CN104745514B - 蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌及其复合菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌及其复合菌剂和应用,该菌株分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus?cereus)L5,已于2013年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC?No.7667。本发明还提供了该菌的应用和包括该菌的微生物复合菌剂以及制备方法。本发明的蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5,能够成功定殖于蓝莓根际土壤,并能够促进蓝莓生长。本发明的微生物复合菌剂,实现了蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌等菌株的优化组合,使蓝莓微生物复合菌剂具有更强的针对性和有效性。

Description

蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌及其复合菌剂和应用
技术领域
本发明涉及一株蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌及其复合菌剂和应用。
背景技术
蓝莓属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vacciniumspp.)植物,为多年生小灌木树种。果实营养和医疗价值较高,鲜食及加工品质较好,具有较高的开发利用价值。
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,在有机质分解和养分循环和植物养分利用过程中发挥着关键的作用。接种土壤微生物被普遍认为是一种环境友好、经济有效的提高作物产量和品质的方法。
蓝莓生长需要强酸性(pH4.0~4.8)的土壤条件,在人工栽培条件下一般采用土壤施用硫磺粉的方法来调节和维持,硫磺粉及土壤的强酸性使蓝莓根际土壤的微生物群落结构十分独特。常用的功能微生物接种到蓝莓土壤中,难以存活和定殖,无法产生持续、稳定的功效。
目前蓝莓专用微生物肥料研究和应用的报道较少。专利CN201110128890.0公开了蓝莓菌根真菌(晶粒鬼伞)及其分离方法和用途,主要涉及了一株从长白山野生越橘属植物根系中分离获得的用于接种蓝莓的菌根真菌及其在促进蓝莓生长和提高产量方面的应用。专利CN201010180670.8公开了蓝莓培育及种植用微生态制剂、制备方法和使用方法,是用有机磷细菌、胶冻样芽孢杆菌、乳酸杆菌、蜡状芽孢杆菌、光合菌、固氮根瘤菌、假丝酵母和丝状真菌分别纯化培养后将各菌液混合配制而成,但并未说明这些菌株的来源,也未能证明这些菌株能否在蓝莓根际土壤中存活和定殖。
本发明人已从蓝莓根际土壤中筛选出了一株蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌L13,保藏编号为CGMCCNo.7068,能适应蓝莓特定的根际土壤环境,并能促进蓝莓生长,该菌株及其应用已获国家发明专利授权,专利授权号:2013100166040。利用从蓝莓根际土壤中筛选的根际促生细菌,研制开发适用于蓝莓的复合菌剂,再有针对性的施用到蓝莓根际土壤中,根际促生细菌易于适应田间条件和根际生态环境,能够产生持续稳定的促生功效。但目前关于蓝莓PGPR菌株的筛选和应用的研究极少,蓝莓根际促生细菌菌株资源十分匮乏。
开发和利用蓝莓根际促生细菌菌株资源,研制蓝莓专用的微生物复合菌剂,以改善土壤微生态环境,是目前蓝莓生产的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一株蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌及包含该菌的微生物复合菌剂的制备方法和应用。
本发明为实现上述目的而采用的技术方案是:
一株蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌,该菌株分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)L5,已于2013年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.7667,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌的菌落特征为:在LB平板上培养24h后形成有光泽白色菌落,圆形,不透明;表面粗糙,扁平,不规则;菌体细胞大小为(1~1.2)μm×(3~5)μm;产芽孢,G+,细胞呈杆状。
所述蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌生理生化特征为:明胶液化试验阳性,淀粉水解试验阳性,吲哚试验阳性,伏—普试验阳性,硝酸盐还原试验阳性,卵磷脂酶试验阳性,甘露醇试验阴性,接触酶试验阳性。
所述蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌具有解无机磷能力和产蛋白酶能力,可产生吲哚乙酸(IAA),促进蓝莓的生长。
一株蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌在制备微生物复合菌剂的应用。
所述微生物复合菌剂,包括蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌。试验表明:三菌株之间无拮抗作用。
所述微生物复合菌剂中,所述蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌的数量(CFU)之比为:10:6~10:3~5,三菌株的CFU之比是经试验确定的。蓝莓微生物复合菌剂含活菌数4~6×108cfu/ml。
所述微生物复合菌剂的制备方法,包括以下步骤:将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌,经分别培养后,制备蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌的发酵液,将所得发酵液按蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌的数量(cfu)之比为:10:6~10:3~5,混合均匀制成微生物复合菌剂,其中,微生物复合菌剂含活菌数4~6×108cfu/ml。
具体步骤如下:
