CN103396960A - 蜡样芽孢杆菌b2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治核桃枝枯病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌B2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治核桃枝枯病中的应用，该菌株于2010年6月14日分离自四川雅安市天全县杂交竹根际。经形态，生理，分子鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；该菌株已于2013年6月20日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO：7767，分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。B2菌株对病原菌的作用不仅局限在寄主枝干表皮部位抑制病原菌的定殖和生长，对病原菌在寄主表皮内的繁殖和扩散也起到较好的抑制作用。

Description

蜡样芽孢杆菌B2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治核桃枝枯病中的应用

技术领域

本发明涉及的是一种蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）B2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治核桃枝枯病中的应用。

背景技术

核桃枝枯病（Melanconium juglandinum Kunze.）主要为害枝干。多发生在1～2年生枝条上，有些地区普遍发生，病枝率可高达20%～30%。造成大量枝条枯死，对树体发育和核桃产量影响很大。受害枝条皮层变为暗灰褐色，后渐变成浅红褐色或灰色，大枝病部下陷。病死枝干的木栓层下散生分生孢子盘，成熟后大量孢子从盘中央顶破木栓层，病枝上散生小米粒大的黑点（分生孢子盘），直径0.2～0.3毫米，初期呈黑色短枝状物，湿度大时软化为黑色突起的孢子堆，直径约1～3毫米。目前主要采用化学防治和营林技术，而生物防治措施研究尚未涉及。化学防治虽是一种有效的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用。而与环境友好的生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持续发展的重要组成部分。核桃枝枯病尚未涉及生物防治，该技术是生态学领域的一个应用学科分支，是基于生态平衡的原理，引进有益生物基因或基因产物，达到稳定、有效地防治靶标病（虫），生物农药(biopesticides)是利用生物活体或者其代谢产物对有害生物进行防治的一类制剂，是生物防治的物质基础和重要手段。

发明内容

本发明人在杂交竹根际中发现蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）一新菌株B2，能有效防治核桃枝枯病。

该菌株于2010年6月14日分离自四川雅安市天全县杂交竹根际。经形态，生理，分子鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；该菌株已于2013年6月20日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO：7767，分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。

含有所述的B2菌株的液体制剂。

所述的液体制剂的制作方法，包括以下步骤：

①一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种蜡样芽孢杆菌B2菌株后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。

②二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种蜡样芽孢杆菌B2斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成蜡样芽孢杆菌B2菌株液体种子。

③液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种B2液体种子，接种量体积比10%，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B2菌株液体制剂；所述的营养肉质培养液：牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL。

B2菌株对病原菌的作用不仅局限在寄主枝干表皮部位抑制病原菌的定殖和生长，对病原菌在寄主表皮内的繁殖和扩散也起到较好的抑制作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

（一）蜡样芽孢杆菌B2菌株筛选

1.1供试病原菌

供试病原菌为核桃黑盘孢[Melanconium juglandinum Kunze]。

1.2芽孢的分离和纯化

取杂交竹根际土壤（表层10cm以下）装入无菌样品袋带回实验室，备用。每份样品称量10g转至装有90mL生理盐水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分混匀后制成土壤悬浮液，放入100℃水浴中加热5min。冷却后，无菌条件下取1mL加入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀得到10^-2的样品稀释液，按照此法依次稀释，分别获得10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的土壤稀释液，取10^-3、10^-4、10^-5和10^-6的土壤稀释液各0.1mL，分别采用稀释平板涂布法将其涂布在LB培养基上，倒置在30℃恒温培养箱中，48h后根据菌落形态特征，挑取单菌落进行平板划线，以保证菌落纯度，分别保存于斜面中，保存备用。

1.3生防芽孢杆菌的初筛

将斜面培养的产孢核桃黑盘孢用无菌水洗出分生孢子，用移液枪取1mL加入无菌培养皿中，然后倒入45℃左右的PDA培养基15mL，充分混合均匀，冷却后制成含菌平板。采用点菌法，接种分离获得的芽孢杆菌，倒置在30℃恒温培养箱中，24h后观察有无抑菌圈产生进行生防芽孢杆菌的筛选，并做好记录。

