CN105878265B - miRNA-489在制备治疗矽肺药物中的应用 - Google Patents

Abstract

miRNA‑489在制备治疗矽肺药物中的应用。本发明提供了一种miRNA‑489在治疗矽肺药物中的应用，所述miRNA‑489的序列为：5’‑AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC‑3’。本发明通过实验证明：无论在体外细胞水平还是体内小鼠矽肺模型水平，上调miRNA‑489的表达对矽尘诱导的肺部炎症和纤维化均具有明显的抑制作用，这提示miRNA‑489可成为矽肺治疗的全新靶点。本发明将有助于矽肺治疗药物的研究和开发，并为其他疾病治疗药物的研制提供借鉴。

Description

miRNA-489在制备治疗矽肺药物中的应用

技术领域

本发明属于基因工程与生命科学领域，具体是基因治疗领域，涉及一种miRNA-489在制备治疗矽肺药物中的应用。

背景技术

矽肺(silicosis)是含游离二氧化硅的粉尘在肺内积聚引起的一种进行性、致残性、不可治愈的肺组织纤维化疾病。目前矽肺病仍是我国最严重的职业病之一，来自全国职业病报告系统数据显示，2014年全国共报告职业病29972例，尘肺病新病例26873例，占2014年职业病报告总例数的89.66％，其中煤工尘肺和矽肺分别为13846例和11471例，占尘肺病例数的94.21％。矽肺病一旦发生，即使不再接触矽尘，病情仍呈进行性发展，对健康损害严重，已成为危害我国相关职业劳动者健康和影响社会稳定的主要公共卫生问题之一。目前我国在矽肺病药物研制方面取得一系列的进展，矽肺病治疗的新药也相继出现。临床上主要参照特发性肺纤维化(IPF)的治疗手段，应用的药物集中于抗炎、抗氧化、抗纤维化等方面，使用的西药主要有汉防己甲素、吡非尼酮、尼达尼布等，但这些药物也面临临床治疗效果不太理想，且存在副作用大、费用昂贵等问题。目前，中医药在防治矽肺肺纤维化方面也显示出一定的疗效和优势。中药治疗矽肺的方法主要包括单味中药黄芪、桔梗、姜黄、苦参素等以及一些中药汤剂和复方制剂，但也主要集中于局限的氧化/抗氧化失衡和成纤维细胞、生长因子(FGF)、TGF-β1、TNF-ɑ、白介素(IL-6)等单一细胞因子。此外，大容量肺灌洗术、健康教育配合呼吸保健操等方法也可在一定程度上稳定或控制矽肺病变的进展，进一步提高患者的肺功能、减轻症状、改善矽肺患者生活质量。虽然目前矽肺病已研制出一些药物进行积极对症治疗，但是由于至今矽肺肺纤维化发病机制尚未完全明确，这给矽肺病治疗方法的研发带来了一定的困难与局限，故目前尚缺乏矽肺病特效的治疗方法。因此，开展矽肺病治疗的药物筛选研究和临床新药研究是亟待解决的重大科学问题。

大量研究证实肺纤维化的发生发展涉及到多种细胞因子及其相关基因的复杂网络调控，而miRNA参与调控人类约1/3基因的表达，提示miRNA可能在肺纤维化发生发展中发挥重要的调控作用。MicroRNA(miRNA)是一类由约22个核苷酸组成的非编码RNA，它们通过与靶基因mRNA 3’非翻译区(3’-UTR)的miRNA反应元件(microRNA response elements，MREs)通过碱基序列互补特异性结合，从而抑制靶基因蛋白质翻译或促进其降解，在不同的细胞和发育过程中如增殖、分化凋亡和应激反应等发挥重要的作用。近年来，越来越多的证据表明在肺纤维化疾病中特异性miRNAs可通过调控不同的靶蛋白，参与多条信号通路影响肺纤维化进程，如miR-424可通过降低调控蛋白Smurf2水平而激活TGF-β信号通路，进而促进肌成纤维细胞分化；let-7d可作用于靶基因HMGA2和α-SMA使成纤维细胞失去间充质细胞特性，而获得上皮细胞特性等。矽肺属于肺纤维化疾病，目前也有报道发现miRNAs如miR-146a、miR-181b等参与矽肺纤维化进程。

