CN114426949B - 一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用 - Google Patents

一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114426949B
CN114426949B CN202210181982.3A CN202210181982A CN114426949B CN 114426949 B CN114426949 B CN 114426949B CN 202210181982 A CN202210181982 A CN 202210181982A CN 114426949 B CN114426949 B CN 114426949B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pancreatic cancer
medium
organoids
establishing
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210181982.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114426949A (zh
Inventor
黄璘
聂盼
万源
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Jiashiteng Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Chongqing Jiashiteng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Jiashiteng Biotechnology Co ltd filed Critical Chongqing Jiashiteng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210181982.3A priority Critical patent/CN114426949B/zh
Publication of CN114426949A publication Critical patent/CN114426949A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114426949B publication Critical patent/CN114426949B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0677—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/507—Pancreatic cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/02—Compounds of the arachidonic acid pathway, e.g. prostaglandins, leukotrienes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用，其中建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基通过对培养基成分的调配，能够快速培养出胰腺癌类器官，并形成与胰腺癌组织在基因型、形态学上高度一致性的3D胰腺癌类器官。所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R‑Spondin 3、Neuregulin 1、FGF10、EGF、PGE2、Noggin、A83‑01、Wnt3a、Y‑27632、SB202190、B27、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗，鉴定方法为检测KRAS G12C基因拷贝数与形态学鉴定相结合。

