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Entparaffinierungs- und Klärmittellösung zur Präparierung von histologischem
Gewebe zur mikroskopisdien Untersuchung
Die Erfindung betrifft das Präparieren von
histologischen Gewebestücken zur mikroskopischen Untersuchung und insbesondere eine
Entparaffinier-und Klärlösung zur Behandlung des Gewebes im Verlauf der Präparierung.
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Die Präparation von Gewebe zur mikroskopischen Untersuchung erfordert
eine Reihe von Behandlungen des Gewebes vor dem Schneiden der Schnitte aus dem Gewebestück
zur Färbung und zum Aufbringen der Schnitte auf den Objektträger.
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Insbesondere ist es bei der Präparierung von Gewebe erforderlich,
das Gewebe nacheinander während bestimmter Zeitabschnitte in eine Reihe von flüssigen
Mitteln einzutauchen, nämlich zuerst zum Fixieren des Gewebes, dann zum Waschen
zur Entfernung des Fixiermittels, dann zum Entwässern des Gewebes, dann zum Eintauchen
des Gewebes in ein Klärmittel und darauf zum Durchtränken des Gewebes mit Paraffin.
Wie den Pathologen wohlbekannt, dient die Behandlung des Gewebes mit einem Klärmittel
vor dem Einbetten in Paraffin dem Zweck, die Entfernung aller Flüssigkeiten aus
dem Gewebe zu bewirken, welche, wenn sie nicht entfernt werden, den Refraktionsindex
des Gewebes herabsetzen und weiterhin die vollständige Durchtränkung des Gewebes
mit Paraffin beeinträchtigen, woraus sich dann schlechte Gewebeschnittabschnitte
ergeben. Einem Pathologen ist es bekannt, daß, je höher der Refraktionsindex bzw.
die Durchsichtigkeit des Gewebes ist,
um so leichter und genauer
die mikroskopische Prüfung durchgeführt werden kann.
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Als ein geeignetes Kleidemittel vor dem Einbetten in Paraffin ist
Kienöl unter Zusatz von kleineren Anteilen Butylacetat und Chlorkohlenwasserstoffen
bekannt.
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Nachdem das Gewebe mit Paraffin durchtränkt ist, wird es in dünne
Schnitte geschnitten, zum Beispiel gewöhnlich unter Verwendung eines Mikrotoms,
worauf die dünnen Schnitte auf Glasobjektträgern aufgebracht werden. Die aufgebrachten
Schnitte werden dann mit einer Entparaffinierlösung zur Entfernung des Paraffins
aus dem Gewebe behandelt. Bisher wurden Toluol und Xylol zu diesem Zweck angewandt,
indem die Schnitte in Toluol und Xylol eingetaucht werden, welche das Paraffin aus
dem Gewebe lösen und so entfernen. Das Gewebe auf dem Objektträger wird dann gefärbt.
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Gewöhnlich werden Hämatoxylinen und Eosinfarbstoffe für basophiles
und acidophiles Material entsprechend dem Gewebe verwendet. Nach dem Färben werden
die Schnitte mit einem Entwässerungsmittel, zum Beispiel Alkohol, behandelt, um
aus dem Gewebe das Wasser zu entfernen, welches durch das Färbemittel eingebracht
wurde und welches bei einer Nichtentfernung den Refraktionsindex des Gewebes verringern
würde. Nach dieser Behandlungsstufe werden die Schnitte noch mit einem Klärmittel
gewöhnlich Xylol oder Toluol, behandelt, um aus dem Gewebeschnitt auf dem Objektträger
die Flüssigkeit, welche in demselben infolge der Behandlung mit Alkohol oder einem
anderen Entwässerungsmittel enthalten ist, zu entfernen und um den Refraktionsindex
des Gewebes zu erhöhen.
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Die Präparierung von Gewebe, wie sie vorstehend beschrieben wird,
wird häufig in automatischen Eintauchapparaten oder automatischen Gewebebehandlungsmaschinen
vorgenommen.
