CN108998395A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明一方面提供了一株新的解淀粉芽孢杆菌，另一方面提供了该解淀粉芽孢杆菌作为杀菌剂的应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）hzq1601及其菌剂不仅能够防治植物病原细菌引起的植物病害，而且能够防止植物病原真菌引起的植物病害，抑菌效果好，防效高，克服了化学杀菌剂容易产生抗性的弊端。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

植物病原菌（包括真菌、细菌、病毒等）引起的植物病害给农业生产造成了重大的经济损失。目前对植物病害的防治主要是使用化学农药（杀菌剂），化学农药虽在农产品的安全生产中作出了巨大贡献，而杀菌剂多是单作用位点的内吸性药剂，长期使用产生了一系列问题，如病原菌产生抗药性、农产品农药残留超标，农田生态环境污染等问题。这些问题增加了农田生产成本，同时也使本身具有优良品质的农产品因农药的过度使用而受影响。新的防治技术和病害防治手段成为植保科技工作者探索的方向。

植物周围不仅存在病原菌，而且还存在着大量的非病原菌，其中有的还是病原菌的拮抗微生物。这些拮抗微生物可通过与病原菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原菌，达到防治植物病害的目的。同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药性，有些还具有促进植物生长的作用，且实际生产工艺简单。此外，拮抗微生物对环境安全，不像化学农药那样造成环境污染以及对人畜的毒害，因此，利用拮抗微生物来防治植物病害的研究日益受到国内外的重视。目前，人们已经分离到多种对植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些己经进入实际应用阶段，产生了相当的社会效益和经济效益。

解淀粉芽孢杆菌能产生低分子量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性物质，抑制植物病原菌的生长或直接杀灭病原物，通过营养和空间的竞争抑制病原菌的生长繁殖，或诱导植物体内防御机能，从而抑制病害的发生，具有抗病抑菌、抗逆防衰、改良土壤、降低农残等多种作用，具有广泛的工业应用前景。关于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）在防治植物病害方面屡有报道，Ng等(2012)将解淀粉芽孢杆菌UPMS3和多种微生物混配的微生物菌肥，田间使用后显著提高了对穗瘟和叶瘟的生防效果，可以减少31％的水稻产量损失，对分蘖数、叶面积和株高的促生作用显著提高。李双东等(2015)报道解淀粉芽孢杆菌RL263发酵液对水稻叶瘟的防效最高可达到70％以上，能够显著提高水稻产量。

已经发现，解淀粉芽孢杆菌对植物病原菌具有广谱抑菌性，但其抑菌的有效性仍具有极强的特异性，针对不同的病原菌需要筛选出特异的生防菌株才能达到最佳抑菌效果。目前，对于同时防治由水稻基腐病菌、水稻白叶枯病菌、甘薯茎腐病菌、番茄青枯病菌和黄瓜角斑病菌引起的植物病害以及水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄白腐病菌和葡萄炭疽病菌引起的植物病害的解淀粉芽孢杆菌未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种解淀粉芽孢杆菌及其应用的技术方案。

所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）hzq1601，其 保 藏 号为 GDMCC NO:60355。

所述的解淀粉芽孢杆菌在制备植物杀菌剂的应用。

所述的植物杀菌剂，其特征在于由权利要求1 所述的解淀粉芽孢杆菌制备得到。

所述的植物杀菌剂，其特征在于包括解淀粉芽孢杆菌的菌体和代谢产物中的至少一种。

所述的植物杀菌剂用于防治由植物病原细菌引起的植物病害，所述的植物病原细菌为水稻基腐病菌、水稻白叶枯病菌、甘薯茎腐病菌、番茄青枯病菌和黄瓜角斑病菌。

所述的植物杀菌剂用于防治由植物病原真菌引起的植物病害，所述的植物病原真菌为水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄白腐病菌和葡萄炭疽病菌。

本发明中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）hzq1601已保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院 59号楼5楼广东省微生物研究所，邮政编码： 510075) ，保藏号为GDMCC NO:60355，保藏时间为：2018年4月16日，分类命名为 Bacillus amyloliquefaciens。

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）hzq1601及其菌剂不仅能够防治植物病原细菌引起的植物病害，而且能够防止植物病原真菌引起的植物病害，抑菌效果好，防效高，克服了化学杀菌剂容易产生抗性的弊端。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌hzq1601菌落示意图；

