CN107043721A

CN107043721A - 枯草芽孢杆菌hmb28948及其应用

Info

Publication number: CN107043721A
Application number: CN201710158062.9A
Authority: CN
Inventors: 郭庆港; 马平; 李社增; 鹿秀云; 张晓云; 王莹; 王培培; 赵卫松; 张丽红
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2017-08-15
Anticipated expiration: 2037-03-16
Also published as: CN107043721B

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB28948，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13212。本发明还公开了利用该菌株生产的微生物菌剂。本发明枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯病的药效高，平均防效在79.0％以上；其次，利用本发明枯草芽孢杆菌HMB28948防治棉花立枯病不易产生抗药性，药效持久性强；此外，本发明枯草芽孢杆菌HMB28948抑菌谱广，除棉花立枯病菌外，还对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、黄瓜靶斑病菌和番茄灰霉病菌等具有很好的抑制作用。

Description

枯草芽孢杆菌HMB28948及其应用

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌HMB28948，以及利用该枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂，还涉及它们在防治棉花立枯病等植物病害上的用途。

背景技术

棉花立枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的一种棉花苗期病害，其主要症状为：在棉种萌发前侵染而造成烂种，棉种萌发后未出土前被侵染而引起烂芽；棉苗出土后受害，初期在近土面基部产生黄褐色病斑，病斑逐渐扩展包围整个基部呈明显缢缩，病苗萎蔫倒伏枯死；拔起病苗，茎基部以下的皮层均遗留土壤中，仅存尖纫的鼠尾状木质部；子叶受害后，多在子叶中部产生黄褐色不规则形病斑，常脱落穿孔。棉花立枯病严重影响棉花的正常生长，发病后常导致棉苗成片死亡，是亟待解决的问题。

棉花立枯病的防治以化学防治为主，包括在播种前利用化学药剂拌种、包衣或浸种，播种后用化学药剂进行喷雾、灌根等，但化学防治效果较差，并且还存在污染环境、长期用药易产生抗药性和成本高等问题。生物防治因具有专化性强、防效高、药效持久性好、并且不存在环境污染问题等优点，近年来受到越来越多的重视。

目前，用于防治棉花立枯病的微生物有：哈茨木霉(CN104430549A)、萎缩芽孢杆菌(CN104531545A)、巨大芽孢杆菌(CN103320360A)、解淀粉芽孢杆菌(CN105176893A；CN104498386A)、枯草芽孢杆菌(CN105199997A；CN104770398A；CN104642390A；CN105340972A；)、双核丝核菌(CN1952106A)、沙雷氏菌(CN103122330A)、绿针假单胞菌(CN1932006A)和荧光假单胞菌(CN1058230A)等。从上述可知，用于防治棉花立枯病的微生物主要是芽孢杆菌(Bacillus)，原因在于芽孢杆菌具有分布广、易分离培养、能产生抗逆性较强的芽胞、贮藏期长和使用方便等特点；此外，芽孢杆菌能产生内生芽胞，有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产和运输，如在剂型加工环境中存活、定殖与繁殖。因此，芽孢杆菌是一种理想的生防微生物。

由于生物多样性和生物的共同进化特性，针对病原微生物的不同种类和不断进化，需要筛选更多不同种类的微生物进行应对，而筛选对病原菌具有抑制作用的生防微生物是对病原微生物防治的最经济有效方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种枯草芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、杀菌谱广等优点。

本发明另一目的在于提供利用上述枯草芽孢杆菌生产的微生物菌剂。

本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第四目的在于提供上述枯草芽孢杆菌菌株在防治棉花立枯病等植物病害上的应用。

本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治棉花立枯病等植物病害上的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB28948，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13212。

利用上述枯草芽孢杆菌HMB28948生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB28948菌体，还包括它的胞外代谢产物。

上述微生物菌剂可以为液体制剂或粉剂。

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的HMB28948菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL LB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基(pH值为7.0)中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养35～40h，得发酵液；

(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB28948的液体制剂。

上述制备方法步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。

上述制备方法步骤(2)中所述的LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。

上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl 0.1～0.8％，MnSO₄·H₂O0.5～1.0％，其余为水。

所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO₄·H₂O混合，再加水，调节pH，搅拌均匀即可。

上述微生物菌剂，其含有HMB28948的活菌数大于20.0×10⁸cfu/mL。

上述枯草芽孢杆菌HMB28948在防治棉花立枯病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、黄瓜靶斑病或番茄灰霉病等植物病害上的应用。

