CN105647840A - 一种沙漠寡营养细菌dob153及在固沙中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种沙漠寡营养细菌DOB153及在固沙中的应用。通过在新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠中分离、筛选、选育、驯化，获得一种沙漠寡营养细菌<i>Bacillus？sp</i>.？DOB153，其菌种的保藏编号为CGMCC？NO.11925，将分离到的寡营养细菌？DOB153菌株制备的菌液使用于沙漠表面不仅能够起到固沙作用，而且可以为发芽速度较慢的一些植物种子的萌发提供较好的水分条件，使一些因为土壤水分不足不能萌发的植物得到生长发育，不仅起到了粘连砂粒、防治流沙活化，还能有效增加土壤中主要微生物数量，提高土壤主要养分含量，增强部分土壤酶活性，并能明显恢复藻结皮，在固沙中具有广泛的应用价值。

Description

一种沙漠寡营养细菌DOB153及在固沙中的应用

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体地说，本发明涉及一种新寡营养细菌在生物结皮固定流沙中应用的技术领域。

背景技术

沙质荒漠化是当今人类共同面对的严重环境问题，我国是世界上受沙漠化危害最严重的国家之一。沙漠化所造成的环境恶化和经济贫困，严重地制约着生态恢复和经济发展，治理迫在眉捷。我国开展沙漠化的研究与防治已有半个世纪，但沙漠化土地一直在扩大蔓延。科学研究与防治实践表明多学科交叉与综合集成是防治沙漠化的必由之路。目前，人工固沙主要途径是通过机械(如草方格)和生物(如栽植梭梭等)等措施，降低风速，减少侵蚀，促进沉积，其中生物固沙技术已进入野外推广阶段。研究表明，生物结皮作为荒漠地区特殊环境的产物，是由细菌、真菌、蓝绿藻、地衣和苔藓植物与土壤形成的有机复合体。生物结皮有机体的地下菌丝、假根及分泌物能够粘结沙粒，作为特殊的生物学活动层，固沙结皮层具有较高的生物学活性，使土壤表面在物理、化学和生物学特性明显不同于松散沙土，具有较强的抗风蚀功能和重要的生态及地学效应，同时也是干旱荒漠地区植被演替的重要基础，成为荒漠化地区防沙治沙和生态恢复研究的热点。

寡营养细菌是一类在营养物质浓度很低的条件下生长的微生物，它属于特殊环境微生物类群，对维持生存所需的营养要求也很低，其多样性与生物量在整个生物圈组成中都具有较大的优势，因而在生物地球化学循环中发挥着重要作用。从世纪年代开始，寡营养细菌在自然或人为环境中的寡营养机制、对饥饿的生理反应以及在生态系统中的作用一直是微生物生态学研究的前沿领域之一，其理论价值与应用前景已受到各国微生物生态学家与环境学家们的广泛重视。但对于新发现类似寡营养细菌新的菌种应用于生物结皮固定流沙中未见报道。

目前，由于微生物能生活在各种极端环境和贫痔生境中，具有广泛的生态适应性，与人类生活、生存、发展息息相关，而人类活动途径又会对荒漠化产生影响，因此微生物与荒漠化之间有着紧密联系。嗜热、嗜冷、嗜酸、嗜盐碱及寡营养特殊环境微生物经过长期自然选择已适应恶劣环境因子，具备稳定的特殊机能和遗传基因。因此，该类菌的物种资源及分子生物学已在国内外进行了广泛的研究，并且越来越引起人们的重视。经过文献查新结果表明，从环境角度看，目前寡营养细菌主要针对水环境进行研究，而对干早荒漠区抗贫瘠环境的寡营养微生物报道还不多见，也未见一些新发现类似寡营养细菌在生物结皮固定流沙中应用的报道。

