CN104726362A - 一种鼠灰链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鼠灰链霉菌及其应用，所述鼠灰链霉菌命名为鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)FXQ-5B，于2014年10月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2014487。鼠灰链霉菌FXQ-5B能够有效抑制油茶叶枯病菌的生长和孢子萌发，防效显著，无污染，环境安全性好，且对其他病菌如尖孢镰刀菌、可可毛色二孢菌、菜豆间座壳菌、狗尾草平脐蠕孢菌、弥泽那拟盘多毛孢菌等也具有良好的抑制效果。具有广谱抗病性，对油茶及其他病害的防治具有重大而深远的意义。

Description

一种鼠灰链霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种鼠灰链霉菌及其应用。
背景技术
油茶(Camellia oleifera Abel)属山茶科山茶属常绿小乔木或灌木，是我国特有的木本油料树种，与椰子、油棕、油橄榄并称“世界四大木本油料树种”。茶油具有很高的药用、食用、生态和经济价值，是世界上极为珍贵的保健植物食用油之一。我国是油茶资源大国，现有油茶栽培面积3400万亩，主要分布在长江流域及其以南的18个省(区、市)，海南省现有油茶面积约2万亩，主要分布于海南中部地区，其中五指山市占海南油茶面积的80％。随着国家对油茶产业的重视，油茶栽种面积也与日俱增，因而带来的病害种类繁多，其危害程度也愈发严重。每年因病害而造成的经济损失巨大，其中油茶叶枯病是一种常见的重要病害，在海南发生尤为严重。其病原是小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)。油茶叶枯病主要危害叶片，叶片染病后，常提早脱落，新稍出现枯死现象，导致油茶产量大幅下降。由该菌引起的病斑形状不规则，红褐色至灰褐色，病斑连片而成大枯斑，病斑背面有肉眼可见的黑色小颗粒，该病菌也侵害油茶果实，使得果实表层产生褐色斑块。
目前，油茶病害的防治主要是化学防治，但长期使用化学杀菌剂，不仅影响茶果的品质，还导致病菌抗药性的产生，而且加大用药剂使用量，又会增加生产成本和农药残留量，影响生态环境，破坏生态平衡。人们越来越重视食物链中化学残留物对人类健康的影响，要求降低果蔬产品农药用量，许多生产上常用的杀菌剂已被明令禁止使用。因此，寻求安全、无毒、有效的控制植物病害的新方法成为当务之急。目前利用拮抗微生物防治植物病害有望成为代替化学药剂的一种安全、无毒、有效的新方法。为了寻求安全、有效和无污染的新方法，人们把目光转向了生物防治，其中研究和利用生防菌是一条重要的思路，对于替代或减少化肥和农药的使用，改善农业生态系统，保持植物微生态系统的生物多样性，以及维护农田生态平衡实现农业可持续发展将起到重要作用。
发明内容
本发明的目的是针对当前技术空白，提供一种鼠灰链霉菌，能够有效抑制油茶叶枯病菌的生长和孢子萌发，防效显著，无污染，环境安全性好，且对其他病菌：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobrcymae)、菜豆间座壳菌(Diaporthe phaseolorum)、狗尾草平脐蠕孢菌(Bipolaris setariae)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)等也具有良好的抑制效果。
本发明的第一个方面是提供鼠灰链霉菌，命名为鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)FXQ-5B，于2014年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉大学，保藏号为CCTCC M2014487。
所述鼠灰链霉菌FXQ-5B的16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的鼠灰链霉菌FXQ-5B在制备拮抗小孢拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis microspora)中制剂中的应用。
本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的鼠灰链霉菌FXQ-5B在制备防治油茶叶枯病病菌制剂中的应用。
本发明第四个方面是提供本发明第一个方面所述的鼠灰链霉菌FXQ-5B在制备抑制油茶叶枯病菌菌丝分生孢子萌发的制剂中的应用。
本发明的第五个方面是提供本发明第一个方面所述的鼠灰链霉菌FXQ-5B在制备抑制和/或致畸油茶叶枯病菌菌丝制剂中的应用。