由于组织中存在miRNAs，且含量丰富、性质稳定、易于定量检测并存在显著的疾病特异性，近年来越来越多学者致力于研究改变miRNAs表达水平在减轻肺纤维化方面的作用机制，并为临床靶向治疗肺纤维化提供科研数据，如上调小鼠体内和A549细胞中miR-26a水平可通过转录后调控HMGA2减轻TGF-β1和博莱霉素引起的上皮间质转化过程(EMT)以及纤维化发生；抑制miR-21水平可减轻博莱霉素引起的纤维化和肌成纤维细胞分化等过程。此外，由Regulus Therapeutics公司开发的氟代和甲氧基修饰的miR-21抑制剂已用于纤维化治疗的临床前期试验。这些研究均表明从发病机制和基因表达调控方面出发，利用miRNAs作为肺纤维化治疗方法具有针对性及效果明显，这为肺纤维化的治疗开拓了新境界。然而，区别于特发性肺纤维化，目前还没有针对矽肺治疗的特异性miRNAs的报道，若能筛选出矽肺特异或异常表达的组织miRNAs作为治疗靶标，并研制相应的治疗药物，对我国矽肺病的治疗现状必将是一次有力的推动。

发明内容

解决的技术问题：本发明提出miRNA-489在制备治疗矽肺药物中的应用。申请人通过前期小鼠矽肺模型肺组织的Affymetrix miRNA表达谱芯片分析初步筛选出矽尘处理组与对照组比较表达下调明显的miRNA-489，并在重建矽肺动物模型肺组织中进行验证，然后通过上调小鼠体内miRNA-489水平表明其具有抑制矽尘诱导肺纤维化的作用。最后在人巨噬细胞和成纤维细胞中进一步验证上调miRNA-489可抑制炎性因子、纤维化因子的释放及纤维化标志物的表达，综合分析最终明确miRNA-489具有抑制矽肺纤维化的作用，这可为miRNA-489用于矽肺病的治疗提供理论依据。

技术方案：miRNA-489在制备治疗矽肺药物中的应用。

miRNA-489的序列为5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’。

一种治疗矽肺的药物，有效成分为miRNA-489。

一种治疗矽肺的药物，有效成分为促进miRNA-489表达的化合物。

一种生物标志物作为靶标用于筛选治疗和预防矽肺的药物中的应用，所述生物标志物为miRNA-489。

具体来说，(1)建立矽尘致小鼠肺纤维化动物模型：以气管灌注方法构建矽尘致小鼠肺纤维化动物模型，明确肺组织中miRNA-489水平下调。(2)建立上调体内miRNA-489水平的矽尘致小鼠肺纤维化动物模型：采用miRNA-489 agomir上调小鼠体内miRNA-489水平，通过病理分析、纤维化指标检测，从整体动物水平明确miRNA-489具有抑制矽尘诱导肺纤维化的作用。(3)建立上调miRNA-489水平的细胞模型：采用miRNA-489 mimic上调人源巨噬细胞和成纤维细胞中miRNA-489水平，通过炎症和纤维化指标检测，从细胞水平进一步明确miRNA-489具有抑制矽尘诱导肺纤维化的作用。

研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.重建小鼠矽肺模型中验证

首先在矽肺模型中进行芯片结果验证：气管灌注法建立小鼠矽肺模型，病理切片显示建模成功。根据病理切片选取矽尘组每个时间点(7、14和28d)和28d生理盐水组各5只小鼠肺组织，采用Trizol裂解-氯仿抽提-异丙醇沉淀的方法提取总RNA，通过逆转录反应得到cDNA样品，加入荧光探针进行PCR反应，检测并比较纤维化肺组织与对照肺组织中miRNA-489水平的变化。

