CN109666610A - 沙漠自源固化菌株的分离方法及其固化砂土能力验证方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了沙漠自源固化菌株的分离方法及其固化砂土能力验证方法。菌株的分离方法如下:从内蒙古沙漠中取深度120~150cm处的沙漠土壤,放入液体培养基中振荡并制备成不同浓度的稀释溶液,然后不同浓度的稀释溶液将分别涂布于固体培养基上,进行恒温培养。再挑取固体培养基上的单菌落进行试培养并选取有固化效果的菌落,反复划线5‑6次进行纯化,直至出现单菌落并选为所述沙漠自源固化菌株。本发明通过分离纯化技术从混杂的天然微生物中分离出芽孢杆菌,其具有很好的研究和应用价值,并适合在砂类土壤的结皮与改良中大规模推广。芽孢杆菌作为一种新型固化土壤的微生物菌种,其具有很好的固化能力。
Description
技术领域
本发明涉及沙漠自源固化菌株制备技术领域,尤其涉及沙漠自源固化菌株的分离方法及其固化砂土能力验证方法。
背景技术
沙漠化是当前社会每个国家都面临的问题。对沙漠治理,首先需对沙漠中的砂土进行固结。避免采用化学固剂进行固结而带来的环境污染,目前大多利用绿色环保的微生物对砂土进行固结。这其中,因胶结芽孢杆菌(芽孢杆菌的一种)能分解硅酸盐和铝硅酸盐及其他矿石中的含钾矿物,并且具有溶磷、释钾和固氮功能,其能明显的改良土壤性质并提高土壤保水保肥。因此,如何从沙漠土壤中分离出胶结芽孢杆菌,达到以沙制沙的目的,是一个重要的研究方向。
发明内容
本发明的目的在于提供沙漠自源固化菌株的分离方法及其固化砂土能力验证方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:沙漠自源固化菌株的分离方法,其分离得到的沙漠自源固化菌株用于改良和固化易风化砂土,其特征在于,包括以下步骤:
S1、从内蒙古沙漠土中取地表120~150cm处的沙漠土n克,放入10n克的无菌蒸馏水中振摇15~20min后静置12h,取上清液备用;
S2、将上清液接种至一号液体培养基中,进行恒温振荡培养;
S3、按稀释的浓度梯度,将步骤S2中恒温震荡培养后的液体制备成不同浓度的稀释溶液,并将所述不同浓度的稀释溶液分别涂布于上表面具有一号固体培养基的平板上,然后进行恒温培养,培养时间1~2d,培养温度30~ 37℃;
S4、选取步骤S3中固体培养基上的单菌落,接种至二号液体培养基中培养,然后选取在二号液体培养基中培养1~2d的菌液进行固化实验验证;
S5、选取步骤S4中固化效果最好的单菌落继续接种至二号固体培养基中,反复划线,进行5~6次纯化培养,得到所述沙漠自源固化菌株。
优选的,所述步骤S2中一号液体培养基进行恒温振荡培养的条件如下:
振荡温度30~37℃,振荡频率140~180r/min,pH为培养基自然pH,培养时长1~2d。
优选的,所述一号液体培养基和二号液体培养基均包括酵母粉、蔗糖和蒸馏水,在每升蒸馏水中,酵母粉占16~21g、蔗糖占10~15g。
优选的,所述一号固体培养基和二号固体培养基均包括酵母粉、蔗糖、琼脂粉和蒸馏水,在每升蒸馏水中,酵母粉占16~21g、蔗糖占10~15g、琼脂粉占15~20g。
优选的,所述步骤S3中的浓度梯度为:10-4、10-5、10-6和10-7。
优选的,采用恒温培养箱对所述平板进行恒温培养。
优选的,所述固化实验包括以下步骤:
a、选取在所述二号液体培养基中培养1~2d的菌液后,将5ml所述菌液和10g砂土混合搅拌均匀,并制备成块状砂土试样;
b、使用地基承载力检测仪对所述块状砂土试样进行检测。
本发明还提供沙漠自源固化菌株固结砂土能力的验证方法,包括以下步骤:
1)、采用如权利要求1至7任意一项所述的沙漠自源固化菌株的分离方法,分离得到沙漠自源固化菌株,将沙漠自源固化菌株培养成沙漠自源固化菌液,所述沙漠自源固化菌液的OD600值为1.5~2.5;
