱变菌株YL13与出发菌株Y13的抑菌作用对比

表3诱变菌株Y13对植物病原真菌的抑制作用

表4诱变菌株YL13对植物病原真菌的抑制作用

实施例3：本发明生防菌剂的制备

表5中载体、助剂具体是采用平板计数法测试它们对YL13生长的影响的。

表5不同载体及助剂对YL13生长的影响

原药：YL13发酵液

(1)初始剂型的制备：将筛选获得的最佳载体皂土与原药(菌体浓度8.0×10¹⁰cfu/mL)按7:1的料液质量比混合均匀，置于50±1℃烘箱中干燥，碾碎成粉。

(2)润湿剂的筛选：润湿性是衡量水分散粒剂优劣的重要指标之一，由于丁基萘磺酸钠相较于茶枯粉对YL13的抑制稍强，但其润湿时间更短，因此优选丁基萘磺酸钠。采用步骤(1)配制成的母粉，将供试润湿剂以2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％的用量与母粉混合(4％与6％用量它们的润湿时间相差不大，4％的成本更低)，造粒制成样品后测定其润湿性。

润湿性测试方法：刻度量筒法。向500mL刻度量筒中添加500mL的342mg/mL的标准硬水；迅速加入1.0g样品，静置；秒表计时，记录99％的样品沉入量筒底部的时间。润湿时间<50s为优级(++)，50-100s为良级(+)，>100s为劣级(-)。

由图9可知，随着用量的增加润湿时间不断减少，当用量在4％的时候，润湿时间的下降开始趋于平缓，其后随着润湿剂用量增加，润湿时间减少不明显，说明当用量为4％时菌剂已经拥有较好的润湿性，此时润湿时间为81.67s。因此将用量确定为4％。

(3)分散剂的筛选：选择分散性良好的分散剂能够保证水分散粒剂在水中顺利散开。采用步骤(1)配制成的母粉，添加3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％比例的供试分散剂木质素磺酸钠，造粒制成样品后测定其分散性、悬浮性。

分散性测试方法：量筒混合法。向100mL量筒中添加99mL去离子水；迅速加入1.0g样品；以2s/次的速度颠倒量筒10次，记录30min、60min时量筒底部沉淀物；1h后再次颠倒量筒10次，静置24h；24h后颠倒量筒若干次，记录直至沉淀物全部分散时所颠倒的次数；颠倒次数<10计合格。

悬浮性测试方法：向盛有50mL(30+1)℃标准硬水de 200mL烧杯中缓慢添加1.0g样品；手轻摇烧杯以120次/min作圆周运动，转动2min后放入(30±1)℃恒温水浴锅中5min；再用(30±1)℃的标准硬水将悬浮液全部洗入250mL量筒中，定容至刻度后盖上盖子；以30次/min的速度颠倒量筒后打开塞子，放置于水浴锅中静置30min，用刻度尺测量底部沉积物厚度；厚度<5mm为优级(++)，506mm为良级(+),>6mm为劣级(-)。

表6分散剂的筛选结果

分析表10可知崩解时间随着用量的增加逐渐降低，当用量超过5％以后，下降速度减缓。同时在用量达到5％时，有较好的分散性及悬浮性。因此分散剂的用量选择宜为5％。

(4)崩解剂的筛选：崩解剂硫酸铵的添加是为了提高水分散粒剂的分散性，这是由于崩解剂通常具有较好的吸水性，吸水迅速膨胀，将菌剂分散成小碎片，提高菌剂的分散效果。采用步骤(1)配制成的母粉，添加2％、3％、4％、5％、6％比例的供试崩解剂，造粒制成样品后测定其崩解性。

崩解性测试方法：在25℃温度条件下，将0.5g样品添加至盛有90mL蒸馏水的100mL量筒中；以8r/min的速度围绕量筒中部转动，直至样品全部崩解；记录时间。

由图10可知，当硫酸铵的用量在3％时，崩解时间出现明显转折，之后随着用量的增加，崩解时间降低不明显，因此将硫酸铵的用量定在3％较好。

(5)粘结剂的筛选：粘结剂萘磺酸甲醛缩合物钠盐主要应用在造粒过程中，不仅产生粘结作用，还能对药效产生影响。采用步骤(1)配制成的母粉，添加1％、2％、3％、4％、5％比例的供试粘结剂，造粒制成样品后测定其成粒率、颗粒强度。

表7粘结剂的筛选结果

如表7所示，粘结剂对粒剂成粒作用至关重要，筛选的粘结剂萘磺酸甲醛缩合物钠盐在水中崩解时间较短，又具有良好的粘结作用，当用量在2-3％时，崩解时间较理想，且3％时成粒软硬适中，因此确定其用量在3％。

