CN103242437B - Soar1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物生长发育中的应用。实验证明，SOAR1表达调低的T-DNA插入突变体植株表现为种子萌发缓慢，幼苗下胚轴伸长，营养生长时间缩短，开花的起始时间提前等；而SOAR1过表达转基因植株则表现为种子萌发加速，幼苗下胚轴缩短，营养生长时间延长，开花的起始时间延迟等。本发明可通过调节SOAR1表达量，可以获得改变原有生长状态和时间的转基因植物，以满足对不同作物的经济需求与特定的文化需求；本发明在农作物遗传改良、花卉果木、生态园林等诸多行业领域具有广阔的市场和应用前景。

Description

SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。

背景技术

开花植物占地球上所有植物种类总数的一半以上，达30多万种。人们种植的粮食、蔬菜、油料作物和果树等，大多数是开花植物。开花植物由根、茎、叶、花、果实、种子六大器官构成，包括双子叶植物和单子叶植物两纲。高等开花植物的生命周期，起始于种子萌发，经过幼苗生长，植株成熟，生殖体形成，开花结实，最终形成种子。

开花植物生长发育过程，要经历营养生长和生殖生长两个不同的阶段：（1）营养生长：包括种子萌发，根、茎、叶等营养器官的生长；（2）生殖生长：包括花、果实、种子等生殖器官的生长。

开花是植物营养生长向生殖生长转换的重要过程，作为这两个不同生长阶段的转换标志。植物开花受到多种内部与外部因素的影响，其中，主要的外部因素有光照与温度，主要的内部因素包括自主途径和赤霉素途径等。

植物的生长发育及营养生长向生殖生长转换过程，涉及到ABA信号传导途径以及调节因子的作用。脱落酸（Abscisic Acid，ABA）是植物体内最重要的天然生长激素，因其具有促进植物叶片脱落的功能而得名。植物激素ABA参与调控植物生长发育各个阶段，包括种子休眠、萌发，幼苗生长、侧根生长，气孔运动，以及营养生长向生殖生长转换等过程。随着ABA信号传导研究的深入及应用的拓展，寻找与ABA受体互作的胞内信使与信号调节子，并如何利用发现的正负调节因子改变植物对ABA信号的响应水平，控制植物生长以达到所需要的状态等成为研究前沿。研究已经发现的ABA响应调节子，包括G蛋白，蛋白磷酸酶例如PP2Cs，依赖钙的蛋白激酶(CDPK)类似物等（Wu Y,Sanchez JP,Lopez.Molina L,et al.The abil-1mutation blocks ABAsignaling downstream of cADPR action[J].Plant Journal,2003,34:307-315.）。

为了满足人们对不同作物的经济需求与特定的文化需求，长期以来，研究人员一直致力于研究探讨如何运用各种不同的方法，调控植物的营养生长和生殖生长等不同发育时段的转变速度，以满足现代化时代人们的丰富需求。已有的人为花期控制的主要技术措施有：控制光照、改变温度、应用生长调节物质、控制水肥、改变收获期以及修剪等。这些技术措施由于受到外界条件干扰和限制，其所达到的花时控制的效果不够稳定，没有从改变植物的遗传特性上得到稳定的花时控制。而随着分子生物学技术的发展及对植物开花分子机制的深入研究，植物生长发育与开花调控基因工程取得重大进展。发现新的开花调节因子，采用转基因技术向植物导入外源基因已成为调控植物生长阶段转换的新途径。通过调节转基因植物的调节因子的基因表达水平的途径和方式，实现对开花植物的生长发育时间和开花时间的控制，并获得更加稳定的控制效果。

随着物质与文化水平的不断提升，这方面研究将在农作物遗传改良、花卉果木、生态园林等诸多行业领域具有广阔的市场和应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种SOAR1蛋白及其编码基因在调控植物生长发育中的应用。

