CN109172593A - miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微小核苷酸has‑miR‑516a‑5p(miR‑516a)抑制子的应用，即，本发明公开了miR‑516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用，抑制膀胱癌增殖和转移。具体而言：抑制miR‑516a，能在体外抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长、并在体内抑制裸鼠皮下肿瘤的形成。抑制miR516a，能在体外抑制膀胱癌细胞迁移浸润能力。

Description

miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用

技术领域

本发明涉及一种微小核苷酸has-miR-516a-5p(miR-516a)抑制子的应用，具体是指抑制miR-516a作为治疗膀胱癌新型靶标分子的应用。

背景技术

癌症目前仍是威胁全球人类生命健康的一个非常重要的难题，在我国，每年由于癌症死亡的人数占疾病死亡总人数的25％。其中膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，居我国泌尿系统恶性肿瘤首位，且临床调查分析发现过去几十年，我国膀胱癌的发病率、复发率呈现稳定上升趋势。根据病理分型可将膀胱癌分为两类：非肌肉浸润性和肌肉浸润性。非肌肉浸润性复发的膀胱癌15％-20％会发展成肌肉浸润性膀胱癌。并且膀胱癌患者术后生存率低，伴有区域或远处转移的患者，其5年生存率仅为45％。目前临床针对膀胱癌治疗缺乏有效手段，膀胱根治性切除或电切术后膀胱灌注给患者带来了巨大痛苦，同时术后巨额医药费用给家庭带来沉重负担。新靶向药物的研发及新预防措施的应用是公认遏制这一态势的主要途径，这使得相应新分子靶标鉴定成为膀胱癌防治研究中的热点。因此，筛选出治疗膀胱癌的新靶标分子已经对于膀胱癌的治疗至关重要。

微小RNA(microRNA)是一类内源基因编码高度保守大小约19～25个核苷酸的非编码小分子单链RNA，其普遍存在于各种生物的细胞中，位于编码蛋白基因(70％)的内含子或外显子中或基因间隔区(30％)。大多数内含子和外显子microRNA来源于他们的宿主基因，暗示他们同宿主转录子共同转录，其他作为独立转录单元在基因间隔区域转录。microRNA与靶mRNA的3'UTR结合，可导致microRNA抑制靶基因的蛋白质翻译或促进靶基因mRNA的降解。microRNA的调控作用构成了复杂的调控网络，既可以通过一个microRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个microRNA的组合来精细调控某个基因的表达。从而参与多种生命过程，包括细胞生长，增殖，转移和凋亡等。因此，可以认为microRNA与肿瘤的发生发展密切相关。研究发现microRNA在人体组织中的表达具有特异性，为microRNA作为不同实体瘤特异性标志分子提供依据。近年来研究报道多种microRNA在膀胱癌中异常表达，然而部分microRNA仍未在膀胱癌中报道，因此探索该部分microRNA同时找到调控膀胱癌发展进程中新的标记物并对其功能开展研究对该疾病的临床防治具有重要意义。

膀胱癌是一种发生在膀胱上皮的泌尿系统恶性肿瘤，多由吸烟及环境致癌物引起，目前尚未发现有效的治疗靶点，而microRNA具有成为潜在的膀胱癌治疗靶点的价值。

目前肿瘤领域研究发现miR-516a在卵巢癌中表达显著下调，发挥抑制卵巢癌细胞增殖的功能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供miR-516a可作为治疗膀胱癌新靶标的应用，miR-516a在抑制膀胱癌细胞增殖转移方面的应用，为临床上膀胱癌的早期诊断、靶向microRNA治疗膀胱癌药物的研发提供理论依据。

为了解决上述技术问题，本发明提供miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用。

作为本发明的miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用的改进：抑制膀胱癌增殖，抑制膀胱癌增殖或转移。

作为本发明的miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用的进一步改进：抑制miR-516a，能在体外抑制(显著抑制)膀胱癌细胞锚定非依赖性生长、并在体内抑制(显著抑制)裸鼠皮下肿瘤的形成。

作为本发明的miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用的进一步改进：抑制miR-516a，能在体外抑制(显著抑制)膀胱癌细胞迁移浸润能力。

本发明通过筛查到miR-516a在配对病人中表达上调，进一步采用实时荧光定量PCR技术在人膀胱癌组织与癌旁组织中检测到miR-516a表达上调。

进一步抑制miR-516a在体外显著抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长能力及迁移能力，在体内显著抑制裸鼠皮下异位移植瘤形成。裸鼠异位移植瘤模型构建应用的膀胱癌细胞为UMUC3,J82细胞。