2.上调miRNA-489水平的矽尘致小鼠肺纤维化动物模型：气管灌注法建立小鼠矽肺模型，采用经化学修饰的miRNA-489激动剂(agomir)于造模0d首次气管注入，随后在7、14和21d分别再经尾静脉注射的方法上调小鼠体内miRNA-489水平，28d收集肺组织进行病理切片HE染色、纤维化程度评分，提取肺组织总蛋白通过Western blot方法进行纤维化指标检测，从整体动物水平明确miRNA-489具有抑制矽尘诱导肺纤维化的作用。

3.上调miRNA-489水平的细胞模型：采用化学合成miRNA-489模拟物(mimic)转染的方法，上调人源巨噬细胞和成纤维细胞中miRNA-489水平，转染24h后分别采用SiO₂处理巨噬细胞，TGF-β1处理成纤维细胞。提取细胞总蛋白后通过Western blot方法进行炎症和纤维化指标检测，从细胞水平进一步明确miRNA-489具有抑制矽尘诱导炎症和肺纤维化的作用。

4.统计分析方法

运用方差分析(Dunnett’s t test)比较纤维化动物模型组与对照组间miRNA-489表达水平分布差异。统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(SAS，v.9.1)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

miRNA的差异表达水平：在肺组织中以U6作为内参，计算比较miRNA-489差异表达情况。用2^-ΔΔCT表示相比于对照组变化的倍数，其中ΔCT＝CT_处理–CT_内参，ΔΔCT＝ΔCT_处理–ΔCT_对照，此后以2为底数、-ΔΔCT为指数计算处理组及对照组间miRNA-489的改变倍数。

以下是本发明进一步说明：

本发明通过实验发现miRNA-489在矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型中显著下调。采用miRNA-489 agomir体内注射和miRNA-489 mimic细胞转染上调miRNA-489表达，通过病理观察、炎症指标和纤维化指标的检测，发现miRNA-489过表达无论在整体动物水平还是细胞水平均可明显抑制矽尘诱导的炎症和肺纤维化的发生，这意味着miRNA-489可成为一种治疗矽肺的药物。具体的，可以合成miRNA-489的核苷酸，并与适当载体如纳米颗粒、脂质体等连接形成药物，通过口服、静脉或肌肉注射的方式对矽肺病进行治疗。

有益效果：本发明提供的miRNA-489用于矽肺病治疗药物的优越性在于：作为基因表达调控的新工具，miRNAs是一种新型靶向分子治疗药物，区别于传统的治疗药物，具有易于合成，易于检测，定量精确，经化学修饰后能増加其稳定性并提高亲和力，可通过特殊药物递送系统有效定位到靶器官等优点，将大大提高矽肺病治疗的特异性和靶向性，该种miRNA药物的成功开发将为矽肺病的治疗开创新局面，为其他疾病治疗药物的研制提供借鉴。

本发明在整体动物和细胞水平均上调miRNA-489水平，研究miRNA-489对矽肺肺纤维化的影响及抑制效果，揭示其作为治疗药物的潜在价值。因此，本发明可为研发具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1.显示重建矽尘致小鼠肺纤维化模型后，肺组织病理改变(HE染色)，包括炎细胞渗出、肺泡结构破坏、矽结节形成等变化。

图2.显示重建矽尘致小鼠肺纤维化模型后，肺组织中纤维化指标上皮细胞标志物(E-cadherin)、间质细胞标志物(α-SMA、Vimentin)的蛋白表达变化。**P<0.01，与生理盐水对照组比较差异有统计学意义。

图3.显示前期miRNA芯片结果，在不同时间点矽尘诱导小鼠肺纤维化动物模型的肺组织中，与生理盐水对照组比较，miRNA-489差异表达的柱状图。

图4.显示在后期重建的矽尘诱导小鼠肺纤维化动物模型肺组织中，进一步验证miRNA-489差异表达的柱状图，与前期芯片结果相一致。**P<0.01，与生理盐水组比较差异有统计学意义。