发明内容

针对现有技术中未见有关能够筛选性能优良新菌种寡营养细菌并且能够用于固沙的报道，且分离筛选的菌种不仅能够起到固沙作用，而且能为发芽速度较慢的一些植物种子的萌发提供较好的水分条件，使一些因为土壤水分不足不能萌发的植物得到生长发育的技术现状，本发明旨在提供一种沙漠寡营养细菌DOB153及在固沙中的应用。本发明通过在新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠中分离出一批微生物菌株，经过进一步分离、筛选、选育、驯化，获得一株编号为DOB153的芽孢杆菌菌株。分离到的寡营养细菌DOB153菌株制备的菌剂喷施到沙漠中后，不仅起到了粘连砂粒、防治流沙活化，还能有效增加土壤中主要微生物数量，提高土壤主要养分含量，增强部分土壤酶活性，并能明显恢复藻结皮。因此，寡营养细菌DOB153是一种比较理想的固沙生物材料，这为有效恢复生物结皮、修复受损沙地提供了新的方法。

本发明采用的主要技术方案：

通过微生物菌种的分离筛选，在新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠中分离出一批微生物菌株，经过进一步分离、筛选、选育、驯化，获得一株编号为DOB153的芽孢杆菌菌株。通过对所获菌株进行形态特征、生理生化特性及16SrDNA区段DNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位，筛选选育驯化获得一种与常见的芽孢杆菌存在明显不同属性的寡营养细菌菌株。本发明分离筛选的编号为DOB153的菌株能够在寡营养培养基上生长，兼性好氧，同时具有固沙的作用，能够粘连砂粒、防治流沙活化，具有广泛的应用价值。

本发明具体提供一种芽孢杆菌(Bacillussp.)DOB153。通过在新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠中分离、筛选、驯化和培养，获得一批细菌类微生物菌株，从中筛选出一株编号为DOB153的菌株，经微生物学分类与鉴定，属于芽孢杆菌(Bacillussp.)，有别于常见的芽孢杆菌，其属性类似于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，但是有别于常见的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，具有新菌种的典型性，是一种典型的寡营养细菌的新菌种芽孢杆菌(Bacillussp.)。

具体的，本发明通过对新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠中的微生物进行分离、筛选和培养，获得一批微生物菌株，从中筛选出一株编号为DOB153的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株其属性类似于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，但是有别于常见的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)具有新菌种的典型性，是一种典型的寡营养细菌的新菌种，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2015年12月25日，保藏号是CGMCCNo.11926。经微生物学鉴定为芽孢杆菌(Bacillussp.)。该菌株革兰氏染色呈阳性、好氧、产芽孢，最适宜温度为28～35℃。菌株可在寡营养培养基R2A培养基及1/5TSA培养基上良好生长，也可在常用细菌培养基，如在LB培养基中生长。其中，采用R2A培养基平板30℃恒温培养，菌落呈圆形、边缘整齐、略凸起、淡黄色、半透明、粘稠易挑取，培养后期中间有皱褶。形态学显微观察，菌体呈杆状，1.2-1.5μm×2-4μm，菌体两端钝圆，有鞭毛，无荚膜。培养8h菌体有芽孢形成，其芽孢芽孢为椭圆形，中生或次端生，菌体不膨大。菌种形态参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对菌株进行分类鉴定，初步确定为芽孢杆菌属菌株。通过16SrRNA基因序列测定及比对，并建立系统发育树分析，结果表明菌株属于芽孢杆菌属(BacillusSp.)，其与NCBI报道菌株BacilluspsychrosaccharolyticusATCC23296^T同源性最高，最高相似性为96.6％，初步断定为该属潜在新种。以BiologMicrostation系统的GPIII测定卡进行测试，其D-纤维二糖，龙胆二糖，蔗糖，D-松二糖，α-D-乳糖，蜜二糖，N-乙酰-D-葡糖胺，N-乙酰-β-D-甘露糖胺，α-D-葡糖，D-甘露糖，D-果糖，D-半乳糖，3-甲酰葡糖，D-果糖，D-甘露醇，D-阿拉伯醇，肌醇，甘油，D-葡糖-6-磷酸，D-果糖-6-磷酸，D-天冬氨酸，D-丝氨酸，明胶，L-谷氨酸，林肯霉素，洁霉素，果胶，L-半乳糖醛酸内酯，D-葡糖酸，D-葡糖醛酸葡糖醛酰胺，粘酸，粘液酸，奎宁酸，糖质酸，L-苹果酸，γ-氨基-丁酸，α-羟基-丁酸，β-羟基-D,L丁酸，乙酰乙酸，甲酸利用均呈阳性结果，判定为芽孢杆菌属一新种，确定该菌建议的生物学命名为Bacillussp.DOB153。

