CN103555618B

CN103555618B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在治疗松烂皮病中的应用

Info

Publication number: CN103555618B
Application number: CN201310494921.3A
Authority: CN
Inventors: 朱天辉; 朱涵明月; 李姝江; 张静; 刘洋; 韩珊; 谯天敏; 张丽娜
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-10-21
Filing date: 2013-10-21
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2033-10-21
Also published as: CN103555618A

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在治疗松烂皮病中的应用，该菌株的分类命名为解淀粉芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens，完整命名为解淀粉芽孢杆菌Ba4，已于2013年9月12日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8177。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Ba4能够有效治疗松烂皮病。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在治疗松烂皮病中的应用

技术领域

本发明涉及生态学领域，尤其涉及的是一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在治疗松烂皮病中的应用。

背景技术

松烂皮病（Cenangium ferruginosum）是世界著名松属病害，发生在2～10年生枝干上，主要为害皮层部份，苗木、幼树到成年树均可受害，轻者枝条枯死，重者全株死亡。1～3月间，部分小枝、侧枝或主干上部的针叶先变为黄绿至灰绿色，后逐渐变成褐色至红褐色，此时病枝干与健康枝干相比无明显变化。到3月末，当针叶变为红褐色时，被害枝干则明显表现出因失水而收缩起皱的病状。针叶逐渐脱落，叶痕处稍膨大。小枝被害时，则易干枯死亡，表现枯枝病状。若侧枝基部的皮部发病，侧枝则枯死下垂，呈弯曲状。主干发病时，病部开始有轻微的流脂现象，随后流脂加剧，病皮亦逐渐干缩下陷，发生溃疡呈烂皮状。患病皮层易与木质部分离。4月份，病部膨大部分破裂，在皮下生出病菌子实体即子囊盘，初为黄褐色，后呈暗褐色，逐渐变大，单生或数个簇生，到5月下旬至6月上旬即成熟。成熟的子囊盘呈杯状或盘状，雨后张开变大，表面为淡黄褐色，干后收缩变黑并僵化。目前主要采用化学防治和营林技术，而生物防治措施研究尚未涉及。化学防治虽是一种有效的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用。而与环境友好的生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持续发展的重要组成部分。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在治疗松烂皮病中的缺陷，提供了一株解淀粉芽孢杆菌及其液体制剂在治疗松烂皮病中的应用。

本发明的技术方案如下：

一株解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌，Bacillus amyloliquefaciens，已于2013年09月12日保藏在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8177。

所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，包括以下步骤：

（1）一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基，接种解淀粉芽孢杆菌后，培养制成一级种子；

（2）二级液体种子：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种解淀粉芽孢杆菌斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，振荡培养，制成解淀粉芽孢杆菌液体种子；

（3）液体发酵：营养肉质培养液经高压灭菌后，在通氧控制下，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例装瓶，在无菌状态接种解淀粉芽孢杆菌液体种子，接种量为液体总体积的10%，振荡培养，制成解淀粉芽孢杆菌液体制剂，然后保存。

所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂17g，水1000mL。

所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其营养肉质培养液的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，松枝条浸渍液1000mL。

所述的制作方法得到液体制剂。

所述的液体制剂在治疗松烂皮病中的应用，是将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取液体制剂稀释液对发病部位进行涂抹，间隔7d一次，共5次。

所述的液体制剂在治疗松烂皮病中的应用，其液体制剂稀释液为将液体制剂稀释成1×10⁹cfu/mL的液体制剂，然后再稀释100倍。

本发明能够有效治疗松烂皮病。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1、内生细菌的分离、纯化与保存

在四川广元市朝天区核桃根腐病发生地采集健康核桃根系，带回实验室分离。采回的样本用无菌水冲洗干净，称取1.0g根组织，用70%的酒精消毒30s，无菌水洗3次后，再用4%的NaClO消毒3min后，无菌水洗3次，吸取最后一次洗涤液100μl涂抹NA平板（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min），28℃黑暗培养24h，用于表面消毒的对照，检查表面消毒是否彻底。

将已表面消毒的根部组织剪碎，放入无菌的研钵，加入灭菌的石英砂和10ml无菌水，充分研磨，静置30min，稀释10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5共5个梯度，分别吸取100μl10^-3，10^-4，10^-5这3个梯度研磨液分别涂布NA平板（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，pH7.0，混匀分装后121℃高压灭菌30min），每个处理3次重复，28℃黑暗培养48h，选取生长最为均匀的梯度，进行平板计数。

依据菌落的大小、颜色、是否突起，边缘特征、表面光滑与否、透明度等方面的差异，挑取单菌落在NA平板上划线纯化，纯化后转接NA斜面于4℃保藏备用。共获10个内生细菌。

2、内生细菌对松烂皮病病菌的平板拮抗作用

平板对峙法：在培养皿中央接种7d的松烂皮病病菌（Cenangium ferruginosum）菌饼（直径5mm)，离该病菌饼约3cm处，分别用接种环沾取培养2d的内生菌，在病菌对称两侧各划一条细线，28℃培养，以只接种病菌的平板为对照，待对照长满皿时测量病菌的菌落生长直径，每处理重复3次。按下式计算菌落生长抑制率：

菌落生长抑制率=（对照菌落净生长直径－处理菌落净生长直径）/对照菌落净生长直径×100%

表1是内生细菌7d后对松烂皮病病菌（Cenangium ferruginosum）的拮抗作用，可以看出，有3种内生细菌菌落生长抑制率达73.85%以上，其中Ba4菌株抑制率达96.92%。

表1内生细菌对松烂皮病病菌的拮抗作用（7天）

注：*差异性比较：含相同字母为差异不显著，否则为显著。

3、内生拮抗菌的种类鉴定

经形态学观察，结合生理生化指标（表2）和分子生物学鉴定该内生菌Ba4为B.amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）。

在NA平板培养基上培养了2d的Ba4菌株的单菌落白色，呈圆形，边缘不整齐，表面干燥，有褶皱，无粘性，不透明，G+。

表2菌株Ba4生理生化指标

4、盆栽试验

（1）Ba4生防菌准备：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL）经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种Ba4斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养36h，制成Ba4菌剂。

（2）病原接种与处理

选取3年生盆栽松树为实验对象。用（1）制得的菌剂采用喷雾法对种苗进行喷雾，每隔7d喷施1次（共3次），并以无菌水作对照。一个月后采用针刺接种法将病原菌接种在幼苗的枝干处，每处理接种100个部位，并对接种部位进行保湿，每处理重复3次。

病原菌接种30d后，按照表3中病害分级标准进行病害调查统计，并计算发病率，病情指数和防治效果。

表3核桃枝枯病害分级标准

级别	代表值	发病枝条比例或病斑横径占树径周长的比例（x）
			Ⅰ	0	0
Ⅱ	1	x＜1/3
			Ⅲ	2	1/3≤x＜2/3
Ⅳ	3	2/3≤x＜4/5(枝条)或1/2≤x＜2/3(径周)
			Ⅴ	4	整株死亡

接种病原菌30d后，生防菌Ba4对松树烂皮病菌表现出良好的保护效果，防治效果随稀释倍数的增加而降低。从表4可以看出，Ba4发酵原液的防治效果达到了90.25%，发病率明显降低，仅为8%，松树烂皮病菌的定殖、生长受到抑制，从而降低了病原菌危害寄主的几率。

Ba4经稀释后，表现出不同的防治效果，在稀释500倍时，防治效果为62.66%，而1000倍时，防治效果不到20%，因此选用50倍，100倍，200倍，500倍稀释液用于大田试验的测定。

表4盆栽试验30d后的防治效果

注：大小写字母分别为p<0.05和p<0.01水平上具有显著性差异。

5、田间防治实例

5.1、Ba4液体制剂的制作

（1）一级斜面种子：常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂17g，水1000mL），接种Ba4后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子。

（2）二级液体种子：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，松枝条浸渍液1000mL）经高压灭菌后，按100mL液体盛于300mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种Ba4斜面种子，每瓶接种2支斜面种子，温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养36h，制成Ba4液体种子。

（3）液体发酵：营养肉质培养液（牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，松枝条浸渍液1000mL）经高压灭菌后，按200mL液体盛于500mL三角瓶比例（通氧控制）装瓶，在无菌状态接种B2液体种子，接种量10%（体积比），温度26-28℃，初始pH值7.0，120r/min振荡培养72h，制成Ba4液体制剂。

（4）制剂保存：瓶装制剂常温保存半年或低温（4度）1年半不影响防治和治疗效果。

（5）步骤（2）、（3）中松枝条浸渍液的制备：将10g松枝条在1000ml水中煮沸10分钟，过滤，得到的滤液为松枝条浸渍液。

5.2、林间涂抹治疗

（1）将Ba4液体制剂稀释成1×10⁹cfu/mL的液体制剂，并将1×10⁹cfu/mL的液体制剂依次配制50倍、100倍、200、500倍的稀释液。

（2）先将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取稀释液对发病部位进行涂抹，以蘸取无菌水涂抹作对照。每处理设100个病斑，间隔7d一次，共5次。每处理重复4次。

在涂抹前和在最后一次喷雾（涂抹）后的第30d进行调查统计，记录发病植株数、发病程度以及治愈病斑数，并计算病斑治愈率。

采用涂抹法治疗（表5），液体制剂治愈率高达91%，50倍、100倍、200倍和500倍稀释液的治愈率分别为85%、83%、80%和63%，其中50倍、200倍和100倍稀释液处理差异不显著。可以看出，治疗效果跟Ba4液体制剂含菌量有关，稀释倍数与治愈效果成反比。尽管Ba4的液体制剂治疗效果最佳，但生产成本较高，50倍、200倍和100倍稀释液治疗效果相差不大，且治愈率均在80%以上，如应用于实践生产，从经济角度考虑，应在50倍至100倍稀释液处理中进行选择；建议使用浓度100倍。

表5涂抹法对松烂皮病的田间治疗效果

注：大小写字母分别为p<0.05和p<0.01水平上具有显著性差异。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一株解淀粉芽孢杆菌，其特征是，保藏编号为CGMCC No.8177。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其特征是，包括以下步骤：

3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其特征是，牛肉膏蛋白胨斜面培养基的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂17g，水1000mL。

4.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的液体制剂的制作方法，其特征是，营养肉质培养液的成分为牛肉膏7.0g，蛋白胨10g，NaCl5g，松枝条浸渍液1000mL。

5.根据权利要求2-4任一所述的制作方法得到液体制剂。

6.根据权利要求5所述的液体制剂在治疗松烂皮病中的应用，其特征是，将病斑刮除干净，用无菌棉球蘸取液体制剂稀释液对发病部位进行涂抹，间隔7d一次，共5次。

7.根据权利要求6所述的液体制剂在治疗松烂皮病中的应用，其特征是，液体制剂稀释液为将液体制剂稀释成1×10⁹cfu/mL的液体制剂，然后再稀释100倍。