本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的鼠灰链霉菌FXQ-5B在制备抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobrcymae)、菜豆间座壳菌(Diaporthe phaseolorum)、狗尾草平脐蠕孢菌(Bipolaris setariae)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)病原菌菌丝生长的制剂中的应用。
本发明的第七个方面是提供一种抑制小孢拟盘多毛孢的发酵液，将本发明第一个方面所述的鼠灰链霉菌FXQ-5B置于液体高氏一号培养基里，25-32℃培养5-10d，即得。
优选地，在将鼠灰链霉菌FXQ-5B置于液体高氏一号培养基里之前，先将鼠灰链霉菌FXQ-5B接种于固体高氏一号培养基上，于25-32℃培养3-8d。
本发明提供的菌株，经多项分类鉴定，确定为鼠灰链霉菌的一个新种，暂命 名为鼠灰链霉菌FXQ-5B(Streptomyces murinus sp.FXQ-5B)，已于2014年10月16日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CCTCC M2014487，地址为中国湖北武汉大学。
本发明提供的鼠灰链霉菌FXQ-5B，能够有效抑制油茶叶枯病菌的生长和孢子萌发，防效显著，无污染，环境安全性好，且对其他病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobrcymae)、菜豆间座壳菌(Diaporthe phaseolorum)、狗尾草平脐蠕孢菌(Bipolaris setariae)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)等也具有良好的抑制效果。具有广谱抗病性，对油茶及其他病害的防治具有重大而深远的意义。
附图说明
图1为本发明提供的灰链霉菌FXQ-5B的平板菌落形态图；
图2为本发明提供的灰链霉菌FXQ-5B在显微镜(1000×)下的形态图；
图3为本发明提供的灰链霉菌FXQ-5B对油茶叶枯病菌的拮抗效果图；
图4为本发明提供的灰链霉菌FXQ-5B对油茶叶枯病菌丝的致畸效果图。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，以更好地理解本发明。
一、放线菌的筛选
从海南文昌红树林采集土壤样品，将土样自然风干，采用梯度稀释法分离放线菌。取一定浓度梯度的土壤稀释液100uL均匀涂布于高氏一号培养基上，28℃培养7d后，计数并根据菌落形态、色泽、大小、气生菌丝有无、产色素情况等特点，对分离到的放线菌菌落进行编号。同时，在高氏平板上纯化有编号的菌株，纯化培养后的放线菌于高氏斜面培养基上培养7d后，低温保存，备用。
二、拮抗菌的初筛
采用平板对峙培养法，在平板中央接放线菌菌饼(直径为6mm)，周围35mm处等距离接4株同样供试病原物菌饼(直径为6mm)。以中央只接病原菌，不接放线菌做对照，每处理重复3次，25℃培养，待各对照菌株长满平板后。观察放 线菌对各菌株的抑菌效果，并进行抑菌圈测量统计，将抑菌宽度大于20mm的8株菌株进行复筛，分别是F14、SY3-20、JL6、F20M10、JL5、FXQ-4B、JL10、FXQ15、FXQ-5B(见表1)。筛选出最好的拮抗菌FXQ-5B，测其广普抑菌性的方法同上，只是病原菌及对照不同(见表2)。
表1土壤放线菌对油茶叶枯病菌的抑菌效果
表2FXQ-5B对其他病原菌的抑制作用
三、拮抗菌的复筛
将筛选到的9株菌(F14、SY3-20、JL6、F20M10、JL5、FXQ-4B、JL10、FXQ15、FXQ-5B)接种于固体高氏一号培养基上，于28℃培养5d后，每个平板用挑针调取5块单菌落，分别置于250mL三角瓶装液体高氏一号培养基，150rpm，28℃摇7d。培养液用0.22um细菌过滤器过滤得到培养滤液。将培养滤 液与45℃左右的PDA培养基按1∶9均匀倒入培养皿中，凝固后在平板中央接入叶枯病菌菌饼(d＝6mm)，以无菌水作对照。5d后测量菌落直径，结果见表3。
表3发酵液对油茶叶枯病菌的抑制作用
菌株 菌落直径(mm) 抑制率(％)
F14 20.3 72.7
F20M10 18.7 74.8
JL5 21.1 71.6
FXQ-4B 21.8 70.7
JL10 19.7 73.4
FXQ15 17.8 76.6
FXQ-5B 11.1 85.1
JL6 18.8 74.7
SY3-20 23.2 68.8
CK 74.3 ---
由表3可知，FXQ菌株发酵液的抑制效果最好，抑制率达85.1％。
四、拮抗菌的鉴定
1、菌株FXQ-5B的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2、菌株FXQ-5B的16S rDNA基因测序BLAST结果如下表4所示。
表4菌株FXQ-5B的16S rDNA基因测序BLAST结果
3、菌株FXQ-5B的进化树
4、菌株FXQ-5B的生长情况和形态图
菌株FXQ-5B能够在ISP2培养基上生长，气生菌丝粉状，白色，形态图如图1和2所示。菌株FXQ-5B也可以在ISP4培养基上生长。