进一步，本发明提供一种Bacillussp.DOB153DOB153CGMCCNO.11926在固沙中的应用。通过利用DOB153菌株制备的菌剂喷施到沙漠中后，不仅起到了粘连砂粒、防治流沙活化，还能有效增加土壤中主要微生物数量，提高土壤主要养分含量，增强部分土壤酶活性，并能明显恢复藻结皮。因此，寡营养细菌DOB153是一种比较理想的固沙生物材料，这为有效恢复生物结皮、修复受损沙地提供了新的方法。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:

(1)本发明提供的菌株Bacillussp.DOB153DOB153CGMCCNO.11926为革兰氏染色呈阳性、好氧、产芽孢，最适宜温度为28～35℃。菌株可在寡营养培养基R2A培养基及1/5TSA培养基上良好生长，也可在常用细菌培养基，如在LB培养基中生长。其中，采用R2A培养基平板30℃恒温培养，菌落呈圆形、边缘整齐、略凸起、淡黄色、半透明、粘稠易挑取，培养后期中间有皱褶。形态学显微观察，菌体呈杆状，1.2～1.5μm×2～4μm，菌体两端钝圆，有鞭毛，无荚膜。培养8h菌体有芽孢形成，其芽孢芽孢为椭圆形，中生或次端生，菌体不膨大。菌种形态参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对菌株进行分类鉴定，初步确定为芽孢杆菌属菌株，具有较强的生长繁殖能力，生长速率快，遗传特性稳定。

(2)本发明提供的菌株Bacillussp.DOB153DOB153CGMCCNO.11926通过16SrRNA基因序列测定及比对，并建立系统发育树分析，结果表明菌株属于芽孢杆菌属(BacillusSp.)，其与NCBI报道菌株BacilluspsychrosaccharolyticusATCC23296^T同源性最高，最高相似性为96.6％，初步断定为该属潜在新种。以BiologMicrostation系统的GPIII测定卡进行测试，其D-纤维二糖，龙胆二糖，蔗糖，D-松二糖，α-D-乳糖，蜜二糖，N-乙酰-D-葡糖胺，N-乙酰-β-D-甘露糖胺，α-D-葡糖，D-甘露糖，D-果糖，D-半乳糖，3-甲酰葡糖，D-果糖，D-甘露醇，D-阿拉伯醇，肌醇，甘油，D-葡糖-6-磷酸，D-果糖-6-磷酸，D-天冬氨酸，D-丝氨酸，明胶，L-谷氨酸，林肯霉素，洁霉素，果胶，L-半乳糖醛酸内酯，D-葡糖酸，D-葡糖醛酸葡糖醛酰胺，粘酸，粘液酸，奎宁酸，糖质酸，L-苹果酸，γ-氨基-丁酸，α-羟基-丁酸，β-羟基-D,L丁酸，乙酰乙酸，甲酸利用均呈阳性结果，判定为芽孢杆菌属一新种，确定该菌建议的生物学命名为Bacillussp.DOB153。具有生物固沙功能，分泌胞外多糖，产生淀粉酶、纤维素酶，水解淀粉，降解甘露聚糖、木聚糖、纤维素。

(3)本发明筛选的Bacillussp.DOB153DOB153CGMCCNO.11926制备的菌液使用于沙漠表面不仅能够起到固沙作用，而且可以为发芽速度较慢的一些植物种子的萌发提供较好的水分条件，使一些因为土壤水分不足不能萌发的植物得到生长发育，

(4)本发明筛选的Bacillussp.DOB153DOB153CGMCCNO.11926制备的菌剂喷施到沙漠中后，不仅起到了粘连砂粒、防治流沙活化，还能有效增加土壤中主要微生物数量，提高土壤主要养分含量，增强部分土壤酶活性，并能明显恢复藻结皮。因此，寡营养细菌DOB153是一种比较理想的固沙生物材料，这为有效恢复生物结皮、修复受损沙地提供了新的方法。