上述微生物菌剂在防治棉花立枯病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、黄瓜靶斑病或番茄灰霉病等植物病害上的应用。

上述微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为10⁷cfu/mL，于棉花播种前将种子浸种半小时；或将上述所得微生物菌剂用碳酸钙吸附，制作成枯草芽孢杆菌HMB28948粉剂，于棉花播种前按照药种比1：10拌种。

HMB28948菌株的分离筛选过程

2013年7月河北省农林科学院植物保护研究所从河北省南宫市宋庄村棉田中采集土样，带回实验室后称取1g土样放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10^-4、10^-5、10^-6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200μL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d-3d，进行细菌的分离和纯化。并以棉花立枯病为靶标，通过平板对峙法、盆栽试验法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对棉花立枯病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB28948。

HMB28948菌株的分类鉴定：

(1)形态特征鉴定

在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB28948属于芽孢杆菌(Bacillus)。

(2)根据16S rDNA序列鉴定分类

以HMB28948的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16S rDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为：

27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)，

1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)。

16S rDNA的PCR反应体系为50μL:10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL，dNTP Mixture(2.5mM)5μL，Taq(5U/μL)1μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，HMB28948的基因组DNA 50ng，ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB28948的16S rDNA序列(见SEQ ID No.3)。将所得HMB28948的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB28948与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到96％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树(见图1)，HMB28948与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB28948属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(3)根据gyrB基因序列鉴定分类

以HMB28948基因组DNA为模板，以芽孢杆菌gyrB基因简并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为：

gyrB-F：5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’(SEQ ID No.4)，

gyrB-R：5’-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3’(SEQ ID No.5)。

gyrB的PCR扩增反应体系为50μL:10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL，dNTP Mixture(2.5mM)5μL，Taq(5U/μL)1μL，gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL，HMB28948基因组DNA 50ng，ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB28948菌株的gyrB基因序列(见SEQ ID No.6)。将获得的HMB28948菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现HMB28948与枯草芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高，达到88.7％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树(见图2)，HMB28948菌株与枯草芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB28948为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且是一个新菌株。

综合以上形态特征、16S rDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知HMB28948属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，并且和现有的芽孢杆菌菌株不同，是一个新的枯草芽孢杆菌菌株。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯病的药效高，平均防效在79.0％以上；(2)利用本发明枯草芽孢杆菌HMB28948防治棉花立枯病不易产生抗药性，药效持久性强；(3)本发明枯草芽孢杆菌HMB28948抑菌谱广，除棉花立枯病菌外，还对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、黄瓜靶斑病菌和番茄灰霉病菌等具有很好的抑制作用；(4)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；(5)本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、使用简单。

生物保藏：本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB28948，己于2016年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13212。

附图说明

图1为根据16S rDNA序列获得的HMB28948菌株系统发育树。

图2为根据gyrB基因序列获得的HMB28948菌株系统发育树。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1HMB28948微生物菌剂的制备

按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-80℃的枯草芽孢杆菌菌株HMB28948(该菌株己于2016年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13212)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培养12小时，得活化的菌株；

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)中一接种环上述活化好的菌株，在30℃、摇床转速180rpm的条件下进行振荡培养12小时，得种子液；

(3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl 0.5％，MnSO₄·H₂O 0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速180rpm条件下进行发酵培养36小时，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞数/(成熟芽胞数+菌体数)×100)；芽胞率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养48小时，得枯草芽孢杆菌HMB28948的液体制剂。

实施例2本发明HMB28948菌株对棉花立枯菌的拮抗作用试验

(一)供试棉花立枯菌来源：棉花立枯菌RH-2菌株采自河北省邯郸市邱县棉花立枯病病株，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，致病力测定表现为强致病力。

(二)试验方法

平板测定试验：首先将棉花立枯菌RH-2在PDA平板上活化培养3天，然后用直径为6mm的打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌片，再将棉花立枯菌菌片转接在另一个PDA平板中央，接着将实施例1步骤(1)活化的枯草芽孢杆菌HMB28948点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB28948菌株的棉花立枯菌生长情况)。在25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量棉花立枯菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HMB28948后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示。

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100。

结果(见表1)本发明枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯菌的抑菌率为74.4％；说明枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯菌具有明显的抑制作用，具有防治棉花立枯病的生防潜力。

