CN109576336A - 一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法 - Google Patents

一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，包括提供巴氏芽孢杆菌菌液和胶结芽孢杆菌菌液、砂土试样矿化以及砂土试样固化。本发明先利用巴氏芽孢杆菌诱导碳酸钙沉淀在砂土颗粒的孔隙中，进行初步固结。再利用胶结芽孢杆菌在生命活动周期中分泌的胞外多糖继续填充在砂土颗粒的孔隙之中，进行二次固结，增强固化能力，具有很好的研究和应用价值。本发明通过采用巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土的方法，使得固化后砂土的内部颗粒连接致密，黏结效果更好且粘聚力增加。通过采用本发明的联合固土方法对砂土进行固化后，固化后的砂土整体强度较高。并且此联合固土的方法改善了巴氏芽孢杆菌单独固土产生的脆性破坏的特性。

Description

一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法
技术领域
本发明涉及沙漠土壤固化的技术领域，尤其涉及一种胶结芽孢杆菌与巴 氏芽孢杆菌联合固土的方法。
背景技术
随着我国人口的增长和社会的发展，对建设用地的需求不断增大。而我 国的可耕地面积越来越少，因此如何利用潜在的土地成为当今重要的研究方 向。沙漠是一块潜在的利用土地。治理好沙漠，有利于产业结构的调整，使 农林牧副渔全面发展。而由于人类的活动对自然界的破坏，沙漠化越来越严 重，沙漠化也成了世界上几乎所有国家都要解决的问题。
而治理沙漠，则先要解决砂土固化的问题。传统的方法，一般会采用化 学固剂对砂土进行加固，而化学固剂大多含有有毒的化学物质，会造成环境 污染问题。为避免造成环境污染，利用绿色环保的微生物进行砂土固结，但 是效果不佳，且存在脆性破坏的特性，出现斜面裂缝。为此，急需研究一种 绿色环保且固结砂土效果好的固土方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方 法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种巴氏芽孢杆菌与胶结 芽孢杆菌联合固土方法，包括以下步骤：
一、提供巴氏芽孢杆菌菌液和胶结芽孢杆菌菌液；
其中，所述巴氏芽孢杆菌菌液和所述胶结芽孢杆菌菌液相互独立属于单 独的两种液体，所述巴氏芽孢杆菌菌液的OD600值为0.6～0.8，所述胶结芽 孢杆菌菌液的OD600值为1.0～2.0；
二、砂土试样矿化；
先将所述巴氏芽孢杆菌菌液与砂土按照质量比1：4的比例混合，搅拌均 匀制备成砂土试样，然后将整个砂土试样浸入粘结液中，浸泡4～9d后取出 烘干；其中，所述粘结液包括2g/L～5g/L NutrientBroth、0.5mol/L～1mol/L 的CO(NH2)2、0.5mol/L～1.0mol/L的CaCl2·2H2O、0.1mol/L～0.5mol/L的NH4Cl、 0.01mol/L～0.1mol/L的NaHCO3；
三、砂土试样固化；
将矿化后的砂土试样整个浸入胶结芽孢杆菌菌液中，浸泡4～7d后取出。
优选的，所述巴氏芽孢杆菌菌液通过将巴氏芽孢杆菌接种至一号培养基 中获取得到，所述一号培养基在每升蒸馏水中包括酵母粉15～20g/L、硫酸铵 7～10g/L、Tris 13～18g/L。
优选的，所述巴氏芽孢杆菌菌液在制备时，先将巴氏芽孢杆菌按照1％的 接种量接种到所述一号培养基中，然后再将所述一号培养基放入震荡箱中并 恒温培养2～3d，培养温度30～35℃，震荡箱转速160～200r/min。
优选的，所述胶结芽孢杆菌菌液通过将胶结芽孢杆菌接种至二号培养基 中获取得到，所述二号培养基在每升蒸馏水中包括酵母粉16～21g/L、10～ 15g/L蔗糖。