附图说明

图1显示为寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926的系统进化发育树图。

图2显示为寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926的保水实验效果图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

实施例一：寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926的分离、筛选及鉴定

1、菌种的分离和筛选

本发明所使用的沙漠寡营养细菌从新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠取样分离，根据菌种作用机理分析，初步筛选出能够在LB培养基上生长的菌株。利用传统的平板培养法分离出新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠中的微生物，利用初筛和复筛进行筛选菌种，平板划线法纯化菌株，通过比较菌种在LB培养基上的生长繁殖情况，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选出综合性能好的一株编号为DOB153的沙漠寡营养细菌菌株。

分离步骤：采用微生物分离的梯度稀释法得到一系列的梯度稀释液，用灭菌吸管分别吸取I0^-1-10^-5稀释度的混合菌稀释液0.lmL，分别移放到倒有LB固体培养基的平板上，用无菌玻璃棒涂布均匀，然后倒置于37℃的恒温培养箱中培养至长出单菌落，在无菌操作台中以无菌接种环挑取平板上长出的单菌落接种到装有LB固体培养基的平板上划线分离待长出单菌落后，再次转入灭菌试管斜面上，每株菌每次做三个重复，置于37℃条件下培养3～5天。利用透过光、反射光及暗背景的光线观察菌落的一致性，涂片染色用光学显微镜观察菌体的一致性，经多次反复分离纯化直到菌落及个体均匀一致后备用。将纯化后的菌株一部分采用冻干物安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4℃直接用于后续研究。

所述的LB培养基:蛋白陈10g，酵母膏5g，Nacl10g，10g～15g琼脂粉，蒸馏l000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。

本发明提供的菌株DOB153，可在适合其增殖的固体培养基或液体培养基中进行增殖培养。利用常规固体斜面培养培养、低温保藏的方法，每次传代可保藏3个月以上；以干燥冷冻法制做的长期保藏菌种，可保藏1年以上；或是以甘油管进行长期保藏。

2、菌株DOB153的生理生化鉴定

具体的，本发明通过对新疆准噶尔盆地古尔班通古特沙漠中的微生物进行分离、筛选和培养，获得一批微生物菌株，从中筛选出一株编号为DOB153的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于Bacillussp.。本发明采用菌株编号为DOB153的菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2015年12月25日，保藏号是CGMCCNo.11926。经微生物学鉴定疑似短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，但其属性特点有别于常见的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，属于芽孢杆菌(Bacillussp.)，建议命名为Bacillussp.DOB153。该菌株为革兰氏阳性杆菌，1.2-1.5μm×2-4μm，菌体两端钝圆，有鞭毛，无荚膜，单个或呈短链状排列。在LB培养基上生长8小时以后可以形成芽孢，其芽孢为椭圆形，中生或次端生，芽孢大小为1.0-1.2μm×1.5-2.0μm，可在寡营养培养基上生长，兼性好氧，最适宜温度为28～35℃。在LB上可生长良好，菌落较小，半透明，中间皱褶，边缘光滑，具有生物固沙功能，分泌胞外多糖，产生卵磷脂酶、酪蛋白酶、明胶酶、过氧化氢酶；经微生物学鉴定为Bacilluspumilus菌。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第八版和《常用细菌系统鉴定手册》对编号为DOB153菌株进行鉴定，结合生理生化综合检测确定菌种编号为DOB153的菌株为芽孢杆菌(Bacillussp.)中的成员，命名为Bacillussp.DOB153。

