CN103232536A - Soar1蛋白及其编码基因在调控植物对aba耐受性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：a1）调控植物对ABA耐受性；a2）选育对ABA耐受性提高的植物品种。本发明可应用于将植物激素ABA作为一种选择性除草剂，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利用SOAR1基因调节植物对ABA的敏感性或耐受性，获得SOAR1基因高表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明符合可持续农业发展需求，对于改良遗传特性，开拓绿色环保、无公害的除草方法和途径等方面具有重要的实用价值和市场前景。

Description

SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。

背景技术

脱落酸（Abscisic Acid，ABA）是植物体内最重要的天然生长激素，早在20世纪60年代初被人们发现，因其具有促进植物叶片脱落的功能而得名。植物激素ABA参与调控植物生长发育各个阶段，包括种子休眠、萌发，幼苗生长、侧根生长，气孔运动，以及营养生长向生殖生长转换等过程。同时，ABA在植物对外界多种逆境胁迫的响应中起着重要作用，逆境胁迫包括旱、冷、盐、渗透胁迫和机械伤害等非生物胁迫，以及病虫害等生物胁迫。由于植物体自身生长发育的局限性以及全球气候环境变化等因素的影响，植物ABA信号转导通路分子机制的阐明对调控植物生长、提高作物品质、改良遗传特性、促进现代农业生产发展具有重要的意义。

近年来，植物中ABA受体及其信号转导功能组分的筛选与鉴定、ABA生物代谢及转运以及ABA信号转导通路模型的构建及与其它植物激素间的交叉对话等研究均取得了重要进展，有力推动了植物中ABA信号转导调控机理的阐明。到目前为止，研究人员分别鉴定出了几种不同的ABA受体或候选受体：镁螯合酶H亚基CHLH/ABAR、START超家族中的PYR/PYL/RCAR受体、类G蛋白偶联受体GTG1、GTG2。

ABAR是第一个被鉴定出来的介导ABA主要生理反应的受体，ABAR蛋白在拟南芥中的同源蛋白是叶绿体中的镁螯合酶的H亚基CHLH，在其介导的ABA信号通路中起正调控作用。目前的研究表明ABAR介导的ABA信号通路是非常复杂的。通过酵母双杂交筛选候选的ABAR互作因子，以及通过在ABAR超表达、对ABA超敏的转基因群体中筛选ABA脱敏突变体，已经获得一些重要的ABAR下游调节子。这些调节子提示ABAR介导着多样化的ABA信号通路。

三角形五肽富足（PPR）蛋白是一类含有35个氨基酸基序重复30次以上的，能够与RNA结合的蛋白。随着对PPR蛋白家族的研究，越来越多的PPR蛋白被人们所认知。PPR蛋白主要分布在高等陆地植物中，在拟南芥中已经发现了超过450种PPR蛋白，在其他高等植物中存在更多。目前在拟南芥中仅发现几个PPR蛋白参与了ABA信号转导过程，如PPR40、ABO5、SLG1、PGN与AHG11等。有关PPR蛋白家族参与ABA信号转导调控还有着巨大的研究空间。

随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，如何利用发现的正负调节因子改变植物对ABA信号的响应水平，控制植物生长以达到所需要的状态，调控植物抗逆性，以及利用天然植物激素实现的选择性除草等成为研究前沿。

发明内容

本发明的目的是提供一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物对ABA耐受性中的应用。

本发明所提供的应用，具体为如下A或B：

A：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质（命名为SOAR1）在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物对ABA耐受性；

a2）选育对ABA耐受性提高的植物品种。

B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（命名为SOAR1）在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物对ABA耐受性；

a2）选育对ABA耐受性提高的植物品种。

在本发明中，以上所有a1）中的所述调控植物对ABA耐受性均具体为提高植物对ABA耐受性；以上所有a2）中的所述选育对ABA耐受性提高的植物品种的方法，均具体可包括将所述SOAR1蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

本发明还提供一种培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a）向目的植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物。

