DE1567188B1

DE1567188B1 - Verfahren und Vorrichtung zum Praeparieren von histologischem Gewebe fuer mikroskopische Untersuchungen

Info

Publication number: DE1567188B1
Application number: DE19641567188
Authority: DE
Inventors: Jack Isreeli
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1963-07-12
Filing date: 1964-06-13
Publication date: 1971-08-12
Also published as: GB1062972A; US3350220A; BE650439A; SE320522B; CH438587A

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum von unmittelbar aufeinanderfolgenden Behältern ent-

Präparieren von histologischem Gewebe für mikrosko- halten ist, deren Anzahl multipliziert mit dem unver-

pische Untersuchungen, bei dem eine Gewebeprobe in änderlich langen Zeitintervall gleich der vorbestimmten

einem automatischen Eintauchgerät für unterschied- Gesamteintauchzeit der Gewebeprobe in die betreffende

liehe vorbestimmte Zeiten in mehrere verschiedene 5 Flüssigkeit ist.

Flüssigkeiten eingetaucht wird, die in einer Reihe Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, aufeinanderfolgender Behälter enthalten sind, und auf daß schon nach einem Bewegungstakt ein neues ein Gerät zur Ausführung des Verfahrens. Präparat eingebracht werden kann, da die Bewegungs-Eine nach dem obigen Verfahren arbeitende Vor- takte so bemessen sind, daß sie alle untereinander richtung ist beispielsweise aus der USA.-Patentschrift io gleich sind. Da die Verweilzeit in einigen der Flüssig-2 341198 bekannt. Weitere Geräte dieser Art sind in keiten länger als dieser kürzeste Takt sein muß, wird den USA.-Patentschriften 2 872 894 und 2 960 962 be- die Eintauchzeit dadurch verlängert, daß mehrere Beschrieben. Ein nach diesen Patentschriften aufgebautes hälter mit der gleichen Flüssigkeit hintereinander vorselbsttätig arbeitendes Eintauchgerät befindet sich im gesehen sind. Um die Gewebeproben in einem ununter-Handel und wird zum Präparieren von Gewebeproben 15 brochenen Vorgang zur Untersuchung mit dem benützt, die in einem gewöhnlichen optischen (nicht Elektronenmikroskop vorzubereiten, ist es zweckelektronischen) Mikroskop geprüft werden sollen. Bei mäßig, unmittelbar nach dem letzten Eintauchen die der Anwendung dieses Gerätes werden mehrere Ge- Gewebeprobe in eine Einbettflüssigkeit zu legen, die webeproben in ein Halterungsgefäß gegeben, das dann durch Wärme in den festen Zustand überführbar ist, automatisch für unterschiedliche vorbestimmte Zeiten 20 und die Einbettflüssigkeit zur Umwandlung in den in mehrere verschiedene Flüssigkeiten eingetaucht festen Zustand unmittelbar anschließend zu erwärmen wird, die in einer Gruppe nebeneinander angeordneter und die Erwärmung zumindest so lange fortzusetzen, Behälter enthalten sind. Zum Einstellen der Verweilzeit bis sich die Einbettflüssigkeit verfestigt hat. in den einzelnen Behältern ist ein Zeitgeber mit ver- Ein Gerät zur Ausführung des Verfahrens mit einem änderlich einstellbaren Zeitintervallen vorgesehen. 25 Halter für eine Reihe von seitlich nebeneinander ange-Ferner ist nach dem deutschen Gebrauchsmuster ordneten Flüssigkeitsbehältern, mit einer intermittie-1 707 811 ein Gerät bekannt, bei dem das histologische rend betätigten Fördereinrichtung, die eine Gewebe-Material durch eine Reihe verschiedener Flüssigkeiten, probe von einem Behälter zum nächsten Behälter der die in aufeinanderfolgend angeordneten Behältern vor- Behälterreihe befördert, und mit einer von einem Zeitgesehen sind, in einem Metallkorb bewegt wird. Auch 30 geber angesteuerten Betätigungsvorrichtung für die bei diesem Gerät sind die Verweilzeiten des Korbes in Fördereinrichtung ist nach der Erfindung dadurch geden verschiedenen Flüssigkeiten verschieden. kennzeichnet, daß die Betätigungsvorrichtung unter Diese bekannten Geräte haben den Nachteil, daß der Steuerung des Zeitgebers die Fördereinrichtung man ein neues Präparat oder eine neue Gruppe von derart periodisch betätigt, daß die Gewebeprobe für Präparaten erst nach Ablauf der Durchlaufzeit des 35 ein veränderlich langes, gleiches Zeitintervall in eine Präparates oder der Präparatgruppe durch alle Flüssig- solche Flüssigkeit eingetaucht wird, die in jedem der keiten in das Gerät einbringen kann, weil die Verweil- aufeinanderfolgenden Behälter enthalten ist, und daß zeiten in den verschiedenen Flüssigkeiten verschieden die gleiche Flüssigkeit in einer Gruppe aus unmittelbar sein müssen. Diese Durchlaufzeit kann unter Um- aufeinanderfolgenden Behältern enthalten ist, deren ständen mehrere Stunden dauern. 40 Anzahl gleich der Gesamteintauchzeit der Gewebe-Wenn man in der Histologie ein Elektronenmikro- proben in die betreffende gleiche Flüssigkeit dividiert skop zur Prüfung von Geweben anwendet, wird es als durch das unveränderlich lange Zeitintervall ist. wichtig betrachtet, daß das Präparieren des Gewebes Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung für eine derartige Prüfung unmittelbar beginnt, nach- werden an Hand von Figuren beschrieben, dem die Probe verfügbar ist, also beispielsweise un- 45 F i g. 1 ist eine Seitenansicht eines Bearbeitungsmittelbar nach der Entfernung eines Geschwulstes aus gerätes für das Gewebe gemäß der Erfindung; einem Körperteil. Zur Prüfung von Gewebe mit dem F i g. 2 ist eine Ansicht dieses Gerätes von oben; Elektronenmikroskop ist es daher erforderlich, daß das F i g. 3 ist eine Ansicht der Linie 3-3 der F i g. 2 in Präparieren der Proben ohne Verzögerung beginnt. vergrößertem Maßstab;