形态特征：该菌种经LB琼脂培养基分离培养，挑取疑似芽孢杆菌的菌落进行显微镜观察，革兰氏染色呈阳性、好氧、产芽孢，最适宜温度为28～35℃。菌株可在寡营养培养基R2A培养基及1/5TSA培养基上良好生长，也可在常用细菌培养基，如在LB培养基中生长。其中，采用R2A培养基平板30℃恒温培养，菌落呈圆形、边缘整齐、略凸起、淡黄色、半透明、粘稠易挑取，培养后期中间有皱褶。形态学显微观察，菌体呈杆状，1.2～1.5μm×2～4μm，菌体两端钝圆，有鞭毛，无荚膜。培养8h菌体有芽孢形成，其芽孢芽孢为椭圆形，中生或次端生，菌体不膨大。菌种形态参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌鉴定手册》对菌株进行分类鉴定，初步确定为芽孢杆菌属菌株。

R2A培养基：配方：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5，磷酸氢二钾0.3g，K₂HPO₄0.3g，MgSO₄0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15.0，蒸馏水1000mL，pH值7.2左右。

1/5TSA培养基：胰蛋白胨5.0g，大豆胨1.0g,NaCl10g15.0g,琼脂15.0，蒸馏水1000mL，pH值7.2左右。

LB培养基：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,琼脂15.0，蒸馏水1000mL，pH值7.2左右。

氧利用试验：将琼脂培养基装入试管后灭菌，待冷却至45-50℃时做好标记，无菌操作吸取菌株的菌悬液加入试管中，双手快速搓动试管，避免振荡使过多的空气混入培养基，待菌种均匀分布于培养基内后，将试管置于冰浴中，使琼脂迅速凝固，将其静置于37℃恒温培养箱保温48h后开始连续进行观察记录，直至结果清晰为止。结果表明：该菌均为兼性好氧菌。

最适生长温度试验：以无菌操作吸取菌株的菌悬液加入液体培养基中，观察试验菌株在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃时的生长情况，菌体的生长量以Du800型分光光度计680nm处所测定的光密度值的大小表示。如果遇到不能生长时，则至少观察15-20天，以充分肯定其能否生长。每一温度重复3次。结果表明，寡营养细菌DOB153的最适宜温度为28-35℃

以BiologMicrostation系统的GPIII测定卡进行测试，其D-纤维二糖，龙胆二糖，蔗糖，D-松二糖，α-D-乳糖，蜜二糖，N-乙酰-D-葡糖胺，N-乙酰-β-D-甘露糖胺，α-D-葡糖，D-甘露糖，D-果糖，D-半乳糖，3-甲酰葡糖，D-果糖，D-甘露醇，D-阿拉伯醇，肌醇，甘油，D-葡糖-6-磷酸，D-果糖-6-磷酸，D-天冬氨酸，D-丝氨酸，明胶，L-谷氨酸，林肯霉素，洁霉素，果胶，L-半乳糖醛酸内酯，D-葡糖酸，D-葡糖醛酸葡糖醛酰胺，粘酸，粘液酸，奎宁酸，糖质酸，L-苹果酸，γ-氨基-丁酸，α-羟基-丁酸，β-羟基-D,L丁酸，乙酰乙酸，甲酸利用均呈阳性结果，判定为芽孢杆菌属一新种，确定该菌参考芽孢杆菌(Bacillussp.)，建议的生物学命名为Bacillussp.DOB153。

通过上述对于菌种寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926的菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测定、耐性试验等试验，与常见的芽孢杆菌相比，参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第八版和《常用细菌系统鉴定手册》的方法进行分类，从菌种分类角度将菌种编号为DOB153的菌株综合鉴定为芽孢杆菌(Bacillussp.)DOB153。

实施例二：寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926的分子水平鉴定

1、PCR扩增寡营养细菌DOB153的DNA序列及其测序

挑取少量寡营养细菌DOB153菌株的单菌落，放入盛有25μL无菌水的EP管中，100℃煮沸8-10min，后迅速放入冰水混合物中5min，离心10000r/min、5min，4℃保存，用时取上清。