Description

一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用。
背景技术
尽管近年来在癌症治疗方面取得了进展，胰腺癌仍然是常见恶性肿瘤中存活率最低的。迟诊断和缺乏治疗的选择是最紧迫的临床问题为这种疾病。因此，需要在临床应用患者模型和生物标记来确定对患者最有效的治疗方法。胰腺类器官是PDAC的体外模型，可以从非常小的活检中建立，使局部、晚期和转移患者的研究成为可能。类器官模型已被应用于胰腺癌的研究，为精准医疗提供了一个有前景的平台。胰腺导管腺癌仍然是最致命和最具侵袭性的癌症类型之一，5年生存率低于8%。PDAC患者预后不良的部分原因是，大多数患者(>70%)诊断为晚期和转移性疾病，不适合手术切除，而手术切除是唯一可能的治疗方法。即使是被诊断为局限性肿瘤，符合手术条件的患者，很多患者在手术干预后也会出现疾病复发。大多数外科病人接受全身治疗手术干预后，许多患者的疾病会复发。大多数外科病人接受全身新辅助或辅助细胞毒性化疗。对于局部晚期或转移性疾病患者，标准治疗方案是联合化疗方案，不幸的是，这些细胞毒性药物并不能治愈绝大多数晚期患者，这些患者的中位总生存期不足一年此外，长期的全身化疗与患者的毒性有关，导致患者维持这些方案的挑战。此外，许多患者患有化疗难治性疾病，目前尚无针对此类患者的个性化治疗方案选择。
类器官是由多能干细胞或器官祖细胞分化，并自组装成有结构和功能的完整哺乳动物器官，类器官技术在研究广泛的对象方面潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等。对于这些应用以及其他应用，类器官培养实现了对现有2D培养方法和动物模型系统的高信息量的互补，是二维培养和活体模型之间的重要桥梁，其较单层细胞培养模型更具生理学相关性，同时比活体模型更容易操纵监测信号通路和基因组编辑。类器官的价值在于它们能够自组织成最小的生物单位，表现出与原始组织相似的功能和复杂性。类器官的可操作性预示着类器官将为广泛的基础研究提供出色的模型系统，包括表达谱研究和体内难以获得的稀有细胞谱系的分析。
因此，亟需一种可以加快胰腺细胞的增殖与自组装能力，加快胰腺类器官的建立以及提高胰腺类器官建立的成功率的培养基及方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基；本发明的目的之二在于提供一种基于所述培养基建立胰腺或胰腺癌类器官的方法；本发明的目的之三在于提供一种胰腺癌类器官的鉴定方法；本发明的目的之四在于提供所述培养基在胰腺癌类器官筛选抗胰腺癌药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基
所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin 3、Neuregulin 1、FGF10、EGF、PGE2、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗。
本发明优选的，所述组分的浓度如下：雌二醇10nM-1000nM、氢化可的松0.1-100μg/ml、R-Spondin 3 100-500ng/ml、Neuregulin 1 1-10nM、FGF10 10-100ng/ml、EGF 1-10ng/ml、PGE2 1ng-10ng/ml、Noggin 50-500ng/ml、A83-01 100-1000nM、Wnt3a 1-5nM、Y-27632 1-10μM、SB202190 100-1000ng、B27 10ng/ml、N -乙酰半胱氨酸1-5nM、烟酰胺1-10nM、GlutaMax 1-5nM、胎牛血清体积分数10%、青霉素/链霉素双抗体积分数1%。
2、基于所述培养基建立胰腺或胰腺癌类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将获得的胰腺或胰腺癌组织制备成单细胞悬液；
（2）将步骤（1）制备的单细胞悬液加入3D培养基质胶重悬，然后接种于培养装置中，加入所述的培养基，培养箱中扩大培养。
本发明优选的，所述胰腺或胰腺癌组织来源于哺乳动物。
本发明优选的，所述胰腺组织或胰腺癌组织制备成单细胞悬液具体过程是经过剪碎、研磨、过滤得到。
本发明优选的，所述剪碎后组织大小为1cm3。
本发明优选的，所述过滤为使用200目的滤网过滤。
3、一种胰腺癌类器官的鉴定方法，包括以下步骤：
（1）将正常胰腺细胞进行KRAS G12C基因拷贝数的检测；
（2）将所述方法建立的第一代胰腺类器官进行KRASG12C基因拷贝数的检测；
（3）对胰腺癌组织与所述方法建立的胰腺类器官分别做HE染色或免疫组化；
（4）将所述方法建立的第一代胰腺类器官与正常胰腺组织的KRAS G12C基因拷贝数进行对比，若KRAS G12C突变拷贝数增加，大于1×104，并且所述方法建立的胰腺类器官与胰腺癌组织的HE染色形态相似，在显微镜下呈现球体，则确定胰腺类器官为胰腺癌类器官。
4、所述培养基在胰腺癌类器官筛选抗胰腺癌药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用，所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin 3、Neuregulin 1、FGF10、EGF、PGE2、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N -乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗，所述培养基用于建立胰腺癌类器官，可以加快胰腺癌细胞的增殖与自组装能力，加快类器官的建立以及提高类器官建立的成功率。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为胰腺癌类器官培养14天生长形态图（标尺长度为100μm）；
图2为胰腺癌类器官培养14天的生长曲线图；
图3为对比配方不含生长因子Neuregulin1、雌二醇、氢化可的松培养基培养14天的生长形态图（标尺长度为100μm）；
图4为胰腺癌类器官与正常胰腺细胞的基因KRASG12C拷贝数图；
图5为胰腺癌类器官(B)与正常胰腺组织的HE(A)染色图（标尺长度为A：50μm；B：100μm）；
图6为胰腺癌类器官筛选药物的CCK8图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明实施例中涉及的培养基组分雌二醇（β-estradiol）购自Sigma公司；氢化可的松（hydrocortisone）购自Sigma公司；R-Spondin 3购自R&D公司；Neuregulin 1购自Peprotech公司；FGF10购自Peprotech公司；；EGF购自Peprotech公司；PGE2购自Peprotech；Noggin购自Peprotech公司；A83-01购自Tocris公司；Wnt3a购自Gibco公司；Y-27632购自Abmole公司；SB202190购自Sigma公司；B27购自Gibco公司；N-Acetylcysteine购自Gibco公司；Nicotinamide购自Sigma公司；GlutaMax购自Sigma公司；胎牛血清购自Gibco公司；Penicillin/Streptomycin，购自Gibco公司；DMEM/F12，购自Gibco公司。