在上述方法中，所述对ABA耐受性提高的转基因植物对ABA的耐受浓度最高可达500μM，如100-200μM或200-500μM，具体如100μM、200μM或500μM。所述转基因植物对ABA的耐受浓度是指所述转基因植物的生长状态与不用ABA处理的对照相比无统计学差异的ABA浓度。

在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（即SOAR1基因）是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）序列表中序列1所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）-3）任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

5）与1）-4）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列1由2216个核苷酸组成，为所述SOAR1基因在拟南芥基因组中序列，其中第653-763位为内含子序列；序列2由2105个核苷酸组成，为所述SOAR1基因的cDNA序列，其中第89-1897位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由602个氨基酸残基组成。

在上述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述SOAR1基因插入到pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点用限制性内切酶BamH I与Sal I之间后得到的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述SOAR1基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。

在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型（Col-0生态型）。

在上述方法的步骤b）中，所述“从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物”是通过如下方法实现的：用所述目的植物不能耐受的浓度的ABA处理所述步骤a）所得转基因植物，从而获得所述“与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物”。

在上述方法中，所述目的植物不能耐受的浓度的ABA为浓度可为0.6μM-200μM的ABA，如0.6μM-10μM，或100μM-200μM，具体如100μM或200μM。所述目的植物不能耐受的浓度是指所述目的植物的生长状态与不用ABA处理的对照相比具有统计学差异的ABA浓度。

在上述方法中，所述“用所述目的植物不能耐受的浓度的ABA处理所述步骤a）所得转基因植物”具体为：将所述步骤a）所得转基因植物的种子或幼苗置于含有所述目的植物不能耐受的浓度的ABA的MS培养基中培养。

本发明的又一个目的是提供一种对所述转基因植物进行除草的方法。

在本发明所提供的对所述转基因植物进行除草的方法中，所用除草剂是浓度为M的ABA溶液；所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受。

在上述方法中，所述“所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受”是指：向所述待除杂草喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述待除杂草死亡；但向所述转基因植物喷洒所述浓度为M的ABA溶液后，所述转基因植物不死亡，且生长状态与喷洒所述浓度为M的ABA溶液前相比无统计学差异。

本发明研究发现SOAR1蛋白是ABA信号传导的核心负调节子。本发明可应用于将植物激素ABA作为一种选择性除草剂，其选择性取决于植物对ABA的敏感性，利用SOAR1调节植物对ABA的敏感性或耐受性，获得SOAR1高表达、抗除草剂转基因作物，实现选择性除草。本发明符合可持续农业发展需求，对于改良遗传特性，开拓绿色环保、无公害的除草方法和途径等方面具有重要的实用价值和市场前景。

附图说明

图1为SOAR1基因相关T-DNA插入突变体的鉴定。测序比对结果，突变体soar1-2以及soar1-3T-DNA分别插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前352bp（启动子区）和77bp（5’非翻译区）位置。

图2为各遗传材料SOAR1基因表达量的分析结果。其中，(a)为SOAR1相关突变体的实时荧光定量PCR检测结果，SOAR1基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1基因的表达为1；(b)为SOAR1相关突变体免疫印迹检测结果，SOAR1蛋白的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1蛋白的表达为100。

图3为ABA对SOAR1各遗传材料种子萌发的影响分析结果。

图4为ABA对SOAR1各遗传材料幼苗生长的影响分析结果（水平生长试验）。

图5为ABA对SOAR1各遗传材料幼苗生长的影响分析结果（竖直生长试验）。其中，（a）为SOAR1各遗传材料种子分别播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上（0μM和0.6μM），竖直生长10d后的幼苗生长情况；（b）为（a）中对应幼苗的主根长度统计。

图6为高浓度ABA对SOAR1转基因株系幼苗生长的影响分析结果。其中，（a）为种子层积后在含不同浓度ABA的MS培养基上的直接生长实验；（b）为种子层积后在普通MS培养基上生长48h后移至含不同浓度ABA的MS培养基上的移苗实验。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供（记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang,Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltrationin Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.）。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点（MCS）上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。

拟南芥野生型（Col-0生态型）：拟南芥野生型种子（Arabidopsis thaliana，ecotypeColumbia-0）购自拟南芥生物研究中心（ABRC）。