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, an- 50 F i g. 4 ist eine Ansicht auf der Linie 4-4 der F i g. 3

fallende Gewebeproben, die mit einem Elektronen- in vergrößertem Maßstab;

mikroskop geprüft werden sollen, in einem selbst- F i g. 5 ist ein Längsschnitt durch eine Vorrichtung

tätigen Vorgang sofort zu präparieren, und zwar der- zum Einbetten des Gewebes;

art, daß man mit dem Präparieren der Proben zu ver- F i g. 6 ist ein Behälter für die zum Einbetten dienen-

schiedenen Zeiten beginnen kann, ohne das Ende der 55 de Substanz und zeigt das in ihr enthaltende Gewebe;

Durchlaufzeit abwarten zu müssen. Ferner soll das F i g. 7 zeigt eine Steckvorrichtung für einen oder

Präparieren derart vorgenommen werden, daß un- mehrere Behälter der F i g. 6.

mittelbar nach Beendigung des Eintauchvorganges die Bei der Gewebeprüfung mit einem Elektronenmikro-Gewebeproben verfestigt werden können, so daß sie skop sind die Proben kleine Gewebestücke. Dementzur Prüfung mit dem Elektronenmikroskop nach be- 60 sprechend können die Gewebehalter und die Reagenzkannten Verfahren in äußerst dünne Filme oder Flocken mittelbehälter oder -becher klein sein und z.B. eine zerschnitten oder zerteilt werden können. Tiefe von 38 mm und einen Durchmesser von 25 mm Zu diesem Zweck ist das eingangs erwähnte Ver- haben. Gemäß den F i g. 1 und 2 sind mehrere Becher fahren nach der Erfindung dadurch gekennzeichnet, 10 seitlich voneinander auf einem Halter 12 eines selbstdaß die Gewebeproben in jeden Behälter für ein un- 65 tätigen Eintauchgerätes oder Gewebearbeiters angeveränderlich langes, gleiches Zeitintervall eingetaucht ordnet, der mit Ausnahme eines Zeitgebers 14 in wird und daß mindestens eine der Flüssigkeiten in einer gewünschter Weise konstruiert sein kann, damit er mehr als einen einzigen Behälter umfassenden Gruppe selbsttätig das Gewebe von einem Becher zum nächsten