图2为解淀粉芽孢杆菌hzq1601对番茄青枯病菌的抑制效果图；

图3为解淀粉芽孢杆菌hzq1601对甘薯茎腐病菌的抑制效果图；

图4为解淀粉芽孢杆菌hzq1601对水稻白叶枯病菌的抑制效果图；

图5为解淀粉芽孢杆菌hzq1601对水稻基腐病菌的抑制效果图；

图6为解淀粉芽孢杆菌hzq1601对小麦赤霉病菌的抑制效果图；

图7为解淀粉芽孢杆菌hzq1601对葡萄灰霉病菌的抑制效果图；

图8为解淀粉芽孢杆菌hzq1601对葡萄白腐病菌的抑制效果图。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：解淀粉芽孢杆菌hzq1601的筛选

样品采集：采集样品为水稻品种（甬优12）根围土壤，地点为浙江省农业科学院温室育苗地。连同水稻根系一同拔出，带回实验室分离。

解淀粉芽孢杆菌分离：称取1g根围土壤，放入100mL无菌水中常温振荡混匀1个小时，用无菌水按照10、10²、10³梯度稀释，用微量移液器取梯度稀释液100ul用均匀在LB固体培养基平板，28℃培养箱培养24h后，接种针挑取单菌落在LB固体平板上用接种环划线培养后，得到纯化后的细菌单菌落，将单菌落用NA液体培养基28℃，200r/min振荡培养24小时后保存在50%甘油中，于-80℃超低温冰箱中保存备用。

LB液体培养基：yeast extract 5g，tryptone 10g，NaCl5g，水1000ml，ph7.2，121℃灭菌15min。LB固体培养基：在液体培养基基础上加入15g琼脂粉。NA液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH 7.2，121℃灭菌15min。NA固体培养基：在液体培养基基础上加入15g琼脂粉。PDA培养基：马铃薯200g，加水1000ml，煮沸后继续煮30min，双层纱布过滤除去固体物质，加水至1000ml，加15g琼脂粉分装灭菌（121℃，15min）。

筛选：将备用的纯化菌株接种在预先混有水稻基腐病菌（DZ1601）（由浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所粮食作物病害研究室分离并保存，下同）的LB培养基平板上，采用菌落对峙法，根据抑菌圈的大小逐一筛选（即：优先选取抑菌圈最大的菌落），即得解淀粉芽孢杆菌hzq1601。

上述筛选方法为本领域常规方法。

实施例2：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）hzq1601的鉴定

如图1所示，对实施例1筛选得到的解淀粉芽孢杆菌hzq1601在LB培养基上呈灰白色，不透明，表面干燥皱缩，边缘不规则，具有较强的粘附性和流动性，革兰氏染色阳性，周生鞭毛，有芽孢，呈杆状；该菌株既能在培养基表面生长又能沿着穿刺线生长，为兼性厌氧型细菌；能产生过氧化氢酶和淀粉水解酶，分解明胶和蛋白胨得色氨酸，但不能分解含硫的有机化合物；可还原培养基中的硝酸盐离子。

根据对该解淀粉芽孢杆菌hzq1601的形态观察并结合生理生化特征，初步认定该解淀粉芽孢杆菌hzq1601为芽孢杆菌。

解淀粉芽孢杆菌hzq1601菌株分子鉴定：提取解淀粉芽孢杆菌hzq1601的总DNA，将所提取的样品基因组DNA作为模板进行PCR扩增，采用细菌通用引物对由上海生物工程有限公司合成：正向引物序列27F 5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物序列1492R 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。 经PCR反应扩增得到的片段经回收纯化后由上海生物工程有限公司进行测序，测得序列提交到NCBI进行序列比对，通过比对发现，解淀粉芽孢杆菌hzq1601的16SrDNA序列（SEQ ID No.1所示）与数据库中已有的解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)的16SrDNA序列同源性均高达100％。结合形态特征，将解淀粉芽孢杆菌hzq1601定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

同时，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (简称GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院 59号楼5楼广东省微生物研究所，邮政编码： 510075) ，保藏号为GDMCCNO:60355，保藏时间为：2018年4月16日，分类命名为 Bacillus amyloliquefaciens。

实施例3：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）hzq1601抑菌剂的制备

首先，配制NA培养基斜面，接种实施例1所得的解淀粉芽孢杆菌hzq1601，放入28℃培养箱培养48小时；其次，配置NA液体培养基，灭菌前分装三角瓶(250mL，装100mL 液)，121℃灭菌15min，冷却后在超净工作台上，用无菌水直接洗下上述斜面菌体，接入上述装有灭菌后的NA液体培养基的三角瓶中，摇瓶培养，pH 7.2，28℃，200r/min，培养48h，得摇瓶培养菌，所得的发酵液即为解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂。