T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3种子：购自凡尔赛遗传学和植物育种实验室拟南芥资源中心（Versailles Genetics and Plant Breeding Laboratory Arabidopsis thalianaResource Centre）。背景为拟南芥野生型（Col-0生态型），soar1-2、soar1-3为SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体。种子编号信息：soar1-2：(stock number:FLAG_546D07)；soar1-3：(stock number:FLAG_500B04)。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供（记载文献：R.Berres,L.Otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue bydifferent strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.）。

大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α（DE3）感受态，购自全式金生物有限公司。

SOAR1蛋白抗体：以特异性较高的由序列表中序列3的第299-602位氨基酸组成的肽段作为免疫原，免疫兔子，制备得到的兔源多克隆抗体。

实施例1、SOAR1转基因植物的获得及鉴定

本实施例中所涉及的SOAR1基因来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由2216个核苷酸组成，其中第653-763位为内含子序列；所述SOAR1基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由2105个核苷酸组成，其中第89-1897位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由602个氨基酸残基组成。

经过生物信息学预测，SOAR1是PPR蛋白家族中的一员。

在http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/index.htmla数据库中对SOAR1进行预测，发现SOAR1蛋白是由N端信号肽、中间三角形五肽富足蛋白区和C端未知功能区段构成。

生物信息学预测表明所发现蛋白SOAR1是一种新发现的PPR蛋白（三角形五肽富足蛋白），其编码基因（SOAR1）是PPR蛋白家族中的一个新基因。

一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1的构建

提取拟南芥野生型（Col-0生态型）的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1800bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第89-1897位核苷酸序列（SOAR1基因的编码序列，ORF）。

引物1：5’-CGGGATCCTATGAACTCTCTGTTCACCGCC-3’（下划线部分为BamH I的识别位点，该序列的第10-30位为序列2的第89-109位）

引物2：5’-ACGCGTCGACTCACTCAAAATCCCCTGCATCTC-3’（下划线部分为Sal I的识别位点，其后的序列为序列2的第1875-1897位的反向互补序列）

用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点BamH I和Sal I之间插入“T+序列2的第89-1897位”所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-SOAR1。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1中，启动所述SOAR1基因转录的启动子为35S启动子。

在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的SOAR1基因为模板。

二、SOAR1基因表达降低突变体鉴定

SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体，将其命名为soar1-2和soar1-3，购买自INRA凡尔赛遗传学和植物育种实验室拟南芥资源中心（Versailles Genetics andPlant Breeding Laboratory,Arabidopsis thaliana Resource Centre，http://dbsgap.versailles.inra.fr/portail/），背景为拟南芥野生型（Col-0生态型）。通过分子生物学方法鉴定出各自的纯合体，并通过测序对突变体T-DNA插入位点进行分析。

测序比对结果如图1所示：

soar1-2突变体中的T-DNA插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前352bp（启动子区）位置；

soar1-3突变体中的T-DNA插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前77bp（5’非翻译区）位置。

所用引物序列如下：

(1)soar1-2(stock number:FLAG_546D07)

LB4:5’-CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT-3’(Left border primer,LB)

soar1-2LP:5’-GTGAACCAACTCAACACTCGG-3’(Left primer,LP)

soar1-2RP:5’-TCACCGCAATGTATCTACCATC-3’(Right primer,RP)

(2)soar1-3(stock number:FLAG_500B04)

LB4:5’-CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT-3’

soar1-3LP:5’-GCTCGTATAGCTTGTTGCACC-3’

soar1-3RP:5’-ATAACCACATCCATTGCCTTG-3’

三、SOAR1转基因拟南芥的获得及鉴定

1、SOAR1转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得

将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有SOAR1基因（PCR目的条带大小为1800bp）的农杆菌GV3101命名为pCAMBIA-1300-221-SOAR1；将转入pCAMBIA-1300-221空载体的农杆菌GV3101命名为空-GFP/pCAMBIA-1300-221。

采用农杆菌花序侵染的方法（SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998,16(6):735-743.）将上述所得的重组农杆菌pCAMBIA-1300-221-SOAR1（或空-GFP/pCAMBIA-1300-221）转化拟南芥野生型（Col-0）。