ORiGiNAL IM

befördert, nachdem das Gewebe in der Flüssigkeit des Bechers eingetaucht ist. Wie in F i g. 3 zu sehen ist, können die Becher 10 mit einem Mantel umgeben sein, damit ein Heiz- oder Kühlmedium je nach Wunsch zirkulieren kann. Der Gewebebearbeiter enthält ein Beförderungsmittel 16, das zum Anbeben eines durchlöcherten Gewebekorbes 18 vertikal nach oben aus dem Becher heraus und dann so gedreht wird, bis der Korb 18 über den nächsten Becher gelangt, worauf eine Abwärtsbewegung des Beförderungsmittels für den nächsten Eintauchvorgang folgt. Der Mechanismus zum Betätigen des Beförderungsmittels zu gewissen Zeiten ist vorzugsweise demjenigen ähnlich, der in der USA.-Patentschrift 2 872 894 beschrieben ist, dessen vorübergehende Betätigung jedoch von einem Zeitgeber 14 beeinflußt wird, dessen Zyklus sich wiederholt und der eine Führungsscheibe 20 enthält, die von einem elektrischen Uhrmotor 22 zum Öffnen und Schließen eines Schalters 24 im Kreis eines Motors (nicht gezeigt) für das Beförderungsmittel betätigt wird. Die Führungsscheibe 20 ist vorzugsweise abnehmbar und durch eine andere ähnliche Führungsscheibe ersetzbar, damit je nach Wunsch unterschiedliche Eintauchzeiten zustande kommen.

Alle Eintauchzeitspannen für eine Gewebeprobe in die Flüssigkeiten, die sich in der Becherreihe befinden, sind gemäß der Erfindung dieselben und betragen z. B. 15 Minuten, damit eine oder mehrere Gewebeproben an einer Anfangsstation mit einer, wenn überhaupt, sehr geringen Verzögerung in den Verarbeiter eingeführt werden können. Wenn die gesamte erforderliche Eintauchzeit in eine spezielle Flüssigkeit 1 Stunde beträgt, werden vier Becher mit dieser Flüssigkeit hintereinander in den Halter 12 gesetzt, damit die Eintauchzeitspanne in allen Bechern 15 Minuten beträgt. Nun sei ein Betriebszyklus des Bearbeiters als Beispiel erläutert:

Nummer des Ein tauchens	Reagenzmittel	Eintauchzeit	Zahl der Stationen
1	Osmiumsäure (Fixa-	Ibis	4 bis 8
	tiv)	2 Stunden
2	35%iger Alkohol	15 Minuten	1
	(Entwässerungs
	mittel)
3	50°/₀iger Alkohol	15 Minuten	1
	(Entwässerungs
	mittel)
4	70%iger Alkohol	15 Minuten	1
	(Entwässerungs
	mittel)
5	95%iger Alkohol	45 Minuten	3
	(Entwässerungs
	mittel)
6	absoluter Alkohol	30 Minuten	2
	(Entwässerungs
	mittel)
7	Propylenoxid (Klär	30 Minuten	2
	mittel)
8	Propylenoxid und	Ibis	4 bis 8
	Epon, ein Epoxid	2 Stunden
	harz (in gleichen
	Volumanteilen)

Wie in der obigen Tabelle angedeutet ist, dient das Eintauchen in Alkohol dem Entwässern des Gewebes, nachdem es durch Eintauchen in Osmiumsäure fixiert ist, was der erste Eintauchvorgang in dem Bearbeiter ist; die Konzentration des Alkohols wird allmählich gesteigert, um das Gewebe gegen eine Beschädigung zu schützen, die dann auftreten könnte, wenn das Gewebe unmittelbar nach dem Eintauchen in das Fixativ starkem Alkohol ausgesetzt würde. Dem Eintauchen in Propylendioxid, das als Klärmittel angegeben ist, folgt ein Eintauchen in eine Lösung aus Epon und Propylenoxid, um das Eindringen des flüssigen Epons in das Gewebe während des Einbettens zu erleichtern, wobei sich ein fester Block bildet, in dem das Gewebe in sehr dünne Schnitte zertrennt werden kann. Am Ende der letzten Eintauchzeitspanne wird die Gewebeprobe aus dem Korb 18 und aus ihrem speziellen Behälter im Korb herausgenommen und unmittelbar in ein kleines fingerhutartiges Gefäß 26 (F i g. 6) gelegt, das am unteren Ende zusammenläuft und das flüssige Epon und eine Gewebeprobe 28 enthält. Um ein oder mehrere Gefäße in der aufrechten Stellung festzuhalten, ist eine Steckvorrichtung 30 vorgesehen. Das eine Ende des eingebetteten Gewebes liegt dabei an einer Seite des Blockes aus Epon, nachdem sich der letztere durch Härten verfestigt hat, so daß das Gewebe derart vorteilhaft im Block liegt, daß es am günstigsten in dünne Schnitte oder Flocken zertrennt werden kann, wenn es im Elektronenmikroskop geprüft werden soll.
Das Härten des Epons im Gefäß 30 wird eingeleitet, sobald das Gewebe an der letzten Eintauchstation eingetaucht ist. Vorzugsweise wird das Härten in mehreren aufeinanderfolgenden Zeitspannen von etwa 24 Stunden bei einer Temperatur von 35° C für die erste, von 45° C für die nächste und von 6O⁰C für die letzte ausgeführt, wenn drei derartige Zeitspannen Anwendung finden sollen. Zu diesem Zweck wird vorzugsweise ein Ofen 32 (F i g. 5) benutzt. Er enthält drei Temperaturbereiche Tl bis Γ3 und ist als langgestreckter Tunnel ausgebildet, durch den ein endloses Förderband die Steckvorrichtung 30 von Bereich zu Bereich bewegt. An beiden gegenüberliegenden Seitenwänden des Tunnels sind elektrische Heizelemente 36 angebracht, die die gewünschten Temperaturen in den Heizbereichen herstellen. Diese Bereiche sind voneinander durch Querwände 38 getrennt, die von einer Dachschiene 40 bewegbar herabhängen, damit sie in Längsrichtung des Tunnels bewegt werden können, wenn die Größe der Heizbereiche verstellt werden soll. Die Geschwindigkeit des Förderbandes 34 ist vorzugsweise dadurch einstellbar, daß die Drehzahl des Antriebsmotors (nicht gezeigt) für das Beförderungsmittel verändert wird. An seinen beiden gegenüberliegenden Enden weist der Tunnel Öffnungen 42 und 44 auf, durch die die Steckvorrichtungen 30 in den Ofen hinein- bzw. aus diesem herausgeschoben werden können. An den unteren Enden der Querwände 38 läßt eine Öffnung 46 den Durchgang der Steckvorrichtung 30 durch die Bereiche zu. Am Abgabeende des Förderbandes 34 ist ein fester Tisch 48 angeordnet, der die Steckvorrichtungen 30 aufnimmt.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Präparieren von histologischem Gewebe für mikroskopische Untersuchungen, bei dem eine Gewebeprobe in einem automatischen Eintauchgerät für unterschiedliche vorbestimmte Zeiten in mehrere verschiedene Flüssig-

