CN117757721A - 肺癌类器官培养的培养基及肺癌类器官的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肺癌类器官培养的培养基及肺癌类器官的培养方法，该培养基中加入的Activin A和SB431542，与肿瘤发生有关，促进细胞增殖，将其添加到肺癌类器官培养基中，可以有效生成肺癌类器官，并且可以长期体外培养及传代。FGF7和FGF10可以提高类器官增值速率，诱导产生更大的肺癌类器官。该发明能够将肺癌原代细胞培养为肺癌类器官，并且缩短培养周期，培养的细胞可以用于肺癌的靶向药物的筛选，为临床肺癌病人的精准用药指导治疗。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及肺癌类器官培养的培养基，还涉及肺癌类器官的培养方法。
背景技术
肺癌分为为NSCLC(占总诊断的85％)或SCLC(占总确诊的15％)。在NSCLC分类中，腺癌是癌症最常见的亚型，其次是鳞状细胞癌。肺癌是全球最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，此外，I期NSCLC患者的5年生o存率约为80％，II期至III期疾病患者的5年生存率为13-60％。对于I期、II期和一些IIIA期疾病患者的护理标准是手术切除。在II期、IIIA期或选定的IB期疾病患者中，增加辅助化疗可提高5-10％的生存率。肺癌是临床精准医疗研究较为成熟的一种疾病，目前已找到一系列相关的疾病驱动基因，并开发出了相应的靶向药物，如吉非替尼、西妥昔单抗等。虽然靶向药物治疗比传统化疗效果更好，但只有携带特定分子遗传标记的人群才可从中受益。
肿瘤类器官(tumor organoid)是目前的前沿技术，不仅能够保留原发肿瘤的特点，保持不同病人肿瘤之间的差异性，而且能够保持同一个病人原发肿瘤内肿瘤细胞的异质性。它能作为替身，为患者试药，进行化疗药、靶向药、新型抗肿瘤抗体药等药物敏感性检测，辅助医生制定个体化治疗方案，有效提高治愈率。已有研究发现，利用肺癌类器官给病人筛选药物，准确率达到90％。然而，现有技术的培养基和培养方式难以在培养过程中保证肺癌类器官的活性，培养后的肺癌类器官衰老情况严重，并且培养液的成分复杂，技术门槛高，价格昂贵，限制了肺癌类器官在实验室研究中的普及。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种肺癌类器官培养的培养基；本发明的目的之二在于提供利用所述的培养基培养肺癌类器官的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、肺癌类器官培养的培养基，所述培养基各组分如下，N-乙酰基-L-半胱氨酸0.5-5mM，GlutaMAXTM1-3mM，烟酰胺1-10mM，HEPES 0.2-20mM，Penicillin-Streptomycin质量分数为1％，N21-MAX Supplement 1×，B27 1×，Noggin 1-200ng/ml，R-Spondin 1 100-500ng/ml，A83-01 50-500nM，Y-27632 1-10μM，CHIR99021 150-250nM，SB431542 0.5-5μM，Activin A 10-100ng/mL，EGF 10-500ng/mL，FGF-10 10-500ng/mL，FGF-7 10-100ng/mL，Wnt3a 0.5-1μg/mL，Advanced DMEM/F12。
本发明优选的，所述培养基各组分如下，N-乙酰基-L-半胱氨酸1.25mM，GlutaMAXTM1mM，烟酰胺10mM，HEPES10mM，Penicillin-Streptomycin质量分数为1％，N21-MAX Supplement 1×，B27 1×，Noggin 200ng/ml，R-Spondin 1 200ng/ml，A83-01 500nM，Y-27632 5μM，CHIR99021 200nM，SB431542 5μM，Activin A 100ng/mL，EGF 500ng/mL，FGF-10 500ng/mL，FGF-7 100ng/mL，Wnt3a 0.5μg/mL，Advanced DMEM/F12。
2、利用所述的培养基培养肺癌类器官的方法，具体包括如下步骤：将肺癌组织消化后制得肺癌原代细胞悬液，然后将肺癌原代细胞悬液与基质胶混合，加入培养板的中央底部，37℃放置5min后倒扣，再放置25min使其凝固，然后在凝固的基质胶与细胞混合物上加肺癌培养基；将细胞培养板置于37℃二氧化碳培养箱培养至少3天。
本发明优选的，所述肺癌原代细胞悬液制备方法如下：将肺癌组织样本用含质量分数为2％Penicillin-Streptomycin的DPBS清洗然后将组织剪碎，然后转移至消化液中，在37℃下置于摇床上孵育15min-30min，然后加入含质量分数2％ Penicillin-Streptomycin的DPBS终止消化，过滤网，离心收集沉淀。
本发明优选的，所述消化液各组分浓度如下：1mg/mL的胶原酶Ⅳ型，0.15mg/mL的透明质酸酶，10mg/mL的dispase II，0.2mg/mL的DNA酶。
本发明的有益效果在于：本发明公开了肺癌类器官培养的培养基，该培养基中加入的Activin A和SB431542，与肿瘤发生有关，促进细胞增殖；将其添加到肺癌类器官培养基中，可以有效生成肺癌类器官，并且可以长期体外培养及传代；FGF7和FGF10可以提高类器官增值速率，诱导产生更大的肺癌类器官；该发明能够将肺癌原代细胞培养为肺癌类器官，并且缩短培养周期，培养的细胞可以用于肺癌的靶向药物的筛选，为临床肺癌病人的精准用药指导治疗。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为培养第1天细胞状态；
图2为培养第2天细胞状态；
图3为培养第3天细胞状态；
图4为培养第6天细胞状态。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、肺癌组织处理