表1本发明HMB28948菌株对棉花立枯菌的拮抗作用试验结果

菌株名称	对照生长量(mm)	处理生长量(mm)	抑菌率(％)
				HMB28948	39.0	10.0	74.4

实施例3本发明HMB28948菌株对棉花立枯病防效对比试验

(一)试验处理：

(1)HMB28948微生物菌剂：将实施例1制备的HMB28948液体制剂用水稀释50倍。

(2)空白对照：清水

(二)试验方法：

首先将蛭石与棉田土壤按照1：1比例混匀，121℃高压湿热灭菌1小时，隔天相同条件再灭菌1次。在500克土壤中接种立枯丝核菌菌丝段悬浮液(约10⁷个/毫升)10毫升，搅拌均匀后装填在直径20厘米的塑料花盆中，压实。棉花品种选用冀丰106，播种前应用实施例1制备的HMB28948液体制剂50倍水稀释液浸种半小时；以清水浸种半小时作为空白对照。浸种处理后每盆播种10粒种子，覆盖灭菌土壤，在温室内正常培养。出苗后逐日调查并记录处理和空白对照立枯病发病株数，当空白对照立枯病发病充分时计算发病率和防治效果。

盆栽试验结果(见表2)枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯病的防效为94.82％。说明本发明HMB28948菌株及其微生物菌剂对棉花立枯病具有很好的防治效果。

表2本发明HMB28948菌株对棉花立枯病防效试验结果

处理	调查株数	病株数	发病率(％)	防效(％)
					HMB28948液体制剂	53	1	1.9b	94.82
空白对照	49	18	36.7a	--

实施例4本发明HMB28948菌株对棉花立枯病防效对比试验

(一)试验处理：

(2)空白对照：清水

(二)试验方法：

(1)配制育苗土：将蛭石与棉田土壤按照1：1比例混匀，121℃高压湿热灭菌1小时，隔天相同条件再灭菌1次，自然降温，备用。

(2)棉花立枯丝核菌菌种培养：将市购完整饱满的小米粒在清水中浸泡4小时，沥去水分，分装在50毫升离心管中，每管20克，121℃高压湿热灭菌半小时；冷却后每管接种棉花立枯丝核菌RH-2菌丝块4-5块，混匀，在25℃恒温培养箱培养10天，备用。

(3)在高10厘米的50毫升离心管中装填制备好的育苗土至距离管底2厘米处，在土面放置一粒培养好的携带棉花立枯丝核菌RH-2的小米粒，继续装填育苗土至距管底7厘米处，压实，播种。棉花品种选用冀丰106，播种前应用实施例1制备的HMB28948液体制剂50倍水稀释液浸种半小时；以清水浸种半小时作为空白对照。播种后覆盖育苗土，轻轻用手压，盖上离心管盖子，置于25℃、12小时光照12小时黑暗的控温控光恒温室中培养，定量加水调节土壤湿度。当种子出土时去掉离心管盖子。出苗后逐日调查并记录处理和空白对照立枯病发病株数，当空白对照立枯病发病充分时计算发病率和防治效果。

结果(见表3)本发明枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯病的防效为72.32％。说明本发明枯草芽孢杆菌HMB28948及其微生物菌剂对棉花立枯病具有很好的防治效果。

表3本发明HMB28948菌株对棉花立枯病防效试验结果

处理	调查株数	病株数	发病率(％)	防效(％)
					HMB28948液体制剂	103	5	4.9b	72.32
空白对照	96	17	17.7a	--

实施例5本发明枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯病防效对比试验

(一)试验处理：

(1)HMB28948粉剂：按照1：1比例向实施例1制备的HMB28948液体制剂中添加碳酸钙，混合均匀，即得HMB28948粉剂。

(2)空白对照：清水

(二)试验方法：

本试验在河北省保定市高阳县北于八村棉花试验田进行。将实施例1制备的HMB28948液体制剂按照1：1比利添加碳酸钙，制备HMB28948粉剂。棉花品种选用冀丰106，播种前用HMB28948粉剂按照药种比1：10拌种；以不处理种子作为空白对照。每个处理重复4次，随机排列，小区面积40平方米。出苗后调查单位面积出苗数和立枯病死苗数，每3天调查一次，累计统计棉花立枯病发病率，计算防治效果。

结果(见表4)本发明枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯病的防效为70.67％。说明本发明枯草芽孢杆菌HMB28948及其微生物菌剂对棉花立枯病具有非常好的防治效果。

表4枯草芽孢杆菌HMB28948对棉花立枯病防效试验结果

处理	调查株数	病株数	发病率(％)	防效(％)
					HMB28948粉剂	183	4	2.2b	70.67
空白对照	186	14	7.5a	--

实施例6本发明HMB28948菌株对4种病原真菌的抑制作用试验

(一)供试病原真菌及其来源：棉花黄萎菌(Verticillium dahliae)VD-1、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.vasinfectum)FOV-1、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)BC-32和黄瓜靶斑菌(Corynespora cassiicola)CC-1。这4种病原真菌和枯草芽孢杆菌HMB26553菌株均由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室保存。