5、菌株FXQ-5B的碳源利用，如表5所示。
表5菌株FXQ-5B的碳源利用情况
+：阳性，-：阴性，w：弱阳性
综上，将该菌FXQ-5B鉴定为鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，将该菌送往中国典型培养物保藏中心进行存活保藏，保藏号为：CCTCC M2014487。
五、鼠灰链霉菌FXQ-5B对油茶叶枯病菌的拮抗效果
用直径为6mm的打孔器取油茶叶枯病菌(Pestalotiopsis microspora)菌饼，将其放置于PDA平板呈十字形的四个顶点上，将FXQ-5B放于平板中央，三次重复，28℃培养，5d后测定抑菌圈直径(>4cm)，结果见图3。由图3可知FXQ-5B 对小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)有很强的抑制作用。
六、鼠灰链霉菌FXQ-5B对油茶叶枯病菌菌丝的致畸作用
用无菌刀片切取生长5d的病原菌丝块2mm×2mm 6块，放于50ml培养液中摇动，培养液由PDA培养液和高氏培养液混合而成，体积比为1：1。再分别取5块同样大小菌丝块和5个FXQ-5B单菌落一起放于同样配比的培养液中，150rpm，28℃摇7d。显微(10×40)观察菌丝情况，结果见图4，其中，左图为正常病原菌菌丝，右图为添加FXQ-5B单菌落后的病原菌菌丝。由图4可知，鼠灰链霉菌FXQ-5B导致油茶叶枯病菌菌丝明显变细，且多破碎、断裂成团。
七、鼠灰链霉菌FXQ-5B对油茶叶枯病菌分生孢子萌发的抑制
在培养7d的叶枯病菌PDA平板内，加15mL水，用无菌接种刀刮除菌丝，四层擦镜纸过滤得孢子液，然后用无菌水配成孢子悬浮液，浓度为4.5×106/ml。取100uL孢子悬浮液，和100uL FXQ-5B菌株发酵原液和被稀释10倍、50倍、100倍的发酵液及100uL发酵滤液分别混匀(将高氏培养基上生长的FXQ-5B 5单块菌落接入50mL液体高氏培养基中，28℃，150rpm震荡培养所得为发酵原液，稀释后为发酵液，经过0.22um细菌过滤器过滤所得为发酵滤液)，滴于凹玻片上，以无菌水为对照。每处理重复6次，置于28℃培养箱中培养，24h后镜检孢子萌发情况，计算萌发率。结果见表6。
表6鼠灰链霉菌FXQ-5B对油茶叶枯病菌分生孢子萌发的抑制效果
处理 孢子萌发率(％)
发酵液原液 5.40
发酵液滤液 10.7
稀释10倍的发酵液 9.60
稀释50倍的发酵液稀 12.7
释100倍的发酵液 14.3
对照 100
由表6可知，发酵液原液的抑制孢子萌发效果最好，抑制率高达94.6％；其 次是发酵滤液，抑制率也达到89.3％。随着稀释倍数的增加，其孢子萌发率也有所增加，即分生孢子抑制率随稀释倍数的增加而有所降低。此结果表明在放线菌发酵培养过程中产生了可能对油茶叶枯病菌有抑制作用的次生代谢产物。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种鼠灰链霉菌，其特征在于，命名为鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)FXQ-5B，于2014年10月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2014487。
2.根据权利要求1所述的鼠灰链霉菌，其特征在于，其16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种如权利要求1所述的鼠灰链霉菌在制备拮抗小孢拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis microspora)制剂中的应用。
4.一种如权利要求3所述的鼠灰链霉菌在制备防治油茶叶枯病病菌制剂中的应用。
5.一种如权利要求3所述的鼠灰链霉菌在制备抑制油茶叶枯病菌菌丝分生孢子萌发的制剂中的应用。
6.一种如权利要求3所述的鼠灰链霉菌在制备防治在制备抑制和/或致畸油茶叶枯病菌菌丝中的应用。
7.一种如权利要求1所述的鼠灰链霉菌在制备抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobrcymae)、菜豆间座壳菌(Diaporthe phaseolorum)、狗尾草平脐蠕孢菌(Bipolaris setariae)、弥泽那拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis menezesiana)病原菌的制剂中的应用。
8.一种抑制小孢拟盘多毛孢的发酵液，其特征在于，将权利要求1所述的鼠灰链霉菌置于液体高氏一号培养基里，25-32℃培养5-10d，即得。
9.根据权利要求8所述的发酵液，其特征在于，在将权利要求1所述的鼠灰链霉菌置于液体高氏一号培养基里之前，先将权利要求1所述的鼠灰链霉菌接种于固体高氏一号培养基上，于25-32℃培养3-8d。
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