CN104673845B - 利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法 - Google Patents

利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法。该方法采用黑曲霉(Aspergillus niger)进行全细胞生物转化，全细胞生物转化的营养液为含茶多酚或EGCG 1～20％的营养液；黑曲霉RAF106菌株的保藏编号为CGMCC NO.9608。全细胞生物转化的营养液的配方为：茶多酚或EGCG1～20％，磷酸氢二钾0.03～0.8％，磷酸二氢钾0.1～3％，硫酸锰0.03～0.7％，氯化钠0.3～2％，硫酸镁0.01～0.3％，酵母或麦芽提取物0.02～2％。采用该营养液进行全细胞一步转化，转化效率高，20h可完成转化，转化产物对结肠癌细胞的杀灭活性高。

Description

利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程与生物化学技术领域，特别涉及一种利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法。
背景技术
茶饮料作为一种全球流行的植物饮料，其在抗癌和心血管等疾病的保健功效已经得到公认。目前认为，儿茶素是茶叶中的主要功能活性成分，含量占茶多酚总量的60～80％，包括表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子酸(GA)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)。茶叶中EGCG含量最高，占到茶叶干重的9～13％。茶多酚具有许多重要的保健功效，有很强的抗氧化活性和清除自由基的能力、抑制肿瘤细胞生长的抗癌作用、抗菌抗病毒活性和抑制脂肪积累的减肥功效等。
普洱茶作为一种后发酵茶，通过微生物发酵，茶叶儿茶素成分通过生物转化，形成独特的品质特性和功能特性。在普洱茶发酵过程中，儿茶素含量下降，EGCG和ECG等酯型儿茶素被完全降解，但普洱茶仍然表现出较强的抗癌、抗菌和降血脂降胆固醇等保健功效，说明普洱茶品质形成过程中，儿茶素被微生物分解转化形成了新的功能性成分。事实上，喝茶后，茶多酚在消化道上段不能被分解利用，同时也很少被吸收。绝大多数茶多酚(超过90％)进入到结肠，被结肠微生物所分解后再被结肠吸收，然后进入系统循环起作用，一部分则被排出体外。因此，茶多酚的低生物可利用度与其功能特性形成悖论。如何提高茶多酚的生物可利用度近年来已成为业界关注的热点。Macedo,JAetal研究发现，采用丹宁酶转化茶多酚和EGCG后其抗氧化活性和抗癌活性均有明显的增强。茶多酚体外转化将在结肠中微生物的消化分解转移到体外进行，相当于延长的动物消化道，可大大提高茶多酚的生物可利用度。
茶多酚体外转化可选择酶转化的方式。东华大学采用米曲霉ATCC20719菌株和黑曲霉ATCC46890菌株制备表没食子酸儿茶素没食子酸酯(EGCG)水解酶对EGCG进行降解获得表没食子酸儿茶素(EGC)和没食子酸(GA)，两种菌株制备酶液发酵过程均需要48-120h，米曲霉获得的酶液需在40℃的反应体系中，处理24h完成转化，而黑曲霉获得的酶液需要在25-60℃，反应0-48h或直至水解反应结束方可停止。酶转化成本较高，需购买酶制剂或自己制备酶液，工艺复杂。为降低成本，可直接采用微生物全细胞进行生物转化，从发表的文献来看，采用黑曲霉发酵转化EGCG酶转化效率最高为发酵时间为5d。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，采用黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株进行全细胞生物转化，全细胞生物转化的营养液为含有茶多酚或EGCG质量百分含量1～20％的营养液。
所述的黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCCNO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
所述的黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株具有以下生物学特性：菌落表面平坦，边缘整齐，培养基背面呈乳白色，中间稍有乳黄色，基内菌丝发达。在25℃的察氏平板培养基上培养8d，RAF106菌落直径为51.0±1.53mm，边缘有少量白色绒毛状气生菌丝，菌落表面呈灰褐色，表面有小滴状黑色渗透液(见图2)。菌落形态不规则，表面褶皱状，培养基背面呈黑褐色。
黑曲霉RAF106菌株rDNA-ITS全长碱基序列如SEQIDNO：1所示。
所述的黑曲霉RAF106菌株应用种子培养基进行种子培养，获得黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子；
所述的种子培养基的配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。黑曲霉RAF106菌株的种子培养基也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基。
所述的种子培养的条件为：茄子瓶静置培养，培养温度28～35℃，培养时间3～5d。
在所述的种子培养过程中，黑曲霉RAF106菌株的种子菌接种量为每毫升全细胞生物转化的营养液接种102～108个黑曲霉RAF106菌株分生孢子。
所述的黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取种子培养基表面，得到黑曲霉分生孢子悬浮液。
所述的全细胞生物转化为液态转化。
所述的全细胞生物转化的营养液的配方为含有如下组分质量百分含量的水溶液：茶多酚或EGCG1～20％，磷酸氢二钾0.03～0.8％，磷酸二氢钾0.1～3％，硫酸锰0.03～0.7％，氯化钠0.3～2％，硫酸镁0.01～0.3％，酵母或麦芽提取物0.02～2％；121℃灭菌30min。