转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-SOAR1的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株（T₁代）。

2、SOAR1转基因拟南芥鉴定

（1）PCR鉴定

从步骤1获得的T₁代SOAR1转基因拟南芥，以及转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。对于SOAR1转基因拟南芥，以引物1和引物2（序列同步骤一所述）进行PCR扩增，经鉴定同时得到大小约为1800bp（外源插入的序列2所示SOAR1基因）和1900bp（拟南芥内源的序列1所示SOAR1基因）两个目的条带的植株即为SOAR1转基因阳性植株，而鉴定只得到大小为1900bp目的条带的植株为SOAR1转基因阴性植株。对于转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，用GFP引物GFP-F1和GFP-R1（引物序列如下）进行PCR鉴定，经鉴定表明含有GFP基因的（PCR产物大小约为700bp）植株即为pCAMBIA-1300-221空载体转入阳性的植株。所用引物序列如下：

GFP-F1：5’-AGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3’；

GFP-R1：5’-GTATAGTTCATCCATGCCATG-3’。

经上述PCR分子鉴定，将鉴定阳性的其中三个SOAR1转基因拟南芥株系分别记作OE1、OE3和OE6。

（2）遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数

根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系（单拷贝SOAR1转基因拟南芥），从而用于纯合体的筛选。

（3）转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系的筛选

经上述鉴定分析后，选择其中三个代表性单拷贝SOAR1转基因拟南芥株系，OE1、OE3和OE6（T₁代）。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长（即所有后代均具潮霉素抗性）的亲本植株为纯合系，最终获得T₃代转基因拟南芥OE1、OE3和OE6的纯合系植株，作为实验材料进行以下ABA耐受性试验分析。

四、转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系中SOAR1基因表达量分析

提取拟南芥野生型（Col-0生态型）与T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3，过表达植株OE1、OE3和OE6的总RNA和总蛋白，利用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术，分别检测材料中SOAR1基因在转录水平和翻译水平上的RNA和蛋白表达情况。具体如下：

1、转录水平分析（RNA表达量）

以上述获得的转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3,以及拟南芥野生型（Col-0生态型）萌发后1d的种子为实验材料。提取各实验材料的基因组RNA，分别通过实时荧光定量PCR方法分析SOAR1基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增SOAR1基因的引物序列为：

引物SOAR1-F：5’-TACGGAACTTAGGTTGCTTGAG-3’（序列2的第715-736位），

引物SOAR1-R：5’-AACAACAGTCGGCTTCACATTC-3’（序列2的第925-946位的反向互补序列）。

以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：

Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’，

Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。

上述引物的反应条件如下：

（1）反应体系的建立

实时荧光定量PCR反应体系

（2）三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。

（3）反应程序的设定：

实时荧光定量PCR反应程序

（4）数值分析，Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt=Ct(Gene)-Ct(Actin)，以2^-ΔCt的值衡量基因转录水平,分析各基因的表达情况。

2、翻译水平分析（蛋白表达量）

（1）拟南芥总蛋白提取

1)取适量植物材料（萌发后1d的种子），在液氮中充分研磨，粉末移入遇冷的离心管中，称重并记录；

2)按2mL/g加入拟南芥总蛋白提取缓冲液，混匀后在冰上放置1h，期间颠倒混匀3～4次；

3)4℃下12,000rpm离心2次，每次15min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE

1)样品准备：蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水煮5～10min，12000rpm离心5min；

2)玻璃板洗净装好，配制适当浓度的分离胶与浓缩胶溶液，注入胶板制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶。分离胶与浓缩胶配方如下所示：

分离胶配方

浓缩胶配方

3)把胶板按Bio-Rad Mini III的要求装好后，加入400mL1×电泳缓冲液，上样，80V恒压电泳20～30min后，换150V恒压电泳约1h，至溴酚蓝跑出分离胶后停止电泳。