为了探究膀胱癌治疗的新靶标，本发明首次发现miR-516a在膀胱癌中高表达，并且抑制其表达明显抑制膀胱癌细胞的增殖及侵袭能力。鉴于miR-516a在膀胱癌增殖转移中的重要调控功能，本发明对于膀胱癌的治疗具有重大意义。肿瘤领域研究发现miR-516a在卵巢癌中表达显著下调，发挥抑制卵巢癌细胞增殖的功能，这与本发明在膀胱癌中发现的作用恰恰相反，表明了抑制miR-516a的表达对于膀胱癌特异性的治疗作用。

本发明利用实时荧光定量PCR技术等技术检测miR-516a表达在膀胱癌中呈显著高表达趋势；进一步应用膀胱癌UMUC3,J82细胞构建裸鼠皮下异位移植瘤模型，抑制miR-516a可在体内外抑制膀胱癌细胞增殖能力。本发明为膀胱癌的治疗提供了新的靶标分子，也有助于推动抗膀胱癌新药研发等方面的应用基础研究。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为miR-516a在临床膀胱癌组织样本中miR-516a表达显著上调的实时荧光定量PCR验证图。

图2A为miR-516a在人膀胱癌细胞中表达显著上调的荧光定量PCR图，图2B-2D分别为miR-516ai稳定抑制UMUC3,J82,T24T细胞miR-516a表达的柱状图，p<0.05。

图3A为采用软琼脂集落形成实验，将UMUC3(miR-516ai)、J82(miR-516ai)以及对照细胞种于软琼脂中，细胞生长两到三周后的代表性图像，图3B为显微镜下计数软琼脂集落形成实验中超过32个细胞的克隆数统计图。该数据证实抑制miR-516a的表达可抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长，p<0.05。

图4A-B分别为抑制miR-516a表达抑制膀胱癌细胞UMUC3、J82增殖能力的示意图。利用ATP生物荧光检测法证实抑制miR-516a表达后膀胱癌细胞的增殖能力明显低于对照组细胞，p<0.05。

图5A、D为稳定抑制miR-516a的表达显著抑制裸鼠皮下异位移植瘤形成的图片。将稳定转染细胞UMUC3(miR-516ai)、J82(miR-516ai)以及对照细胞各2.5×10 ⁶细胞悬浮于100μL PBS中，皮下注射于4周龄无胸腺裸鼠的右上背腹区域，共四组，每组六只。具体而言，图5A为UMUC3(miR-516ai)以及对照细胞各2.5×10 ⁶个细胞皮下注射细胞四周后裸鼠活体图片；图5D为J82(miR-516ai)以及对照细胞各2.5×10 ⁶个细胞皮下注射细胞四周后裸鼠活体图片。图5B、E在细胞注射四周后处死裸鼠，取出肿瘤拍照并称重。具体而言，图5B为UMUC3(miR-516ai)以及对照组在细胞注射四周后处死裸鼠，取其右背部肿瘤所拍照片；图5E为J82(miR-516ai)以及对照组在细胞注射四周后处死裸鼠，取其右背部肿瘤所拍照片。柱形图表示每组6只裸鼠肿瘤重量的平均值±标准差(图5C、F)，p<0.05。具体而言，图5C为UMUC3(miR-516ai)以及对照组每组6只裸鼠肿瘤重量统计图；图5F为J82(miR-516ai)以及对照组每组6只裸鼠肿瘤重量统计图。

图6A-D为Transwell小室实验验证miR-516a对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响。经固定和染色后拍照，统计迁移和侵袭细胞数目，并与对照组进行平均值±标准差统计分析，结果表明抑制miR-516a表达抑制了膀胱癌细胞迁移和浸润能力。具体而言，图6A为10倍显微镜下拍摄，抑制miR-516a抑制T24T细胞的转移及浸润小室图片，图6B为抑制miR-516a抑制T24T细胞的转移的统计图，图6C为10倍显微镜下拍摄，抑制miR-516a抑制UMUC3细胞的转移及浸润小室图片，图6D为抑制miR-516a抑制UMUC3细胞的转移的统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、临床膀胱癌配对样本和人膀胱癌细胞系中miR-516a的表达水平检测：

1)、组织样本

收集于温州医科大学第二附属医院泌尿外科行膀胱全切术的19例患者的组织标本。本研究中所用的膀胱癌临床样本多数为男性患者且行膀胱全切术，组织经病理诊断为膀胱尿路上皮癌。每例标本均采集肿瘤组织，同时距肿瘤周围约3cm处切取癌旁正常组织作为对照，每份样本在组织离体后冻存于液氮灌中。所有患者资料均包含姓名、性别、年龄、病理诊断等信息。