16SrDNA基因序列测定及其系统进化树的构建：按常规方法提取寡营养细菌DOB153菌株的总DNA，用去离子水将稀释通用引物进行16SrDNA区段的PCR扩增。

50μl的反应体系含：10×PCR缓冲液5μl，引物各20pmol，模板DNA1μl，TaqTM(TaKaRa公司)0.5U，dNTP8μl。PCR扩增条件：95℃预变性5min，94℃45sec，55℃1min，72℃1min循环30次，72℃10min修复延伸，4℃终止反应。PCR产物的纯化：PCR产物进行1％琼脂糖凝胶中电泳，用TaKaRaPCRFragmentRecoveryKit从胶中回收目的片段，溶于30μl的高纯水中。送至测序公司进行16SrDNA区段序列的测定，菌种寡营养细菌DOB153的基因序列参见附后的基因序列表。

aacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagccagttgttgagtttactcaacaattagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctataagactgggataacttctggaaaccggagctaataccggatatgttcttctcttgcatgagagaagatggaaagacggtctcggctgtcacttatagatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcaacgatgcgtagtcgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcgcagactcctacgcgaggcagcagtagggaatcttccgcaatgaacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgaacgatgaaggctttcgggtcgtaaagttctgttgttagggaagaccaagtgccagagtaactgctggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaattacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggttccttaagtctgatgtcagagccaatggctcaaccggggagggtcattggaaactttggaacttgagtgtagaagagcatagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctataactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctgttagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttaccgggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctgggcgatacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggttgtgacatcctctgacactcctagagttaggacgttccccttcgggggacagagtgacacgtggtgcatgcggtgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatccagtaaggcactctacggtgactgcctgtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcaacatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagagctgcaaacccgtgagtgtaagcgaatctcatagagccattctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagctggaatcgctagtaatcgcccatcagcatgccgcggtgaatacgtctccggaccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccgcaaggagctagccgcctaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatca

3、16SrDNA基因序列比对及系统发育分析

将测序得到的16SrDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16SrDNA序列，将寡营养细菌DOB153的16SrDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后，构建系统进化树。参见附图1所示，

通过16SrRNA基因序列测定及比对，并建立系统发育树分析，结果表明菌株属于芽孢杆菌属(Bacillussp.)，其与NCBI报道菌株BacilluspsychrosaccharolyticusATCC23296^T同源性最高，最高相似性为96.6％，初步断定为该属潜在新种。其属性类似于短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)，但是有别于常见的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)具有新菌种的典型性，是一种典型的寡营养细菌的新菌种芽孢杆菌(Bacillussp.)，综合结合寡营养细菌DOB153的形态结构特征及生理生化特性，确定其为菌种编号为DOB153综合鉴定为寡营养细菌Bacillussp.。

实施例三：寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926的特性研究

1、实验过程

将寡营养细菌DOB153在LB培养基上反复划线活化后，用于液体菌剂的制备，接种后置37℃摇瓶培养60h。

(1)固沙试验

用流沙装长30cm×宽20cm×高5cm的磁盘2个，将流沙装入盘中，把经过摇床震荡培，养后的寡营养细菌DOB153喷洒在其中一个沙盘的流沙表面，另一个沙盘喷洒等量的自来水作为对照。

(2)保水试验

取己知烘干恒重的坩埚20个(其中10个喷水作对照，10个喷寡营养细菌DOB153的菌液)称重，记为W₁，分别称30g沙子装入这20个坩埚中，向其中10个装沙的坩埚各喷6g寡营养细菌DOB153的菌液作为试验组，向另外10个装沙的坩埚各喷水6g作为对照组，记为W₂。将这20个坩埚置于恒温培养箱中，在第2天、第4天、第6天、第8天和第10天，分别取出试验组和对照组各2个，置于105℃烘箱中烘2-3小时，冷却后称重，记为W₃，采用烘重法测定其土壤含水量。

(3)保苗试验

在10个花盆内均装等量沙子，均喷等量水，向每一花盆内均匀撒种，乌拉尔甘草、中麻黄各50粒，然后均覆土40g，置于窗台使其自然生长，待生长2-3天后，甘草、麻黄均出土记完数后，喷洒寡营养细菌DOB153菌液。设置不同浓度梯度向花盆中喷洒菌液均30ml，设置1组对照和4组菌液浓度梯度25％、50％、75％、100％，每组做三个重复，每天记录平均存活苗数，直至第7天，可初步看出菌液是否具有保苗作用。