（3）蛋白质免疫印迹Western blot

1)按照Bio-Rad湿转法转膜的要求进行电泳（100mA恒流电泳8～10h），将胶上的蛋白转至硝酸纤维膜上；

2)把膜放入封闭液中，在脱色摇床上室温慢摇3h；

3)封闭结束后，把膜放入一抗（SOAR1蛋白抗体，兔源多克隆抗体）溶液中，在脱色摇床上室温慢摇2h；

4)用TBST1洗膜3次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

5)把膜放入二抗（Cell Signaling Technology公司产品，其产品目录号为Anti-rabbitIgG,AP-linked Antibody#7054，为羊抗兔抗体）溶液中，在脱色摇床上室温慢摇1h；

6)用TBST2洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

7)用TBS洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

8)把膜放入显色液中进行显色，显色完成后将膜放入ddH₂O中，终止反应。

同时以Actin作为内参。

各遗传材料中SOAR1基因表达量的分析结果如图2所示。具体的，SOAR1相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图2中(a)所示，SOAR1基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1基因的表达为1。SOAR1相关遗传材料免疫印迹检测结果如图2中(b)所示，SOAR1蛋白的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1蛋白的表达为100。从图2中可以看出，相比拟南芥野生型（Col-0），步骤三获得的转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系中SOAR1基因的表达量显著提高，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3中SOAR1基因的表达在转录水平和翻译水平上相对于拟南芥野生型（Col-0）均明显调低。

实施例2、SOAR1转基因植物对ABA耐受性分析试验

一、ABA对SOAR1各遗传材料种子萌发的影响

在植物种子休眠与萌发过程中，ABA起着至关重要的作用，施加外源ABA可以抑制种子的正常萌发。随着外源ABA浓度的增加，拟拟南芥野生型（Col-0生态型）种子的萌发率会逐渐降低。种子萌发实验是研究ABA信号转导的重要方法之一，可以观察到ABA对SOAR1相关突变体植株种子萌发的影响。

以拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上（0μM，0.6μM，1μM和3μM）（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中。记录种子在层积后的24h到60h之间的萌发数，每隔12h记录一次，并对结果进行统计。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图3所示，在含有0μM ABA的培养基上，各种实验材料种子的萌发情况基本一致。在含有不同浓度ABA的培养基上，soar1-2、soar1-3相对于拟南芥野生型（Col-0生态型）都明显的表现出对ABA超敏的表型（对ABA的耐受性降低），即在相同检测时间内soar1-2和soar1-3的种子萌发数低于拟南芥野生型（Col-0生态型）；而实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6都明显的表现出ABA脱敏的表型（对ABA的耐受性提高），即在相同检测时间内OE1、OE3和OE6的种子萌发数高于拟南芥野生型（Col-0生态型）。同时，从图中可以看出，OE1、OE3和OE6的种子萌发情况并没有因为培养基中是否含有ABA而发生变化。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其种子萌发情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。综合以上结果可见，实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6对ABA表现出较高的耐受性。

二、ABA对SOAR1各遗传材料幼苗生长的影响

ABA能够抑制植物幼苗的生长。随着外源ABA浓度的升高，拟南芥野生型（Col-0生态型）受到的抑制得到增强，其主根和叶片的生长都会受到不同程度的影响。为了便于观察，本发明采取了水平生长和竖直生长这两种方式观察各个遗传材料对ABA的表型。实验重复3次。

1、水平生长实验

以拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上（0μM、0.4μM和10μM）（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，10d后观察各拟南芥幼苗生长的情况。

结果如图4所示，在含0μM ABA的培养基上，各种遗传材料的幼苗都能够正常生长。在含0.4μM ABA的MS培养基上，soar1-2、soar1-3相对于拟南芥野生型（Col-0），对ABA表现出明显超敏的表型（对ABA的耐受性降低）。在含10μM ABA的MS培养基上，SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6相对于野生型Col-0，对ABA均表现出明显脱敏的表型（对ABA的耐受性提高）。在10μM外源ABA处理下，拟南芥野生型（Col-0）生长被ABA完全抑制而不能正常生长，SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6的幼苗生长则基本不受ABA的影响。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其幼苗生长情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）。基本一致，无统计学差异。综合以上实验结果可见，实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6对ABA表现出较高的耐受性。