2)、组织/细胞总RNA提取

使用美国Qiagen公司所购miRNeasy Mini Kit提取，提取步骤如下：

a.从-80℃冰箱中取出膀胱癌临床样本，每个样本约30-50ug于EP管中，放置冰上；细胞约1×10⁷个以内。

b.加入700ul的Qiazol混匀，大组织需用剪刀剪碎。

c.彻底混匀后，室温静置5-10min。组织需要使用匀浆器以最大转速将组织匀碎，通常2min，整个过程在冰上进行。

d.加入140μl氯仿(chloroform)，剧烈震荡1min，室温静置2-3min。

e.将样品在12000g 4℃离心15min，离心后缓慢吸取上清至一新的去酶EP管。

f.加入1.5倍体积100％无水乙醇(通常是525μl)，上下颠倒混匀数次，作为样本备用于下一步；

g.将RNeasy Mini spin column置于2ml离心管中，吸取上述样本700ul至离心柱中，室温离心30s，转速10000rpm，弃去滤液。

h.重复步骤g，直至样本全部滤过。

i.向离心柱中加入700μl Buffer RWT，转速10000rpm，室温离心30s，弃去滤液；

j.向离心柱中加入500μl Buffer RPE，转速8000g，室温离心30s，弃去滤液；

k.再次向离心柱中加入500μl Buffer RPE，8000g转速离心1min，再以10000rpm离心1min，以便更加有效的富集RNA，弃去滤液。

l.将RNeasy Mini spin column置于新的2ml离心管，1000g室温离心2min。

m.将离心柱置于新的1.5ml去酶EP管中，加入Rnase-free water 30-50μl(直接加在膜上)，10000rpm，室温离心1min，收集滤液。

n.吸取滤液至离心柱膜上，重复步骤l，收集滤液。

o.使用Biodrop测定浓度，封口膜密封后保存于-80℃

3)microRNA逆转录

所需组织，细胞按照上述方法提取总RNA后，应用逆转录试剂盒进行逆转录，步骤如下：配制RT反应体系如下，冰上操作。

将上述体系振荡混匀后点离，放入PCR仪中设置程序如下：37℃70min→95℃5min。逆转录microRNA，反应结束后样品置冰上2min，用封口膜密封后至-80℃保存或用于荧光定量实验。

荧光定量PCR检测microRNA的表达

将所需组织、细胞获得cDNA后，使用美国Qiagen公司所购miScript SYBR GreenPCR Kit进行PCR，配制PCR反应体系如下：

充分混匀以上反应体系，然后加入至384孔板中，每个样本设置3个复孔，短暂离心后将384孔板，置于Q6荧光定量PCR仪中检测。Q-PCR反应，预变性95℃，15min后循环条件如下，扩增40个循环，95℃变性，15秒，55℃退火，30秒，72℃延伸，30秒。主要引物序列如前文所示，U6作为内参对照，从Qiagen公司购买。

主要引物序列如下：

hsa-miR-516a 5’-TTCTCGAGGAAAGAAGCACTTTC-3’

所得结果如图1所示，miR-516a在膀胱癌组织中高表达。

实施例2、抑制miR-516a抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长和细胞增殖能力

1)构建稳转细胞株

我们对比发现相对于人永生化膀胱上皮细胞系UROtsa，多种膀胱癌细胞系中miR-516a的表达呈现显著上调趋势(图2A)，因此选用人膀胱癌常用的UMUC3、J82、T24T细胞作为研究对象，自上海吉玛制药技术有限公司购买LV3(H1/GFP&puro)-hsa-miR-516a-5pinhibitor sponge及其对照质粒，通过Polyjet脂质体转染方法转染至细胞中，应用嘌呤霉素筛选3-4周后获得稳定抑制miR-516a的UMUC3(miR-516ai)、J82(miR-516ai)和T24T(miR-516ai)细胞。以U6作为内参，采用2^-△△ct相对定量计算miR-516a在稳定转染细胞中基因表达的倍数变化。结果如图2B，2C和2D显示，稳定抑制miR-516a表达的UMUC3、J82、T24T细胞构建成功；柱形图显示来自三个独立实验的平均值±标准差，差异具有统计学意义。

2)软琼脂集落形成实验

a.取出已配置好的1.25％琼脂糖溶液，微波炉中加热至沸腾后放于42℃水浴锅中防止凝固。

b.取1.2ml的1.25％琼脂糖溶液与1.8ml 2×细胞培养基于15ml离心管中，混匀后加入6孔板中，铺板时速度要快，平整，防止凝固，且不能有气泡。

c.3h后，按照如下体系铺上层胶：

1.25％琼脂糖 0.264ml

2×细胞培养基 0.736ml

细胞数 1×10⁴

先将1.25％琼脂糖与2×细胞培养基混合预热，然后取对数生长期的单层培养细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，计数，加入相应细胞数，然后再铺板，注意事项和铺下层胶一样

d.3h后，用封口膜密封，37℃5％CO2细胞培养箱中培养，两周后开始观察，采用显微镜5倍镜拍照并计数含32个细胞以上得克隆，计算细胞集落数形成率。两到三周左右拍摄特征性图片(图3A)；同时显微镜下观察并计数软琼脂集落形成超过32个细胞的克隆数(图3B)。以上数据表明miR-516a可显著促进膀胱癌细胞锚定非依赖性生长能力。