2)、将沙漠自源固化菌液和砂土按照质量比(1:3)~(1:5)的比例进行混合并搅拌均匀,并制成砂土试样;
3)、再将所述砂土试样完全浸入固化营养液中,并与固化营养液充分反应5~10天;
4)、对步骤3)中反应后的砂土试样,进行无侧限抗压强度测试,从而验证沙漠自源固化菌株固结砂土的能力。
优选的,所述固化营养液包括酵母粉、硫酸铵、Tris和蒸馏水,在每升蒸馏水中,酵母粉占15~20g、硫酸铵占7~10g、Tris占13~18g。
优选的,所述砂土的粒径为0.074mm~2mm。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明通过分离纯化技术从混杂的天然微生物中分离出芽孢杆菌。芽孢杆菌作为一种新型固化土壤的微生物菌种,其具有很好的固化能力。利用芽孢杆菌产生的胞外多糖,使得砂土试件的颗粒黏结更紧。其具有很好的研究和应用价值,适合在砂类土壤的结皮与改良中大规模推广。
2、利用分离得到的芽孢杆菌对砂土进行固结,不会破坏原有土壤的生态环境且也不需要诱导碳酸钙沉淀对砂土进行固结,对沙漠的不利影响大大降低。
生物材料的保藏
本发明所提供的芽孢杆菌菌株是GiLi 1#,微生物名称为芽孢杆菌 Bacillussp.,已于2018年07月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所),保藏中心登记号为CGMCC No.16169。
附图说明
图1为本发明沙漠自源固化菌株分离方法的流程图;
图2为本发明沙漠自源固化菌株的系统发育树的示意图;
图3为本发明分离得到的沙漠自源固化菌株的SEM扫描电镜图像;
图4为本发明沙漠自源固化菌株固结砂土能力的验证方法的流程图;
图5为固化的砂土试样的SEM扫描电镜图像;
图6为固化的砂土试样进行无侧限抗压强度实验后,砂土试样被破坏示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
菌株是用于砂土的改良与固化的微生物,是一种具有固化能力的细菌。且菌株在岩土工程中能提高土的力学性能,具有很好的应用前景。
实施例1
参考图1和图2,沙漠自源固化菌株的分离方法,其分离得到的沙漠自源固化菌株用于改良和固化易风化砂土,包括以下步骤:
S1、从内蒙古沙漠土中取地表120~150cm处的沙漠土n克,放入10n克的无菌蒸馏水中振摇15~20min后静置12h,取上清液备用;
S2、将上清液接种至一号液体培养基中,进行恒温振荡培养,振荡温度 30~37℃,振荡频率140~180r/min,pH为培养基自然pH,培养时长1~2d;
S3、按稀释的浓度梯度,将步骤S2中恒温震荡培养后的液体制备成不同浓度的稀释溶液,并将所述不同浓度的稀释溶液分别涂布于上表面具有一号固体培养基的平板上,然后进行恒温培养,培养时间1~2d,培养温度30~ 37℃。其中,采用恒温培养箱对所述平板进行恒温培养。
S4、选取步骤S3中固体培养基上的单菌落,接种至二号液体培养基中培养,然后选取在二号液体培养基中培养1~2d的菌液进行固化实验验证。所述固化实验验证包括以下步骤:
a、选取在所述二号液体培养基中培养1~2d的菌液后,将5ml所述菌液和10g砂土混合搅拌均匀,并制备成块状砂土试样;
b、使用地基承载力检测仪对所述块状砂土试样进行检测。
S5、选取步骤S4中固化效果最好的单菌落继续接种至二号固体培养基中,反复划线,进行5~6次纯化培养,得到所述沙漠自源固化菌株。
其中,所述一号液体培养基和二号液体培养基均包括酵母粉、蔗糖和蒸馏水,在每升蒸馏水中,酵母粉占16~21g、蔗糖占10~15g;所述一号固体培养基和二号固体培养基均包括酵母粉、蔗糖、琼脂粉和蒸馏水,在每升蒸馏水中,酵母粉占16~21g、蔗糖占10~15g、琼脂粉占15~20g;所述步骤 S3中的浓度梯度为:10-4、10-5、10-6和10-7。所述一号液体培养基、二号液体培养基、一号固体培养基以及二号固体培养基中的最佳碳源、最佳氮源以及有无Tris是通过以下实验方法选择的:
将一号培养基和二号培养基中的碳源均分别替换成蛋白胨、乳糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉,接种量为1%,测生长曲线,得到蔗糖是最适合芽孢杆菌的碳源。再将一号培养基和二号培养基中的氮源均分别替换成牛肉膏、酵母粉、蚕蛹粉、尿素、蛋白胨,接种量为1%,测生长曲线,得到酵母粉是最适合芽孢杆菌的氮源。进行去Tris试验,接种量1%,测生长曲线,得到在无Tris的培养基中芽孢杆菌生长情况更佳。
利用细菌的16SrDNA序列测序的方法对本实施例分离得到的沙漠自源固化菌株经进行测序,测序结果如表1所示。根据测序的结果和利用NJ法构建的系统发育树(如图2所示),可以得出本实施例分离得到的沙漠自源固化菌株可归属为芽孢杆菌属(Bacillus)并命名为GiLi 1#。此外,通过扫描电镜图(如图3所示)可以清晰观察到分离出的沙漠自源固化菌株的大小均匀,形状为杆状且平均长为1.5μm~2.5μm。其中,本发明中16SrDNA的序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司进行。
表1本发明分离得到的沙漠自源固化菌株的核苷酸序列测定表
实施例2
对实施例1分离得到的沙漠自源固化菌株的固化能力进行验证,保证其可以被应用于砂土固化中。
参考图4,沙漠自源固化菌株固结砂土能力的验证方法,包括以下步骤:
1)、采用实施例1中的沙漠自源固化菌株的分离方法,分离得到沙漠自源固化菌株。将沙漠自源固化菌株培养成沙漠自源固化菌液。所述沙漠自源固化菌液的OD600值为1.5~2.5;
2)、将步骤1)中的沙漠自源固化菌液和砂土按照质量比(1:3)~(1:5) 进行混合并搅拌均匀,并制成砂土试样。所述砂土的粒径为0.074mm~2mm。
3)、再将所述砂土试样完全浸入固化营养液中,并与固化营养液充分反应5~10天。其中,所述固化营养液包括酵母粉、硫酸铵、Tris和蒸馏水。在每升蒸馏水中,酵母粉占15~20g、硫酸铵占7~10g、Tris占13~18g。
4)、对步骤3)中反应后的砂土试样,进行无侧限抗压强度测试,从而验证沙漠自源固化菌株固结砂土的能力。
在本实施例中,将质量为150g~160g且粒径为0.074mm~2mm的砂土与 40ml的沙漠自源固化菌液混合并搅拌均匀。然后制备成尺寸为50×50mm的砂土试件,并将砂土试件完全浸入固化营养液中。接着通入氧气,使沙漠自源固化菌液与固化营养液充分反应5~10天,即可得到固化后的砂土试件。然后对固化后的砂土试件进行无侧限抗压强度实验和SEM电镜扫描。
如图5所示,通过SEM扫描电镜图像可以清晰看到固化后的砂土试件的砂土内部被粘结性物质包裹粘结。无侧限抗压强度实验结果表明,当沙漠自源固化菌液的OD600值为1.5~2.5时,砂土试件的强度范围为0.3~0.6MPa。具体的,当沙漠自源固化菌液的OD600值为2.5时,砂土试件的强度达到 0.6MPa。如图6所示,当加载大压力超过0.6MPa时,砂土试件裂缝呈现斜面破坏。
通过本实施例的验证结果,可以得知从沙漠分离得到的沙漠自源固化菌株具有很好的固结砂土的能力,其提高了砂土内部颗粒的粘聚力,能够被应用于沙漠砂土固化中。具体的原理如下:利用沙漠自源固化菌不断产生胞外多糖,并填充与砂土内部的颗粒孔隙中,使砂土得到固结。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 内蒙古工业大学
<120> 沙漠自源固化菌株的分离方法及其固化砂土能力验证方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp.)