2、竖直生长实验

为了更加直观的观察ABA对SOAR1基因相关的各个突变体幼苗与根长的影响，本发明将拟南芥野生型（Col-0生态型），T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3，实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株的种子分别播种在含有0.6μM ABA的MS培养基上（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，10d后观察各拟南芥幼苗子叶和主根的生长情况。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图5所示，在含0.6μM ABA的MS培养基上，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3相对于拟南芥野生型（Col-0）表现出明显的对ABA超敏的表型（对ABA的耐受性降低），且主根生长明显受阻。SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6相对于拟南芥野生型（Col-0）则表现出强烈的对ABA脱敏的表型（对ABA的耐受性提高），且主根生长基本不受到影响。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其幼苗生长情况均与拟南芥野生型（Col-0）基本一致，无统计学差异。

三、高浓度ABA对SOAR1转基因株系幼苗生长的影响

以上试验结果证明了SOAR1转基因株系在种子萌发和幼苗生长上对ABA有强烈的脱敏表型（对ABA的耐受性提高）。本发明的发明人基于以上试验结果，接着分析了高浓度ABA对SOAR1转基因株系幼苗生长的影响。具体如下：

1、在含ABA培养基上直接播种并观察生长表型

将拟南芥野生型（Col-0生态型）、实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株的种子分别播种在含有不同浓度ABA的MS培养基上（0μM、100μM和200μM）（每种实验材料播种80-100粒）。4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中，10d后观察幼苗生长的情况。实验重复3次。

结果如图6中（a）所示，在含0μM ABA的MS培养基上，各遗传材料的幼苗都能够正常生长。在含有100μM ABA的MS培养基上，拟南芥野生型（Col-0生态型）被ABA抑制，无法正常萌发和生长；而SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6的幼苗生长几乎没有受到ABA的抑制。直到在含有200μM ABA的MS培养基上，SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6植株幼苗的生长才受到ABA的抑制。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其幼苗生长情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

2、将正常萌发后的幼苗移到含ABA培养基上并观察生长表型

将拟南芥野生型（Col-0生态型）、T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3，实施例1得到的单拷贝插入的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株的种子分别播种在正常MS培养基上，4℃下低温层积3d后移入光照培养箱中生长48h后，再将刚萌发的幼苗分别移入含有不同浓度ABA的培养基上（0μM、200μM和500μM），竖直生长10d后观察幼苗生长的情况。实验重复3次。

结果如图6中（b）所示，在含0μM ABA的MS培养基上，各遗传材料的幼苗都能够正常生长。在含200μM ABA的MS培养基上，拟南芥野生型（Col-0生态型）、T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3被ABA抑制无法正常萌发和生长，而SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6幼苗几乎没有受到ABA的抑制。直到在含500μM ABA的MS培养基上，SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6植株才能看到受ABA抑制的表型现象。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，无论是在含有0μM ABA的培养基上，还是在含有不同浓度ABA的培养基上，其幼苗生长情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

Claims (9)

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物对ABA耐受性；

a2）选育对ABA耐受性提高的植物品种。

2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下a1）或a2）中的应用：

a1）调控植物对ABA耐受性；

a2）选育对ABA耐受性提高的植物品种。

3.培育对ABA耐受性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：

a）向目的植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物。

4.根据权利要求1或2所述的应用，或权利要求3所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1）至5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2所示的DNA分子；

3）序列表中序列1所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）-3）任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

5）与1）-4）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤b）中，所述从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物，是通过如下方法实现的：用所述目的植物不能耐受的浓度的ABA溶液处理所述步骤a）所得转基因植物，从而获得所述与所述目的植物相比，对ABA耐受性提高的转基因植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述目的植物不能耐受的浓度的ABA溶液为浓度为0.6μM-200μM的ABA水溶液。

9.一种对权利要求3-6任一中所述的转基因植物进行除草的方法，其特征在于：所用除草剂是浓度为M的ABA溶液；所述浓度为M的ABA溶液对于待除杂草来说不能耐受，但对于所述转基因植物来说能耐受。

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