本发明所提供的应用，具体为如下A或B：

A：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质（命名为SOAR1）在调控植物生长发育中的应用。

B：由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（命名为SOAR1）在调控植物生长发育中的应用。

在本发明中，所述植物生长发育，体现在如下1）-4）中至少一种：

1）种子萌发速率；

2）幼苗下胚轴长度；

3）植株开花的起始时间（营养生长向生殖生长转换的起始时间）；

4）果实成熟时间。

更加具体的，以上所有的所述调控植物生长发育均具体为如下5）-8）中至少一种：

5）加快种子萌发速率；

6）缩短幼苗下胚轴长度；

7）延迟植株开花的起始时间（使营养生长向生殖生长转换的起始时间延迟）；

8）延迟果实成熟时间。

由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的SOAR1蛋白或其编码基因SOAR1在选育具有如下I）-IV）目的性状中至少一种的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围：

I）种子萌发速率加快或减慢；

II）幼苗下胚轴长度缩短或伸长；

III）植株开花的起始时间延迟或提前；

IV）果实成熟时间延迟或提前。

在实际应用中，当所选育的植物品种为具有以上I）-IV）所述目的性状中至少一种[I）-IV）所述目的性状均选择“或”字之前的性状]的植物品种时，需将所述SOAR1蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交。当所选育的植物品种为具有以上I）-IV）所述目的性状中至少一种[I）-IV）所述目的性状均选择“或”字之后的性状]的植物品种时，需将所述SOAR1蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交。

本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

a）向目的植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下b1）-b4）目的性状中至少一种的转基因植物：

b1）种子萌发速率加快；

b2）幼苗下胚轴缩短；

b3）植株开花的起始时间延迟；

b4）果实成熟时间延迟。

在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（即SOAR1基因）是如下（1）至（5）中任一所述的DNA分子：

（1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2所示的DNA分子；

（3）序列表中序列1所示的DNA分子；

（4）在严格条件下与（1）-（3）任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

（5）与（1）-（4）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列1由2216个核苷酸组成，为所述SOAR1基因在拟南芥基因组中序列，其中第653-763位为内含子序列；序列2由2105个核苷酸组成，为所述SOAR1基因的cDNA序列，其中第89-1897位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由602个氨基酸残基组成。

在上述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述SOAR1基因插入到pCAMBIA-1300-221载体的多克隆位点用限制性内切酶BamH I与Sal I之间后得到的重组质粒。

在上述方法中，将携带有所述SOAR1基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物即可为单子叶植物，也可为双子叶植物。

在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物，具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型（Col-0生态型）。

在本发明中，上述应用或方法中，所述“幼苗下胚轴”中的所述“幼苗”为自播种日起第10天（播种后4℃下低温层积3d，光照培养7d）的拟南芥幼苗。

实验证明，SOAR1表达调低的T-DNA插入突变体植株表现为种子萌发缓慢，幼苗下胚轴伸长，营养生长时间缩短，开花的起始时间提前等；而SOAR1过表达转基因植株则表现为种子萌发加速，幼苗下胚轴缩短，营养生长时间延长，开花的起始时间延迟等。本发明可通过调节SOAR1表达量获得改变原有生长及开花时间的转基因植物，以满足对不同作物的经济需求与特定的文化需求。在农作物遗传改良、花卉果木、生态园林等诸多行业领域具有广阔的市场和应用前景。

附图说明

图1为SOAR1基因相关T-DNA插入突变体的鉴定。测序比对结果，突变体soar1-2以及soar1-3T-DNA分别插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前352bp（启动子区）和77bp（5’非翻译区）位置。

图2为各遗传材料SOAR1基因表达量的分析结果。其中，(a)为SOAR1相关突变体的实时荧光定量PCR检测结果，SOAR1基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1基因的表达为1；(b)为SOAR1相关突变体免疫印迹检测结果，SOAR1蛋白的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1蛋白的表达为100。

图3为SOAR1基因相关突变体的种子萌发速率分析结果。

图4为SOAR1基因相关突变体的幼苗生长发育分析结果。其中，(a)为不同基因型幼苗的形态比较；（b）为对不同基因型幼苗下胚轴长度进行统计的结果。

图5为SOAR1基因相关突变体植株开花时期状况。其中，(a)为土中生长40天不同基因型植株生长情况；（b）为土中生长65天不同基因型植株生长情况。

图6为SOAR1基因相关突变体植株的茎生长同高度（1-2cm）所对应的莲座叶片数及天数。其中，（a）为对应莲座叶片数；（b）为对应的天数。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

pCAMBIA-1300-221载体：由清华大学提供（记载文献：Lijing Liu,Yiyue Zhang,Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltrationin Nicotiana benthamiana.The Plant Journal,2010(61):893-903.）。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点（MCS）上游的启动子为35S启动子。在pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221载体相关信息：http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。