实施例1、建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基
按下述浓度将各组分加入到DMEM/F12培养基中，得到用于培养胰腺或胰腺癌类器官的培养基A：
配方1：雌二醇100nM，氢化可的松50μg/ml、R-Spondin 3（250ng/ml）、Neuregulin1(5nM)、FGF10(50ng/ml)、EGF(5ng/ml)、PGE2（5ng/ml）、Noggin(100ng/ml)、A83-01(TGF-βI型受体抑制剂，500nM)、Wnt3a (5nM)、Y-27632(蛋白激酶p160ROCK抑制剂，5μM)、SB202190(p38 MAPK抑制剂，500ng)、B27(10ng/ml)、N -乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine，5nM)、烟酰胺（Nicotinamide，10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、胎牛血清(FBS，10%)、青链霉素（Penicillin/Streptomycin，1%)。
配方2：雌二醇10nM，氢化可的松0.1μg/ml、R-Spondin3（100ng/ml）、Neuregulin1(1nM)、FGF10(10ng/ml)、EGF(1ng/ml)、PGE2（1ng/ml）、Noggin(50ng/ml)、A83-01(100nM)、Wnt3a(1nM)、Y-27632(1μM)、SB202190(100ng)、B27(10ng/ml)、N-Acetylcysteine（1nM)、Nicotinamide（1nM)、GlutaMax添加剂(1nM)、FBS（10%)、Penicillin/Streptomycin（1%)。
配方3：雌二醇1000nM，氢化可的松100μg/ml、R-Spondin3（500ng/ml）、Neuregulin1(10nM)、FGF10(100ng/ml)、EGF(10ng/ml)、PGE2（10ng/ml）、Noggin(500ng/ml)、A83-01(1000nM)、Wnt3a (5nM)、Y-27632(10μM)、SB202190(1000ng)、B27(10ng/ml)、N-Acetylcysteine（5nM)、Nicotinamide（10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、FBS（10%)、Penicillin/Streptomycin（1%)。
对比配方：与上述配方区别是培养基中不含Neuregulin 1、雌二醇、氢化可的松，各组分具体含量如下：R-Spondin 3（250ng/ml）、FGF10(50ng/ml)、EGF(5ng/ml)、PGE2（5ng/ml）、Noggin(100ng/ml)、A83-01(TGF-β I型受体抑制剂，500nM)、Wnt3a (5nM)、Y-27632(蛋白激酶p160ROCK抑制剂，5μM)、SB202190(p38 MAPK抑制剂，500ng)、B27(10ng/ml)、N -乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine，5nM)、烟酰胺（Nicotinamide，10nM)、GlutaMax添加剂(5nM)、胎牛血清(FBS，10%)、青链霉素（Penicillin/treptomycin，1%)。
实施例2、建立胰腺癌类器官的方法
本实施例中胰腺、胰腺癌样本均来自重庆市人民医院。
使用实施例1的培养基建立胰腺癌类器官的方法，具体操作步骤如下：
一、胰腺癌组织的获取
采集后将获得的胰腺癌组织/胰腺组织采用50ml的DMEM/F12+FBS（10%）+Penicillin/Streptomycin(1%)进行浸泡。
二、胰腺癌类器官的培养
（1）将得到的胰腺癌样本浸泡于1%的Penicillin/Streptomycin(青链霉素)中1h，将浸泡的胰腺癌样本取出，用一次性手术刀将细胞剪碎，剪碎的组织大约为1cm×1cm×1cm；用碾磨棒将1cm×1cm×1cm的胰腺癌手术样本碾碎，制备成为单细胞悬液。
（2）将单细胞悬液吸出，用200目的细胞滤网过滤2-3次，将多余的残留组织去除，加入PBS清洗3次，再加入matrigel重悬细胞，接种于6孔板中；在六孔板中加入培养基A培养细胞，放置于37℃的培养箱中，每三天更换一次培养基，观察细胞的形态，光学显微镜下拍照记录，培养至14天。
配方1~3的培养基A培养1天，3天，5天，7天，10天和14天的形态如图1所示。类器官体积和细胞数量统计结果如图2所示，结果显示，培养过程中细胞逐渐增多，培养至第2天可形成类器官，培养至第4天类器官细胞数量快速增加，至6天呈对数增长；同时培养过程中类器官逐渐变大，培养至10天最大能达到400μm。对比配方不含生长因子Neuregulin 1、雌二醇、氢化可的松培养基培养14天的生长形态图如图3所示，胰腺类器官的数量较少。
实施例3、胰腺癌类器官KRAS G12C基因拷贝数的检测
一、总RNA提取
1、称取定量正常胰腺组织和胰腺癌类器官样品于预冷的研钵中，加入液氮彻底研磨成粉末状，转入清洁的EP管内，加入Trizol试剂（1ml/100mg组织），用*头反复吹吸至裂解液中无明显沉淀，室温静置5分钟；
2、加入氯仿（0.2ml/mlTrizol），用力震荡EP管15秒，室温下静置3分钟；
3、4℃，12000rpm离心15分钟，分三层，RNA在上层水相层，水相层体积约为Trizol用量60%；蛋白质存在于下层有机层中，可用异丙醇提取，存于4℃冰箱；
4、吸取上清液置于新EP管中，勿吸出白色中间层，加入异丙醇（0.5ml/mlTrizol），上下颠倒离心管充分混匀，可涡旋混匀，室温静置10分钟；
5、4℃，12000rpm离心10分钟；
6、小心弃去上清液，缓慢沿离心管壁加入无水乙醇（1ml/mlTrizol），上下颠倒并涡旋混匀；
7、4℃，12000rpm离心5分钟，弃去乙醇，室温干燥沉淀2分钟；
8、加50µl DEPC水溶解提取的总RNA，-80℃保存备用；
二、RNA纯度及质量检测
1、纯度检测：
RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于约40μg/ml的单链RNA。用双蒸水稀释RNA样品n倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000，同一样品重复测三次取平均值。
以双蒸水100µl为空白对照，实验组为1µlRNA样品+99µl双蒸水。测得不同样本TotalRNA浓度后，用DEPC水将RNA调整至同一浓度，TotalRNA模板量在10ng-5µg较为适宜。
2、质量检测：将提取TotalRNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性。完整的RNA电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽，根据条带结果判断RNA是否降解。
三、cDNA制备
按照表中组分配制RT反应液（在冰上进行），并进行逆转录反应。制备好的cDNA若不马上进行PCR反应须在4℃（短期）或-20℃保存。
可设置阴性对照NRT和NTC，NTC对照即除不加入模板RNA外，其余试剂按量加入；NRT对照为除不加入反转录酶外，其余试剂按量加入。
5×Prime Script RT Master Mix（2μl）
Total RNA（1μl）
Rnase-FreeddH2O （10μl）
4）引物序列Primer
Forward primer：5'-acagtgcaatgagggaccag-3'(SEQ ID NO.1)；
Reverse primer：5'-acaaagaaagccctccccag-3'(SEQ ID NO.2)；
扩增片段长度为50bp
5）Real Time PCR
TB Green Premix ExTaqMII(TliRNase H Plus)2X（10μl）
PCR Forward Primer（0.8μl）
PCR Reverse primer（0.8μl）
ROXReference Dye or Dye ⅡI(50x)（0.4μl）
RT反应液(cDNA溶液)（2μl）
灭菌水（6μl）
6）两步法PCR扩增标准程序。
7）得到数据。
结果如图4所示，与正常胰腺组织的KRAS G12C基因的拷贝数相比，发生癌变的胰腺组织的KRAS G12C基因的拷贝数大幅增加，大于1×104。
实施例4、胰腺癌类器官HE染色
将生长状态良好的类器官放入离心管内，200g转速离心10min，弃置部分上清液，在离心管内加入2ml蛋清，轻摇混匀，在蛋清液中悬浮细胞团，再加入5倍蛋清混合液体积的80%酒精，混匀，200 g转速离心10min，去除上清液，加入10%甲醛固定3h。
使用4%多聚甲醛溶液浸泡组织样本，48h后采用石蜡包埋并切片。
HE染色步骤如下：二甲苯（Ⅰ）15min；二甲苯（Ⅱ）15min；无水乙醇（Ⅰ）5min；无水乙醇（Ⅱ）5min；95%乙醇 3min；80%乙醇2min；70%乙醇2min；蒸馏水5min；苏木精染色液6min；自来水冲洗1min；1%盐酸乙醇1-2s；自来水冲洗10-30s；0.2%氨水返蓝6min；自来水冲洗10-30s；0.5%伊红染色液1-3min；蒸馏水冲洗 1-2s；70%乙醇1min；80%乙醇1min；95%乙醇2min；无水乙醇（Ⅰ）3min；二甲苯（Ⅰ）10min；二甲苯（Ⅱ）10min。结果如图5所示。结果显示，胰腺癌类器官形成细胞团，且细胞核与细胞质与胰腺癌细胞具有高度的形态一致性。
实施例5、胰腺癌类器官评估药物效果的CCK-8毒性实验
1）制作标准曲线（用于测定细胞具体数量）
（1）先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。
（2）按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议3-6个复孔。
（3）接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量，使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。
2）细胞活性检测
（1）在96孔板中接种细胞悬液100 μL/孔，将培养板放在培养箱中37℃，5% CO2预培养一段时间。
（2）向每孔加入10 μL CCK-8溶液，注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。
（3）将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
（4）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
（5）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
3）细胞增殖-毒性检测
（1）在第七天，加入消化酶消化Matrigel，在96孔板中配制100 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱37℃，5% CO2预培养24小时。
（2）向培养板加入10 μL不同浓度的化疗药物和靶向药物，包括但不限于5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨。
（3）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。
（4）向每孔加入10 μL CCK-8溶液，注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。
（5）将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
（6）用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
（7）若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
（8）最终计算出5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨、生理盐水对肿瘤类器官的抑制率。
结果如图6所示，相比较于生理盐水，5-氟尿嘧啶、顺铂、多西他赛、吉西他滨对胰腺癌类器官都有一定的抑制作用，且多西他赛对胰腺癌类器官的抑制率最高，高达76%。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 重庆嘉士腾生物科技有限公司
<120> 一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
acagtgcaat gagggaccag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
acaaagaaag ccctccccag 20