<400> 1
gcaagtcgag cggacagaag ggagcttgct cccggatgtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggagc taataccgga 120
tagttccttg aaccgcatgg ttcaaggatg aaagacggtt tcggctgtca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgggg taatggctca ccaaggcgac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcg agagtaactg 420
ctcgcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg 480
taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactgggaaa 600
cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg 660
gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc 720
gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag 780
tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840
gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca 900
tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacaacc 960
ctagagatag ggctttccct tcggggacag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020
tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc 1080
agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140
acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca 1200
aagggctgca agaccgcaag gtttagccaa tcccataaat ctgttctcag ttcggatcgc 1260
agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg 1320
gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt ttgcaacacc 1380
cgaagtcggt gaggtaacct ttatggagcc agc 1413
Claims (10)
1.沙漠自源固化菌株的分离方法,其分离得到的沙漠自源固化菌株用于改良和固化易风化砂土,其特征在于,包括以下步骤:
S1、从内蒙古沙漠土中取地表120~150cm处的沙漠土n克,放入10n克的无菌蒸馏水中振摇15~20min后静置12h,取上清液备用;
S2、将上清液接种至一号液体培养基中,进行恒温振荡培养;
S3、按稀释的浓度梯度,将步骤S2中恒温震荡培养后的液体制备成不同浓度的稀释溶液,并将所述不同浓度的稀释溶液分别涂布于上表面具有一号固体培养基的平板上,然后进行恒温培养,培养时间1~2d,培养温度30~37℃;
S4、选取步骤S3中固体培养基上的单菌落,接种至二号液体培养基中培养,然后选取在二号液体培养基中培养1~2d的菌液进行固化实验验证;
S5、选取步骤S4中固化效果最好的单菌落继续接种至二号固体培养基中,反复划线,进行5~6次纯化培养,得到所述沙漠自源固化菌株。
2.根据权利要求1所述的沙漠自源固化菌株的分离方法,其特征在于,所述步骤S2中一号液体培养基进行恒温振荡培养的条件如下:
振荡温度30~37℃,振荡频率140~180r/min,pH为培养基自然pH,培养时长1~2d。
3.根据权利要求1所述的沙漠自源固化菌株的分离方法,其特征在于,所述一号液体培养基和二号液体培养基均包括酵母粉、蔗糖和蒸馏水,在每升蒸馏水中,酵母粉占16~21g、蔗糖占10~15g;
所述一号固体培养基和二号固体培养基均包括酵母粉、蔗糖、琼脂粉和蒸馏水,在每升蒸馏水中,酵母粉占16~21g、蔗糖占10~15g、琼脂粉占15~20g。
4.根据权利要求1所述的沙漠自源固化菌株的分离方法,其特征在于,所述步骤S3中的浓度梯度为:10-4、10-5、10-6和10-7。
5.根据权利要求1所述的沙漠自源固化菌株的分离方法,其特征在于,采用恒温培养箱对所述平板进行恒温培养。
6.根据权利要求1所述的一种沙漠自源固化菌株的分离方法,其特征在于,所述固化实验包括以下步骤:
a、选取在所述二号液体培养基中培养1~2d的菌液,将5ml所述菌液和10g砂土混合搅拌均匀,并制备成块状砂土试样;
b、使用地基承载力检测仪对所述块状砂土试样进行检测。
7.根据权利要求1所述的沙漠自源固化菌株的分离方法,其特征在于,分离得到的沙漠自源固化菌株为杆状,其平均长为1.5μm~2.5μm。
8.沙漠自源固化菌株固结砂土能力的验证方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)、采用如权利要求1至7任意一项所述的沙漠自源固化菌株的分离方法,分离得到沙漠自源固化菌株,将沙漠自源固化菌株培养成沙漠自源固化菌液,所述沙漠自源固化菌液的OD600值为1.5~2.5;
2)、将沙漠自源固化菌液和砂土按照质量比(1:3)~(1:5)的比例进行混合并搅拌均匀,并制成砂土试样;
3)、再将所述砂土试样完全浸入固化营养液中,并与固化营养液充分反应5~10天;
4)、对步骤3)中反应后的砂土试样,进行无侧限抗压强度测试,从而验证沙漠自源固化菌株固结砂土的能力。
9.根据权利要求8所述的沙漠自源固化菌株固结砂土能力的验证方法,其特征在于,所述固化营养液包括酵母粉、硫酸铵、Tris和蒸馏水,在每升蒸馏水中,酵母粉占15~20g、硫酸铵占7~10g、Tris占13~18g。
10.根据权利要求8所述的沙漠自源固化菌株固结砂土能力的验证方法,其特征在于,所述砂土的粒径为0.074mm~2mm。
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