3)ATP细胞增殖实验

a.细胞种板：用0.25％胰酶消化处于对数生长期的需要检测的细胞，吹打制成单细胞悬液，采用血细胞计数法计数细胞，以200个细胞/孔的密度接种于96孔培养板，分3个时段，每个时段5个复孔，移入CO₂孵箱，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。

b.细胞贴壁后用0.1％FBS完全培养基饥饿12h.

c.饥饿后用完全培养基培养1day，3day，5day，弃掉培养基，加入25μl PBS和25μl的CellTiter-Glo assay reagent。混合后室温振荡10min。

d.化学发光仪检测，计算增殖率。

描绘生长曲线：以时间为横轴，5个复孔的平均增殖率为纵轴描绘细胞生长曲线。经公式计算后，结果如图4A、B所示，进一步证明抑制miR-516a的表达明显抑制UMUC3及J82膀胱癌细胞增殖，并且第五天抑制情况更显著。

实施例3、抑制miR-516a表达抑制裸鼠异位移植模型中肿瘤的生长

裸鼠皮下成瘤实验

1)动物饲养

购买BALB/C-nu裸鼠，3-4周龄，适应性饲养1周。所有动物实验均依据温州医科大学伦理委员会相关规定执行。

2)细胞皮下接种

UMUC3(miR-516ai)、J82(miR-516ai)及其对照细胞(vector)按照细胞数2.5×10⁶/只悬浮于100μL PBS中，皮下注射于裸鼠的右背部。裸鼠注射部位用75％酒精消毒。接种前充分混匀细胞，1ml无菌注射器吸取100ul细胞悬液，将细胞悬液注射于小鼠右背部皮下。在细胞注射常规饲养四周后，全部处死裸鼠，取出肿瘤拍照并称重。结果如图5所示稳定抑制miR-516a显著抑制裸鼠肿瘤生长。

根据图5C、图5F，可得知：miR-516a有显著促进膀胱癌细胞体内增殖的生物学功能，抑制其表达显著抑制了其体内成瘤。

实施例4、抑制miR-516a抑制膀胱癌细胞迁移和侵袭能力：

Transwell实验：

a.孵育Transwell小室：将Invasion小室从-20℃拿出来，放在24孔板中，室温静止10分钟，分别上室中加入400μL serum-free DMEM，下室加入700μL serum-free DMEM，放在37℃培养箱孵育2小时左右；再取不带胶小室同上孵育1h。

b.消化细胞：将细胞消化后，用0.1％FBS DMEM/F-12或者0.1％FBS DMEM重悬细胞，充池计数。

c.铺板：弃掉小室中的培养基，上室加入400μL细胞悬液(含有3×10⁴个细胞)，下室加入700μL5％FBS DMEM/F-12或10％FBS DMEM培养基，静置于37℃培养箱培养24小时；

d.4％多聚甲醛固定：弃掉上室培养基，PBS洗两遍，放置在干净的24孔板中，上室加入400μL、下室加入700μL 4％多聚甲醛于室温下固定3分钟；

e.100％甲醇通透：固定结束后，用PBS洗两遍，将小室置于干净的24孔板中，上室加入400μL100％、下室加入700μL100％甲醇于室温下通透20分钟；

f.吉姆萨染色：PBS洗两遍，将小室放置在干净的24孔板中，上室加入400μL已过滤的吉姆萨工作液，下室加入700μL吉姆萨工作液于室温下避光染色15-30分钟；

g.染色结束后，将小室用PBS洗涤两遍，然后用棉签蘸取PBS将小室底部擦净；

h.采集代表性图像，统计穿过小室的细胞数目，并进行统计学分析。

根据图6，可得知：抑制miR-516a表达抑制了膀胱癌细胞迁移和浸润能力。

最后，仍需注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttctcgagga aagaagcact ttc 23

Claims (4)

1.miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用。

2.根据权利要求1所述的miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用，其特征是：抑制膀胱癌增殖和转移。

3.根据权利要求1或2所述的miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用，其特征是：抑制miR-516a，能在体外抑制膀胱癌细胞锚定非依赖性生长、并在体内抑制裸鼠皮下肿瘤的形成。

4.根据权利要求1或2所述的miR-516a作为治疗膀胱癌的靶标的应用，其特征是：抑制miR516a，能在体外抑制膀胱癌细胞迁移浸润能力。