(1)所述蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13的培养方法(以下为重量百分比):
①试管种子培养
种子培养基配方为:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,余量为水,pH7.0-7.2。
将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13分别接种到培养基上,30~35℃恒温培养,获得试管种。
②液体发酵培养
液体发酵培养基配方为:乳糖2%,蛋白胨2%,K2HPO40.15%,MgSO4·7H2O0.02%,CaCl20.01%,pH6.2-6.8,余量为水。
将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13试管种子分别接种到液体培养基中,接种量分别为液体培养基体积的10%,于30~35℃摇床培养,培养后得蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5发酵液和纺锤芽孢杆菌L13发酵液。
(2)本发明使用的干酪乳酸杆菌来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),干酪乳酸杆菌菌种编号为1.0580,可以通过商业途径购买,它的培养和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行,得到干酪乳杆菌的发酵液。
(3)将所得发酵液按所含活菌数的数量比混合均匀,得到微生物复合菌剂。
所述步骤(1)中,恒温培养时间为36h。
所述步骤(1)中,所述摇床培养条件是:转速180r/min,培养时间为12h。
所述步骤(3)中,发酵液按所含活菌数的数量比为:蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌的数量(CFU)之比为:10:6~10:3~5。
所述的微生物复合菌剂在促进蓝莓生长的应用。
本发明与现有技术相比,具有如下效果和优点:
(1)本发明的蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5,能够成功定殖于蓝莓根际土壤,并能够促进蓝莓生长。
(2)本发明的微生物复合菌剂,实现了蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌等菌株的优化组合,使蓝莓微生物复合菌剂具有更强的针对性和有效性。
(3)试验证明,蓝莓苗木接种本发明的微生物复合菌剂与单一接种蓝莓根际促生蜡样芽孢杆L5发酵液、纺锤芽孢杆菌L13发酵液、干酪乳酸杆菌发酵液相比,蓝莓根重、地径和苗高均显著增加。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌的筛选
(1)筛选过程:
通过梯度稀释法,从山东省黄岛区佳沃集团有限公司蓝莓生产基地的蓝莓根际土样中分离出252株分离物。通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化,并通过镜检判断菌株是否纯化,对纯化后的细菌进行编号,挑取单菌落,转接到LB斜面上保存备用。通过测定各细菌分离物产生长素(IAA)、解无机磷以及产蛋白酶的能力,筛选出4株效果较好的菌株,结合蓝莓营养钵育苗试验,最终筛选出1株具有良好促生效果的细菌。
(2)菌落特征及菌体形态
BacilluscereusL5在LB平板上培养24h后形成有光泽白色菌落,圆形,不透明;表面粗糙,扁平,不规则;菌体细胞大小为(1~1.2)μm×(3~5)μm;产芽孢,G+,细胞呈杆状。
(3)生理生化特征
明胶液化试验阳性,淀粉水解试验阳性,吲哚试验阳性,伏—普试验阳性,硝酸盐还原试验阳性,卵磷脂酶试验阳性,甘露醇试验阴性,接触酶试验阳性。
(4)解磷能力测定
将BacilluscereusL5用灭菌牙签接种于无机磷细菌培养基平板,28℃培养3d后,测量溶磷圈与菌落直径,并计算溶磷圈与菌落直径之比。
菌株在无机磷细菌培养基平板上培养后,可产生透明的溶磷圈。经测量与计算,溶磷圈直径为10.5mm,菌落直径为3.5mm,溶磷圈与菌落比达3。
(5)产蛋白酶能力测定
将BacilluscereusL5用灭菌牙签接种于脱脂奶粉培养基平板上,37℃培养2d后,可产生透明圈。经测量与计算,透明圈直径为21mm,菌落直径为5mm,透明圈与菌落比达4.2。
(6)产吲哚乙酸(IAA)能力测定
将蜡样芽胞杆菌接种于含有L-色氨酸的R2A液体培养基中,28℃,180rpm,摇床培养4d。用分光光度法测定菌悬液的OD600值,然后将菌悬液10000rpm离心10min,取上清液加入等体积Salkowski(50mL35%HClO4+1mL0.5MFeCl3)比色液,避光静置30min,测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时,单位体积发酵液中IAA的含量,通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量。通过测定,蜡样芽胞杆菌产IAA含量为104μg/(mL·OD600)-1
(5)16SrDNA序列分析
16SrDNA基因序列,见核苷酸序列表所示。将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列比对,结果表明:L5与Bacilluscereus同处于一个最小分支上,其16SrDNA序列与Bacilluscereus(AF169537)的相似性达98%。结合菌落形态,生理生化特征和16SrDNA序列分析,鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)。
实施例2对蓝莓生长具有促生作用
分别将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆L5和纺锤芽孢杆菌L13活化2~3次后,,用接种环挑取少量菌体接种于含有50mL培养基(牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,余量为蒸馏水,pH7.0-7.2,以上均为质量百分比)100mL三角瓶中,于37℃,180rpm条件下振荡培养2天。发酵液6000rpm下离心5min,无菌生理盐水润洗菌体3次后,无菌生理盐水调节菌悬液(2.0×108cfu/m)制成接种剂。将蓝莓容器苗定植后,分别取20ml用无菌水稀释10倍均匀浇灌于蓝莓根部周围,三个月后测定蓝莓的根系、苗高及地径情况,结果如表所示。同纺锤芽孢杆菌L13相比,蜡样芽孢杆L5处理的不定根长度、茎部粗、平均不定根数以及株高均显著增加。