优选的，所述胶结芽孢杆菌菌液在在制备时，先将胶结芽孢杆菌按照2％ 的接种量接种到所述二号液体培养基中，然后再将所述二号液体培养基放入 震荡箱中进行震荡培养，振荡温度30～37℃，震荡箱转速140～180r/min， pH值为7～9，培养时长1～2d。
优选的，所述胶结芽孢杆菌是从内蒙古沙漠红黏土中分离纯化得到。
本发明还提供另外一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，包 括以下步骤：
A、提供混合菌液；
所述混合菌液同时采用巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌，所述混合菌液中 巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌的体积比为(2:1)～(4:1)；
B、砂土试样固化；
将所述混合菌液与砂土按照质量比(1:2.5)～(1:4.5)的比例混合搅 拌均匀制备成砂土试样，并使整个砂土试样浸入所述粘结液中，浸泡7～9d 后取出；其中，所述粘结液包括2g/L～5g/L NutrientBroth、0.5mol/L～1mol/L 的CO(NH2)2、0.5mol/L～1.0mol/L的CaCl2·2H2O、0.1mol/L～0.5mol/L的NH4Cl、 0.01mol/L～0.1mol/L的NaHCO3。
优选的，所述混合菌液是通过将巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌同时接种 至三号培养基中获取得到的。
优选的，所述三号培养基包括酵母粉、硫酸铵、Tris、蔗糖和蒸馏水， 在每升蒸馏水中，酵母粉占23～28g，硫酸铵占7～10g，Tris占13～18g， 蔗糖占8～12g。
优选的，所述步骤A中混合菌液的制备方法还可以先将巴氏芽孢杆菌接 种到所述三号液体培养基中，培养18～26h后，再将胶结芽孢杆菌接种到所 述三号液体培养基种并与巴氏芽孢杆菌共同培养22～28h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、先利用巴氏芽孢杆菌诱导碳酸钙沉淀在砂土颗粒的孔隙中，进行初步 固结。再利用胶结芽孢杆菌在生命活动周期中分泌的胞外多糖继续填充在砂 土颗粒的孔隙之中，进行二次固结，增强固化能力，具有很好的研究和应用 价值；
2、通过采用巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土的方法，使得固化后 砂土内部颗粒连接致密，黏结效果更好且粘聚力增加。固化后的砂土整体强 度较高，并且此联合固土的方法还改善了巴氏芽孢杆菌单独固土产生的脆性 破坏的特性。
生物材料保藏
本发明所提供的胶结芽孢杆菌的菌株是GiLi 1#，微生物名称为芽孢杆 菌Bacillus sp.，已于2018年07月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所)，保藏中心登记号为CGMCC No.16169。
附图说明
图1为实施例1中联合固土方法的流程图；
图2为实施例1中砂土试样矿化后，进行强度实验后，砂土试样被破坏 的示意图；
图3为实施例1中砂土试样固化后，进行强度实验后，砂土试样的示意 图；
图4为实施例2中联合固土方法的流程图；
图5为胶结芽孢杆菌分离方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而 不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做 出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
菌株是用于砂土的改良与固化的微生物。其是一种具有矿化能力以及粘 合固化能力的细菌，并且在岩土工程中提高土的力学性能，具有很好的应用 前景。
实施例1
参考图1至图3，一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，包括 以下步骤：
一、提供巴氏芽孢杆菌菌液和胶结芽孢杆菌菌液；