Claims (7)

1.一种建立胰腺癌类器官的培养基，其特征在于，所述培养基为含有如下组分的DMEM/F12完全培养基：雌二醇、氢化可的松、R-Spondin 3、Neuregulin 1、FGF10、EGF、PGE2、Noggin、A83-01、Wnt3a、Y-27632、SB202190、B27、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、GlutaMax、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗；所述组分的浓度如下：雌二醇10nM-1000nM、氢化可的松0.1-100μg/ml、R-Spondin 3 100-500ng/ml、Neuregulin 1 1-10nM、FGF10 10-100ng/ml、EGF 1-10ng/ml、PGE2 1ng-10ng/ml、Noggin 50-500ng/ml、A83-01 100-1000nM、Wnt3a 1-5nM、Y-27632 1-10μM、SB202190 100-1000ng、B27 10ng/ml、N -乙酰半胱氨酸1-5nM、烟酰胺1-10nM、GlutaMax 1-5nM、胎牛血清体积分数10%、青霉素/链霉素双抗体积分数1%。
2.基于权利要求1所述培养基建立胰腺癌类器官的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将获得的胰腺癌组织制备成单细胞悬液；
（2） 将步骤（1）制备的单细胞悬液加入3D培养基质胶重悬，然后接种于培养装置中，加入权利要求1所述的培养基，培养箱中扩大培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述胰腺癌组织来源于哺乳动物。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述胰腺癌组织制备成单细胞悬液具体过程是经过剪碎、研磨、过滤得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述剪碎后组织大小为1cm3。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述过滤为使用200目的滤网过滤。
7.权利要求1所述培养基在胰腺癌类器官筛选抗胰腺癌药物中的应用。
CN202210181982.3A 2022-02-25 2022-02-25 一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用 Active CN114426949B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210181982.3A CN114426949B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210181982.3A CN114426949B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114426949A CN114426949A (zh) 2022-05-03
CN114426949B true CN114426949B (zh) 2024-04-16