拟南芥野生型（Col-0生态型）：拟南芥野生型种子（Arabidopsis thaliana，ecotypeColumbia-0）购自拟南芥生物研究中心（ABRC）。

T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3种子：购自凡尔赛遗传学和植物育种实验室拟南芥资源中心（Versailles Genetics and Plant Breeding Laboratory Arabidopsis thalianaResource Centre）。背景为拟南芥野生型（Col-0生态型），soar1-2、soar1-3为SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体。种子编号信息：soar1-2：(stock number:FLAG_546D07)；soar1-3：(stock number:FLAG_500B04)。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）：根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学提供（记载文献：R.Berres,L.Otten,B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue bydifferent strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.）。

大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α（DE3）感受态，购自全式金生物有限公司。

SOAR1蛋白抗体：以特异性较高的由序列表中序列3的第299-602位氨基酸组成的肽段作为免疫原，免疫兔子，制备得到的兔源多克隆抗体。

实施例1、SOAR1转基因植物的获得及鉴定

本实施例中所涉及的SOAR1基因来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），其在拟南芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由2216个核苷酸组成，其中第653-763位为内含子序列；所述SOAR1基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由2105个核苷酸组成，其中第89-1897位为编码序列（ORF）；序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由602个氨基酸残基组成。

经过生物信息学预测，SOAR1是PPR蛋白家族中的一员。

在http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/index.htmla数据库中对SOAR1进行预测，发现SOAR1蛋白是由N端信号肽、中间三角形五肽富足蛋白区和C端未知功能区段构成。

生物信息学预测表明所发现蛋白SOAR1是一种新发现的PPR蛋白（三角形五肽富足蛋白），其编码基因（SOAR1）是PPR蛋白家族中的一个新基因。

一、重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1的构建

提取拟南芥野生型（Col-0生态型）的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板，通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约1800bp片段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5’端起第89-1897位核苷酸序列（SOAR1基因的编码序列，ORF）。

引物1：5’-CGGGATCCTATGAACTCTCTGTTCACCGCC-3’（下划线部分为BamH I的识别位点，该序列的第10-30位为序列2的第89-109位）

引物2：5’-ACGCGTCGACTCACTCAAAATCCCCTGCATCTC-3’（下划线部分为Sal I的识别位点，其后的序列为序列2的第1875-1897位的反向互补序列）

用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经过同样双酶切的pCAMBIA-1300-221载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点BamH I和Sal I之间插入“T+序列2的第89-1897位”所示DNA片段的重组质粒命名为pCAMBIA-1300-221-SOAR1。在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1中，启动所述SOAR1基因转录的启动子为35S启动子。

在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1的构建过程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的SOAR1基因为模板。

二、SOAR1基因表达降低突变体鉴定

SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体，将其命名为soar1-2和soar1-3，购买自INRA凡尔赛遗传学和植物育种实验室拟南芥资源中心（Versailles Genetics andPlant Breeding Laboratory,Arabidopsis thaliana Resource Centre，http://dbsgap.versailles.inra.fr/portail/）,背景为拟南芥野生型（Col-0生态型）。通过分子生物学方法鉴定出各自的纯合体，并通过测序对突变体T-DNA插入位点进行分析。

测序比对结果如图1所示：

soar1-2突变体中的T-DNA插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前352bp（启动子区）位置；

soar1-3突变体中的T-DNA插入在SOAR1基因的起始密码子（ATG）前77bp（5’非翻译区）位置。

所用引物序列如下：

(1)soar1-2(stock number:FLAG_546D07)

LB4:5’-CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT-3’(Left border primer,LB)

soar1-2LP:5’-GTGAACCAACTCAACACTCGG-3’(Left primer,LP)

soar1-2RP:5’-TCACCGCAATGTATCTACCATC-3’(Right primer,RP)

(2)soar1-3(stock number:FLAG_500B04)

LB4:5’-CGTGTGCCAGGTGCCCACGGAATAGT-3’

soar1-3LP:5’-GCTCGTATAGCTTGTTGCACC-3’

soar1-3RP:5’-ATAACCACATCCATTGCCTTG-3’

三、SOAR1转基因拟南芥的获得及鉴定

1、SOAR1转基因拟南芥及转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株的获得

将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-SOAR1通过冻融法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有SOAR1基因（PCR目的条带大小为1800bp）的农杆菌GV3101命名为pCAMBIA-1300-221-SOAR1；将转入pCAMBIA-1300-221空载体的农杆菌GV3101命名为空-GFP/pCAMBIA-1300-221。

采用农杆菌花序侵染的方法（SJ Clough,AF Bent.Floral dip:a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal,1998,16(6):735-743.）将上述所得的重组农杆菌pCAMBIA-1300-221-SOAR1（或空-GFP/pCAMBIA-1300-221）转化拟南芥野生型（Col-0）。

转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素MS培养基上培养，收集具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的两种转基因苗，即转入pCAMBIA-1300-221-SOAR1的拟南芥植株和转入pCAMBIA-1300-221空载体的拟南芥植株（T₁代）。

2、SOAR1转基因拟南芥鉴定

（1）PCR鉴定

从步骤1获得的T₁代SOAR1转基因拟南芥，以及转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。对于SOAR1转基因拟南芥，以引物1和引物2（序列同步骤一所述）进行PCR扩增，经鉴定同时得到大小约为1800bp（外源插入的序列2所示SOAR1基因）和1900bp（拟南芥内源的序列1所示SOAR1基因）两个目的条带的植株即为SOAR1转基因阳性植株，而鉴定只得到大小为1900bp目的条带的植株为SOAR1转基因阴性植株。对于转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，用GFP引物GFP-F1和GFP-R1（引物序列如下）进行PCR鉴定，经鉴定表明含有GFP基因的（PCR产物大小约为700bp）植株即为pCAMBIA-1300-221空载体转入阳性的植株。所用引物序列如下：

GFP-F1：5’-AGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3’；

GFP-R1：5’-GTATAGTTCATCCATGCCATG-3’。

经上述PCR分子鉴定，将鉴定阳性的其中三个SOAR1转基因拟南芥株系分别记作OE1、OE3和OE6。

（2）遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数

根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单拷贝插入的株系（单拷贝SOAR1转基因拟南芥），从而用于纯合体的筛选。

（3）转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系的筛选

经上述鉴定分析后，选择其中三个代表性单拷贝SOAR1转基因拟南芥株系，OE1、OE3和OE6（T₁代）。播种于含40mg/L潮霉素MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后代均能正常生长（即所有后代均具潮霉素抗性）的亲本植株为纯合系，最终获得T₃代转基因拟南芥OE1、OE3和OE6的纯合系植株，作为实验材料进行以下ABA耐受性试验分析。

四、转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系中SOAR1基因表达量分析

提取拟南芥野生型（Col-0生态型）与T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3，过表达植株OE1、OE3和OE6的总RNA和总蛋白，利用实时荧光定量PCR和免疫印迹技术，分别检测材料中SOAR1基因在转录水平和翻译水平上的RNA和蛋白表达情况。具体如下：

1、转录水平分析（RNA表达量）

以上述获得的转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3,以及拟南芥野生型（Col-0生态型）萌发后1d的种子为实验材料。提取各实验材料的基因组RNA，分别通过实时荧光定量PCR方法分析SOAR1基因在各实验材料中的表达情况。其中，扩增SOAR1基因的引物序列为：

引物SOAR1-F：5’-TACGGAACTTAGGTTGCTTGAG-3’（序列2的第715-736位），

引物SOAR1-R：5’-AACAACAGTCGGCTTCACATTC-3’（序列2的第925-946位的反向互补序列）。

以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：

Actin-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’，

Actin-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。

上述引物的反应条件如下：

（1）反应体系的建立

实时荧光定量PCR反应体系

（2）三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。

（3）反应程序的设定：

实时荧光定量PCR反应程序

（4）数值分析，Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt=Ct(Gene)-Ct(Actin)，以2^-ΔCt的值衡量基因转录水平,分析各基因的表达情况。

2、翻译水平分析（蛋白表达量）

（1）拟南芥总蛋白提取

1)取适量植物材料（萌发后1d的种子），在液氮中充分研磨，粉末移入遇冷的离心管中，称重并记录；

2)按2mL/g加入拟南芥总蛋白提取缓冲液，混匀后在冰上放置1h，期间颠倒混匀3～4次；

3)4℃下12,000rpm离心2次，每次15min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。

（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE

1)样品准备：蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水煮5～10min，12000rpm离心5min；

2)玻璃板洗净装好，配制适当浓度的分离胶与浓缩胶溶液，注入胶板制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶。分离胶与浓缩胶配方如下所示：

分离胶配方

浓缩胶配方

3)把胶板按Bio-Rad Mini III的要求装好后，加入400mL1×电泳缓冲液，上样，80V恒压电泳20～30min后，换150V恒压电泳约1h，至溴酚蓝跑出分离胶后停止电泳。

（3）蛋白质免疫印迹Western blot

1)按照Bio-Rad湿转法转膜的要求进行电泳（100mA恒流电泳8～10h），将胶上的蛋白转至硝酸纤维膜上；

2)把膜放入封闭液中，在脱色摇床上室温慢摇3h；

3)封闭结束后，把膜放入一抗（SOAR1蛋白抗体，兔源多克隆抗体）溶液中，在脱色摇床上室温慢摇2h；

4)用TBST1洗膜3次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

5)把膜放入二抗（Cell Signaling Technology公司产品，其产品目录号为Anti-rabbitIgG,AP-linked Antibody#7054，为羊抗兔抗体）溶液中，在脱色摇床上室温慢摇1h；

6)用TBST2洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

7)用TBS洗膜2次，每次10min，洗膜时摇床转速为150～160rpm；

8)把膜放入显色液中进行显色，显色完成后将膜放入ddH₂O中，终止反应。

上述过程中以Actin作为内参。

各遗传材料中SOAR1基因表达量的分析结果如图2所示。具体的，SOAR1相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图2中(a)所示，SOAR1基因的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1基因的表达为1。SOAR1相关遗传材料免疫印迹检测结果如图2中(b)所示，SOAR1蛋白的表达均为相对值，以拟南芥野生型（Col-0生态型）SOAR1蛋白的表达为100。从图2中可以看出，相比拟南芥野生型（Col-0），步骤三获得的转基因拟南芥OE1、OE3和OE6纯合系中SOAR1基因的表达量显著提高，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3中SOAR1基因的表达在转录水平和翻译水平上相对于拟南芥野生型（Col-0）均明显调低。

实施例2、SOAR1转基因植物生长发育情况鉴定

一、SOAR1表达变化对种子萌发速率的影响

以拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2和soar1-3、实施例1得到的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子（每种实验材料播种80-100粒）播种在MS培养基上。4℃下低温层积3d后，移入光照培养箱中。其间记录种子在层积后的24h到72h之间的萌发数，每隔12h记录一次并对结果进行统计。

结果如图3所示，在层积的0-48h内，与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3种子萌发速率较为缓慢；而SOAR1转基因株系OE1、OE3和OE6种子萌发速率较快。在60h后不同基因型的种子萌发率趋于一致。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，其种子萌发情况与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

二、SOAR1表达变化对幼苗生长发育的影响

将拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2，实施例1得到的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子（每种实验材料播种80-100粒）播种在MS培养基上。4℃下低温层积3d后，移入光照培养箱中进行培养7d。将各实验材料的幼苗侧放照相，并统计其下胚轴长度。

结果如图4所示，不同基因型幼苗的形态比较，如图4中（a）所示。左图为MS培养基中生长7d后，各植株幼苗表型，右图为将左图幼苗放大后照片。从图中可以直观的看出，与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，soar1-2表现出子叶张角集中、叶片偏小、下胚轴伸长；而SOAR1转基因株系OE1则表现出子叶叶片张角变大，下胚轴变短。对各植株幼苗下胚轴长度的统计结果具体如图4中（b）所示。而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，其幼苗生长情况与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

三、SOAR1表达变化对植物开花时间的控制

将拟南芥野生型（Col-0生态型）、SOAR1基因表达降低的两个T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3，实施例1得到的T3代纯合体SOAR1转基因株系OE1、OE6，以及实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子（每种实验材料播种80-100粒）播种在MS培养基上。4℃下低温层积3d后，移入光照培养箱中进行培养7d，移至土中生长，对其开花时间进行观测，并通过统计植株抽薹即茎生长相同高度（1-2cm）对应莲座叶片数及生长天数作为开花时间记录指标，比较不同植株开花时间；另外，还对各植株的荚果成熟时间进行比较。

图5中（a）所示为在土中生长40天时各植株生长情况。与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3表现出极显著的开花提前表型；而SOAR1转基因株系OE1、OE6则表现为营养生长时间长、开花延迟。图5中（b）所示为在土中生长65天时各植株生长情况。与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3荚果成熟较早，而SOAR1转基因株系OE1、OE6则荚果成熟较晚。

图6中（a）所示为不同植株的茎生长同高度（1-2cm）所对应的莲座叶片数。与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3表现出莲座叶片数显著减少；而SOAR1转基因株系OE1、OE6则表现出莲座叶片数显著增加。图6中（b）所示为不同植株的茎生长同高度（1-2cm）所对应的天数。与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，SOAR1 T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3茎生长同高度所对应的天数明显减少；而SOAR1转基因株系OE1、OE6茎生长同高度所对应的天数则明显增加。

而对于实施例1得到的转入pCAMBIA-1300-221空载体的对照植株，其以上各项植株生长指标情况均与拟南芥野生型（Col-0生态型）基本一致，无统计学差异。

以上结果表明：与拟南芥野生型（Col-0生态型）相比，T-DNA插入突变体soar1-2、soar1-3表现出营养生长时间缩短，生殖生长提前；而SOAR1转基因株系则表现出营养生长时间延长，生殖生长显著滞后。

综合本实施例实验结果，可见调节SOAR1的表达水平可以控制植物生长发育及开花时间。SOAR1表达调低的T-DNA插入突变体植株表现为种子萌发缓慢，幼苗下胚轴伸长，营养生长时间缩短，开花的起始时间提前等；而SOAR1过表达转基因植株则表现为种子萌发加速，幼苗下胚轴缩短，营养生长时间延长，开花的起始时间推迟等。

Claims (1)

1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控拟南芥生长发育中的应用；

所述拟南芥生长发育，体现在如下1）-4）中至少一种：

1）种子萌发速率；

2）幼苗下胚轴长度；

3）植株开花的起始时间；

4）果实成熟时间。

2、由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在选育具有如下I）-IV）目的性状中至少一种的拟南芥品种中的应用：

I）种子萌发速率加快或减慢；

II）幼苗下胚轴长度缩短或伸长；

III）植株开花的起始时间延迟或提前；

IV）果实成熟时间延迟或提前。

3、根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下（1）至（3）中任一所述的DNA分子：

（1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2所示的DNA分子；

（3）序列表中序列1所示的DNA分子。

4、培育具有如下目的性状中至少一种的转基因拟南芥的方法，包括如下步骤：

a）向目的拟南芥中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因拟南芥；

b）从步骤a）所得转基因拟南芥中得到与所述目的拟南芥相比，具有如下b1）-b4）目的性状中至少一种的转基因拟南芥：

b1）种子萌发速率加快；

b2）幼苗下胚轴缩短；

b3）植株开花的起始时间延迟；

b4）果实成熟时间延迟。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下（1）至（3）中任一所述的DNA分子：

（1）编码序列为序列表中序列2自5’末端第89至1897位核苷酸所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2所示的DNA分子；

（3）序列表中序列1所示的DNA分子。

6、根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的拟南芥中的。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动子。

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