分离共获得36株芽孢杆菌，根据菌落形态、颜色、边缘、光学特性以及是否产生色素进行合并后，共25株。分别通过点菌法进行拮抗测定，筛选出核桃黑盘孢具有较强拮抗做用的菌株6株。抑菌圈直径达到5mm以上的共3株，其中B2菌株拮抗作用最强，抑菌圈直径均达到16mm左右；其次是B22，抑菌圈直径均达到9mm左右；B20抑菌圈最小，仅达到5mm。B2菌株经形态、生理、分子鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）；该B2菌株已于2013年6月20日保藏在中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC NO：7767，分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。

1.4发酵液活性的测定（复筛）

1.3筛选出抑菌活性较强的芽孢杆菌菌株，活化后分别将其接种于LB肉汤培养液中，30℃，120r/min的恒温摇床中培养，培养24h后，作为种子液以1:1比例加入含有葡萄糖的LB肉汤培养基，30℃，120r/min的恒温摇床中培养48h后取出，用牛津杯法和打孔法进行抑菌试验，检测发酵液是否有抑菌活性。

待测生防菌株发酵后，静置，取上清液，3500r/min，离心5min，取上清液分别采用打孔法、牛津杯法对指示病原菌进行拮抗测定。

采用打孔法，将指示病原菌分生孢子接种在平板上，直径5mm打孔器打孔后，在孔中加入待测的生防菌发酵液，测得B22、B20基本不产生抑菌圈，而B2菌株抑菌圈直径达到22mm±0.5mm，说明B2核桃黑盘孢具有较好的抑制作用。

采用牛津杯法对发酵液进行拮抗活性的测定，测得B2具有一定的拮抗活性，发酵液对病原菌的抑菌圈直径达到14mm±0.4mm，而B22和B20基本看不出抑菌圈，发酵液无抑菌活性。

1.5发酵滤液活性的测定

用移液枪吸取5mL经过24h培养的种子液，加入装有45mL含葡萄糖的LB肉汤培养液的250mL三角瓶中，30℃，120r/min的恒温摇床中培养，36h后，经3000r/min，离心5min后，取上清液，用0.2μm细菌过滤器过滤，获得无细胞发酵滤液。取0.1mL病原菌稀释液涂布于平板上，采用牛津杯法、打孔法测定发酵滤液对病原菌的抑菌活性，重复3次，并设对照，2d后测量抑菌圈直径。

同时对发酵液进行121℃，15min高温处理，按照上述方法检测拮抗活性的有无。

结合1.3和1.4实验结果，筛选出最佳生防芽孢杆菌进行后续试验。

B2菌株经发酵后，取其上清液用细菌过滤器（直径0.2μm）过滤后获得无菌发酵滤液，用打孔法和牛津杯法分别测定抑菌活性测定。结果表明，B2菌株经发酵后获得无细胞发酵滤液对指示病原菌表现出一定的拮抗效果，打孔法和牛津杯法产生的抑菌圈带宽分别为4mm±0.5mm和3mm±0.2mm。发酵滤液经过121℃，15min高温处理后仍具有拮抗活性，说明抑菌代谢产物具有耐热性。

1.6盆栽试验

选取一年生盆栽核桃种苗为实验对象。筛选出的生防菌经发酵后，取其发酵液采用喷雾法对种苗进行喷雾，每隔7d喷施1次（共3次），并以无菌水作对照。一个月后采用针刺接种法将病原菌接种在幼苗的枝干处，每处理接种100个部位，并对接种部位进行保湿，每处理重复3次。

病原菌接种30d后，按照表1中病害分级标准进行病害调查统计，并计算发病率，病情指数和防治效果。接种后60d，对病斑扩展和新增情况进行调查统计，计算病斑增长率和相对防效。

表1核桃枝枯病害分级标准

级别	代表值	发病枝条比例或病斑横径占树径周长的比例（x）
			Ⅰ	0	0
Ⅱ	1	x＜1/3
			Ⅲ	2	1/3≤x＜2/3
Ⅳ	3	2/3≤x＜4/5(枝条)或1/2≤x＜2/3(径周)
			Ⅴ	4	整株死亡