Family

ID=81312607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210181982.3A Active CN114426949B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114426949B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891749B (zh) * 2022-07-13 2022-12-02 杭州艾名医学科技有限公司 一种胰腺癌类器官的培养基及胰腺癌类器官的培养方法
CN117247905A (zh) * 2023-11-15 2023-12-19 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院) 一种胸腹水来源消化道肿瘤细胞类器官模型的构建方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109321528A (zh) * 2018-09-18 2019-02-12 梁廷波 中国人B7-H5表达阳性胰腺癌细胞系sipanc-1076建立方法
CN112592883A (zh) * 2020-12-31 2021-04-02 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种小鼠胰腺类器官培养基及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109321528A (zh) * 2018-09-18 2019-02-12 梁廷波 中国人B7-H5表达阳性胰腺癌细胞系sipanc-1076建立方法
CN112592883A (zh) * 2020-12-31 2021-04-02 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种小鼠胰腺类器官培养基及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114426949A (zh) 2022-05-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xie et al. Three-dimensional bio-printing of primary human hepatocellular carcinoma for personalized medicine
CN114426949B (zh) 一种建立胰腺或胰腺癌类器官的培养基及方法和应用
EP4137565A1 (en) Culture medium for esophageal squamous cell carcinoma epithelial cells, culture method, and application thereof
WO2021088119A1 (zh) 原代乳腺上皮细胞培养基、培养方法及其应用
CN111575237B (zh) 一种乳腺癌无支架类器官专用培养基及培养方法
CN112725279B (zh) 一种基于肿瘤类器官模型的药敏检测和标准建立方法以及微流控芯片结构的应用
Lin et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU
Rose et al. WNT and inflammatory signaling distinguish human Fallopian tube epithelial cell populations
Wang et al. Establishment of a patient-derived organoid model and living biobank for nasopharyngeal carcinoma
Xu et al. Organoids in lung cancer: A teenager with infinite growth potential
Kinoshita et al. Efficient establishment of bile-derived organoids from biliary Cancer patients
CN115786267B (zh) 肿瘤类器官耐药模型及其构建方法
CN105878265B (zh) miRNA-489在制备治疗矽肺药物中的应用
WO2018049925A1 (zh) 筛选抗乳腺癌转移化合物的方法及相关化合物的应用
CN108138135A (zh) 细胞培养
Contartese et al. Relevance of humanized three-dimensional tumor tissue models: a descriptive systematic literature review
CN114478706B (zh) 用于三维培养纤维网状结构多肽及其应用
CN114317442A (zh) 一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用
Liang et al. Patient-derived tumor models: a suitable tool for preclinical studies on esophageal cancer
US20230011168A1 (en) Bio-Chips and Production Method Thereof
Gong et al. Establishment of organoid models for pancreatic ductal adenocarcinoma and screening of individualized therapy strategy
CN115305240B (zh) 一种培养类器官的方法和类器官的培养装置
Brenner Alternatives to animal testing to assess NASH drugs and hepatotoxicity
CN103525941A (zh) Cthrc1基因在制备检测/治疗宫颈癌药物中的应用
CN115024280B (zh) 食管癌原位种植成瘤模型建立方法及模型

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240814

Address after: Room 2, Floor 15, No. 8, West Section of Mount Taishan Avenue, Liangjiang New District, Yubei District, Chongqing 401121

Patentee after: Chongqing Jiashiteng Pharmaceutical Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: 401120 No. 21-03-001343, 3 / F, No. 210, west section of Jinkai Avenue, Dazhulin street, Liangjiang New Area, Chongqing

Patentee before: Chongqing jiashiteng Biotechnology Co.,Ltd.

Country or region before: China