(6)加水量筛选：进行加水造粒时，采用步骤(1)配制成的母粉，添加10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、28％比例的蒸馏水，造粒制成样品后测定其成粒率。

成粒率测定方法：新型水分散粒剂成粒标准为粒径在30-60目之间。成粒率见公式。

成粒率(％)＝(成粒样品质量/样品总质量)×100％ (公式)

在造粒过程中，加水量决定了粒剂是能成粒。加水量确定结果如图所示。由图11中可知，随着水量的不断增加成粒率不断提高的。且在加水量18％时趋于平稳，后期再加入一定量的水，成粒率不再提高。而在18％之前，成粒率较低，造成物料严重浪费。而加水量在18％-24％这段期间，虽然成粒率一直保持在80％以上，但并没有较大幅度的提升，而加水量过高会导致颗粒粘度增加，在制造过程中容易粘结外界物质，造成污染，颗粒之间也会相互粘结，难以分离。因此，加水量控制在18％-22％之间为最佳。

表8YL13新型水分散粒剂抑菌活性和活菌数与时间的关系

初步确定了新型水分散粒剂的配方为：皂土与1.0×10¹⁰--1.0×10¹¹cfu/mL菌株发酵液按6:1-8:1的料液质量比混合，添加4-6％木质素磺酸钠、2-3％萘磺酸甲醛缩合物钠盐、3-5％丁基萘磺酸钠、3-5％硫酸铵、以及18-22％的水。

进一步确定最优配方为：皂土与8.0×10¹⁰cfu/mL菌株发酵液按7:1的料液质量比混合，添加5％木质素磺酸钠、3％萘磺酸甲醛缩合物钠盐、4％丁基萘磺酸钠、3％硫酸铵、以及18-22％的水。

对该菌剂抑菌活性及货架期进行了研究，结果表明YL13新型水分散粒剂能够贮存在常温环境中，密封贮存时间在12个月以上。对YL13新型水分散粒剂进行毒性测试，说明YL13菌剂属于安全无污染的生物菌剂。对林间防治效果进行了测定，结果表明，YL13菌剂对油茶炭疽病有良好的防治效果，于发病初期在林间进行菌剂施用能够起到预防作用。

保质期

产品在常温下密封保存，保质期一年。

实施例4：本发明生防菌剂的小试使用试验：

(1)施药对象：攸县天华油茶基地幼林地。

(2)施药方式：实验采用喷洒植株叶面+灌根的方式进行药物施用，喷洒以喷施叶面为度，灌根幼林每棵100mL，以10d为周期施用菌剂，共施用4次。

(3)选择适宜的样地进行标准地设置，每块标准地面积为6m²(2×(1.5+1.5))，共6株油茶，标准地之间设置保护行，共需标准地15个，植株共15×6＝90株；设置好标准地后进行标记编号，注明标地号、施药种类、施药浓度、施药次数及时间。

(4)实验处理设计

处理一(CK)：清水；

处理二：100倍菌剂稀释液，即用100千克水和1000克菌剂产品制成稀释剂；

处理三：500倍菌剂稀释液，即用100千克水和200克菌剂产品制成稀释剂；

处理四：1000倍菌剂稀释液，即用100千克水和100克菌剂产品制成稀释剂；

处理五：75％的多菌灵500倍稀释液，即用100千克水和200克75％的多菌灵产品制成稀释剂。

产品的使用方法

表9新型水分散粒剂对油茶炭疽病的防治效果

表10新型水分散粒剂对降香黄檀炭疽病的防治效果

表11新型水分散粒剂对檀香炭疽病的防治效果

由上述结果可知：100倍稀释效果最好，但成本较高；500倍稀释防治效果不够理想；为达到防治效果和节约成本，故稀释200倍比较合适。具体是在油茶苗木期时用100千克水和500克菌剂产品制成稀释剂，按每亩20--30公斤稀释剂用量，将稀释剂喷洒植株叶面和灌根处理即可。

表12

Claims (9)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YL13，保藏号为CCTCC NO:M 2018008。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于抑制油茶炭疽病菌、油茶根腐病菌、油茶软腐病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌、番茄早疫病菌、梭孢菌、水稻纹枯病菌中的一种或多种。

3.权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于抑制油茶炭疽病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌中的一种或多种。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于抑制或致畸炭疽病病菌菌丝。

5.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于抑制炭疽病病菌分生孢子的萌发。

6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于制备拮抗油茶炭疽病菌、油茶根腐病菌、油茶软腐病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌、番茄早疫病菌、梭孢菌、水稻纹枯病菌中的一种或多种的制剂。

7.权利要求6所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于制备拮抗油茶炭疽病菌、降香黄檀炭疽病菌、檀香炭疽病菌中的一种或多种的制剂。

8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YL13应用于促进植物的生长。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的植物包括：油茶、降香黄檀、檀香、番茄、芒果、水稻。