其中，所述巴氏芽孢杆菌菌液和所述胶结芽孢杆菌菌液相互独立属于单 独的两种液体。所述巴氏芽孢杆菌菌液的OD600值为0.6～0.8，所述胶结芽 孢杆菌菌液的OD600值为1.0～2.0。巴氏芽孢杆菌菌液和胶结芽孢杆菌菌液 具体的制备方法如下：
1)巴氏芽孢杆菌菌液制备；
所述巴氏芽孢杆菌菌液通过将巴氏芽孢杆菌接种至一号培养基中获取得 到。一号培养基在每升蒸馏水中包括酵母粉15～20g/L、硫酸铵7～10g/L、 Tris 13～18g/L。具体的，所述巴氏芽孢杆菌菌液在制备时，先将巴氏芽孢 杆菌按照1％的接种量接种到所述一号培养基中。然后再将所述一号培养基放 入震荡箱中并恒温培养2～3d。其中，培养温度30～35℃，震荡箱转速160～ 200r/min。
2)巴氏芽孢杆菌菌液制备；
所述胶结芽孢杆菌菌液通过将胶结芽孢杆菌接种至二号培养基中获取得 到。二号培养基在每升蒸馏水中包括酵母粉16～21g/L、10～15g/L蔗糖。具 体的，所胶结芽孢杆菌菌液在在制备时，先将胶结芽孢杆菌按照2％的接种量 接种到所述二号液体培养基中。然后再将所述二号液体培养基放入震荡箱中 进行震荡培养。其中，振荡温度30～37℃，震荡箱转速140～180r/min，pH 值为7～9，培养时长1～2d。
二、砂土试样矿化；
先将所述巴氏芽孢杆菌菌液与砂土按照质量比1：4的比例混合，搅拌均 匀制备成砂土试样，然后将整个砂土试样浸入粘结液中，浸泡4～9d后取出 烘干。其中，所述粘结液包括2g/L～5g/L NutrientBroth、0.5mol/L～1mol/L 的CO(NH2)2、0.5mol/L～1.0mol/L的CaCl2·2H2O、0.1mol/L～0.5mol/L的NH4Cl、 0.01mol/L～0.1mol/L的NaHCO3。粘结液可以为巴氏芽孢杆菌菌液中的菌株的 生长提供所需的营养以及钙源。这样巴氏芽孢杆菌菌液中的菌株在新陈代谢 过程中充分发挥其矿化能力，不断诱导碳酸钙沉淀在砂土颗粒孔隙中，使砂 土得到固结。
三、砂土试样固化；
将矿化后的砂土试样整个浸入胶结芽孢杆菌菌液中，浸泡4～7d后取出。
本实施例中，具体的是将粒径0.075mm～2.0mm的砂土150g～160g与40ml 巴氏芽孢杆菌菌液混合搅拌均匀，并制备成尺寸为50×50mm的砂土试样。再 将尺寸为50×50mm的砂土试样完全浸入粘结液中，然后用打氧泵通入氧气。 使微生物与营养液充分反应4～9天，即对砂土试样进行矿化。然后再将矿化 好的砂土试样整个浸入胶结芽孢杆菌菌液中，浸泡4～7天对砂土试样进行固 化。利用地基承载力检测仪分别对矿化好的砂土试样和固化好的砂土试样进 行强度测试，其结果如图2和图3所示。从图2和图3，可以明显看出，巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土的效果，远强于巴氏芽孢杆菌单独固土的 效果。且巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固化的砂土试样强度和均匀性效 果较好，土颗粒间连接致密，粘聚力增加，整体强度较高。这是因为巴氏芽 孢杆菌矿化诱导形成的碳酸钙后的土颗粒以及碳酸钙之间仍然存在孔隙，固 结不稳。
在本实施例中，通过利用巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌两种菌种，对砂 土进行联合固化。先利用巴氏芽孢杆菌诱导碳酸钙沉淀在砂土颗粒的孔隙中， 进行初步固结。再利用胶结芽孢杆菌在生命活动周期中分泌的胞外多糖继续 填充在孔隙之中，进行二次固结，增强固化能力。
实施例2
参考图4，一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，还可以采用 以下步骤：
A、提供混合菌液；
所述混合菌液同时采用巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌，所述混合菌液中 巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌的体积比为(2:1)～(4:1)。其具体的制备方 法如下：