图5.显示上调小鼠体内miRNA-489水平后，矽尘诱导小鼠肺纤维化模型肺组织中miRNA-489表达水平比较的柱状图；表明采用miRNA-489 agomir成功上调小鼠体内miRNA-489水平。**P<0.01，与miR-NC+矽尘组比较差异有统计学意义；**P<0.01，与生理盐水组比较差异有统计学意义。

图6.显示上调小鼠体内miRNA-489水平后，肺组织病理改变(HE染色)，包括肺泡结构的完整性、肺泡壁增厚、炎细胞渗出、矽结节形成等变化。

图7.显示上调小鼠体内miRNA-489水平后，肺组织中纤维化指标上皮细胞标志物(E-cadherin)、间质细胞标志物(α-SMA、Vimentin)的蛋白表达变化。**P<0.01，与miR-NC+矽尘组比较差异有统计学意义。

图8.显示采用miRNA mimic转染的方法上调人巨噬细胞中miRNA-489水平后，再用培养基配制的SiO₂粉尘悬液处理细胞。提取细胞总蛋白，采用western blot实验检测炎性因子IL-1β和纤维化因子TGF-β1蛋白水平变化。**P<0.01，与mimic-NC+矽尘组比较差异有统计学意义。

图9.显示采用miRNA mimic转染的方法上调人成纤维细胞中miRNA-489水平后，再用培养基配制的TGF-βl溶液处理细胞。提取细胞总蛋白，采用western blot实验检测纤维化指标α-SMA和Vimentin蛋白水平变化。**P<0.01，与mimic-NC+TGF-βl组比较差异有统计学意义。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述的实施例。下述的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规进行。

以下实施例中所使用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

以下实施例中体内动物实验所使用的miRNA-489 agomir，体外细胞实验转染用的转染试剂及miRNA-489 mimic均购自广州锐博生物科技公司，均为商业化产品。

实施例1：重建小鼠矽肺模型

矽尘致小鼠肺纤维动物模型建立：选择6-8周，体重为20-25g的雄性C57BL/6小鼠，麻醉状态下经支气管灌注50μL生理盐水配制的50mg/mL SiO₂粉尘悬液，对照组给予生理盐水，在第7、14、28d时处理小鼠，留存肺组织。右下肺叶经甲醛固定后石蜡包埋、切片进行HE染色。其余肺组织经液氮速冻后存于-80℃冰箱，备用。采用western blot方法测定肺组织中上皮细胞标志物(E-cadherin)、间质细胞标志物(α-SMA、Vimentin)的蛋白水平。小鼠肺组织病理切片和纤维化指标的结果相结合评价矽尘致小鼠肺纤维化模型构建是否成功。

(1)HE染色

小鼠肺组织经甲醛固定一脱水一淋蜡一包埋一切片等一系列步骤后，制成空白切片进行HE染色。组织切片放入60℃电热恒温培养箱中烘烤2h以防止脱片。经梯度脱蜡至水后苏木素染色15min，水洗玻片上多余染液；1％盐酸酒精分化，镜下控制直至细胞核染色清晰为止；自来水冲洗10min左右；伊红染色1min左右至镜下观察控制，待细胞质染成红色即可；经梯度脱水-透明-用中性树胶进行封片，显微镜下观察。苏木素为碱性染料，将细胞核染成蓝色。伊红为酸性染料，将细胞质染成红色。结果如图1所示，与生理盐水组比较，矽尘组出现了炎细胞渗出、肺泡结构破坏，14d时开始出现纤维化改变，28d出现典型矽结节。

(2)纤维化指标的western blot实验

1)提取肺组织总蛋白

取约l00mg的肺组织样本置于1mL消毒的研磨器中，加入组织蛋白提取液(T-PERTissue Protein Extraction Reagent，thermo scientific)500μL，将研磨充分的含组织蛋白液的研磨器放置于冰上30min后于4℃，12,000rpm，离心15min后取上清，此为提取的肺组织总蛋白质。