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Xylol, Toluol und andere Entparaffinier- und Klärlösungen der bisher
verwendeten Art sind jedoch aus einer Reihe von Gründen zu beanstanden, und zwar
hauptsächlich aus folgenden: a) Sie sind hoch entflammbar und bilden daher eine
Feuergefahr; b) sie trocknen rasch.
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Selbst bei Verwendung von automatischen Eintauch- oder Gewebebehandlungsmaschinen
ist es nicht ungewöhnlich festzustellen, daß das Gewebe beim Ubertragen von einer
Tauchbehandlung zur anderen trocknet. Ein Gewebeschnitt, welcher auf dem Objektträger
trocknet, wird aber selbst dann, wenn er anschließend in die Lösung wieder eingetaucht
wird, nicht seine ursprüngliche Transparenz wiedererhalten. Eine zu rasche Trocknung
der Entparaffinierlösung oder des Klärmittels verursacht oft eine Zerstörung von
wertvollen Schnitten.
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Die Entparaffinier- und Klärlösung nach der Erfindung weist demgegenüber
folgende Eigenschaften auf: I. Sie hat ein hohes Lösungsvermögen für Paraffin; 2.
sie härtet das Gewebe nicht und beeinträchtigt nicht die cytologische Struktur desselben;
3. sie setzt nicht den Refraktionsindex des Gewebes herab; 4. sie ist im wesentlichen
unentflammbar bei den Verwendungsbedingungen; 5. ihr Trocl:nungsvermögen ist so,
daß es die Behandlung der Schnitte in einem gemächlichen Tempo gestattet. Hierdurch
ist die Notwendigkeit einer überstürzten Behandlung im Hinblick auf das Trocknen
der Schnitte ausgeschaltet, wie es bei Verwendung von Xylol, dem bisher gewöhnlich
verwendeten Lösungsmittel zur Entfernung des Paraffins und zur Klärung, der Fall
ist.
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Andere Gesichtspunkte und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden
Einzelbeschreibung ersichtlich: Gemäß der Erfindung besteht die Entparaffinierungs-
und Klärlösung im wesentlichen aus erstens einer aromatischen Kohlenwasserstofffraktion
mit einem Siedebereich von etwa I77 bis etwa 2320 und einem spezifischen Gewicht
von etwa o,8go bis 0,895 bei I5,50, zweitens aus Kohlenstofftetrachlorid und drittens
Xylol. Diese Bestandteile werden in beliebiger Reihenfolge bei Zimmertemperatur
in einem Verhältnis von etwa 40 bis etwa 800/(r der aromatischen Kohlenwasserstofffraktion,
von etwa 10 bis etwa 20°/o Kohlenstofftetrachlorid und von etwa 10 bis etwa wo0/(
Xylol gemischt. Alle Verhältnisangaben in dieser Beschreibung beziehen sich auf
das Volumen.
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Die aromatische Kohlenwasserstofffraktion wird durch Hydrierung einer
im wesentlichen aus Naphthen-Petroleum bestehenden Fraktion hergestellt. Sie besteht
ganz oder teilweise aus aromatischen Verbindungen der folgenden Art: I, 2, 4, 5-Tetramethylbenzol,
I, 2, 3, 5-Tetramethylbenzol, I,2-Dialkylbenzol, I,3-Dialkylbenzol, 1, 4-Dialkylbenzol,
1, 2, 3-Trialkylbenzol, I, 2, 4-Trialkylbenzol und Naphthalin.
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Das Mengenverhältnis dieser Bestandteile und die Länge der Kohlenstoffkette
der Alkylgruppen werden von der besonderen Naphthenfraktion als auch von den Bedingungen
ihrer Hydrierung abhängen.
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-Die Fraktion soll einen Siedebereich von etwa I77 bis etwa 2320,
vorzugsweise von etwa I85 bis etwa 2I80, einen Destillationstrockenpunkt von etwa
205 bis etwa 2180, vorzugsweise von etwa 205 bis etwa zu30, und ein spezifisches
Gewicht von etwa o,8go bis etwa 0,895, vorzugsweise von etwa 0,892 bei I5,50 aufweisen.
Solche aromatischen Kohlenwasserstofffraktionen sind im Handel erhältlich.