表2盆栽试验30d后的防治效果

注：大小写字母分别为p<0.05和p<0.01水平上具有显著性差异。

接种病原菌30d后，生防菌B2发酵液对核桃枝枯病表现出良好的保护效果，防治效果随稀释倍数的增加而降低。从表2可以看出，B2菌株发酵原液的防治效果达到了90.69%，说明在接种病原的核桃枝干上喷洒B2发酵液，发病率明显降低，仅为9%，核桃枝枯病菌的定殖、生长受到抑制，从而降低了病原菌危害寄主的几率。

B2菌株发酵液经稀释后，表现出不同的防治效果，在稀释500倍时，防治效果为68.29%，而1000倍时，防治效果不到50%，因此选用50倍，100倍，500倍稀释液用于大田试验的测定。

表3盆栽试验60d后的防治效果

接种病原菌60d后（表3），尽管病斑有少量增加，旧病斑有所增大，但与对照相比，病斑增长速度明显减缓，说明B2菌株对病原菌的作用不仅局限在寄主枝干表皮部位抑制病原菌的定殖和生长，对病原菌在寄主表皮内的繁殖和扩散也起到较好的抑制作用。

（二）田间防治实例

1、B2菌株液体制剂制作

①一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂17g，水1000mL），接种蜡样芽孢杆菌B2菌株后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。

②二级液体种子：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL）经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种蜡样芽孢杆菌B2斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成蜡样芽孢杆菌B2菌株液体种子。

③液体发酵：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL，核桃枝浸渍液制法：新鲜核桃枝10g在1000ml水中煮沸10分钟，保持水量，除去叶片滤液即可）经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种B2液体种子，接种量10%(体积比)，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B2菌株液体制剂。

④制剂保存：瓶装制剂常温保存半年或低温（4度）1年半不影响防治和治疗效果。

2、田间涂抹治疗

拮抗菌发酵后，将发酵原液稀释成1×10⁹cfu/mL的发酵液，并在此基础上依次配制50倍、100倍、500倍的稀释液。

先将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取稀释液对发病部位进行涂抹，以蘸取无菌水涂抹作对照。每处理设50个病斑，间隔7d一次，共5次。每处理重复4次。

分别在涂抹前和在最后一次涂抹后的第30d进行调查统计，记录发病植株数、发病程度以及治愈病斑数，并计算病情指数增长率、防治效果和病斑治愈率。

发病率、病情指数、防治效果同上计算。

采用涂抹法防治（表4），发酵液原液治愈率高达86%，50倍、100倍和500倍稀释液的治愈率分别为82%、80%和64%，其中50倍和100倍稀释液处理差异不显著。可以看出，涂抹法的防效与B2发酵液含菌量有关，稀释倍数与防治效果成反比。尽管B2的发酵液原液防效最佳，但生产成本较高，50倍和100倍稀释液防效相差不大，且防效和治愈率均在80%以上，如应用于实践生产，从经济角度考虑，应在50倍和100倍稀释液两种处理中进行选择。

表4采用涂抹法对核桃枝枯病的田间防治效果

注：大小写字母分别为p<0.05和p<0.01水平上具有显著性差异。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）B2菌株，所述B2菌株保藏编号为CGMCC NO：7767。

2.含有权利要求1所述的B2菌株的液体制剂。

3.权利要求1或2所述的B2菌株或液体制剂在防治核桃枝枯病中的应用。

4.权利要求2所述的液体制剂的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

①一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种蜡样芽孢杆菌B2菌株后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。

②二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种蜡样芽孢杆菌B2斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养36h，制成蜡样芽孢杆菌B2菌株液体种子。

③液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种B2液体种子，接种量体积比10%，温度26-28℃，初始pH值6.0，120r/min振荡培养72h，制成B2菌株液体制剂；所述的营养肉质培养液：牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，核桃枝浸渍液1000mL。