2)BCA法测定肺组织蛋白浓度

首先按50体积BCA试剂A与1体积BCA试剂B(50：1)配制适量的BCA工作液，进行充分混匀；将蛋白标准品提取溶解，取10μL蛋白标准品用生理盐水稀释至100μL，使应用终浓度为0.5mg/mL；将蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加入96孔板的标准品孔中，然后用生理盐水补足至20μL；将19μL生理盐水加到96孔板的样品孔中，然后加入1μL待测样品；对待测各孔加入临用前配制好的200μL BCA工作液，于37℃孵箱放置30min；酶标仪测定波长为570nm检测吸光度值，然后用Excel根据蛋白浓度和吸光度值绘制标准曲线，最后根据标准曲线计算待测样本的蛋白质总浓度。

3)western blot实验

采用12.5％浓度分离胶(下层胶)和5％浓度的浓缩胶(上层胶)，10孔梳子所做泳道每孔加蛋白质样品的总体积为40μL，需保证每个泳道样品蛋白上样量相等。在电泳槽内加适量电泳缓冲液，以电压60V进行电泳。电泳结束将甲醇预浸泡后的适当大小的PVDF膜与3mm滤纸经转移缓冲液4℃冰箱平衡30min，然后从下向上依次按顺序将滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸放好，去除各层内气泡，150mA恒流电转膜90min；转膜结束将PVDF膜置于5％的脱脂牛奶中，室温摇床低速封闭1小时。根据待测目的蛋白配制抗体稀释液，一般情况下第一抗体为1:1000稀释，4℃冰箱与PVDF膜孵育过夜，经1×TBST洗膜15min，第二抗体羊抗兔IgG-HRP或羊抗小鼠IgG-HRP(稀释比为1:1000)，室温解育1h；l×TBST洗膜45min。根据试剂盒说明书进行操作，将化学发光液ECL A液与B液按1:1配制适量的显色液，采用全自动图像分析系统对目的蛋白条带进行扫描曝光，依据条带灰度来判定蛋白量表达变化。结果如图2所示，小鼠支气管灌注矽尘后7、14、28d，肺组织中上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达水平逐渐降低，而间质细胞标志物a-SMA和Vimentin表达水平逐渐升高。结合图1病理切片结果综合评价表明重建矽尘致小鼠肺纤维化模型构建成功。

实施例2：重建小鼠矽肺模型中miRNA-489水平的qRT-PCR实验

确定模型建立成功后，根据肺组织病理切片选第7、14、28d矽尘处理组和28d生理盐水组各5只小鼠肺组织提取RNA进行qRT-PCR检测。在整个研究过程中均实施严格的质控，每个样本连续检测三次，所有样本均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成从而避免偏倚。

(1)制备RNA样品

将消毒后的组织匀浆器置于冰上，放入100mg小鼠肺组织后再加入1.0mL Trizol(Life Technologies/ambion，Carlsbad，CA)研磨至匀浆状态；②将匀浆液转移到1.5mL无RNA酶EP管中，加入氯仿(三氯甲烷)200μL，夹在两板间轻柔的上下颠倒混匀，室温放置2～3min。RNA被氯仿萃取到上层水相，蛋白质和DNA在下层有机相；③4℃、12,000rpm，离心15min；④吸取上清液至新EP管中，加入-20℃预冷的异丙醇500μL，-20℃放置10min，以防降解；⑤4℃、12,000rpm，离心10min；⑥弃上清液并吸干残留的少量上清；-20℃预冷75％乙醇后，取1mL加入到EP管中，混匀；⑦4℃、7，500g，离心5min；⑧弃上清，观察RNA量，倒置于干净滤纸上片刻；⑨常温7，500rpm离心3min；用枪头吸去多余乙醇，置于通风橱内挥发至无乙醇；⑩根据RNA的量，加入适量消毒的DEPC水，混匀后4℃溶解1～2h，得到RNA样品。

(2)使用Takara试剂盒进行qRT-PCR实验

1)通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录反应体系总体积10μL，包括2μL 5×PrimeScript Buffer(for Real Time)、0.5μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ、0.5μLSpecific Primer(2μM)、1μL总RNA(500ng/μL)及6μL RNase Free dH₂O。反应步骤为42℃反应15min，85℃反应5sec，4℃存放；反应结束后加入20μL RNase Free dH₂O，补足终体积至30μL。使用仪器为BIO-RAD T100 Thermal Cycler。逆转录引物由广州锐博生物科技公司设计和合成。

