CN102918394A - 用于鉴定改变植物细胞中基因和蛋白质的野生型表达的组合物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于鉴定选择性地改变植物细胞的野生型基因表达的化合物的方法，所述方法包括将来自与第一测试化合物接触的植物细胞或组织的第一表达谱，来自与另外的测试化合物接触的相同植物细胞或组织的另外的表达谱，和来自与所述第一测试化合物和另外的测试化合物接触的相同植物细胞或组织的组合化合物表达谱进行比较，其中将各植物细胞或组织接触足以在所述植物的细胞或组织中的至少一种基因或基因产物的表达上产生改变的时间；并且其中每种表达谱包含所述植物细胞或组织的至少一种基因或基因产物的表达水平或模式；和鉴定组合化合物谱的基因或基因产物与第一谱和另外的谱的加合改变的基因或基因产物之间在表达水平或模式上显著的、意想不到的改变。

Description

用于鉴定改变植物细胞中基因和蛋白质的野生型表达的组合物的方法
发明背景
为处理植物、种子、组织和器官以调节或调整植物的物理特性所需要的组合物和方法的寻找涉及鉴定负责所需特性的靶基因或蛋白，然后筛选各种“测试”化合物对所述靶基因/蛋白的影响。通常将植物与每种测试化合物接触，然后在常规情况下生长以确定一种或多种测试化合物对野生型植物的影响。这样的筛选技术在确定所涉及的靶基因和生长植物以观察每种测试化合物的效果上均需要相当长的时间。
最近，已经提出了鉴定目标植物的基因或蛋白的方法以促进化合物筛选。参见，例如美国专利申请公开号US 2005/0221290和美国专利申请公开号US 2007/0265164。
在本领域中仍然需要更简单且更快速的鉴定影响植物细胞中野生型基因/蛋白表达的化合物的方法。
发明概述
本文所述的组合物和方法允许快速鉴定选择性地改变植物细胞中野生型基因的表达或蛋白的表达的测试化合物的组合。所述方法允许在为了获得这些信息不得不将植物培养至充分生理成熟之前，在机理上确定化合物是如何表现和相互作用。这些方法为测试化合物对植物的影响提供了遗传学评估。
在一个方面，描述了一种用于鉴定选择性地改变植物细胞的野生型基因表达的化合物的组合的方法。一种这样的方法包括比较(a)来自单独接触第一测试化合物的植物细胞或组织的第一表达谱，(b)来自单独接触另外的测试化合物的相同的植物细胞或组织的另外的表达谱，和(c)来自接触所述第一测试化合物和所述另外的测试化合物的组合的相同的植物细胞或组织的组合表达谱。在该方法的其他实施方案中，另外的化合物包括两种或更多种另外的化合物。与第一谱(a)和另外的谱(b)相比，组合化合物谱(c)中多种基因或基因产物的表达水平或模式上任何扣除背景的、显著的改变鉴定出两种或更多种化合物的组合在影响植物的生长特性中是有用的。在一种实施方案中，表达谱的改变是协同的。在另一实施方案中，表达谱的改变是拮抗的。
在上述方法的任一种中，所述比较步骤通过生成数值或图形数据的计算机处理器或计算机程控的设备任选地进行。
在另一实施方案中，通过将第一测试化合物(a)与另外的测试化合物(b)组合于为了同时或共同施用于植物的单一的组合物或试剂盒中，制备影响植物生长特性的组合物。
在下面详细的描述中进一步描述这些方法和组合物的其它方面及优势。
附图简述
图1是显示由于施用化合物，1-甲基环丙烯(MCP)vs.玉米基因(UT)、甲氧基丙烯酸酯(Strobiliurin)(STB)vs.UT、或MCP和STB的组合vs.UT，差异表达的玉米基因的数目和分布的图。交叉的圆圈表明当用MCP处理玉米植株时，与未处理的相比，934个基因(实体列表1)的表达显著改变(≥2倍)，其中一个362个基因的子集响应于这种条件发生了特有的改变。当使用杀菌剂甲氧基丙烯酸酯(strobilurin)处理相同植物时，仅有185个基因(实体列表2)的表达显著改变，其中78个基因的变化是此条件特有的。但是，当将这两种化合物的组合施用于玉米植株时，共1128个基因在表达上发生了改变(实体列表3)，其中仅有568个基因发生了对该组合特有的变化。
图2是显示由于施用化合物，1-甲基环丙烯(MCP)vs.未处理的拟南芥基因(UT)、甲氧基丙烯酸酯(STB)vs.UT、或MCP/STB的组合vs.UT，差异表达的拟南芥基因的分布图。交叉的圆圈表明当用MCP处理拟南芥植株时，与未处理的相比，411个基因(实体列表1)的表达统计地改变(≥5倍)，其中202个特有的基因表达改变。当使用杀菌剂甲氧基丙烯酸酯处理相同植物时，仅有278个基因(实体列表2)的表达统计地改变，其中80个基因是此条件特有的。但是，当将这两种化合物的组合施用于植株时，仅93个基因(实体列表3)在表达上显著地改变，其中仅44个特有的基因变化。
发明详述
本文所述的组合物和方法提供对影响植物生长特性的化合物的组合的快速、有效的鉴定。本文所述的方法的特征在于在执行所述方法之前没有任何对确定特定靶基因的需要。同样这些方法不要求任何指定基因增强的表达，而是依赖于多个基因/蛋白表达的改变模式。该模式可以包括响应测试化合物的组合的多个基因的上调和/或下调。
如本文所用的，术语“植物细胞或组织样品”指单一的植物细胞或植物细胞的培养物或植物的全部或部分。代表的细胞或细胞培养物或植物组织可以衍生自单一的特定细胞类型、细胞类型的组合；单一的特定组织类型；组织类型的组合；单一的特定植物器官；或植物器官的组合。这样的细胞选自植物组织和器官，包括但不限于营养组织，例如，根、茎、或叶，和生殖组织，如果实、胚珠、胚、胚乳、珠被、种子、种皮、花粉、花瓣、萼片、雌蕊、花、花药、或任何胚组织。
如本文所用的，术语“植物”选自双子叶或单子叶植物。这样的植物包括装饰用的开花植物，以及供人类或动物食用的植物或植物部分。例如，提供这些方法中所使用的细胞的合适的植物可以是稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、高粱(sorghum)、小米(millet)、柳枝稷(switchgrass)、芒草(miscanthus)、禾本科植物(grass)、燕麦(oats)、番茄(tomato)、马铃薯(potato)、香蕉(banana)、猕猴桃(kiwi fruit)、鳄梨(avocado)、甜瓜(melon)、芒果(mango)、甘蔗(cane)、甜菜(sugar beet)、烟草(tobacco)、木瓜(papaya)、桃(peach)、草莓(strawberry)、悬钩子(raspberry)、黑莓(blackberry)、蓝莓(blueberry)、莴苣(lettuce)、甘蓝(cabbage)、花椰菜(cauliflower)、洋葱(onion)、西兰花(broccoli)、抱子甘蓝(brussel sprout)、棉花(cotton)、双低菜(canola)、葡萄(grape)、大豆(soybean)、油菜(oil seed rape)、芦笋(asparagus)、豆类(beans)、胡萝卜(carrots)、黄瓜(cucumbers)、茄子(eggplant)、瓜类(melons)、秋葵(okra)、欧防风(parsnips)、花生(peanuts)、椒类(peppers)、菠萝(pineapples)、倭瓜(squash)、甘薯(sweet potatoes)、黑麦(rye)、罗马甜瓜(cantaloupes)、豌豆(peas)、南瓜(pumpkins)、向日葵(sunflowers)、菠菜(spinach)、苹果(apples)、樱桃(cherries)、酸果蔓(cranberries)、葡萄柚(grapefruit)、柠檬(lemons)、酸橙(limes)、油桃(nectarines)、橙(oranges)、桃(peaches)、梨(pears)、橘柚(tangelos)、柑橘(tangerines)、百合(lily)、麝香石竹(carnation)、菊(chrysanthemum)、矮牵牛(petunia)、蔷薇(rose)、天竺葵(geranium)、堇菜(violet)、唐菖蒲(gladioli)、兰(orchid)、丁香(lilac)、海棠(crabapple)、枫香树(sweetgum)、槭树(maple)、一品红(poinsettia)、刺槐(locust)、梣(ash)、杨(poplar)、椴树(linden tree)和拟南芥(Arabidopsis)。
这样的植物细胞的特征在于不同组的核酸分子的表达。在所述植物的任一物理状态，这些核酸分子，例如植物基因或其编码的产品中的某些比其他表达的更多或更少，从而提供了多个基因或基因产物的表达模式。可以将这种模式称为表达“谱”或“指纹”，其可以鉴定细胞的生理状态。因此，术语“表达谱”指细胞或细胞培养物中可鉴定的分子组的表达模式。可以表征其表达谱的代表性分子类型包括mRNA转录物或由其衍生的cDNA；蛋白；磷蛋白；碳水化合物；脂质，代谢产物；或mRNA转录物、蛋白、磷蛋白、碳水化合物、脂质和代谢产物的任意组合或排列。可以获得这样的表达谱以代表在任一生理状态的野生型或背景谱，或当植物在特定的物理状态，例如它已被暴露于化学剂或环境条件时，在细胞中观察到的改变的谱。
在一个实施方案中，表达谱是植物细胞的完整基因组或编码的基因产物的完整集合。在另一实施方案中，每个表达谱包含植物完整基因组编码的基因或基因产物的子集。在某些实施方案中，基因产物是植物蛋白。在仍有的其它实施方案中，谱跟踪作为谱中一种或多种基因产物改变的结果的植物代谢中的相应变化。
在本文所述的方法的一个实施方案中，形成相关表达谱的基因或基因产物的子集包含3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种基因或基因产物。在另一实施方案中，形成表达谱的基因或基因产物的子集包含20、30、40、50、60、70、80、90或100种或更多种基因或基因产物。还有其它在本文所述的方法中有用的表达谱是由150、200、250、300、350、400、450或500种或更多种基因或基因产物形成的。还有其它在本文所述的方法中有用的表达谱是由750、850、1000、1500、2000种或更多种基因或基因产物，包括多达植物细胞的整个基因组形成的。根据获得的显示差异表达的基因数，最典型地选择≥2倍变化或≥5倍变化的截止值以将分析集中于最有意义的子集。为形成对本文所述的方法有用的表达谱，评价的植物细胞的表达谱必须与相同植物细胞样品的背景表达谱以及来自第一测试化合物的表达谱和另外的表达谱均显著地改变。
如本文所用的，术语植物的“物理状态”包括但不限于以下条件：增加的乙烯敏感性，降低的乙烯敏感性，提高的成熟，对胁迫、热、种群密度或盐度增加的抗性，对胁迫、热、种群密度或盐度降低的抗性，增加的病原体抗性，降低的病原体抗性，增加的开花，增加的氮效率，增加的除草剂抗性，增加的光合活性和增加的产量。
如本文所用的，术语“测试化合物”或“另外的化合物”指测试其在暴露于植物、植物细胞或细胞培养物时其对植物表达谱的作用的化合物。这样的化合物可以包括当单独使用时对植物具有已知或未知作用的化合物。这样的化合物可以包括已知的植物疾病或调节试剂，或者可以是使用本领域已知的组合文库方法中的各种方法中的任一种获得的未知化合物。测试化合物可以存在于合适的载体、稀释剂或溶液中，并且可以通过浸渍、喷雾、粉化、淋、滴、或灌溉植物或植物细胞来应用。
为产生用于本文所述的方法的表达谱，每种植物或植物细胞或组织来自相同的植物，并在组成，例如细胞的数量及密度、细胞培养基、培养条件、植物生长条件等方面，是基本相同的。每种植物、植物细胞或培养物与第一测试化合物；或另外的测试化合物，或所述第一测试化合物与所述另外的测试化合物的组合中的一种接触以在所述植物的细胞或组织中的至少三种基因或基因产物的表达上产生改变的时间。通常将“足以……的时间”定义为至少5、10、15、25、30、45、或60分钟，或者至少为1、2、3、4、5、6至12小时或24小时。组合中的化合物可以同时或连续地施加到植物或植物细胞。此外，在某些实施方案中，另外的测试化合物不止一种单一的化合物而其本身可以是混合物。在某些实施方案中，第一测试化合物是对植物细胞具有已知作用的化合物而另外的化合物是对细胞具有未知作用的化合物，或者是相反的情况。在其它实施方案中，第一测试化合物和另外的测试化合物均对细胞具有未知的独立作用。同样，在本方法中需要使用的测试化合物的量与田间试验或在实验室种植植物所需的量相比是相当小的。当然，用于细胞或细胞培养物的组合物的合适的量将取决于化合物本身的特性，但可以包括至少0.2、0.5、0.8或1.0或更多微克每毫克培养物中的细胞，或者以稀释液的mL表示的相同的量以供施用于植物或植物组织。在另一个实施方案中，测试化合物的量包含至少2、5、8或10或更多微克每毫克培养物中的细胞，或者以稀释液的mL表示的相同的量以供施用于植物或植物组织。在另一个实施方案中，测试化合物的量包含至少2、5、8或10或更多毫克每毫克培养物中的细胞，或者以稀释液的mL表示的相同以供施用于植物或植物组织。
接触植物细胞、组织或植物后，在与化合物接触后的2、5、10、20、30、40、50或60分钟，或2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24小时内收集组织样品。在一些实施方案中，可以在与化合物接触后的2、4、6、8、10、14、16、18、20、22、24、26、28、30天取样组织。又在其他实施方案中，可以在接触植物细胞、组织或植物后的长达6个月每月进行取样以便获得化合物的更长效的下游作用。
该方法进一步包括产生来自单独接触第一测试化合物的植物细胞或组织的表达谱，来自单独接触另外的测试化合物的植物细胞或组织的表达谱；和来自接触所述测试化合物和所述另外的化合物的组合的植物细胞或组织的组合化合物表达谱的步骤。
可以通过下列方法中的一种或多种常规地获得表达谱的产生和表征：将适当制备的样品应用于植物基因组或其编码产物的多聚核酸微阵列。Affymetrix，Inc或许多其他微阵列制造商已经描述了这种微阵列的例子。微阵列的产生或使用可以接着mRNA表达模式检测；适当制备的样品的2-维凝胶电泳以衍生蛋白表达的模式；将样品应用于抗体阵列以衍生蛋白表达谱；将样品应用于差异结合到特定肽的多核苷酸的阵列以衍生蛋白表达模式。同样地，通过质谱对适当制备的样品的分析可以用于衍生mRNA或蛋白的表达模式。可以通过基于珠的mRNA和蛋白表达的分析方法，例如LynxTherapeutics,Inc.、Illumina,Inc.或Luminex,Inc.描述的方法，对适当制备的样品进行分析以衍生mRNA或蛋白的表达模式。下面的实施例中描述的技术同样可以用于这些目的。为了在本文所述的方法中使用，可以使用上述的方法以外的任何表征样品的多种分子成分的特有表达谱的方法。参见，例如US2007/0265164；US2005/0221290；或在药品专利US 7,332,272，等本领域现存的其它已知的产生表达谱的描述中描述的产生表达谱的技术。
在某些实施方案中，通过提取、酶促扩增和用可检测的信号产生试剂标记植物的mRNA来产生表达谱。然后将此种标记的核酸分子暴露在微阵列上，该微阵列已分散地点有与植物细胞表达的许多或全部可能的mRNA种类互补的DNA序列。标记的植物细胞表达的核酸分子与分散的斑点差异地杂交，赋予与样品中每一分子的浓度成比例的可检测的信号。使用已有技术，例如，微阵列读取器快速检测和定量每个斑点的信号强度。确定就各种植物细胞(例如野生型植物细胞、第一化合物处理的植物细胞、第二化合物处理的植物细胞、和用两种测试化合物处理的植物细胞)而言的那些相同mRNA转录物或整个基因组的表达水平。当产生了各种表达谱并在通过合适的聚类或其他技术分析结果之前，减去形成表达谱的基因/基因产物的背景表达水平。背景表达水平获得自相同类型的植物、植物细胞/培养物产生的谱，它们已暴露于与“测试”植物细胞或培养物相同的培养和环境条件，但是没有与所述第一化合物或任何另外的化合物接触。
此后，将单独处理的谱与组合的谱相比较以鉴定在不同处理的植物细胞之间具有不同的表达水平和模式的mRNA转录物。所谓的“加合表达谱”是每一单独处理的表达谱的组合的预期的计算结果。
本文所述的方法可以使用植物细胞培养物，而不是整个植株在高通量分析中进行。例如，在96孔或更多孔的培养板中建立数以千计的植物细胞的单独培养物，其中每个孔用不同的测试化合物处理。如上所述处理和提取RNA。然后将每个样品暴露于野生型植物细胞的单独的微阵列。通过一个微阵列读取器或多个微阵列读取器读取每个微阵列以衍生每种测试化合物对植物细胞表达谱的效果。计算预期的加合谱并使用严谨的统计分析将预期的结果与实际的组合表达谱相比。
表达谱分析(expression profiling)也可以利用多种基因的转录率的同时检测。通过对正经历某种干扰的细胞、组织或植物的快速顺序的阵列测量获得该率。可以独立考虑表达水平的率的改变率，和率的阵列，或与绝对表达水平组合考虑，以获得包含更多信息的表达谱。因此，本领域的技术人员可以将对许多生物分子，例如mRNA转录物的表达率的同时检测应用于本文所述的方法。
本文所述的方法进一步包括通过比较各自的表达谱，鉴定组合的化合物表达谱的基因或基因产物和形成单独接触第一测试化合物和另外的化合物的细胞/培养物的表达谱的那些在表达水平或模式上的显著改变。可以通过目视检查谱或可理想地通过生成数值或图形数据的计算机处理器或计算机程控的设备进行这一比较步骤。以平均值(mean)或均值(average)、数值平均值或数值平均值的范围、数值模式、或图形模式表示形成各种表达谱的基因或基因产物的表达的每个改变。
在一个实施方案中，改变是与在第一测试化合物谱和另外的测试化合物谱中相同的基因或基因产品的加合表达相比，组合化合物谱中相同的所选基因或基因产物的上调。在另一实施方案中，改变是与在第一测试化合物谱和另外的测试化合物谱中相同的基因或基因产品的加合表达相比，组合化合物谱中相同的所选基因或基因产物的下调。
在另一个实施方案中，改变是组合化合物谱中一种或多种所选基因或基因产品表达的变化，其中所选基因或基因产物与在产自第一谱和另外的谱的加合改变的谱中的野生型水平相比是未变的。例如，与组合化合物表达谱中的野生型表达水平相比改变的基因或基因产物是在第一测试化合物谱、另外的测试化合物谱、或通过单独的谱预测的加合谱中改变的不同的基因或基因产物。或者，相同的基因或基因产物形成比较的表达谱，但改变涉及在组合化合物谱中相同的选定的基因或基因产物的上调，所述基因或基因产物在第一谱和另外的谱的单独的或预测的加合表达谱中是不受影响或下调的。再或者，显著的改变涉及在组合化合物谱中相同的选定的基因或基因产物的下调，所述基因或基因产物在第一谱和另外的谱的单独的或预测的加合表达谱中是不受影响或上调的。在组合表达谱和单独表达谱(或从其预测的加合谱)之间的又一显著改变涉及在形成组合谱的单独基因或基因产物的特性上相对于形成通过第一测试化合物谱和另外的测试化合物谱形成的单独或预期的加合谱的改变。例如，在产生自第一谱和另外的谱的加合改变的谱中与野生型水平相比未改变的某些基因/基因产物在组合谱中是上调或下调的，而在产生自第一谱和另外的谱的加合改变的谱中与野生型水平相比上调或下调的其他基因/基因产物与组合谱中表达的野生型水平相比是未变的。
在一个实施方案中，在组合化合物表达谱中显著改变的鉴定与选择的对植物细胞的作用，例如与单独由测试化合物或另外的化合物导致的作用不同的作用，或与这两种化合物预期的加合作用相比不同的，更大或更小的作用是相关的。在一个实施方案中，改变的作用是由一种测试化合物导致的作用的显著增强或减少和由其他化合物导致的作用的减少。在一个实施方案中，改变的作用是能够基于它们的表达谱预期的由测试化合物和另外的化合物的加合使用产生的作用的显著提高。在又一实施方案中，组合表达谱导致与由测试和另外的化合物的单独的作用本身或预期的加合作用导致的作用不同的作用。
在另一实施方案中，化合物的组合具有协同作用，其是在组合化合物的谱中植物的基因或基因产物在表达模式或水平上，与由第一和另外的表达谱的模式或水平中的加合改变所预测的相比更大的改变。在某些实施方案中，在组合表达谱中表达模式或水平的改变是在或上调或下调的形成第一和另外的谱的加合改变的模式的基因或基因产物的表达上至少2倍的改变。在其它实施方案中，改变是基于它们的表达谱预测的这两种化合物的加合作用(上调或下调)所期望的至少3、4、5、6、7、8、9、10或大于20倍。
在仍进一步的实施方案中，化合物的组合具有拮抗作用，其是与第一和另外的谱的加合改变的表达模式或水平产生的相比，在组合化合物谱中的基因或基因产物的表达模式或水平上的改变幅度的减少。这种类型的结果表明这两种化合物对植物细胞具有拮抗作用。
因此，通过应用本发明的方法，并将用不同的化合物组合处理的植物细胞所产生的表达谱与两种或更多种化合物的单独表达谱，或它们计算出的加合表达谱结果相比较，此方法提供了一种快速且有效的筛选化合物的组合以供治疗各种植物疾病或状况，例如胁迫的影响，以延迟成熟等，而不必要在化合物中培养植物。
这些方法及其所获得的结果进一步允许用于治疗植物疾病或操纵植物的物理状态的组合物或试剂盒的配制。每种组合物或试剂盒包含有效的协同作用量的本文所述的方法鉴定的至少两种化合物。那些化合物可以物理混和为单一制剂以供应用于植物，或可以存在于试剂盒中的独立容器中以供同时或连续应用于田间的植物。
以下实施例说明了上面讨论的方法的某些实施方案，其通过使用第一测试化合物，即植物生长调节剂1-甲基环丙烯(1-MCP)，和作为另外的测试化合物的50%w/w的水分散性颗粒制剂(Bayer Environmental Science,NorthCarolina)的COMPASSTM杀真菌剂肟菌酯(trifloxystrobin)来生成。已观察到甲氧基丙烯酸酯类除了其作为杀菌剂的益处之外，还对植物健康的有一些作用。尽管这些化合物均是已知的，也被声称是协同作用的，将它们用于证明所要求保护的方法的性能。这些实施例不限制权利要求和说明书的披露。
实施例1：玉米植物的生长和处理
在充满FAFARD 3BTM盆栽混合物(Conrad Fafard,Inc.,Agawam,Massachusetts)的1夸脱盆中种植杂交玉米种子(每盆一株植物)。在温室中培养玉米，以12小时的光周期和每24小时浇水或根据需要浇水以保持无胁迫条件。当玉米植株达到V10生长阶段，将盆按每处理具有3个重复布置到4个植株的随机化的完整区块设计中(the pots were arranged into a randomizedcomplete block design with 4 plants with 3 replications per treatment)。使用标准的CO2喷雾器以20gal/英亩载体体积(carrier volume)处理玉米植株。
处理是：
对照：使用0.035％v/v有机硅(organosilicone)表面活性剂SILWET L-77(HelenaChemical Co.,Collierville,TN)的油/佐剂标准(check)
化合物1：A17492F(MCP)25g活性成分/公顷(ai/ha)+0.035％SILWET表面活性剂
化合物2：COMPASS杀菌剂1x+0.035％SILWET表面活性剂
组合(1和2)：1MCP 25g/ha+COMPASS杀真菌剂：1x
喷雾施用后两个小时，采样受到喷雾的上部叶。对于每一植株，取5片2英寸的叶片，切成小片并合并到50mL聚丙烯管中。立即将样品在干冰上冷冻并在干冰上过夜发送到实验室以供处理。
实施例2：玉米RNA制备和杂交
A.实验设计
使用安捷伦(Agilent)单色全基因表达谱分析设计定义处理的参照未处理的玉米叶组织差异表达的基因。将3个技术阵列重复(Agilent TechnologiesInc.,Santa Clara,CA)进行杂交以比较参照未处理的叶组织，以COMPASS杀真菌剂和/或1-MCP处理的叶组织之间不同的转录物丰度。
使用Dow AgroSciences定制生产的60聚体(60-mer)全面转录组范围的(comprehensive transcriptome-wide)玉米(Zea maize)寡核苷酸阵列进行微阵列杂交。该阵列代表了获得自公开数据源的超过58,000种不同的玉米转录物(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA)。微阵列芯片使用Agilent格式2x105K印制，包括100个探针的10个拷贝，44,196个探针的2个拷贝，14,355个探针的1个拷贝，以及1325个Agilent掺入对照(spike-in control)。使用制造商的Sure-Print技术原位合成60聚体的独特和特异性寡核苷酸。
B.RNA的分离和纯化
将30-50mg冷冻叶组织样品重悬于450μL RNeasyTM试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)的RLT提取缓冲液以进行RNA提取。然后通过向各冷冻样品中加入一颗3mm的研磨珠并使用GenoGrinder设备以速率300，1X研磨3分钟将组织研磨成细粉末。根据制造商的说明纯化总RNA。然后使用NanoDropTM分光光度计并用标准的1%琼脂糖凝胶电泳显影来对纯化的总RNA进行定量和质量控制。
C.cRNA标记
为了标记，将来自处理和未处理组织的总共1.0μg纯化的RNA根据Agilent(Santa Clara，CA)单色基于微阵列的基因表达QuickAmpTM标记方案反转录、扩增并用Cy3-CTP标记。由于Dow AgroSciences-生产的用于基因表达的玉米AGILENTTM微阵列(P/N G4503A，设计ID 022232)包含内部掺入对照，也根据制造商的说明使用单色RNA掺入试剂盒(Agilent，Santa Clara，CA)标记。使用MMLV逆转录酶反转录样品并使用T7 RNA聚合酶扩增。扩增后使用Qiagen的RNeasy微型旋转柱纯化cRNA并使用NanoDrop分光光度计定量。由下面的公式确定Cy3的比活性：(Cy3浓度)/(cRNA浓度)*1000=pmol的Cy3每μg的cRNA。用于杂交的样品标准化至825ng，其中比活性>8.0pmol的Cy3每μg的cRNA。
D.杂交
根据制造商的说明使用Agilent Technologies(Santa Clara，CA)基因表达杂交试剂盒、洗涤缓冲液试剂盒、稳定和干燥溶液杂交寡聚基因表达阵列。在完全自动化的TECAN HS4800 PROTM(TECAN U.S.，Research TrianglePark，NC)上进行杂交。在65℃注入杂交混合物并在65℃的载片预杂交(sildepre-hybridization)30秒的步骤后在搅拌下温育17小时。然后在37°C用AgilentGE洗液＃1洗涤载片1分钟，接着是在30℃用Agilent GE洗液＃2进行的1分钟第二洗涤和使用氮气的在30°C的2分钟和30秒的最后干燥步骤。立即扫描载片以尽量减少环境氧化剂对信号强度的影响。
E.扫描、特征提取和QC度量
使用Agilent G2565CA微阵列激光扫描仪以SureScanTM高分辨率技术(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)扫描阵列。用于扫描每个阵列的方案定义了染料通道、扫描区域和分辨率、TIFF文件动态范围、PMT增益和对于最终图像结果的设置的参数。一旦扫描了阵列，遵循特征提取方案，其具有为安置和优化网格拟合，发现斑点，标识异常(flagging outlier)，计算背景偏差、错误和比率，和计算质量控制度量定义的参数。
扫描和特征提取方案完成后，生成了包含Cy3图像的TIFF文件，以及质量控制度量报告和包含所有原始数据的最终文件(TXT)。图像文件(TIFF)用于检测载片的一般质量，掺入对照在正确位置(四角)上且以正确强度存在确认杂交、洗涤、扫描和特征提取过程是成功的。质量控制(QC)报告提供变化系数的值并用于基于Agilent Technologies(Santa Clara，CA)提供并设计的阳性和阴性(原核基因和人工序列)掺入对照衡量数据的分散。该报告用于确定数据分布、均匀性、背景、重现性、灵敏度和数据的一般质量。将包含所有原始数据的TXT文件上传到GeneSpringTM程序(Agilent，Santa Clara，CA)进行分析。
F.数据上传、标准化、过滤和统计分析
扫描和特征提取后，将原始数据文件上传到GeneSpringTM GX版本10.0.2(Agilent，Santa Clara，CA)并创建将各阵列数据文件定义为样本并分配合适的参数值的项目。将具有相同参数值的样品作为重复对待。创建解释(interpretation)以指定样品如何根据实验条件分组并用于显现和分析数据。在开始分析前进行基于掺入对照的样品质量控制以确保数据的质量。生成一份报告。
使用全局百分转变标准化方法(global percentile shift normalizationmethod)标准化数据以尽量减少系统性的非生物学差异并标准化阵列以进行交叉比较。然后基于标准化数据中的20%和100%之间的表达水平过滤数据并限制到进行研究的每个样品中在截止值内具有显著的值。通过选择进行研究的每一单独样品中标记为存在的实体并去除标记为临界(Marginal)或缺失的实体进行另一组过滤。
使用此最终的实体列表(阵列中表示的基因)作为输入，以校正的p值P≤0.05和0.05的Benjamin-Hochberg多重测试校正FDR使用单向ANOVA进行统计分析。然后由一个特定的变化倍数过滤显著性实体的最终列表，并用于数据解释。图1图例显示了实施例3、4和5的结果。
实施例3：1-甲基环丙烯诱导的玉米基因表达
以1-甲基环丙烯(1-MCP)处理玉米导致微阵列上934个基因的差异表达(≥2倍变化)。从这些基因中，进一步分析了1-MCP处理特有的362个基因的子集。在此分析中，我们集中于注释基因并寻找基因的相关功能组内的变化/趋势。这些基因的表达及假定的功能如表1所示。
表1中特定基因的分析表明，诱导了在这个特定实验中表达改变的参与翻译的10个基因中的9个的表达，而只有一个是被抑制的。由于全局翻译通常是响应于非生物和生物胁迫首先被抑制的进程之一，一般翻译机构组分的表达可以充当植物中一般胁迫水平的指示剂。这些数据表明植物并没有受胁迫和可能经历了降低水平的胁迫。基因例如谷胱甘肽转移酶或硫氧还蛋白相关蛋白在胁迫条件下经常是被诱导的，并且观察到的这些基因的表达的减少与降低的胁迫水平是一致的。在第三类中，编码特定胁迫诱导表达的蛋白(例如通用应激蛋白)的基因的表达降低表示胁迫降低，而参与细胞扩展的β-扩张蛋白的表达增加，与胁迫降低相符合。参与ABA生产的viviparous14的表达增加，和由于乙烯和ABA通常彼此对抗，这可能表明1-MCP处理导致乙烯信号传导降低。整体而言，1-MCP处理似乎导致了胁迫相关基因表达的降低，以及反映更积极的代谢的一组基因的表达的增加。接着后面的实施例10的表1列出了响应于单独的1-MCP差异表达的提供信息的玉米基因。
实施例4：Compass杀真菌剂诱导的玉米基因表达
以COMPASS甲氧基丙烯酸酯杀真菌剂处理玉米导致了微阵列上185个基因的差异表达(≥2倍变化)。其中，一个78个基因的子集是COMPASS处理特有的。与1-MCP处理相比，在此处理中观察到比较少的差异表达的基因。这可能是由于COMPASS甲氧基丙烯酸酯杀真菌剂在处理后需要超过2个小时以在基因表达水平上产生显著的变化。
实施例5：1-MCP和Compass杀真菌剂的组合诱导的玉米基因表达
以1-甲基环丙烯和甲氧基丙烯酸酯杀真菌剂Compass的组合处理玉米导致了微阵列上1128个基因的差异表达(≥2倍变化)。从这些基因中，进一步分析了组合处理特有的568个基因的子集。在此分析中，我们集中于注释基因并寻找基因的相关功能组内的变化/趋势。条件比较的图形结果如图1所示。
这些基因的表达及假定的功能如表2所示。这些基因的分析表明，诱导了在这个特定实验中表达改变的参与翻译的7个基因中的3个的表达，而4个是被抑制的。与单独1-MCP处理所观察到的不同，组合处理没有揭示任何与全局翻译的状态一致的趋势。但是，观察到基因，例如谷胱甘肽转移酶或抗坏血酸过氧化物酶的表达减少与降低的胁迫水平相一致。在这个特定实验中表达变化的5个这些基因中4个降低了，只有1个增加。在第三类中，编码特定胁迫诱导表达的(例如温度诱导的)蛋白的7个基因中的5个的表达降低，表明胁迫降低，仅有2个增加。2个参与防御应答的基因也有所下降，表明胁迫的降低。除草剂安全剂(safener)结合蛋白的表达增加了，其参与结合保护玉米免受某些除草剂(如氯乙酰苯胺和硫代氨基甲酸酯)的伤害并作为一种保护机制诱导谷胱甘肽生产或增加谷胱甘肽转移酶表达的安全剂。在单独甲氧基丙烯酸酯处理中此蛋白同样增加，表明这可能是一个特异性应答甲氧基丙烯酸酯而诱导的基因。它可能充当甲氧基丙烯酸酯处理/应答的潜在的标记基因。在另一类中，参与将CO2转化为碳酸氢盐，以协助叶绿体中为进行光合作用的CO2浓度的提高，的碳酸酐酶的表达增加了。但是，在1-MCP处理中此相同基因的表达降低了。此外，在来自组合处理的568个特有基因的子集中，参与卡尔文循环的其他三个基因的表达降低，表明在光合作用中可能的降低。
在进一步的类别中，一种组蛋白脱乙酰基酶(经常参与转录诱导的酶)的表达增加，而另一种组蛋白脱乙酰基酶的表达减少。一种可能的解释是，在相同条件下，不同的家族成员可能差异性地发挥作用。参与茉莉酸(jasmonate)的生物合成，通常认为是胁迫相关激素的丙二烯氧化物合酶(allene oxidesynthase)的表达降低，表明在胁迫水平上可能的降低。因此，一些变化表明胁迫上可能的降低，而其他则可能不会。综上所述，这些结果表明这两种化合物相拮抗地发挥作用。
实施例6：拟南芥植物的生长和处理
在充满砂质粘土培养基的6英寸盆中种植13颗拟南芥种子(Columbia品种)。出苗后，将盆减稀到每盆10个植株。在温室中培养植株，以12小时的光周期和每24小时浇水或根据需要浇水以保持无胁迫条件。当拟南芥植株达到营养(>BBCH 11<BBCH 30)阶段(大约在种植后2-3周)，将盆按每处理具有3个重复布置到10个植株的随机化的完整区块设计中。使用标准的CO2喷雾器以20gal/A载体体积处理植株。
处理是：
对照：油/佐剂标准(0.035%v/v SILWET佐剂L-77)
化合物1：A17492F(MCP)25g ai/ha+0.035%SILWET佐剂
化合物2：COMPASS杀真菌剂1x+0.035%SILWET佐剂
组合：1MCP 25g/ha+COMPASS杀真菌剂1x
喷雾施用后两个小时，采样受到喷雾的叶。对于每一处理，从每10株植株取2片叶并合并到50ml聚丙烯管中。立即将样品在干冰上冷冻并在干冰上过夜发送到实验室以供处理。
实施例7：拟南芥RNA的制备和杂交
A.实验设计
使用Agilent单色全基因表达谱设计定义处理的参照未处理的拟南芥叶组织差异表达的基因。将3个技术阵列重复(Agilent Technologies Inc.,SantaClara,CA)进行杂交以比较参照未处理的叶组织，以甲氧基丙烯酸酯和/或1-MCP处理的叶组织之间不同的转录物丰度。从Agilent Technologies获得拟南芥载片，产品＃G2519F，设计ID 021169。
B.RNA的分离和纯化
将30-50mg冷冻的叶组织样品重悬于450μL RNeasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)的RLT提取缓冲液以进行RNA提取。然后通过向各冷冻样品中加入一颗3mm的研磨珠并使用GenoGrinder设备以速率300，1X研磨3分钟将组织研磨成细粉末。根据制造商的说明纯化总RNA。然后使用NanoDropTM分光光度计并用标准的1%琼脂糖凝胶电泳显影来对纯化的总RNA进行定量和质量控制。
C.cRNA的标记
为了标记，将来自处理和未处理组织的总共1.0μg纯化的RNA根据Agilent(Santa Clara，CA)单色基于微阵列的基因表达QuickAmpTM标记方案反转录，扩增并用Cy3-CTP标记。由于用于基因表达的Agilent拟南芥微阵列(产品#G2519F，设计ID 021169)包含内部掺入对照，也根据制造商的说明使用单色RNA入试剂盒(Agilent，Santa Clara，CA)标记。使用MMLV逆转录酶反转录样品并使用T7RNA聚合酶扩增。扩增后使用Qiagen的RNeasy微型旋转柱纯化cRNA并使用NanoDrop分光光度计定量。由下面的公式确定Cy3的比活性：(Cy3浓度)/(cRNA浓度)*1000=pmol的Cy3每μg的cRNA。用于杂交的样品标准化至825ng，其中比活性>8.0pmol的Cy3每μg的cRNA。
D.杂交
根据制造商的说明使用Agilent Technologies(Santa Clara，CA)基因表达杂交试剂盒、洗涤缓冲液试剂盒、稳定和干燥溶液杂交寡聚基因表达阵列。在完全自动化的TECAN HS4800PRO (TECAN U.S.，Research Triangle Park，NC)杂交仪上进行杂交。在65℃注入杂交混合物并在65℃载片预杂交30秒的步骤后在搅拌下温育17小时。然后在37°C用Agilent GE洗液＃1洗涤载片1分钟，接着是在30℃用Agilent GE洗液＃2进行的1分钟第二洗涤和使用氮气的在30°C的2分钟和30秒的最后干燥步骤。立即扫描载片以尽量减少环境氧化剂对信号强度的影响。
E.扫描、特征提取和QC度量
使用Agilent G2565CA微阵列激光扫描仪以SureScanTM高分辨率技术(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)扫描阵列。用于扫描每个阵列的方案定义了染料通道、扫描区域和分辨率、TIFF文件动态范围、PMT增益和对于最终图像结果的设置的参数。一旦扫描了阵列，遵循特征提取方案，其具有安置和优化网格拟合，发现斑点，标识异常，计算背景偏差、错误和比率，和计算质量控制度量定义的参数。扫描和特征提取程序完成后，生成了包含Cy3图像的TIFF文件，以及质量控制度量报告和包含所有原始数据的最终文件(TXT)。图像文件(TIFF)用于检测载片的一般质量，掺入对照在正确位置(四角)上且以正确强度存在确认杂交、洗涤、扫描和特征提取过程是成功的。质量控制(QC)报告提供变化系数的值并用于基于Agilent Technologies(Santa Clara，CA)提供并设计的阳性和阴性(原核基因和人工序列)掺入对照衡量数据的分散。该报告用于确定数据分布、均匀性、背景、重现性、灵敏度和数据的一般质量。将包含所有原始数据的TXT文件上传到GeneSpring(Agilent，Santa Clara，CA)进行分析。
F.数据上传、标准化、过滤和统计分析
扫描和特征提取后，将原始数据文件上传到GeneSpring GX版本10.0.2(Agilent，Santa Clara，CA)并创建将各阵列数据文件定义为样本并分配合适的参数值的项目。将具有相同参数值的样品视为重复。创建解释以指定样品如何根据实验条件分组并用于显现检测和分析数据。在开始分析前进行基于掺入对照的样品质量控制以确保数据的质量。生成一份报告。
使用全局百分转变标准化方法标准化数据以尽量减少系统性的非生物学差异并标准化阵列以进行交叉比较。然后基于标准化数据中的20%和100%之间的表达水平过滤数据并限制到进行研究的每个样品中在截止值内具有显著的值。通过选择进行研究的每一单独样品中标记为存在的实体并去除标记为临界或缺失的实体进行另一组过滤。
使用此最终的实体列表(阵列中表示的基因)作为输入，以校正的p值P≤0.05和0.05的Benjamin-Hochberg多重测试校正FDR使用单向ANOVA进行统计分析。然后由一个特定的变化倍数过滤显著实体的最终列表，并用于数据解释。图2图例显示了实施例8-10每一种条件显著表达的基因的比较，和这些条件中任一种表达的特有基因的数目。
实施例8：拟南芥中1-甲基环丙烯诱导的基因表达
以1-甲基环丙烯(1-MCP)处理拟南芥导致微阵列上411个基因的差异表达(≥5倍变化)。从这些基因中，进一步分析了1-MCP处理特有的202个基因的子集。在此分析中，我们集中于注释基因并寻找基因的相关功能组内的变化/趋势。这些基因的表达及假定的功能如表3所示。如特有的MCP基因集合中反映的1-MCP处理似乎导致胁迫相关基因表达的减少，以及一组已知为乙烯-诱导的基因，例如，PDF1.2、几丁质酶、ACS2、SAG13表达的降低。虽然使用的微阵列芯片中代表的几丁质酶基因是否类似地受到调节是未知的，注意到α-几丁质酶是乙烯诱导型的。此外，乙烯调节往往参与的一组ABA调节的基因的表达降低表明它们可能确实代表表达上真实减少。在胁迫条件过程中经常诱导基因，例如谷胱甘肽转移酶或硫氧还蛋白相关蛋白，而且观察到的这些基因表达的减少与胁迫降低的水平是一致的。此外，编码表达受到特定胁迫(例如通用应激蛋白)诱导的蛋白的基因的表达降低表明胁迫降低。这在玉米微阵列实验中也观察到。受伤抑制的ACS5表达的增加也与胁迫减少是一致的。催化茉莉酸生物合成第一步的丙二烯-氧化物环化酶(AOC3)的表达降低，表明在胁迫水平上可能的减少。类似地，在玉米微阵列实验中，参与茉莉酸生物合成，通常被认为是胁迫相关的激素的丙二烯氧化物合酶的表达降低。这表明在胁迫水平上可能的减少。乙烯诱导丙二烯氧化物合酶的表达。一种F-box家族蛋白的表达降低和一些F-box蛋白受到乙烯的下调，例如那些调节性EIN3。几个WRKY转录因子的表达降低，已知一些WRKY转录因子是受到乙烯诱导的，其他的由乙烯抑制。2种含AP2结构域的转录因子家族蛋白的表达降低。乙烯应答因子(ERFS)，其中几种受乙烯诱导，是乙烯应答因子/apetala2家族成员。其他基因的表达，即含甲硫氨酸亚砜还原酶结构域的蛋白、S-腺苷甲硫氨酸-依赖性甲基转移酶/甲基转移酶MAPKKK19、ATP结合/激酶/蛋白激酶/蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白激酶家族蛋白、备选氧化酶、过氧化物酶和MYB蛋白，显示某种模式，但不知道它们是否是受乙烯调节的。接着后面的实施例10的表3列出了响应于单独的1-MCP差异表达的提供信息的拟南芥基因。数据表明，总体而言，1-MCP处理导致胁迫相关基因的表达的降低。
实施例9：拟南芥中COMPASS杀真菌剂诱导的基因表达
以COMPASS甲氧基丙烯酸酯杀真菌剂处理拟南芥导致了微阵列上278个基因的差异表达(≥5倍变化)。其中，一个80个基因的子集是COMPASS处理特有的。可以分组以提供对COMPASS处理作用的了解的注释的基因如表4中所示。80个COMPASS单独处理特有的基因的分析揭示了基因表达的一些模式，包括营养贮藏蛋白、茉莉酸-Zim-结构域蛋白、腈特异性蛋白(Nitrile Specifier Protein)、α-淀粉酶、O-甲基转移酶家族2蛋白、转移酶家族蛋白、作为JA诱导的伤口响应基因的JR1、核苷磷酸酶家族蛋白、棕榈酰蛋白硫酯酶家族蛋白、半胱氨酸蛋白酶、NAI2的降低。但是，不知道它们是否是受乙烯调节的。在其它注释的基因中，没有观察到影响共同通路的基因组而因此无法确定趋势，因此，基于这些的结论将是高度不确定的。在这种处理中，我们观察到很少数的差异表达的基因。COMPASS甲氧基丙烯酸酯杀真菌剂在处理后可能需要超过2个小时以在基因表达水平上产生显著的变化。
单独用1-MCP或COMPASS处理后有165个共同的基因的事实表明，在两种处理之间有比甲氧基丙烯酸酯单独处理特有的基因更多的共同的基因，这表明甲氧基丙烯酸酯处理可能改变与1-MCP处理的相同的基因的子集。每种处理共同的提供信息的基因如表5所示，接着后面的实施例10。多种编码过氧化物酶基因表达的降低表明在控制细胞氧化还原状态的胁迫应答上的减少。GST表达的降低与此一致。WRKY转录因子表达的降低与1-MCP处理看到的是相似的。对基因集合的其他分析揭示了基因表达的一些模式，包括晚期胚胎发生丰富蛋白、β-葡糖苷酶/铜离子结合/岩藻糖苷酶/水解酶、水解O-糖基化合物、营养贮藏蛋白、富含羟脯氨酸糖蛋白家族蛋白、jacalin凝集素家族蛋白、脂肪酸还原酶的降低。但是，不知道它们是否是受乙烯调节的。
接着后面的实施例10的表4列出了响应于单独的COMPASS差异表达的提供信息的拟南芥基因。下表5列出了单独1-MCP或COMPASS处理共同的提供信息的拟南芥基因。
实施例10：拟南芥中1-MCP和Compass杀真菌剂的组合诱导的基因表达
以1-甲基环丙烯和COMPASS甲氧基丙烯酸酯杀真菌剂的组合处理拟南芥导致微阵列上93个基因的差异表达(≥5倍变化)。从这些基因中，进一步分析了组合处理特有的44个基因的子集。在此分析中，我们集中于注释基因并寻找基因的相关功能组内的变化/趋势。图2显示了条件比较的图形结果。
这些注释的基因的表达及假定的功能如表6所示。虽然代表1-MCP和甲氧基丙烯酸酯组合处理改变的特有基因的基因集合是很小的，44个基因，但观察到基因表达上的一些模式，包括乙烯应答元件结合家族蛋白(ERFs)和含AP2结构域的转录因子(属于ERF/AP2转录因子超家族)的增加。该数据表明，可能已经发生了胁迫信号上的增加。疾病抗性蛋白和C-重复序列结合因子，其是一种DNA结合转录因子(注意CBF2阻遏应激激素乙烯诱导的叶衰老)的表达增加表明应激信号传导的改变。另一种乙烯应答性因子，发病相关的基因，AGD2样防御应答蛋白1和几种热休克蛋白的表达降低表明在应激应答上可能的降低。因此，在拟南芥中，这两种化合物不是如玉米中的结果那样拮抗地发挥作用。此数据为对于在这些实施例中测试的两种化合物的物种和/或单子叶植物/双子叶植物特异性应答提供了证据。下表6列出了响应于1-MCP和COMPASS杀真菌剂组合差异表达的提供信息的拟南芥基因。
Figure BDA00002480372200201
Figure BDA00002480372200211
Figure BDA00002480372200231
Figure BDA00002480372200241
Figure BDA00002480372200251
Figure BDA00002480372200261
Figure BDA00002480372200271
Figure BDA00002480372200281
Figure BDA00002480372200291
Figure BDA00002480372200301
Figure BDA00002480372200321
Figure BDA00002480372200331
Figure BDA00002480372200341
上文列出或参考的所有文献，包括专利、专利申请和出版物、和非专利出版物，以及附带的图表以整体引用的方式纳入本文作为参考，到它们与本说明书显而易见的内容相一致的程度。但是，本文中任何参考文献的引用，不应视为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”得到。
应当理解尽管在说明书中不同的实施方案以使用“包括”的语言给出，在不同的环境下，相关的实施方案也可以使用“由......组成”或“基本上由......组成”描述。应该注意术语“一个(a)”或“一种(an)”指一个或者多个/一种或者多种，例如“一种化合物”理解为代表一种或多种化合物。依其本身，术语“一个/一种(a)”(或“一种(an)”)，“一个或多个/一种或多种”以及“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。虽然本发明已经说明了具体实施方案，但是，应当认识到在不离开本发明主旨的范围内可以做出改变。这些改变落入权利要求的范围之内。

Claims (18)

1.一种用于鉴定选择性地改变植物细胞的野生型基因表达的化合物的方法，所述方法包括：
比较
来自与第一测试化合物接触的植物细胞或组织的第一表达谱，
来自与另外的测试化合物接触的相同植物细胞或组织的另外的表达谱，和
来自与所述第一测试化合物和所述另外的测试化合物接触的相同植物细胞或组织的组合化合物表达谱，
其中将各植物细胞或组织接触足以在所述植物的细胞或组织中的至少一种基因或基因产物的表达上产生改变的时间；并且其中每种表达谱包含所述植物细胞或组织的至少一种基因或基因产物的表达水平或模式；和
鉴定组合化合物谱的基因或基因产物与所述第一谱和另外的谱的加合改变的基因或基因产物之间在表达水平或模式上显著的、意想不到的改变。
2.依照权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：
将来自相同植物的植物细胞或组织与下述之一接触：
i.第一测试化合物；
ii.另外的测试化合物；或
iii.所述第一测试化合物和所述另外的测试化合物的组合；和产生
iv.来自与(i)接触的植物细胞或组织的第一表达谱；
v.来自与(ii)接触的植物细胞或组织的另外的表达谱；和
vi.来自(iii)的植物细胞或组织的组合化合物表达谱。
3.依照权利要求1所述的方法，其中组合化合物谱中经接触的植物细胞的基因或基因产物的表达相对于所述第一谱和所述另外的谱的加合改变的基因或基因产物的表达的改变与所述化合物组合导致的对植物细胞的选择的作用相关。
4.依照权利要求1所述的方法，其中在比较步骤前从每种谱减去来自未与任何所述第一或另外的测试化合物接触的相同植物的细胞或组织的野生型基因或基因产物表达谱。
5.依照权利要求1所述的方法，其中表达谱的改变作为平均值(mean)或均值(average)、数值平均值或数值平均值的范围、数值模式、图形模式或表达谱的形式表示。
6.依照权利要求1所述的方法，其中所述改变选自下组：
在组合化合物谱中相同的选择的基因或基因产物与第一谱和另外的谱中相同基因或基因产物的加合表达相比的上调；和
在组合化合物谱中相同的选择的基因或基因产物与第一谱和另外的谱中相同基因或基因产物的加合表达相比的下调；和
在组合化合物谱中一种或多种选择的基因或基因产物的特性或表达的改变，所述选择的基因或基因产物在由第一谱和另外的谱的加合改变产生的谱中是未改变的。
7.依照权利要求1所述的方法，其中所述第一化合物对植物具有已知的作用而其中所述另外的化合物对植物具有未知的作用。
8.依照权利要求1所述的方法，其中每种表达谱包含由植物的完整基因组编码的基因或基因产物的子集。
9.依照权利要求1所述的方法，其中所述基因产物是植物蛋白。
10.依照权利要求1所述的方法，其进一步包括鉴定作为基因产物改变的结果的植物代谢物中的相应改变。
11.依照权利要求1所述的方法，其中化合物的组合具有协同作用，其是在组合化合物谱中植物的基因或基因产物在表达模式或水平上的改变与由所述第一和另外的表达谱在模式或水平上的加合改变产生的相比更大。
12.依照权利要求1所述的方法，其中化合物的组合具有拮抗作用，其是在组合化合物谱中基因或基因产物在表达模式或水平上的改变幅度与由所述第一和另外的谱的加合改变的表达模式或水平产生的相比减少。
13.依照权利要求11所述的方法，其中在组合表达谱中表达模式或水平上的改变是在形成所述第一和另外的谱的加合改变的模式的基因或基因产物的表达上至少2倍的改变。
14.依照权利要求1所述的方法，其中基因或基因产物表达谱的选择的改变是处于选自下组的状态的植物典型的基因或基因产物表达模式：增加的乙烯敏感性，降低的乙烯敏感性，提高的成熟，对胁迫、热、种群密度或盐度增加的抗性，对胁迫、热、种群密度或盐度降低的抗性，增加的病原体抗性，降低的病原体抗性，增加的开花，增加的氮效率，增加的除草剂抗性，增加的光合活性和增加的产量。
15.依照权利要求1所述的方法，其中所述另外的化合物包括两种或更多种另外的化合物。
16.依照权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞来自选自下组的植物：稻、玉米、小麦、大麦、高粱、小米、柳枝稷、芒草、禾本科植物、燕麦、番茄、马铃薯、香蕉、猕猴桃、鳄梨、甜瓜、芒果、甘蔗、甜菜、烟草、木瓜、桃、草莓、悬钩子、黑莓、蓝莓、莴苣、甘蓝、花椰菜、洋葱、西兰花、抱子甘蓝、棉花、双低菜、葡萄、大豆、油菜、芦笋、豆类、胡萝卜、黄瓜、茄子、瓜类、秋葵、欧防风、花生、椒类、菠萝、倭瓜、甘薯、黑麦、罗马甜瓜、豌豆、南瓜、向日葵、菠菜、苹果、樱桃、酸果蔓、葡萄柚、柠檬、酸橙、油桃、橙、桃、梨、橘柚、柑橘、百合、麝香石竹、菊、矮牵牛、蔷薇、天竺葵、堇菜、唐菖蒲、兰、丁香、海棠、枫香树、槭树、一品红、刺槐、梣、杨、椴树和拟南芥。
17.一种用于鉴定选择性地改变植物细胞的野生型基因表达的协同化合物的方法，所述方法包括：
(a)比较
i.来自与第一测试化合物接触的植物细胞或组织的第一表达谱；
ii.来自与另外的测试化合物接触的相同植物细胞或组织的另外的表达谱，和
iii.来自与所述第一测试化合物和所述另外的测试化合物接触的相同植物细胞或组织的组合表达谱，
其中将各植物细胞或组织接触足以在所述植物的细胞或组织中的至少一种基因或基因产物的表达上产生改变的时间；并且其中每种表达谱包含所述植物细胞或组织的至少一种基因或基因产物的表达水平或模式；和
(b)鉴定组合化合物谱(a)(iii)的基因和基因产物与第一谱(a)(i)和另外的谱(a)(ii)的组合的基因和基因产物之间在表达水平或模式上显著的、意想不到的改变。
18.依照权利要求1-17任一项所述的方法，其中通过生成数值或图形数据的计算机处理器或计算机程控设备进行比较。
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