实施例3微生物复合菌剂的制备
具体步骤如下:
(1)所述蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13的培养方法(以下为重量百分比):
①试管种子培养
种子培养基配方为:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,余量为水,pH7.0-7.2。
将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13分别接种到培养基上,30~35℃恒温培养36h,获得试管种。
②液体发酵培养
液体发酵培养基配方为:乳糖2%,蛋白胨2%,K2HPO40.15%,MgSO4·7H2O0.02%,CaCl20.01%,pH6.2-6.8,余量为水。
将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13试管种子分别接种到液体培养基中,接种量分别为液体培养基体积的10%,于30~35℃摇床培养,转速180r/min,培养时间为12h,培养后得蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5发酵液和纺锤芽孢杆菌L13发酵液。
按前述蓝莓根际促生蜡样芽孢杆L5、纺锤芽孢杆菌L13的制备蓝莓根际促生蜡样芽孢杆L5、纺锤芽孢杆菌L13发酵液。
按菌种保藏单位提供的培养方法制备干酪乳酸杆菌的发酵液。
将所得发酵液按所含活菌数的数量比混合均匀:蓝莓根际促生蜡样芽孢杆L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌=10:10:5。微生物复合菌剂含活菌数5×108cfu/ml。
实施例4微生物复合菌剂应用试验
按照实施例3的方法制备分别制备蓝莓根际促生蜡样芽孢杆L5、纺锤芽孢杆菌L13发酵液、干酪乳酸杆菌的发酵液和复合菌剂。采取盆栽试验,随机区组设计,共设置4个处理:处理1,蜡样芽孢杆L5;处理2纺锤芽孢杆菌L13;处理3,干酪乳酸杆菌;处理4,蓝莓微生物复合菌剂。按照草炭与土体积比1∶3的比例混匀,装盆备用。定植蓝莓苗,并分别将4种菌液与水按1∶2的比例混匀,按照每盆40亿微生物总量浇入。蓝莓生长6个月后,调查根系情况,并测定叶片光合指标,结果见下表。可以看出,复合菌剂与单一接种蓝莓根际促生蜡样芽孢杆L5发酵液、纺锤芽孢杆菌L13发酵液、干酪乳酸杆菌发酵液对比,可显著促进蓝莓细根的生长,提高光合速率。

Claims (7)

1.一株蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌,其特征在于:该菌株分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)L5,已于2013年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.7667。
2.如权利要求1所述的蓝莓根际促生蜡样芽胞杆菌在制备微生物复合菌剂中的应用。
3.一种微生物复合菌剂,其特征在于,包括蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌组成;所述蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌的数量(cfu)之比为:10:6~10:3~5,其中,微生物复合菌剂含活菌数4~6×108cfu/ml;
所述蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.7667;
所述蓝莓根际促生纺锤芽孢杆菌L13,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.7068;
所述干酪乳酸杆菌为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌种编号为1.0580的菌株。
4.权利要求3所述的微生物复合菌剂的制备方法,其特征在于:将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌,经分别培养后,制备蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌的发酵液,将所得发酵液按蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13、干酪乳酸杆菌的数量(cfu)之比为:10:6~10:3~5,混合均匀制成微生物复合菌剂,其中,微生物复合菌剂含活菌数4~6×108cfu/ml。
5.如权利要求4所述的微生物复合菌剂的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)所述蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13的培养方法(以下为重量百分比):
①试管种子培养
种子培养基配方为:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,余量为水,pH7.0-7.2;
将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13分别接种到培养基上,30~35℃恒温培养,获得试管种;
②液体发酵培养
液体发酵培养基配方为:乳糖2%,蛋白胨2%,K2HPO40.15%,MgSO4·7H2O0.02%,CaCl20.01%,pH6.2-6.8,余量为水;
将蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5、纺锤芽孢杆菌L13试管种子分别接种到液体培养基中,接种量分别为液体培养基体积的10%,于30~35℃摇床培养,培养后得蓝莓根际促生蜡样芽孢杆菌L5发酵液和纺锤芽孢杆菌L13发酵液;
(2)干酪乳酸杆菌的培养和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行,得到干酪乳杆菌的发酵液;
(3)将所得发酵液按所含活菌数的数量比混合均匀,得到微生物复合菌剂。
6.如权利要求5所述的微生物复合菌剂的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,恒温培养时间为36h。
7.如权利要求5所述的微生物复合菌剂的制备方法,其特征在于:所述步骤(1)中,所述摇床培养条件是:转速180r/min,培养时间为12h。
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