所述的全细胞生物转化的条件为：温度25～42℃，摇床转速160～220r/min，时间20～60h。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明所筛选到的黑曲霉菌株，对茶多酚的耐受性极高，采用全细胞转化茶多酚，其优势在于转化方式简单、快速，可实现茶多酚高效转化，大大提高转化率和降低转化成本，且转化后产物抗癌活性明显增强。
(2)本发明采用全细胞一步生物转化EGCG，简便高效，茶多酚转化效率高，20h即可完全转化EGCG成为EGC和GA，发酵28h其转化产物抗癌活性达到最强。EGCG可100％得到转化，成本大大降低。茶多酚通过体外生物转化，其生物活性明显提高，可有效的杀死结肠癌细胞。
附图说明
图1是实施例中黑曲霉产生酯酶对儿茶素进行生物转化的示意图；
图2是实施例中黑曲霉RAF106菌株菌落的形态图，其中：A为PDA平板中黑曲霉RAF106菌株菌落的形态图，B为察氏平板中黑曲霉RAF106菌株菌落的形态图；
图3是实施例中经黑曲霉RAF106菌株生物转化茶多酚20h时的HPLC图谱，其中左图为未转化的茶多酚的HPLC图谱，右图为经黑曲霉RAF106菌株生物转化茶多酚20h时HPLC图谱；
图4是实施例中经黑曲霉RAF106菌株生物转化茶多酚28h时的HPLC图谱，其中左图为未转化的茶多酚的HPLC图谱，右图为经黑曲霉RAF106菌株生物转化茶多酚28h时HPLC图谱；
图5是实施例中经黑曲霉RAF106菌株生物转化EGCG36h时的HPLC图谱，其中左图为未转化的EGCG的HPLC图谱，右图为经黑曲霉RAF106菌株生物转化EGCG36h时HPLC图谱；
图6是实施例中经黑曲霉RAF106菌株生物转化EGCG48h时的HPLC图谱，其中左图为未转化的EGCG的HPLC图谱，右图为经黑曲霉RAF106菌株生物转化EGCG48h时HPLC图谱；
图7为茶多酚及其生物转化产物对HT-29的细胞毒性结果图；
图8为茶多酚及其生物转化产物对HCT-116的细胞凋亡的影响结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCCNO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
黑曲霉RAF106菌株的种子培养基的配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌15min。也可使用市售的马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基。
黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度28℃，培养时间4d。
黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1×108个/mL。
全细胞生物转化的营养液配方为：茶多酚2％，磷酸氢二钾0.03％，磷酸二氢钾0.5％，氯化钠0.8％，硫酸锰0.7％，硫酸镁0.2％，麦芽提取物0.05％，121℃灭菌30min，所述的百分比为质量百分比。
全细胞生物转化的条件：温度30℃，摇床转速160r/min，时间20h。
取色谱级甲醇与三蒸水(1：1)将转化后的混合液稀释100倍后，采用0.02μm滤膜过滤，将滤液适度稀释后直接进行HPLC检测产物浓度，结果如图3所示；从图3可以看出，转化20h时，EGCG几乎被全部转化。
实施例2
黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCCNO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
黑曲霉RAF106菌株的种子培养基的配方为：市售的马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基。
黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度30℃，培养时间3d。
黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1×108个/mL。
全细胞生物转化的营养液配方为：茶多酚1.2％，磷酸氢二钾0.4％，磷酸二氢钾0.3％，氯化钠0.3％，硫酸锰0.7％，硫酸镁0.03％，酵母提取物1.2％，121℃灭菌30min，所述的百分比为质量百分比。
全细胞生物转化的条件：温度28℃，摇床转速150r/min，时间28h。
取色谱级甲醇与三蒸水(1：1)将转化后的混合液稀释100倍后，采用0.02μm滤膜过滤，将滤液适度稀释后直接进行HPLC检测产物浓度，结果如图4所示；从图4可以看出，转化28h时，EGCG已经被全部转化，EGCG生物转化产生的GA也被部分分解。
实施例3
黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCCNO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
黑曲霉RAF106菌株的种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌15min。黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度25℃，培养时间2d。
黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1×108个/mL。
全细胞生物转化的营养液配方为：EGCG5％，磷酸氢二钾0.8％，磷酸二氢钾1％，氯化钠0.6％，硫酸锰0.5％，硫酸镁0.03％，酵母提取物2％，121℃灭菌30min，所述的百分比为质量百分比。
全细胞生物转化的条件：温度37℃，摇床转速180r/min，时间36h。