a.将手术或活检获取的肺癌组织样本用含质量分数为2％的Penicillin-Streptomycin的DPBS清洗新鲜肿瘤组织3次后并置于无菌1.5mL EP管中，将组织剪碎；
b.用1mL枪头转移剪碎的肿瘤组织至预先准备好的消化液(1mg/mL的胶原酶Ⅳ型，0.15mg/mL的透明质酸酶，10mg/mL的dispase II，0.2mg/mL的DNA酶)中，在37℃下置于摇床上孵育15min-30min，期间在显微镜下观察细胞漏出情况。
c.待大部分细胞脱离组织后，加含质量分数为2％的Penicillin-Streptomycin的DPBS终止消化后，将组织悬液通过100μm的滤网，300g，5min离心后去上清，取得细胞沉淀。
d.(可选)若红细胞沉淀明显，加入1-2mL红细胞裂解液重悬细胞沉淀，冰上裂解10min后，加入2-4ml DPBS2倍稀释终止，300g，5min，弃上清收获细胞沉淀。
实施例2、肺癌原代细胞培养
将基质胶(Matrigel)与步骤(1)制备的肺癌原代细胞悬液混合，各取50μL滴加至24孔细胞培养板的中央底部，于37℃放置5min后倒扣，再放置25min使其凝固；然后在凝固的基质胶与细胞混合物上加600μL肺癌培养基；将细胞培养板置于37℃二氧化碳培养箱培养；每天观察细胞生长状态并拍照，结果如图1～4所示。结果显示，培养至第3天，可见肺癌类器官生长成熟。
本实施例中肺癌培养基成分及浓度如下：
重组人R-Spondin 1蛋白200ng/mL，Wnt3a 500ng/mL,CHIR99021 200nM，ActivinA100ng/mL，重组人Noggin蛋白200ng/mL，重组人FGF-7因子100ng/μL，重组人FGF-10因子500ng/mL，重组人EGF因子500ng/mL，A 83-01 500nM，Y-27632 5μM，SB 4315425μM，B27 1×，N21-MAX Supplement 1×，N-Acetylcysteine(N-乙酰基-L-半胱氨酸)1.25mM,Nicotinamide(烟酰胺)10mM，GlutaMAXTMSupplement 1mM，HEPES(n-2-羟乙基哌嗪-n-2-乙烷磺酸)缓冲液10mM，Penicillin-Streptomycin(青霉素链霉素)1％，Advanced DMEM/F12。
本发明中培养基在如下浓度范围均能实现发明目的：
N-乙酰基-L-半胱氨酸0.5-5mM，GlutaMAXTM1-3mM，烟酰胺1-10mM，HEPES 0.2-20mM，Penicillin-Streptomycin 1％，N21-MAX Supplement 1×，B27 1×，Noggin 1-200ng/ml，R-Spondin1 100-500ng/ml，A83-01 50-500nM，Y-27632 1-10μM，CHIR99021150-250nM，SB4315420.5-5μM，Activin A 10-100ng/mL，EGF 10-500ng/mL，FGF-10 10-500ng/mL，FGF-7
10-100ng/mL，Wnt3a 0.5-1μg/mL，Advanced DMEM/F12。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (5)
1.肺癌类器官培养的培养基，其特征在于：所述培养基各组分如下，N-乙酰基-L-半胱氨酸0.5-5mM，GlutaMAXTM1-3mM，烟酰胺1-10mM，HEPES 0.2-20mM，Penicillin-Streptomycin质量分数为0-1％，N21-MAX Supplement 1×，B27 1×，Noggin 1-200ng/ml，R-Spondin 1100-500ng/ml，A83-01 50-500nM，Y-27632 1-10μM，CHIR99021 150-250nM，SB431542 0.5-5μM，Activin A 10-100ng/mL，EGF 10-500ng/mL，FGF-10 10-500ng/mL，FGF-7 10-100ng/mL，Wnt3a 0.5-1μg/mL，Advanced DMEM/F12。
2.根据权利要求1所述肺癌类器官培养的培养基，其特征在于：所述培养基各组分如下，N-乙酰基-L-半胱氨酸1.25mM，GlutaMAXTM1mM，烟酰胺10mM，HEPES 10mM，Penicillin-Streptomycin质量分数为1％，N21-MAX Supplement 1×，B27 1×，Noggin 200ng/ml，R-Spondin 1 200ng/ml，A83-01 500nM，Y-27632 5μM，CHIR99021 200nM，SB431542 5μM，Activin A 100ng/mL，EGF 500ng/mL，FGF-10 500ng/mL，FGF-7 100ng/mL，Wnt3a 0.5μg/mL，Advanced DMEM/F12。
3.利用权利要求1或2所述的培养基培养肺癌类器官的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：将肺癌组织消化后制得肺癌原代细胞悬液，然后将肺癌原代细胞悬液与基质胶混合，加入培养板的中央底部，37℃放置5min后倒扣，再放置25min使其凝固，然后在凝固的基质胶与细胞混合物上加肺癌培养基；将细胞培养板置于37℃二氧化碳培养箱培养至少3天。
4.根据权利要求1所述培养基培养肺癌类器官的方法，其特征在于：所述肺癌原代细胞悬液制备方法如下：将肺癌组织样本用含质量分数为2％Penicillin-Streptomycin的DPBS清洗然后将组织剪碎，然后转移至消化液中，在37℃下置于摇床上孵育15min-30min，然后加入含质量分数2％Penicillin-Streptomycin的DPBS终止消化，过滤网，离心收集沉淀。
5.根据权利要求4所述培养基培养肺癌类器官的方法，其特征在于：所述消化液各组分浓度如下：1mg/mL的胶原酶Ⅳ型，0.15mg/mL的透明质酸酶，10mg/mL的dispase II，0.2mg/mL的DNA酶。
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