(二)试验方法：

采用对峙培养法检测枯草芽孢杆菌HMB28948菌株对4种植物病原真菌的抑制作用。枯草芽孢杆菌HMB28948在LB斜面培养基上30℃下活化24h，待测。取本试验室保存的4种病原真菌，在PDA培养基上活化5d，然后在菌落边缘用直径6mm的打孔器打取菌龄一致的菌盘，菌丝朝下转接到另一PDA平板中央，在距菌盘2cm处呈“品”字形接种待测细菌，以不接细菌为对照，每处理3次重复，放于25℃恒温培养5d，测量处理菌落半径和细菌接种点至病原菌菌落边缘的间距(抑菌带)，确定抑菌程度，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100。

表5本发明HMB28948菌株对植物病原真菌的抑制作用试验结果

结果(见表5)本发明枯草芽孢杆菌HMB28948对供试的4种病原真菌的抑菌率为60.83％～73.33％，其中对棉花黄萎病菌的抑菌率达到了73.33％，对番茄灰霉病菌的抑菌率最低，为60.83％，说明本发明菌株HMB28948除了棉花立枯病菌外，对棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、番茄灰霉病菌和黄瓜靶斑病菌也有很好的抑制作用，其抑菌谱广。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 枯草芽孢杆菌HMB28948及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 27F

<400> 1

agagtttgat catggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1492

<400> 2

ggctaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 975

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 3

ggccggcggg ctgctataca tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taatggctca 240

ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcgaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctg 975

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gyrB-F

<400> 4

ttgrcgghrg ygghtataaa gt 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gyrB-R

<400> 5

tccdccstca gartcwccct c 21

<210> 6

<211> 1040

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 6

cccgcgagat acggatgtag tgcgtcggtc gtaacgcact atcaacagag cttgatgtga 60

cggttcaccg tgacggtaaa attcaccgcc aaacctataa acgcggagtt ccggttacag 120

accttgaaat cattggcgaa acggatcata caggaacgac gacacatttt gtcccggacc 180

ctgaaatttt ctcagaaaca accgagtatg attacgatct gcttgccaac cgcgtgcgtg 240

aattggcctt tttaacaaag ggcgtaaaca tcacgattga agataaacgt gaaggacaag 300

agcgcaaaaa tgaataccat tacgaaggcg gaattaaaag ttatgtagag tatttaaacc 360

gctctaaaga ggttgtccat gaagagccga tttacattga aggcgaaaag gacggcatta 420

cggttgaagt ggctttgcaa tacaatgaca gctacacaag caacatttac tcgtttacaa 480

acaacattaa cacgtacgaa ggcggtaccc atgaagctgg cttcaaaacg ggcctgactc 540

gtgttatcaa cgattacgcc agaaaaaaag ggcttattaa agaaaatgat ccaaacctaa 600

gcggagatga cgtaagggaa gggctgacag cgattatttc aatcaaacac cctgatccgc 660

agtttgaggg ccaaacgaaa aacaaagctg ggcaactcag aagcacggac aatcaccgat 720

acgttatttt ctacggcgat ggaaacattt atgctggaaa atccagatgc ggccaaaaaa 780

attgtcgata aaggcttaat ggcggcaaga gcaagaatgg ctgcgaaaaa agcgcgtgaa 840

ctaacacgcc gtaagagtgc tttggaaatt tcaaacttgc ccggtaagta gcggactgct 900

cttcaaagat ccgagcattt ccgagttata tatcgtagag gtgactcttg acgcggacat 960

gccgggtgag agaacctata acgcggagtt cggtactgaa cttgtgatca ttgggcgaac 1020

gggacattcc agggaaccga 1040

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HMB28948，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13212。

2.利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB28948生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌HMB28948菌体。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂为液体制剂或粉剂。

4.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将低温保存的HMB28948菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL LB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基(pH值为7.0)中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养35～40h，得发酵液；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)中所述的LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl 0.1～0.8％，MnSO₄·H₂O 0.5～1.0％，其余为水。

8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB28948在防治棉花立枯病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、黄瓜靶斑病或番茄灰霉病上的应用。

9.权利要求2所述的微生物菌剂在防治棉花立枯病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、黄瓜靶斑病或番茄灰霉病上的应用。