所述混合菌液是通过将巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌同时接种至三号培 养基中获取得到的。所述三号培养基包括酵母粉、硫酸铵、Tris、蔗糖和蒸 馏水。在每升蒸馏水中，酵母粉占23～28g，硫酸铵占7～10g，Tris占13～ 18g，蔗糖占8～12g。所述混合菌液在三号培养基中具体的培养过程同实施例1所述。
B、砂土试样固化；
将所述混合菌液与砂土按照质量比(1:2.5)～(1:4.5)的比例混合搅 拌均匀制备成砂土试样，并使整个砂土试样浸入所述粘结液中，浸泡7～9d 后取出；其中，所述粘结液包括2g/L～5g/L NutrientBroth、0.5mol/L～1mol/L 的CO(NH2)2、0.5mol/L～1.0mol/L的CaCl2·2H2O、0.1mol/L～0.5mol/L的NH4Cl、 0.01mol/L～0.1mol/L的NaHCO3。
本实施例中，混合菌液的制备方法还可以先将巴氏芽孢杆菌接种到所述 三号液体培养基中，培养18～26h后，再将胶结芽孢杆菌接种到所述三号液 体培养基种并与巴氏芽孢杆菌共同培养22～28h。
实施例3
实施例1和实施例2中应用的胶结芽孢杆菌均是从内蒙古沙漠红黏土中 分离纯化得到。其具体的分离方法如下：
参考图5，胶结芽孢杆菌的分离方法包括以下步骤：
S1、从内蒙古沙漠土中取地表120～150cm处的沙漠土n克，放入10n克 的无菌蒸馏水中振摇15～20min后静置12h，取上清液备用；
S2、将上清液接种至一号液体培养基中，进行恒温振荡培养；
S3、按稀释的浓度梯度，将步骤S2中恒温震荡培养后的液体制备成不同 浓度的稀释溶液，并将所述不同浓度的稀释溶液分别涂布于上表面具有一号 固体培养基的平板上，然后进行恒温培养，培养时间1～2d，培养温度30～ 37℃。其中，采用恒温培养箱对所述平板进行恒温培养。
S4、选取步骤S3中固体培养基上的单菌落，接种至二号液体培养基中培 养，然后选取在二号液体培养基中培养1～2d的菌液进行固化实验验证。所 述固化实验验证包括以下步骤：
a、选取在所述二号液体培养基中培养1～2d的菌液后，将5ml所述菌液 和10g砂土混合搅拌均匀，并制备成块状砂土试样；
b、使用地基承载力检测仪对所述块状砂土试样进行检测。
S5、选取步骤S4中固化效果最好的单菌落继续接种至二号固体培养基中， 反复划线，进行5～6次纯化培养，得到所述沙漠自源固化菌株。
其中，所述恒温振荡培养的条件为：振荡温度30～37℃，振荡频率140～ 180r/min，pH为培养基自然pH，培养时长1～2d；所述一号液体培养基和二 号液体培养基均包括酵母粉、蔗糖和蒸馏水，在每升蒸馏水中，酵母粉占16～ 21g、蔗糖占10～15g；所述一号固体培养基和二号固体培养基均包括酵母粉、 蔗糖、琼脂粉和蒸馏水，在每升蒸馏水中，酵母粉占16～21g、蔗糖占10～ 15g、琼脂粉占15～20g；所述步骤S3中的浓度梯度为：10-4、10-5、10-6和10-7。
经16srDNA测序并构建系统发育树，表明本实施例中分离出的菌株可归 属为芽孢杆菌属(Bacillus)，命名为GiLi 1#。且该芽孢杆菌属为革兰氏阳 性，好氧性菌。芽孢杆菌经16srDNA测序后，得到的核苷酸序列表如表1所 示：
表1分离得到的沙漠自源固化菌株的核苷酸序列测定表
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而 言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行 多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限 定。
序列表
<110> 内蒙古工业大学
<120> 一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp.)
<400> 1
gcaagtcgag cggacagaag ggagcttgct cccggatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggagc taataccgga 120
tagttccttg aaccgcatgg ttcaaggatg aaagacggtt tcggctgtca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgggg taatggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcg agagtaactg 420
ctcgcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactgggaaa 600
cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg 660
gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc 720
gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780
tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840
gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900
tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaacc 960
ctagagatag ggctttccct tcggggacag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080
agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca 1200
aagggctgca agaccgcaag gtttagccaa tcccataaat ctgttctcag ttcggatcgc 1260
agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgcaacacc 1380
cgaagtcggt gaggtaacct ttatggagcc agc 1413

Claims (10)

1.一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，包括以下步骤：
一、提供巴氏芽孢杆菌菌液和胶结芽孢杆菌菌液；
其中，所述巴氏芽孢杆菌菌液和所述胶结芽孢杆菌菌液相互独立，属于单独的两种液体；所述巴氏芽孢杆菌菌液的OD600值为0.6～0.8，所述胶结芽孢杆菌菌液的OD600值为1.0～2.0；
二、砂土试样矿化；
先将所述巴氏芽孢杆菌菌液与砂土按照质量比1：4的比例混合，搅拌均匀制备成砂土试样，然后将整个砂土试样浸入粘结液中，浸泡4～9d后取出烘干；其中，所述粘结液包括2g/L～5g/LNutrientBroth、0.5mol/L～1mol/L的CO(NH2)2、0.5mol/L～1.0mol/L的CaCl2·2H2O、0.1mol/L～0.5mol/L的NH4Cl、0.01mol/L～0.1mol/L的NaHCO3；
三、砂土试样固化；
将矿化后的砂土试样整个浸入胶结芽孢杆菌菌液中，浸泡4～7d后取出。
2.根据权利要求1所述的巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，所述巴氏芽孢杆菌菌液通过将巴氏芽孢杆菌接种至一号培养基中获取得到，所述一号培养基在每升蒸馏水中包括酵母粉15～20g/L、硫酸铵7～10g/L、Tris13～18g/L。
3.根据权利要求2所述的巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，所述巴氏芽孢杆菌菌液在制备时，先将巴氏芽孢杆菌按照1％的接种量接种到所述一号培养基中，然后再将所述一号培养基放入震荡箱中并恒温培养2～3d，培养温度30～35℃，震荡箱转速160～200r/min。
4.根据权利要求1所述的巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，所述胶结芽孢杆菌菌液通过将胶结芽孢杆菌接种至二号培养基中获取得到，所述二号培养基在每升蒸馏水中包括酵母粉16～21g/L、10～15g/L蔗糖。
5.根据权利要求4所述的巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，所述胶结芽孢杆菌菌液在在制备时，先将胶结芽孢杆菌按照2％的接种量接种到所述二号液体培养基中，然后再将所述二号液体培养基放入震荡箱中进行震荡培养，振荡温度30～37℃，震荡箱转速140～180r/min，pH值为7～9，培养时长1～2d。
6.根据权利要求2所述的巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，所述胶结芽孢杆菌是从内蒙古沙漠红黏土中分离纯化得到。
7.一种巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提供混合菌液；
所述混合菌液同时采用巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌，所述混合菌液中巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌的体积比为(2:1)～(4:1)；
B、砂土试样固化；
将所述混合菌液与砂土按照质量比(1:2.5)～(1:4.5)的比例混合搅拌均匀制备成砂土试样，并使整个砂土试样浸入所述粘结液中，浸泡7～9d后取出；其中，所述粘结液包括2g/L～5g/LNutrientBroth、0.5mol/L～1mol/L的CO(NH2)2、0.5mol/L～1.0mol/L的CaCl2·2H2O、0.1mol/L～0.5mol/L的NH4Cl、0.01mol/L～0.1mol/L的NaHCO3。
8.根据权利要求7所述的巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，所述混合菌液是通过将巴氏芽孢杆菌和胶结芽孢杆菌同时接种至三号培养基中获取得到的。
9.根据权利要求8所述的巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，所述三号培养基包括酵母粉、硫酸铵、Tris、蔗糖和蒸馏水，在每升蒸馏水中，酵母粉占23～28g，硫酸铵占7～10g，Tris占13～18g，蔗糖占8～12g。
10.根据权利要求7所述的巴氏芽孢杆菌与胶结芽孢杆菌联合固土方法，其特征在于，所述步骤A中混合菌液的制备方法还可以先将巴氏芽孢杆菌接种到所述三号液体培养基中，培养18～26h后，再将胶结芽孢杆菌接种到所述三号液体培养基种并与巴氏芽孢杆菌共同培养22～28h。
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