2)qRT-PCR扩增反应：反应体系总体积5μL，包括：2.5μL Premix ExTaq II(Tli RNaseH Plus)，0.1μL 50×ROX Reference Dye，0.1μL PCR Forward Primer(10μM)、0.1μL PCR Reverse Primer(10μM)、1.2μL RNase Free dH₂O及1μL逆转录得到的cDNA。使用ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR反应条件是：95℃、30sec进行一个循环→95℃、0.05sec，60℃、1min进行40个循环。扩增反应正向引物和反向引物均由广州锐博生物科技公司设计和合成。

结果如图4所示，qRT-PCR检测发现在各组时间点5例肺组织样本中，与对照生理盐水组比较，miRNA-489在7、14、28d矽尘组显著降低，与图3所示前期miRNAs芯片结果一致。

实施例3：上调miRNA-489水平的矽尘致小鼠肺纤维化动物实验

(1)动物模型建立

采用经化学修饰的miRNA-489激动剂(agomir)上调小鼠体内miRNA-489水平。选择6-8周，体重为20-25g的雄性C57BL/6小鼠，将小鼠分为对照组(生理盐水)、矽尘组(SiO₂悬液)、miR-NC+矽尘组(miR-NC+SiO₂悬液)、miRNA-489高表达+矽尘组(miRNA-489 agomir+SiO₂悬液)，麻醉状态下经支气管灌注50μL生理盐水配制的50mg/mL SiO₂粉尘悬液，其中miRNA-489高表达组在支气管灌注SiO₂粉尘悬液后，伴随首次气管注射5nmol miRNA-489agomir，随后在7、14和21d分别再经尾静脉注射2.5nmol miRNA-489 agomir，28d收集肺组织、血清。

(2)qRT-PCR及western blot实验

qRT-PCR方法检测miRNA-489表达水平(方法同实施例2)评价上调小鼠体内miRNA-489水平的效果。结果如图5所示，与miR-NC+矽尘组比较，miR-489 agomir+矽尘组miR-489水平出现显著增加，表明成功上调小鼠体内miRNA-489水平。将小鼠右下肺组织经甲醛固定后，制作病理切片进行HE染色(方法同实施例1)。结果如图6所示，在miR-NC+矽尘组出现了典型的炎症反应，肺泡结构破坏和纤维化结节，而上调miR-489表达后这些改变均出现明显减轻。根据肺组织病理切片，各组选择5只小鼠肺组织提取总蛋白，western blot方法测定肺组织中上皮细胞标志物(E-cadherin)、间质细胞标志物(α-SMA、Vimentin)的蛋白水平(方法同实施例1)。结果如图7所示，与miR-NC+矽尘组比较，miR-489 agomir+矽尘组间质细胞标志物(a-SMA,Vimentin)的蛋白水平降低，而上皮细胞标志物E-cadherin的蛋白水平得到一定程度恢复。

(3)小鼠肺组织纤维化病理评分

根据小鼠肺组织病理切片，以肺泡壁增厚、细胞増殖情况、炎性损伤、胶原沉积及纤维化损伤为评判纤维化程度的基础依据，对每只小鼠的病理切片都进行评分，具体的评分系统参照文献进行，严重程度判定等级为：0表示无异常，1表示边缘的，2表示轻微，3表示中度，4表示严重，5表示非常严重；损伤分布判定等级为：0表示无损伤，1表示少见或者机会性出现(占肺部面积的10％)，2表示稀少的/有限的(占肺部面积的10％-25％)；3表示中度(占肺部面积的25％-50％)；4表示扩増性或者广泛分布(占肺部面积的50％-75％)；5表示非常广泛或者非常明显(分布面积超过肺部面积的75％)。结果如表1所示，miR-489 agomir+矽尘组肺损伤的严重程度和分布范围均低于miR-NC+矽尘组。结合图5、6、7综合评价表明miR-489具有明显抑制肺纤维化的作用。

