CN103789230A

CN103789230A - 生防菌株bs71及其在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用

Info

Publication number: CN103789230A
Application number: CN201310755168.9A
Authority: CN
Inventors: 陈云; 尹燕妮; 马忠华
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN103789230B

Abstract

本发明公开了一种生防菌株BS71及其在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用，所述的生防菌株BS71为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS71，保藏编号为CGMCC No.8191。所述的应用包括：制备含所述生防菌株BS71的生防菌剂；将所述的生防菌剂施在所述的农作物上。本发明的生防菌株对黄曲霉的拮抗作用强烈，可用于黄曲霉毒素污染的防治。且本发明提供了黄曲霉毒素污染的生物防治方法，不使用化学农药，具有无毒、不易产生抗药性、环境和生物安全等优点，具有广阔的应用前景。

Description

生防菌株BS71及其在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用

技术领域

本发明属于作物病害防控技术领域，尤其涉及一种生防菌株BS71及其在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用。

背景技术

黄曲霉毒素（Aflatoxin，以下简写成AFT）主要是黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)的代谢产物，是迄今发现的污染农产品毒性最强的一类生物毒素。据世界粮农组织估计，目前世界范围内有25％的农作物产品受真菌毒素的污染，其中主要就是AFT。在我国花生、玉米等作物的黄曲霉毒素污染严重影响着食品安全和农产品出口竞争力。

由于AFT污染所带来的巨大经济损失和健康危害，人们一直在探索控制AFT污染的有效措施。选育抗病虫品种是控制黄曲霉毒素的重要途径之一，但由于选育抗AFT的作物品种周期长，在生产中广泛应用还尚需时日。目前控制农产品AFT比较有效的是生物防治，美国近来在AFT生物防治研究方面已取得重大进展，即：利用不产AFT的黄曲霉菌株NRRL21882能有效防治花生AFT污染，其防效可达90%以上，使花生中AFT的含量能有效控制在限量标准范围内。我国在AFT生物防治方面研究还刚刚起步。已有研究发现，一株不产黄曲毒素的黄曲霉菌株A051可用来控制农产品黄曲霉毒素的污染（ZL200810120929.2），由乳酪杆菌、枯草芽孢杆菌和异常汉逊酵母复合培养液在抑制黄曲霉生长和降解毒素方面有一定作用（CN201110190287.5）。公开号为CN102816725A的中国专利文献还公开了一种枯草芽孢杆菌T-500，该菌株虽然对多种病原菌具有拮抗作用，但是对黄曲霉菌的抑制率仅为35.7%，效果较差。我国微生物资源丰富，挖掘其它控制黄曲霉毒素污染的潜在生防菌，对有效控制我国黄曲霉毒素污染意义重大。

发明内容

本发明提供了一种生防菌株BS71，对黄曲霉菌菌丝生长、孢子萌发有较好的抑制作用，对储存过程中农作物黄曲霉毒素污染具有较好的防治效果。

本发明提供了一种生防菌株BS71，分类命名枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），完整命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS71，已于2013年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.8191。

该菌株BS71在LB培养基上菌落表面粗糙、不透明，呈现皱缩、白色，能够形成芽孢，能移动，需氧型。

本发明还提供了所述生防菌株BS71在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用。

实验发现，本发明的生防菌株BS71对黄曲霉菌菌丝生长、孢子萌发有较好的抑制作用，对储存过程中花生、玉米黄曲霉毒素污染具有较好的防治效果，因此，可将该生防菌株BS71用于防治农作物的黄曲霉毒素污染。

所述的农作物具体可以为花生或玉米，其中，所述花生的品种具体可以为鲁花9号。

所述应用具体包括：

（1）制备含所述生防菌株BS71的生防菌剂；

（2）将所述的生防菌剂喷施在所述的植物上。

喷施生防菌剂时，选择农作物易被黄曲霉毒素污染的时期进行喷施,喷施至植物表面水珠流动即可。如对花生黄曲霉毒素污染进行防治时，可在储藏期将所述的生防菌剂喷施在花生果实上，喷施至花生果实表面水珠流动即可，喷施结束后可将花生置于常温储存。

为达到较好的防治效果，所述的生防菌剂中，所述生防菌株BS71的浓度优选为1×10⁸～10¹⁰CFU/mL，更优选为1×10⁸CFU/mL。

所述生防菌剂可通过如下方法进行制备：

（1）将所述生防菌株BS71于培养基中培养至OD₆₀₀为0.5～0.8，获得种子液；

（2）将种子液接种于发酵培养液中扩大培养，调节发酵液中生防菌株BS71的浓度至1×10⁸～10¹⁰CFU/mL，获得所述生防菌剂。

所述的培养基可选用LB液体培养基。

其中，所述种子液的接种量优选为1～2%（v/v），优选为1%（v/v）。

以每升计，所述发酵培养液的配方为：葡萄糖，18～22g；L-谷氨酸，2.4～2.6g；L-天门冬酰胺，2.4～2.6g；KH₂PO₄，0.8～1.2g；MgSO₄·7H₂O，0.4～0.6g；KCl，0.4～0.6g；酵母粉，0.8～1.2g；L-苯丙氨酸，2～3×10^-3g；MnSO₄·H₂O，5～6×10^-3g；CuSO₄·5H₂O，0.16～0.18×10^-3g；FeSO₄·7H₂O，0.15～0.17×10^-3g；调节pH值为7.0。

作为进一步优选，以每升计，所述发酵培养基液的配方为：葡萄糖，20g；L-谷氨酸，2.5g；L-天门冬酰胺，2.5g；KH₂PO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；KCl，0.5g；酵母粉，1g；L-苯丙氨酸，2×10^-3g；MnSO₄·H₂O，5×10^-3g；CuSO₄·5H₂O，0.16×10^-3g；FeSO₄·7H₂O，0.15×10^-3g；调节pH值为7.0。该发酵培养液由Landy培养基改良而来，更有利于本发明所述枯草芽孢杆菌的增殖。

本发明中，所述扩大培养是发酵罐中进行的，所述扩大培养的温度为28～30℃，优选为30℃，所述扩大培养的时间为20～24h。在该培养条件下，在保证菌活力的同时使其具有较快的增殖速度。

扩大培养过程中，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20%，通气量5-7m³/小时，转速240～260r/min，罐压0.05-0.1KPa。发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度为1×10⁸～10¹⁰CFU/mL。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明的生防菌株BS71为枯草芽孢杆菌，生防菌BS71菌体和上清在平板拮抗试验中显示对黄曲霉菌菌丝生长、孢子萌发有较好的抑制作用，可将其应用于农作物黄曲霉毒素污染中的生物防治。

（2）光照培养箱进行的花生黄曲霉毒素污染防治试验效果显示，本发明的生防菌株BS71能有效抑制病菌在花生表面的生长，防效高达82.56%，在常温贮藏条件下，本发明的生防菌株BS71对花生黄曲霉毒素污染的防效仍可达到70%以上，防治效果好，因此可利用该生防菌株BS71防治花生黄曲霉毒素污染。

（3）本发明生防菌株BS71应用于农作物黄曲霉毒素污染中的防治，可完全克服因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于农产品的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于提高产品质量。

附图说明

图1为生防菌BS71的菌落形态图。

图2为生防菌BS71平板拮抗黄曲霉菌菌丝生长。

图3为生防菌BS71无菌上清抑制黄曲霉菌菌丝生长。

图4为生防菌BS71无菌上清抑制黄曲霉菌孢子萌发。

图5为BS71生防菌剂光照培养箱防治花生黄曲霉毒素污染的效果。

图6为BS71生防菌剂光照培养箱防治玉米黄曲霉毒素污染的效果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1BS71生防菌株的采集、分离和鉴定

BS71菌株分离自浙江省绍兴市花生根围土壤中。取土壤置于无菌水中，振荡1小时后，吸取上清，80℃水浴10分钟后涂布于LB平板上；次日挑取菌落进行纯化培养。

菌株BS71在LB培养基上菌落表面粗糙、不透明，呈现皱缩、白色（见图1），能够形成芽孢，能移动，需氧型。

提取该菌株的DNA，扩增16S rDNA序列，进行测序，该菌株的16SrDNA如SEQ ID No.1所示，序列在NCBI中的比对结果显示与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的同源性最高。

该菌株已保存在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年9月16日，保藏编号为：CGMCC No.8191。

实施例2生防菌剂的制备

1、生防菌剂的制备

（1）将生防菌株BS71接种到LB培养液中，30℃，180r/min振荡培养，12～16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，OD测定过程中以未接菌的培养液来调零；

（2）当振荡培养至菌液的OD值为0.5～0.8之间时即为种子菌液，将种子菌液以体积比为1：100加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，30℃250r/min振荡培养20～24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量为20%，通气量5-7m³/小时，罐压为0.05-0.1KPa。发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度约为1×10⁹cfu/ml。

发酵培养液的配方（每升）为：葡萄糖，20g；L-谷氨酸，2.5g；L-天门冬酰胺，2.5g；KH₂PO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；KCl，0.5g；酵母粉，1g；L-苯丙氨酸，2×10^-3g；MnSO₄·H₂O，5×10^-3g；CuSO₄·5H₂O，0.16×10^-3g；FeSO₄·7H₂O，0.15×10^-3g；调节pH值为7.0。

实施例3BS71生防菌株对黄曲霉菌的拮抗活性测定

1、BS71对黄曲霉菌平板拮抗活性测定

（1）试验方法

采用对峙培养法，将保存于4℃中的黄曲霉菌HZ17(前期试验鉴定产黄曲霉毒素的菌株，该菌株对嘧霉胺产生抗性)接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为6mm的圆形菌块。将菌丝块接种在WA平板（WA培养基/L：蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，pH=7.0）的中心，在其四周距中心约25mm处分别接种BS71，试验以枯草芽孢杆菌模式菌株PY79、清水和10μg/ml嘧霉胺为对照组。25℃培养，待菌丝接近长满平板时测量抑菌圈的大小（从细菌菌落中心算起）。

根据抑菌圈的大小对BS71的拮抗黄曲霉菌活性进行评估：0mm无抑制作用；＜2mm有轻微的抑制作用；2-5mm中等抑制作用；＞5mm较强的抑制作用。

抑制率根据以下公式进行计算：

抑制率=100(R₁-R₂)/R₁，R₁为对照病原菌在清水方向上的菌落半径；R₂为病原菌在细菌方向的菌落半径。

（2）结果分析

如图2所示，平板拮抗试验表明：生防菌BS71对黄曲霉菌菌丝生长具有较强的抑制效果，抑制圈半径为13.0mm，菌丝抑制率为58.1%，而阴性对照PY79、清水和嘧霉胺处理组无拮抗效果。

2、生防菌BS71无菌上清抑制黄曲霉菌菌丝活性测定

（1）试验方法

取实施例2的生防菌BS71菌株发酵液，10,000r/min，离心10min后取上清。上清经细菌滤器（0.22μm）过滤后待用。

向50℃WA培养基中加入黄曲霉菌HZ17的孢子，至孢子终浓度为10⁵个/ml。将含黄曲霉菌HZ17孢子的WA培养基倒入9cm直径的平板中，每平板倒入20mL。待冷却凝固后，用7mm直径的打孔器在平板的对称位置打3个孔，每孔分别加入25μL制备的无菌上清，以培养液和嘧霉胺为对照组。25℃静止培养后观察拮抗圈大小（从孔中心算起）。

（2）结果分析

生防菌BS71无菌上清能抑制菌丝生长，抑制圈半径为5.0mm，3倍浓缩无菌上清的抑菌圈半径为7.0mm，见图3。

3、生防菌BS71无菌上清抑制黄曲霉菌孢子萌发活性测定

（1）试验方法

在上述无菌上清中加入果糖，使果糖终浓度至10mM，加入黄曲霉菌HZ17的孢子。对照组为含1%果糖的培养液。取置于果糖溶液中的孢子悬浮液10μl置于载玻片上，每处理5次重复。玻片置于保湿盒中，25℃静止培养，每隔1小时观察各处理组孢子萌发情况，计算萌发率。

（2）结果分析

生防菌BS71无菌上清能推迟黄曲霉菌孢子的萌发（图4）。诱导萌发后，6和9小时分别统计各处理组的萌发率，结果显示当阴性对照组萌发率为100%时，BS71处理组孢子仅有29%萌发率。统计结果见表1。

表1各处理组黄曲霉菌孢子萌发率

实施例4生防菌光照培养箱防治花生黄曲霉毒素污染效果评价

（1）试验方法

称70g花生于250ml三角瓶中，121℃,灭菌20分钟后，冷却，加入10⁴CFU/ml的黄曲霉孢子，1ml；同时加入利用上述方法制备的生防菌剂，生防菌10⁸CFU/ml，2ml。25℃培养2周后，取10g花生米加入80%甲醇，15ml。振荡过夜，离心取上清。按照ELISA定量检测黄曲霉毒素B1试剂盒（北京百林康源生物技术有限责任公司）使用说明检测黄曲霉毒素。无拮抗作用的枯草芽孢杆菌PY79作为对照。每个处理测定3瓶花生。试验供试花生品种为鲁花9号。

（2）结果分析

表2各处理组光照培养箱防治花生黄曲霉毒素污染效果

在光照培养箱中进行BS71防治花生黄曲霉毒素污染试验结果表明，生防菌BS71能够显著抑制黄曲霉菌HZ17在花生上的生长和产毒（图5）。在鲁花9号上的防治效果为82.56%，而对照PY79仅为4.41%（表2）。

实施例5生防菌光照培养箱防治玉米渣黄曲霉毒素污染效果评价

（1）试验方法

称70g玉米渣于250ml三角瓶中，121℃，灭菌20分钟后，冷却，加入10⁴CFU/ml的黄曲霉孢子，1ml；同时加入利用上述方法制备的生防菌剂，生防菌10⁸CFU/ml，2ml。25℃培养2周后，取10g玉米渣加入80%甲醇，15ml。振荡过夜，离心取上清。按照ELISA定量检测黄曲霉毒素B1试剂盒（北京百林康源生物技术有限责任公司）使用说明检测黄曲霉毒素。无拮抗作用的枯草芽孢杆菌PY79作为对照。每个处理测定3瓶玉米渣。

（2）结果分析

在光照培养箱中进行BS71防治玉米渣黄曲霉毒素污染试验结果表明，生防菌BS71能够显著抑制黄曲霉菌HZ17在玉米渣上的生长和产毒图6），另外，试剂盒检测不到黄曲霉毒素B1，说明BS71处理后,显著的抑制了毒素的产生。

实施例6常温储存条件下生防菌防治花生黄曲霉毒素污染效果评价

（1）试验方法

从黄曲霉发病严重的花生田采取样品，将样品混匀后平均分为9份（3斤），设BS71，PY79和清水3个处理，每个处理3份样品。利用上述方法制备生防菌剂，将10⁸CFU/ml生防菌喷施在花生表面，水珠流动即可，过夜风干后，置于25℃存放2个月后，利用ELISA定量检测黄曲霉毒素B1试剂盒进行毒素含量测定。

（2）结果分析

表3BS71贮藏条件下防治花生黄曲霉毒素污染效果

如表3所示，在常温贮藏条件下，通过喷施生防菌BS71，可显著抑制黄曲霉在花生上的生长和毒素产生，对花生黄曲霉毒素污染平均防效可达70.56%左右，而对照PY79仅为7.32%。

综上，本发明的菌株对黄曲霉菌丝生长、孢子萌发具有显著的抑制作用，且通过生物竞争来抑制黄曲霉的生长数量，进而控制黄曲霉毒素的污染。

Claims

1.一种生防菌株BS71，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）BS71，保藏编号为CGMCC No.8191。

2.如权利要求1所述的生防菌株BS71在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的农作物为花生。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述花生的品种为鲁花9号。

5.如权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述的应用包括：

（1）制备含所述生防菌株BS71的生防菌剂；

（2）将所述的生防菌剂施在所述的农作物上。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的生防菌剂中，所述生防菌株BS71的浓度为1×10⁸～10¹⁰CFU/mL。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述生防菌剂可通过如下方法进行制备：

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述种子液的接种量为1～2%。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，以每升计，所述发酵培养液的配方为：葡萄糖，18～22g；L-谷氨酸，2.4～2.6g；L-天门冬酰胺，2.4～2.6g；KH₂PO₄，0.8～1.2g；MgSO₄·7H₂O，0.4～0.6g；KCl，0.4～0.6g；酵母粉，0.8～1.2g；L-苯丙氨酸，2～3×10^-3g；MnSO₄·H₂O，5～6×10^-3g；CuSO₄·5H₂O，0.16～0.18×10^-3g；FeSO₄·7H₂O，0.15～0.17×10^-3g。