实施例4：多种植物病原细菌的平板抑制作用试验

将实施例3所配制的解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂用无菌水按照10²、10³、10⁴梯度稀释将NA培养基加热熔化，待冷却至45℃时分别加入水稻细菌性基腐病菌、水稻白叶枯病菌、番薯茎腐病菌、番茄青枯病菌、黄瓜角斑病菌的NA液体培养基发酵培养液至终浓度为1×10⁷CFU/mL。随后倒入直径为9cm的培养皿，待NA培养基完全凝固后，取直径为0.6cm的圆形无菌滤纸片浸入上述稀释好的解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂，待菌液均匀布展后沥干，等距离放置平贴于含有菌液的平板表面，以清水为对照CK，静置于28℃恒温培养箱中，培养24h后十字交叉法测量抑菌圈直径。结果表明，应用实施例3制备的解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂对上述5种病原菌均有很明显的抑制作用，其抑制效果见下表和图2-5所示。

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实施例5：多种植物病原真菌的抑制作用试验

采用平板对峙法测试应用实施例3所得的解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄白腐病菌等病原真菌的拮抗效果。将实施例3所得解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂100℃煮沸30min后，与45℃PDA培养基按1：300的比例混合均匀后倒平板，以不加菌液为对照，在PDA平板中央接入直径为0.5cm的靶标菌丝块，28℃黑暗培养待对照菌落长至直径6cm时，测量并记录靶标菌落直径，计算抑菌效果。

结果表明，应用实施例3制备的解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂抑菌谱广，对上述7种病原真菌均有很明显的抑制作用，其抑制效果见下表和图6-8所示。

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实施例6：黄瓜角斑病的田间防治测试

选择黄瓜角斑病常年发病的地块，于移栽后25-30d施用解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂500倍稀释液，施药方式为叶面喷雾，施药量为25mL/株，以72%农用硫酸链霉素80g/667m²为药剂对照，设置清水处理为空白对照。每小区植株为20株，小区随机排列，3 次重复，大田常规栽培管理。于黄瓜角斑病发病盛期调查所有处理黄瓜植株的发病情况，统计发病率和病情指数，以此计算实施例二所得的解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂对黄瓜角斑病的田间相对防治效果。

分级标准：0级，全叶无病；1级，有很少病斑，占叶面积1/5以下；2级，少数病斑，占叶面积的1/5-1/3；3级，许多病斑，占叶面积1/3-2/3；4级，许多中等大小病斑，占叶面积2/3以上，细菌溢量中度；5级，全叶发病，细菌溢量多，部分病斑干枯，形成穿孔。结果表明：解淀粉芽孢杆菌hzq1601抑菌剂与72%农用硫酸链霉素的相对防效分别为88.2%，67.3%。其试验统计数据见下表：

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实施例7：水稻稻瘟病的室内防治测试

解淀粉芽孢杆菌S170菌株在温室盆栽条件下的生防效果：挑选健康水稻品种Co39，1％次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗3次，28℃人工气候箱催芽，待芽长到1cm时播种于塑料育苗穴盘（6cm×6cm×高5.5cm），每穴10-15粒种子。种植21d后喷施待测芽孢杆菌发酵液，芽孢浓度为1×108CFU/mL，每4穴喷施15mL，以三环唑作为对照药剂，清水处理作为对照。24h后接种稻瘟病菌孢子悬浮液，孢子浓度为1×10⁶CFU/mL。7d后调查叶瘟发生情况，计算病情指数和防效。结果见下表：

防效计算公式

。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1423

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

actgcagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt 60

aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg 120

gatggttgtc tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac cacttacaga 180

tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360

tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat 420

agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480

cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg 540

gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg 600

gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 660

gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct gaggagcgaa 720

agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780

aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg 840

ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900

gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca 960

atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020

agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt 1080

gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140

atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga 1200

acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct cagttcggat 1260

cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320

gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac 1380

acccgaagtc ggtgaggtaa cctttatgga gccagccgcc gaa 1423

Claims (6)

1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）hzq1601，其 保 藏 号 为 GDMCCNO:60355。

2.如权利要求1 所述的解淀粉芽孢杆菌在制备植物杀菌剂的应用。

3.植物杀菌剂，其特征在于由权利要求1 所述的解淀粉芽孢杆菌制备得到。

4.如权利要求3 所述的植物杀菌剂，其特征在于包括解淀粉芽孢杆菌的菌体和代谢产物中的至少一种。

5.如权利要求3 或4 所述的植物杀菌剂用于防治由植物病原细菌引起的植物病害，所述的植物病原细菌为水稻基腐病菌、水稻白叶枯病菌、甘薯茎腐病菌、番茄青枯病菌和黄瓜角斑病菌。

6.如权利要求3 或4 所述的植物杀菌剂用于防治由植物病原真菌引起的植物病害，所述的植物病原真菌为水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄溃疡病菌、葡萄白腐病菌和葡萄炭疽病菌。