实施例4：上调人源巨噬细胞和成纤维细胞中miRNA-489水平的实验

(1)细胞分组

将人源巨噬细胞(PMA诱导的THP-1细胞)和成纤维细胞(MRC细胞)分别提前一天传代于六孔板中，根据要求实验分组设对照组(不做任何处理正常细胞)；处理组(巨噬细胞用培养基配制的SiO₂粉尘处理24h，成纤维细胞用TGF-βl处理细胞48h)；miR-NC+处理组(细胞转染25nM阴性对照miR-NC后经SiO₂或TGF-βl分别处理两种细胞)；miRNA-489 mimic+处理组(细胞转染25nM miRNA-489 mimic后经SiO₂或TGF-βl分别处理两种细胞)共四组。

(2)细胞转染miRNA-489 mimic

待细胞生长密度达40％时进行转染处理，提前将5nM干粉状miRNA-489 mimic试剂用消毒后的250μL DEPC水溶解，存储终浓度为20μM，分装保存。使用PBS稀释riboEFCT^TMCPBuffer(10×)缓冲液为riboEFCT^TMCP Buffer(1×)。用120μL riboEFCT^TMCP Buffer(1×)稀释5μL 20μM miRNA-489 mimic，混匀室温孵育5min。加入12μL riboEFCT^TMCP Reagent，混匀室温解育20min。将以上混合液加入到1863μL细胞培养基中混匀后加入六孔板的一个孔中。根据细胞所需转染孔的数量配制上述混合液。

(3)细胞SiO₂或TGF-βl处理

待人源巨噬细胞和成纤维细胞转染miRNA-489 mimic 24h后，更换新鲜培养液，分别加入所需一定浓度的SiO₂或TGF-βl(本实验SiO₂处理的浓度为100μg/mL，TGF-βl处理的浓度为1ng/mL)，空白对照组正常更换培养基，37℃培养箱巨噬细胞培养24h，成纤维细胞培养48h。

(4)细胞总蛋白提取及western blot实验

配制细胞裂解液(1mL RIPA裂解液，临用前加入10μL PMSF，使终浓度为1mM)，六孔板每孔弃培养液后用1mL PBS清洗1次，每孔加入上述配好的裂解液80μL，4℃摇床裂解30min。4℃，12,000rpm，离心15min，取上清，如实施例1，使用BCA法测定总蛋白浓度，在巨噬细胞中采用western blot实验检测炎性因子IL-1β和纤维化因子TGF-β1蛋白水平变化，在成纤维细胞中采用western blot实验检测纤维化指标α-SMA和Vimentin改变。结果如图8、图9所示，与mimic-NC组比较，采用miR-489 mimic转染巨噬细胞上调细胞中miR-489水平可抑制IL-1β和TGF-β1的表达；采用miR-489 mimic转染成纤维细胞发现上调miR-489可降低a-SMA和Vimentin水平。综合分析表明在人源巨噬细胞和成纤维细胞中上调miRNA-489水平可抑制炎症和纤维化反应。

结论：上调小鼠体内、人源巨噬细胞和成纤维细胞中miR-489的表达水平对矽尘诱导的肺部炎症和纤维化均具有明显的抑制作用。因此，将其应用于矽肺药物的研发，具有较好的应用前景。

表1 miRNA-489对肺组织纤维化严重程度和分布范围的影响

表1.显示上调小鼠体内miRNA-489水平后，对小鼠肺组织病理切片进行纤维化严重程度和分布范围评分。**P<0.01，与miR-NC+矽尘组比较差异有统计学意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学

<120> miRNA-489在制备治疗矽肺药物中的应用

<130> F1601838

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaugacacca cauauauggc agc 23

Claims (2)

1.如5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’编码的miRNA-489在制备治疗矽肺药物中的应用。

2.一种生物标志物作为靶标用于筛选治疗和预防矽肺的药物中的应用，所述生物标志物为5’-AAUGACACCACAUAUAUGGCAGC-3’编码的miRNA-489。