取色谱级甲醇与三蒸水(1：1)将转化后混合液稀释100倍后，采用0.02μm滤膜过滤，将滤液适度稀释后直接进行HPLC检测产物浓度，结果如图5所示；从图5可以看出，转化36h时，EGCG几乎被全部转化。
实施例4
黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCCNO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号(100101)。
黑曲霉RAF106菌株的种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌15min。黑曲霉RAF106菌株的种子培养条件为：茄子瓶静置培养，培养温度25℃，培养时间5d。
黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取培养基表面，获得黑曲霉分生孢子悬浮液，并采用无菌生理盐水调节至孢子浓度为1×108个/mL。
全细胞生物转化的营养液配方为：EGCG15％，磷酸氢二钾0.2％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠1.6％，硫酸锰0.06％，硫酸镁0.3％，麦芽提取物1.6％，121℃灭菌30min，所述的百分比为质量百分比。
全细胞生物转化的条件：温度28℃，摇床转速180r/min，时间48h。
取色谱级甲醇与三蒸水(1：1)将转化后混合液稀释100倍后，采用0.02μm滤膜过滤，将滤液适度稀释后直接进行HPLC检测产物浓度，结果如图6所示；从图6可以看出，转化48h时，EGCG已经被全部转化，EGCG生物转化产生的GA也被部分分解。
实施例5
采用RPMI1640培养基继代培养HT-29细胞和HCT-116细胞，传代培养4d收集细胞计数，按照浓度350cell/ml种植于6孔板，37℃，培养24h；
吸去培养基，将样品T0(转化0h样品)，T28(转化28h样品)分别用DMSO稀释至2.5mg/ml，5mg/ml和10mg/ml三个浓度，取5mlRPMI于MTT管，每管分别加入样品5ul，振荡均匀后，按每空2ml样品液处理；并于第4、8d更换HT-29细胞的培养基和样品。HCT-116细胞培养皿则在第4d直接在倒置显微镜拍照记录。
染色：第10d吸去培养基，每孔取0.6ml结晶紫(0.2％，溶解于2％乙醇)，染色10min，然后用蒸馏水清洗4次，置通风橱风干。
扫描：将6孔板置扫描仪扫描获得图片。
结果分析：图7为茶多酚及其生物转化产物对HT-29的细胞毒性，可见，采用T0和T28处理后，HT-29细胞群落数量明显减少，T28细胞群落数量最少，说明茶多酚生物转化后，对结肠癌细胞HT-29的细胞毒性明显增强。图8为茶多酚及其生物转化产物对HCT-116的细胞凋亡的影响，茶多酚生物转化后，能显著促进结肠癌细胞HCT-116的细胞凋亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，其特征在于，采用黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株进行全细胞生物转化，全细胞生物转化的营养液为含有茶多酚或EGCG质量百分含量1～20％的营养液；
所述的黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株，保藏日期为2014年8月27日，保藏编号为CGMCCNO.9608，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，其特征在于，所述的黑曲霉(Aspergillusniger)RAF106菌株应用种子培养基进行种子培养，获得黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子；
所述的种子培养基配方为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min。
3.根据权利要求2所述的利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，其特征在于，所述的种子培养的条件为：茄子瓶静置培养，培养温度28℃～35℃，培养时间3～5d。
4.根据权利要求2所述的利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，其特征在于，黑曲霉RAF106菌株的种子菌接种量为每毫升全细胞生物转化的营养液接种102～108个黑曲霉RAF106菌株分生孢子。
5.根据权利要求2所述的利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，其特征在于，所述的黑曲霉RAF106菌株的种子分生孢子的获取方法为：采用无菌生理盐水冲洗长满黑色黑曲霉分生孢子的茄子瓶，并以接种环轻轻刮取种子培养基表面，得到黑曲霉分生孢子悬浮液。
6.根据权利要求1所述的利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，其特征在于，所述的全细胞生物转化为液态转化。
7.根据权利要求1所述的利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，其特征在于，所述的全细胞生物转化的营养液的配方为含有如下组分质量百分含量的水溶液：茶多酚或EGCG1～20％，磷酸氢二钾0.03～0.8％，磷酸二氢钾0.1～3％，硫酸锰0.03～0.7％，氯化钠0.3～2％，硫酸镁0.01～0.3％，酵母或麦芽提取物0.02～2％；121℃灭菌30min。
8.根据权利要求1所述的利用黑曲霉全细胞转化生产表没食子儿茶素和没食子酸的方法，其特征在于，所述的全细胞生物转化的条件为：温度25～42℃，摇床转速160～220r/min，时间20～60h。
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