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Kohlenstofftetrachlorid erhöht den Flammpunkt der Mischung ohne Beeinträchtigung
des Lösungsvermögens für Paraffin oder auch für andere Bestandteile, welche eine
Herabsetzung des Refraktionsindex des Gewebes bedingen. Kohlenstofftetrachlorid,
Xylol und die aromatische Kohlenwasserstofffraktion der obenerwähnten Art mischen
sich zu einer homogenen Lösung. Die Anwendung von Xylol in dem oben bezeichneten
Mengenverhältnis ergibt eine Lösung mit einem Optimum des Refraktionsindex und des
Trockenvermögens.
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Ein vorzugsweises Ausführungsbeispiel einer Entparaffinierungs- und
Klärmittellösung nach der
Erfindung wird nachstehend gegeben. Selbstverständlich
soll der Gegenstand der Erfindung durch dieses Beispiel nicht eingeschränkt werden.
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AromatischeKohlenwasserstofffraktion 70 ovo Kohlenstofftetrachlorid
.......... 15% Xylol I ......... 15 <>/ Diese Bestandteile vermischen sich
zu einer klaren Lösung mit einem spezifischen Gewicht von o,ggo, einem Refraktionsindex
von I,499 bei 250 und einem Flammpunkt, -welcher nach der (ASTM Cleveland Open Cup)
Vorschrift bestimmt wurde.
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Bei dieser Temperatur werden aber reichlich chlorierte Dämpfe abgegeben,
um ein tatsächliches Brennen zu verhindern. Mit anderen Worten, es liegt ein unechter
Flammpunkt vor, da sofort durch die abgegebenen chlorierten Dämpfe des Kohlenstofftetrachlorids
Ablöschung erfolgt.
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Es ist ohne weiteres verständlich, daß bei Verwendung des Enbaraffinierungs-
und Klärmittels nach der Erfindung das mit Paraffin imprägnierte oder durchtränkte
Gewebestück, welches auf einen Glasträger aufgebracht ist, in die Lösung in einem
entsprechenden Behälter, zum Beispiel einem Becherglas, eingetaucht wird. Diese
Behandlung kann beispielsweise in einem automatischen Eintauch-oder Gewebebehandlungsgerät
der obenerwähnten Art ausgeführt werden und soll sich auf einen Zeitabschnitt erstrecken,
der genügt, um das Paraffin aus dem Gewebe zu entfernen. Eine Behandlungszeit von
etwa 2 Minuten wird gewöhnlich ausreichend sein. Die Objektträger mit den Schnitten
werden aus der Lösung entfernt, in destilliertes Wasser getaucht, wieder daraus
entfernt, gefärbt, zum Beispiel durch Eintauchen in ein Hämatoxylon-Färbungsmittel,
wieder daraus entfernt, wieder in destilliertes Wasser getaucht, durch Eintauchen
in ein Bad von Eosinlösung gefärbt, hieraus entfernt, in destilliertes Wasser getaucht,
daraus entfernt, in Alkohol oder ein anderes Entwässerungsmittel der oben bezeichneten
Art eingetaucht, daraus entfernt und danach in eine Lösung nach der Erfindung zur
Klärung getaucht. JedeTauchperiode kann etwa 2 bis 5 Minuten betragen.
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Es wurde gefunden, daß eine Entparaffinierungs-und Klärlösung nach
der Erfindung mit den drei Bestandteilen der obenerwähnten Art in den angegebenen
Mengenverhältnissen in überraschendem und außerordentlichem Maßstabe die gewünschten
Eigenschaften, welche oben angegeben sind, vereinigt. Sie ist mindestens ein ebenso
gutes, wenn nicht besseres Lösungsmittel für Paraffin als Xylol.
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Sie verdampft nicht so schnell wieXylol und ergibt somit kein Trocknen
der Schnitte mit der hieraus folgenden Zerstörung; sie ist im wesentlichen unentflammbar
und verringert dadurch entsprechend die Brandgefahr; sie härtet das Gewebe nicht
und beeinträchtigt so seine cytologische Struktur nicht.
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Der Refraktionsindex 1,4999 bei 25 0 ist etwas höher als derjenige
von Xylol, der I,497 bei 25 0 beträgt.