2、实验结果

(1)固沙试验结果

喷洒自来水的对照沙盘表面无结皮的形成；喷洒菌液的试验沙盘表面形成了约6mm的结皮层，该试验结果表明使用寡营养细菌DOB153菌液喷洒在流沙表面可以起到固沙、防止流沙表面活化的作用。

(2)保水试验效果

参见附图2。喷洒菌液的试验沙盘和喷洒自来水的对照沙盘25℃的条件下放置10天，测定其土壤含水量，结果表明，实验组和对照组虽然均有水分的流失，但随着时间的延长试验组水分的流失的速率比对照组要慢，尤其是8d后，对照组水分流失率迅速加大，因此使用该菌液喷洒流沙表面具有一定的保水作用。

(3)保苗试验效果

寡营养细菌DOB153菌液喷洒在流沙表面的保苗试验效果。待出苗，喷洒不同浓度菌液后的第7天，己经出土的幼苗大部分又由于干旱的原因慢慢死去。但可以明显看出，喷洒水的幼苗存活天数最短，死得最快，而喷洒寡营养细菌DOB153菌液的幼苗存活天数较长，死得较慢，但并不是菌液浓度越高幼苗存活的天数越长，因此适宜的菌液浓度可以起到一定的保苗效果。

可见，在流沙表面喷洒的寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926菌液形成结皮，与喷洒等量水的对照相比，可使土壤中水分蒸发速度减慢，延长土壤持水时间。因此如果将该寡营养细菌DOB153菌液使用于沙漠表面不仅能够起到固沙作用，而且可能为发芽速度较慢的一些植物种子的萌发提供较好的水分条件，使一些因为土壤水分不足不能萌发的植物得到生长发育。

实施例四:寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926对古尔班通古特沙漠土壤环境的影响

1、实验过程

将寡营养细菌DOB153在LB培养基上反复划线活化后，用于液体菌剂的制备，接种后置35℃摇瓶培养60h，制备获得寡营养细菌DOB153菌剂。

在古尔班通古特沙漠的腹地选择2个5m×5m的流沙区作为试验样地，设置2个处理，即喷洒寡营养细菌DOB153菌剂和不喷洒，后者为对照。1个月后分别采集各样方0-2cm和2-5cm土样进行土壤微生物种群数量、土壤酶活性、对环境的适应性、孢子植物的测定，每个土样均设3个重复。

2、实验结果

(1)喷洒寡营养细菌DOB153菌剂对不同土层主要微生物分布的影响

实验结果见表1，寡营养细菌DOB153菌剂的施加，影响了土壤原有微生物类群的数量特征。对照各土层，喷洒寡营养细菌菌剂后，各类微生物数量均有较明显的增加。对细菌而言，对照样地0-2cm层的细菌数量显著小于2-5cm土层，而喷洒寡营养细菌DOB153菌剂的样地内，细菌的分布规律表现为表层大于次表层，而且0-2cm层的细菌数量显著高于对照。喷洒寡营养细菌后，各土层的真菌和放线，菌数量均有所增加。寡营养细菌DOB153菌剂中的寡营养细菌DOB153进入土壤后，对其他微生物的生长繁殖起到了一定的促进作用，对土壤微生物活性的提高有一定帮助。

表1不同处理样地土壤主要微生物类群数量特征

(2)喷洒寡营养细菌DOB153菌剂对不同土层土壤酶活性的影响

与对照相比，寡营养细菌DOB153的施加，对测试土壤中5种酶活性均有不同程度的影响。提高了0-2cm和2-5cm土层的过氧化氢酶和多酚氧化酶活性。脲酶活性的变化在2个土层中呈相反趋势，表现为上层脲酶活性升高，而下层活性降低。酶活性的不同响应与土壤养分的改变有关。

(3)寡营养细菌对环境的适应性

喷洒寡营养细菌菌剂后，0-2cm土层和2-5cm土层寡营养细菌数量均有所增加，其中2-5cm土层是对照的3.41倍(P＜0.05)；而且喷洒处理后，2-5cm土层寡营养细菌数量显著(P＜0.05)大于0-2cm土层，且是后者的4.61倍。说明喷洒处理后，寡营养细菌成为土壤中的优势菌群，不仅可以适应土壤环境，而且能够较好地生长和繁殖。这样以来，它不仅可以通过自身新陈代谢分泌黏性物质，粘连砂粒起到固沙作用，又可减少对其他微生物的营养资源竞争。

(4)喷洒寡营养细菌DOB153菌剂对生物结皮形成的影响

蓝藻是藻结皮中的优势种，对生物结皮的早期形成与恢复起着非常重要的作用。本研究表明，见表2，对裸沙区喷洒寡营养细菌DOB153菌剂后，蓝藻数量明显增加(200-300个/g土)，而对照区蓝藻极少(10-20个/g土)，表明寡营养细菌DOB153具有促进藻结皮形成的作用，但在2个样地内均未发现地衣和苔藓结皮。

表2不同处理下土壤中主要孢子植物类群的变化

名称	蓝藻	地衣	苔藓
				喷洒寡营养细菌DOB153菌剂	250-350个	0个	0个
未喷洒喷洒寡营养细菌DOB153菌剂	10-20个	0个	0个

从上述评价可以看出，本发明利用自行筛选分离驯化的寡营养细菌Bacillussp.DOB153CGMCCNO.11926施加到沙土后，不仅起到了粘连砂粒、防治流沙活化，还能有效增加土壤中主要微生物数量，提高土壤主要养分含量，增强部分土壤酶活性，并能明显恢复藻结皮。因此，寡营养细菌DOB153是一种比较理想的固沙生物材料，这为有效恢复生物结皮、修复受损沙地提供了新的方法。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

SEQUENCELISTING

<110>新疆大学；毛培宏

<120>一种沙漠寡营养细菌DOB153及在固沙中的应用

<130>DOB153

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1508

<212>DNA

<213>DOB153

<220>

<221>DOB153

<222>(1)..(1508)

<400>1

aacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagccagttgttgagtttactcaacaat60

tagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctataagactgggataacttctg120

gaaaccggagctaataccggatatgttcttctcttgcatgagagaagatggaaagacggt180

ctcggctgtcacttatagatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaatggctc240

accaaggcaacgatgcgtagtcgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagaca300

cggcgcagactcctacgcgaggcagcagtagggaatcttccgcaatgaacgaaagtctga360

cggagcaacgccgcgtgaacgatgaaggctttcgggtcgtaaagttctgttgttagggaa420

gaccaagtgccagagtaactgctggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggcta480

attacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggc540

gtaaagcgcgcgcaggtggttccttaagtctgatgtcagagccaatggctcaaccgggga600

gggtcattggaaactttggaacttgagtgtagaagagcatagtggaattccacgtgtagc660

ggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctataa720

ctgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctgttagtccacg780

ccgtaaacgatgagtgctaagtgttaccgggtttccgccctttagtgctgcagctaacgc840

attaagcactccgcctgggcgatacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggg900

gcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccagg960

ttgtgacatcctctgacactcctagagttaggacgttccccttcgggggacagagtgaca1020

cgtggtgcatgcggtgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacga1080

gcgcaacccttgatcttagttgccagcatccagtaaggcactctacggtgactgcctgtg1140

ataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcaacatgccccttatgacctgggctac1200

acacgtgctacaatggatggtacaaagagctgcaaacccgtgagtgtaagcgaatctcat1260

agagccattctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagctggaatcgcta1320

gtaatcgcccatcagcatgccgcggtgaatacgtctccggaccttgtacacaccgcccgt1380

cacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccgcaaggagctagccgcc1440

taaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcgg1500

ctggatca1508

Claims (3)

1.一种沙漠寡营养细菌Bacillussp.DOB153，其特征在于，所述的沙漠寡营养细菌Bacillussp.DOB153的保藏编号为CGMCCNO.11926。

2.如权利要求1所述沙漠寡营养细菌Bacillussp.DOB153的基因序列如SEQUENCELISTING。

3.如权利要求1所述沙漠寡营养细菌Bacillussp.DOB153在固沙中的应用。