keiten eingetaucht wird, die in einer Reihe aufeinanderfolgender Behälter enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe in jeden Behälter für ein unveränderlich langes, gleiches Zeitintervall eingetaucht wird und daß mindestens eine der Flüssigkeiten in einer mehr als einen einzigen Behälter umfassenden Gruppe von unmittelbar aufeinanderfolgenden Behältern enthalten ist, deren Anzahl multipliziert mit dem unveränderlich langen Zeitintervall gleich der vorbestimmten Gesamteintauchzeit der Gewebeprobe in die betreffende Flüssigkeit ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gesamte Menge mindestens einer der Flüssigekeiten in einem einzigen Behälter angeordnet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe aus dem Gerät unmittelbar nach dem letzten Eintauchvorgang herausgenommen und in eine Einbettflüssigkeit gelegt wird, die durch Wärme in den festen Zustand überführbar ist, und daß die Einbettflüssigkeit zur Umwandlung in den festen Zustand unmittelbar anschließend erwärmt und die Erwärmung zumindest so lange fortgesetzt wird, bis sich die Einbettflüssigkeit verfestigt hat.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Erwärmen während einer vorgegebenen Zeitspanne bei einer höheren Temperatur als während der vorausgehenden Zeitspanne durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das innerhalb des Behälters mit der Einbettflüssigkeit befindliche Gewebe von einem Beförderungsmittel durch einen Ofen transportiert wird, der Heizbereiche mit in Bewegungsrichtung des Behälters zunehmender Temperatur aufweist.

6. Gerät zur Ausführung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche mit einem Halter für eine Reihe von seitlich nebeneinander angeordneten Flüssigkeitsbehältern, mit einer intermittierend betätigten Fördereinrichtung, die eine Gewebeprobe von einem Behälter zum nächsten Behälter der Behälterreihe befördert, und mit einer von einem Zeitgeber angesteuerten Betätigungsvorrichtung für die Förderrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß die Betätigungsvorrichtung unter der Steuerung des Zeitgebers die Fördereinrichtung derart periodisch betätigt, daß die Gewebeprobe für ein unveränderlich langes, gleiches Zeitintervall in eine solche Flüssigkeit eingetaucht wird, die in jedem der aufeinanderfolgenden Behälter enthalten ist, und daß die gleiche Flüssigkeit in einer Gruppe aus unmittelbar aufeinanderfolgenden Behältern enthalten ist, deren Anzahl die Gesamteintauchzeit der Gewebeprobe in die betreffende gleiche Flüssigkeit dividiert durch das unveränderlich lange Zeitintervall ist.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen