CN110982828A

CN110982828A - 一种水稻丛枝菌根特异诱导的硝酸盐转运蛋白基因及其应用

Info

Publication number: CN110982828A
Application number: CN202010000479.4A
Authority: CN
Inventors: 陈爱群; 王双双; 徐国华
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2040-01-02
Also published as: CN110982828B; US20230045368A1; WO2021138660A1

Abstract

本发明公开了一种水稻丛枝菌根特异诱导的硝酸盐转运蛋白基因及其应用。一种水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因OsNPF4.5编码的蛋白质OsNPF4.5，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5在增加丛枝菌根真菌的定殖，提高植物共生过程中的氮素吸收中的应用。

Description

一种水稻丛枝菌根特异诱导的硝酸盐转运蛋白基因及其应用

技术领域

本发明属于农业生物工程领域，涉及一种水稻丛枝菌根特异诱导的硝酸盐转运蛋白基因及其应用。

技术背景

丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza；AM)是土壤中的一类属于球囊霉门的有益真菌(简称丛枝菌根真菌；AM真菌)与植物根系建立形成的互惠共生体(李晓林&冯固，2001)。地球上85％以上的陆生植物(除十字花科、黎科、石竹科和少数形成排根的豆科类植物外)都可以与土壤中不同种类的AM真菌共生形成丛枝菌根(冯固等，2010)。形成菌根后，植物可以通过两个途径吸收土壤中的养分：一是通过植物自身根系的直接吸收途径；二是借助于AM真菌菌丝体的间接吸收途径(也称为菌根途径)(Smith et al.2011)。植物根系借助于AM真菌的根外菌丝可数十倍地扩展在土壤中的吸收空间，增加对土壤中养分(主要是P和N)的吸收利用(弓明钦等，1997；Harrison et al.2002)。在苜蓿、百脉根、水稻等多个物种已经陆续报道了菌根强烈/特异表达的磷转运蛋白和氨转运蛋白，但是菌根诱导表达的硝酸盐转运蛋白却鲜有报道。

水稻是我国重要的粮食作物，虽然长期生活在淹水环境，但大量的研究证明硝对水稻的生长发育同样起着至关重要的作用(张亚丽等，2004)。AM真菌是好氧类真菌，长期淹水会直接影响菌根共生体的形成，但水稻通气组织的泌氧功能使得水稻仍然能够被土著AM真菌侵染。有研究显示，对旱作水稻进行连续7天的淹水灌溉虽然会降低AM真菌对根系的侵染率，但并不能完全阻止菌根共生(Vallino et al.,2014)。有研究发现，水稻土中也存在着大量不同种类的AM真菌孢子。此外，在水稻生长期间需要通过适度晒田来改良土壤环境，增强根系活力和微生物活性，以达到提高养分吸收和降低无效分蘖的目的，这也为AM真菌侵染水稻根系和利用NO3-提供了有利的环境。本发明从水稻中鉴定了单子叶植物第1个受丛枝菌根特异诱导表达的硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5，并研究了其与菌根共生的关系，提出了利用OsNPF4.5基因进行水稻(旱稻)与有益微生物丛枝菌根真菌互惠共生过程中提高氮素养分吸收利用的方法。

发明内容

本发明目的是提供一种水稻硝酸盐转运蛋白基因。

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白。

本发明的又一目的是提供该基因的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述基因OsNPF4.5编码的蛋白质OsNPF4.5，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5的重组表达载体。

所述的水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5在增加丛枝菌根真菌的定殖，提高植物共生过程中的氮素吸收中的应用。

所述的水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5在水稻品种改良中的应用。

所述的重组表达载体在增加丛枝菌根真菌的定殖，提高植物共生过程中的氮素吸收中的应用。

所述的重组表达载体在水稻品种改良中的应用。

有益效果

1、本发明公开了一种水稻菌根特异诱导的硝酸盐转运蛋白基因(OsNPF4.5基因)序列，结构 (图1)及其所编码的蛋白质。该基因来自水稻(Oryza sativa L.)，可作为目的基因导入植物，提高植物对氮素的吸收(图2)，以进行植物品种改良。所编码的蛋白质具有转运硝酸盐功能。

2、本发明人提供的OsNPF4.5基因功能是参与植物与有益微生物丛枝菌根真菌的侵染和共生过程，转录水平分析表明OsNPF4.5基因受丛枝菌根特异诱导表达(图3)。

3、本发明的OsNPF4.5基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

4、利用本发明OsNPF4.5基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或自身启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒， Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

附图说明

图1.OsNPF4.5的内含子/外显子结构分析(黑色方框部分为外显子)

黑色方框下方数字和线条上方数字分别代表不同外显子和内含子

图2.在水稻中超表达OsNPF4.5促进水稻生长和氮素吸收

WT：野生型；OX-2、OX-3和OX-4为3个超表达转基因株系

图3.OsNPF4.5在接种/不接种AM真菌水稻植株中的表达分析

R：Roots；L：Leaves；AMF：AM真菌(R.irregularis)

图4.蛙卵异源系统证实OsNPF4.5具有硝酸盐转运活性

H₂O：阴性对照；CHL1：拟南芥中的一个已知硝酸盐作为阳性对照

图5.用于构建超表达的双元表达载体图谱

图6.水稻转基因株系OsNPF4.5超表达效果鉴定

WT：野生型；OX1-5为5个超表达转基因株系

图7.在水稻中超表达OsNPF4.5促进水稻根系对硝态氮的吸收

WT：野生型；OX1-5为5个超表达转基因株系

图8.测序验证获得3个osnpf4.5纯合突变体osnpf4.5-1，osnpf4.5-2和osnpf4.5-3 发生碱基插入或缺失的位置由箭头标出

图9.突变OsNPF4.5降低水稻地上部生物量和氮浓度

WT:野生型；osnpf4.5-1、osnpf4.5-2和osnpf4.5-3为三个突变体材料

具体实施方式

实施例1

水稻菌根特异诱导表达的硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5的分子克隆

选用水稻品种“日本晴”(常规实验品种)，试验前，沙子于180度干热灭菌后装到大约4升的盆中。每盆种4穴(每穴2株)发芽后生长两周的水稻幼苗，每穴苗根系周围接入约200个孢子的R.irregularis菌剂或灭活的菌剂(作为对照)。每周浇一次水稻IRRI营养液(磷浓度降低为30μM)接种六周后，采取根部样品置于液氮中冷冻保存。取部分根系，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents,Invitrogen,USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。因为在没有接种AM真菌的水稻根系中OsNPF4.5 只有很低的表达，在EST/cDNA文库中找不到其全长的编码序列，所以我们通过RACE-PCR(采用Ambion公司RACE试剂盒，FirstChoice RLM-RACE Kit,Ambion,Inc.,Austin,TX,USA) 技术从水稻菌根中克隆到该基因的全长cDNA序列。首先以上述中的RNA为模板以Oligo(dT) 为锁定引物在反转录酶MMLV的作用下，反转录合成cDNA第一链。然后用含有部分接头的通用引物UMP作为上游引物和基因特异引物GSP1作为下游引物，以cDNA第一链为模板进行PCR 循环，把目的基因5’末端的cDNA片段扩增出来。同理以UMP为下游引物，GSP2为上游引物扩增出3’末端cDNA片段。最终从2个有相互重叠序列的3’/5’-RACE产物中获得全长cDNA. 通过测序获得了水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5的cDNA序列。序列分析显示，该基因ORF (开放阅读框)为1830bp，编码区存在6个内含子，如下式1。

RACE-PCR引物如下:

因为OsNPF4.5属于NRT1/PTR家族，预示着可能具有硝酸盐转运功能。为了确定其功能，克隆出cDNA序列并连接到蛙卵表达载体pT7Ts上，体外合成cRNA.在蛙卵体内注射OsNPF4.5 的cRNA待其经过48小时培养后，分别放在含有0.25mM和2.5mM的¹⁵NO₃ ^-中处理2小时，检测蛙卵体内¹⁵N丰度。蛙卵实验的分析结果证明从水稻中新得到的基因确为一个编码硝酸盐转运蛋白基因(图4)。本发明的水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5为水稻中的首次报道，同时也是植物中首次发现的与丛枝菌根共生相关的硝酸盐转运蛋白基因，有望应用于植物尤其是旱作植物以提高在丛枝菌根共生过程中氮素养分的吸收利用。

实施例2

OsNPF4.5的序列信息与特性分析

本发明的OsNPF4.5ORF(开放阅读框)为1830bp(SEQ ID NO.3)，包含7个外显子和6个内含子。DNAssist软件分析表明OsNPF4.5共编码609个氨基酸，有12个跨膜结构域，符合转运蛋白的基本特征。经Blast程序比较发现，OsNPF4.5基因的核苷酸序列与高粱SbNPF4.3、玉米ZmNPF4.5核苷酸相似性分别为78.2％、78.1％。表明OsNPF4.5基因进化上在不同物种中高度保守。

实施例3

OsNPF4.5的表达研究

用实施例1中的序列设计OsNPF4.5两端的引物进行定量RT-PCR，分析水稻接种丛枝菌根真菌的幼苗地上部与地下部的表达，以水稻actin基因Rac1(McElroy et al,1990)的表达为内参，结果表明，OsNPF4.5在地上部和不接种的根系中表达量很低，而在接种丛枝菌根真菌的根系特异强烈诱导表达，与对照相比，其表达量上调了上百倍。

定量RT-PCR使用的引物如下所示：

OsACTIN QF:CAACACCCCTGCTATGTACG

OsACTIN QR:CATCACCAGAGTCCAACACAA

OsNPF4.5 QF:CGCCGTGCTCAGCTTCCTCAACTT

OsNPF4.5 QR:AGGCAAAAATGGTAGCAACAACTG

实施例4

正反义OsNPF4.5转基因水稻植株的获得

根据实施例1得到的OsNPF4.5的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。

OsNPF4.5 OF：cgcGTCGACATGAGCAAAGTAACTCAAGCTA(下划线表示酶切位点)

OsNPF4.5 OR：gccAAGCTTTCATACTTTGTGCTCTGCTG(下划线表示酶切位点)

以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsNPF4.5的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到常用的双元表达载体pTCK303(图5)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，转入水稻品种日本晴。待获得的转基因植株通过定量RT-PCR验证超表达效果后进行植物的功能验证(图6)。将转基因植株的T2代和对照植株进行2.5mM ¹⁵NO₃ ^-和¹⁵NH₄ ⁺处理，检测它们¹⁵N吸收速率，，结果表明转基因水稻在¹⁵NO₃ ^-处理下¹⁵N 吸收速率显著高于对照组，而氨处理下没有差异(图7)。为了更好的研究其在植物中的功能，我们利用CRISPR-Cas9技术创制了Osnpf4.5突变体材料。首先在OsNPF4.5的编码区设计了三个特异的spacer并连接到sgRNA和Cas9载体上，再将其电转至农杆菌中，转入水稻品种日本晴，经测序鉴定获得3个株系的纯合突变体osnpf4.5-1、osnpf4.5-2和osnpf4.5-3(图8)。 osnpf4.5突变体转基因植株在接种丛枝菌根真菌情况下，与野生型相比，突变体地上部生物量和氮浓度显著降低(图9)。

上述实施例表明本发明中克隆的水稻菌根特异诱导表达的硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5，为水稻中首次克隆的菌根诱导的硝酸盐转运蛋白基因,此类基因在植物菌根共生过程中的功能迄今未经描述。实施例3、4表明该基因与菌根共生硝酸盐吸收密切相关。此基因由于受到丛枝菌根真菌显著特异诱导，更加适合旱稻、玉米、小麦等多个粮食作物的抗逆性(养分胁迫)遗传改良。

本发明人从单子叶植物水稻(Oryza sativa L.)中克隆了一个cDNA，它编码硝酸盐转运蛋白，命名为OsNPF4.5。mRNA表达分析表明OsNPF4.5只在接种菌根的根系中特异诱导表达，而在不接种的根系和地上部表达量很低。转基因研究表明，将OsNPF4.5基因转入水稻，转基因水稻在¹⁵NO₃ ^-处理下¹⁵N吸收速率显著高于对照组，而氨处理下没有差异。Osnpf4.5 突变体转基因植株在接种丛枝菌根真菌情况下，与野生型相比，突变体地上部生物量和氮浓度显著降低，同时根系侵染率和丛枝丰度也相应降低。在本发明的方法中，可利用OsNPF4.5 基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒 (CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或菌根特异诱导的启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶) 来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种水稻丛枝菌根特异诱导的硝酸盐转运蛋白基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2167

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

cgcggatccg aacactgcgt ttgctggctt tgatgaaagt gtccagcatt tccatcttct 60

cattgtgtcg atactctcac tgatgtgtgg tttttcatga catcttaata ggaaaacgag 120

gagatgagca aagtaactca agctaatgga atagactcca gggaacacaa agggcagagc 180

atagcagttg aagccaacag caaaggagag actcgtgaag tcgttgaagg gaaggttgac 240

tggaggggaa gacctgcaat aagagggagt catggtggtg ttgccaattc tttcttcatt 300

cttgtgaact ttgggctcga gaaccttgcc tcgttgtctc tagccgtgaa ccttatcatc 360

tacttcatga cggtcatgca cattggtctg actgatggct ccaacctgct gaccaactac 420

atgggcacga gctacatggt cgcagtgctc atctccgtct tcgcggacac tttcattggc 480

cggtacaaga ctgtcatcat atcgtcagtg atcgagctcg tgggcctgct gattcttaca 540

ctgcaagctc actccaataa gctgaagcca ccgtattgcg tcttcccgtt cgaccccaag 600

tgcgagacgg tgagcggcga cggcaggacg cacctctacg tggggctgta cctcgtggcg 660

atcggctcgg cgggcatcaa ggcggcgctg ccggcgcact gcgccgacca gttcgacgag 720

aagcacccca cggagaagct gcagatgtcc agcttcttca actggctgct gctcagcctc 780

tgcaccggcg gcgccatcag cgtcacggtg ttcgtgtgga tccagagcta caagggctgg 840

gacaaagggt tcggcgccgc caccggcgtg atgggcctcg ccctcctcgt cttcatcgcc 900

ggcctccccg ggtaccgcat ctccgtcgtg cagggcagca ccgcgcttct tgaaatcttg 960

caggtgtatg ttgctgccat caggaacagg aatatgaagc tccctgagaa cccagacgag 1020

ctgtacgaga tcagcaagag caaagctccc cctgacacgg acttcatggc tcacagggat 1080

aaaccgttca ggttccttga caaggcggcg atagtacagg cgccaacgga tgaggcgccg 1140

agcccatggc ggcagtgccg agtgacccag gtggagcacg ccaagacggt gctcgccatg 1200

gtgcccatct tctgcagcgc catcatcatg agcacctgcc tcgcgcagct ccagacattc 1260

tccatccagc agggcgtcac catggacagg accatcggca cgttcaagat gccgccggcg 1320

tcgctgccca tcatcccgct catcgtcctc gtgttcgcgg tgcccatcta cgagcggggc 1380

ttcgtgccct tcgcccgccg catcaccggc caccccaacg gcatcccgca cctgcagcgg 1440

gtcggcgtcg gcctcgtgct ctccatcgtc tccatggcca tcgccgccgt cgtggaggtg 1500

cgccgcaaga gggtggcagc aaggcacggg atgctggacg cgaatcccat tctcgggaag 1560

cagctgccca tctcctgctt ctggctggcg ccgcagttca ccgtgttcgg cgtcgctgac 1620

atgttcacct tcatcgggct cctcgagttc ttctactcgc aggcgccgcc ggcgctcaag 1680

tccatgtcat cctcgttcct gtggtgcccc atgtcgctcg ggtacttcct cagcaccatc 1740

atcgtcaagg ctgtgaacgc cgccaccagg ggcgccacgg cgagcggcgg ctggttggcc 1800

ggcaacaaca tcaaccggaa ccacctcgac ctcttcttct ggctgctcgc cgtgctcagc 1860

ttcctcaact tcctcaacta cctcttctgg gccagctggt acaagtacaa gcctcagcag 1920

tcagcccacg taccagcaga gcacaaagta tgatgatcat ccagcgtctc gagaaccttg 1980

gtaataaaag atgtgcagtt gttgctacca tttttgcctc acgggtgcac ggagtaccaa 2040

cgtggcaacg tgagtttccc ataaggggaa gaatatatag gtatacggaa cttaattcta 2100

atcagttcca gtacaaagat catggaattg catcgtcggt gtgtataaat gtgatatttt 2160

gaagcac 2167

<210> 2

<211> 609

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Ser Lys Val Thr Gln Ala Asn Gly Ile Asp Ser Arg Glu His Lys

1 5 10 15

Gly Gln Ser Ile Ala Val Glu Ala Asn Ser Lys Gly Glu Thr Arg Glu

20 25 30

Val Val Glu Gly Lys Val Asp Trp Arg Gly Arg Pro Ala Ile Arg Gly

35 40 45

Ser His Gly Gly Val Ala Asn Ser Phe Phe Ile Leu Val Asn Phe Gly

50 55 60

Leu Glu Asn Leu Ala Ser Leu Ser Leu Ala Val Asn Leu Ile Ile Tyr

65 70 75 80

Phe Met Thr Val Met His Ile Gly Leu Thr Asp Gly Ser Asn Leu Leu

85 90 95

Thr Asn Tyr Met Gly Thr Ser Tyr Met Val Ala Val Leu Ile Ser Val

100 105 110

Phe Ala Asp Thr Phe Ile Gly Arg Tyr Lys Thr Val Ile Ile Ser Ser

115 120 125

Val Ile Glu Leu Val Gly Leu Leu Ile Leu Thr Leu Gln Ala His Ser

130 135 140

Asn Lys Leu Lys Pro Pro Tyr Cys Val Phe Pro Phe Asp Pro Lys Cys

145 150 155 160

Glu Thr Val Ser Gly Asp Gly Arg Thr His Leu Tyr Val Gly Leu Tyr

165 170 175

Leu Val Ala Ile Gly Ser Ala Gly Ile Lys Ala Ala Leu Pro Ala His

180 185 190

Cys Ala Asp Gln Phe Asp Glu Lys His Pro Thr Glu Lys Leu Gln Met

195 200 205

Ser Ser Phe Phe Asn Trp Leu Leu Leu Ser Leu Cys Thr Gly Gly Ala

210 215 220

Ile Ser Val Thr Val Phe Val Trp Ile Gln Ser Tyr Lys Gly Trp Asp

225 230 235 240

Lys Gly Phe Gly Ala Ala Thr Gly Val Met Gly Leu Ala Leu Leu Val

245 250 255

Phe Ile Ala Gly Leu Pro Gly Tyr Arg Ile Ser Val Val Gln Gly Ser

260 265 270

Thr Ala Leu Leu Glu Ile Leu Gln Val Tyr Val Ala Ala Ile Arg Asn

275 280 285

Arg Asn Met Lys Leu Pro Glu Asn Pro Asp Glu Leu Tyr Glu Ile Ser

290 295 300

Lys Ser Lys Ala Pro Pro Asp Thr Asp Phe Met Ala His Arg Asp Lys

305 310 315 320

Pro Phe Arg Phe Leu Asp Lys Ala Ala Ile Val Gln Ala Pro Thr Asp

325 330 335

Glu Ala Pro Ser Pro Trp Arg Gln Cys Arg Val Thr Gln Val Glu His

340 345 350

Ala Lys Thr Val Leu Ala Met Val Pro Ile Phe Cys Ser Ala Ile Ile

355 360 365

Met Ser Thr Cys Leu Ala Gln Leu Gln Thr Phe Ser Ile Gln Gln Gly

370 375 380

Val Thr Met Asp Arg Thr Ile Gly Thr Phe Lys Met Pro Pro Ala Ser

385 390 395 400

Leu Pro Ile Ile Pro Leu Ile Val Leu Val Phe Ala Val Pro Ile Tyr

405 410 415

Glu Arg Gly Phe Val Pro Phe Ala Arg Arg Ile Thr Gly His Pro Asn

420 425 430

Gly Ile Pro His Leu Gln Arg Val Gly Val Gly Leu Val Leu Ser Ile

435 440 445

Val Ser Met Ala Ile Ala Ala Val Val Glu Val Arg Arg Lys Arg Val

450 455 460

Ala Ala Arg His Gly Met Leu Asp Ala Asn Pro Ile Leu Gly Lys Gln

465 470 475 480

Leu Pro Ile Ser Cys Phe Trp Leu Ala Pro Gln Phe Thr Val Phe Gly

485 490 495

Val Ala Asp Met Phe Thr Phe Ile Gly Leu Leu Glu Phe Phe Tyr Ser

500 505 510

Gln Ala Pro Pro Ala Leu Lys Ser Met Ser Ser Ser Phe Leu Trp Cys

515 520 525

Pro Met Ser Leu Gly Tyr Phe Leu Ser Thr Ile Ile Val Lys Ala Val

530 535 540

Asn Ala Ala Thr Arg Gly Ala Thr Ala Ser Gly Gly Trp Leu Ala Gly

545 550 555 560

Asn Asn Ile Asn Arg Asn His Leu Asp Leu Phe Phe Trp Leu Leu Ala

565 570 575

Val Leu Ser Phe Leu Asn Phe Leu Asn Tyr Leu Phe Trp Ala Ser Trp

580 585 590

Tyr Lys Tyr Lys Pro Gln Gln Ser Ala His Val Pro Ala Glu His Lys

595 600 605

Val

<210> 3

<211> 1830

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 3

atgagcaaag taactcaagc taatggaata gactccaggg aacacaaagg gcagagcata 60

gcagttgaag ccaacagcaa aggagagact cgtgaagtcg ttgaagggaa ggttgactgg 120

aggggaagac ctgcaataag agggagtcat ggtggtgttg ccaattcttt cttcattctt 180

gtgaactttg ggctcgagaa ccttgcctcg ttgtctctag ccgtgaacct tatcatctac 240

ttcatgacgg tcatgcacat tggtctgact gatggctcca acctgctgac caactacatg 300

ggcacgagct acatggtcgc agtgctcatc tccgtcttcg cggacacttt cattggccgg 360

tacaagactg tcatcatatc gtcagtgatc gagctcgtgg gcctgctgat tcttacactg 420

caagctcact ccaataagct gaagccaccg tattgcgtct tcccgttcga ccccaagtgc 480

gagacggtga gcggcgacgg caggacgcac ctctacgtgg ggctgtacct cgtggcgatc 540

ggctcggcgg gcatcaaggc ggcgctgccg gcgcactgcg ccgaccagtt cgacgagaag 600

caccccacgg agaagctgca gatgtccagc ttcttcaact ggctgctgct cagcctctgc 660

accggcggcg ccatcagcgt cacggtgttc gtgtggatcc agagctacaa gggctgggac 720

aaagggttcg gcgccgccac cggcgtgatg ggcctcgccc tcctcgtctt catcgccggc 780

ctccccgggt accgcatctc cgtcgtgcag ggcagcaccg cgcttcttga aatcttgcag 840

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tacgagatca gcaagagcaa agctccccct gacacggact tcatggctca cagggataaa 960

ccgttcaggt tccttgacaa ggcggcgata gtacaggcgc caacggatga ggcgccgagc 1020

ccatggcggc agtgccgagt gacccaggtg gagcacgcca agacggtgct cgccatggtg 1080

cccatcttct gcagcgccat catcatgagc acctgcctcg cgcagctcca gacattctcc 1140

atccagcagg gcgtcaccat ggacaggacc atcggcacgt tcaagatgcc gccggcgtcg 1200

ctgcccatca tcccgctcat cgtcctcgtg ttcgcggtgc ccatctacga gcggggcttc 1260

gtgcccttcg cccgccgcat caccggccac cccaacggca tcccgcacct gcagcgggtc 1320

ggcgtcggcc tcgtgctctc catcgtctcc atggccatcg ccgccgtcgt ggaggtgcgc 1380

cgcaagaggg tggcagcaag gcacgggatg ctggacgcga atcccattct cgggaagcag 1440

ctgcccatct cctgcttctg gctggcgccg cagttcaccg tgttcggcgt cgctgacatg 1500

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aacaacatca accggaacca cctcgacctc ttcttctggc tgctcgccgt gctcagcttc 1740

ctcaacttcc tcaactacct cttctgggcc agctggtaca agtacaagcc tcagcagtca 1800

gcccacgtac cagcagagca caaagtatga 1830

Claims

1.一种水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因OsNPF4.5编码的蛋白质OsNPF4.5，其特征在于氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5的重组表达载体。

4.权利要求1所述的水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5在增加丛枝菌根真菌的定殖，提高植物共生过程中的氮素吸收中的应用。

5.权利要求1所述的水稻硝酸盐转运蛋白基因OsNPF4.5在水稻品种改良中的应用。

6.权利要求3所述的重组表达载体在增加丛枝菌根真菌的定殖，提高植物共生过程中的氮素吸收中的应用。

7.权利要求3所述的重组表达载体在水稻品种改良中的应用。